專利名稱：雙特異性抗-egfr/抗-igf-1r抗體的制作方法
雙特異性抗-EGFR/抗-1GF-1R抗體
本申請(qǐng)是國際申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2009/006782，國際申請(qǐng)日為2009年9月21日，進(jìn)入中國國家日期是2011年3月24日，中國國家申請(qǐng)?zhí)柺?00980137723. 3，發(fā)明名稱為“雙特異性抗-EGFR/抗-IGF-IR抗體”的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及針對(duì)EGFR和針對(duì)IGF-IR的雙特異性抗體，制備它們的方法，包含所述抗體的藥物組合物，及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
EGFR 和抗-EGFR 抗體人表皮生長因子受體(也已知為HER-I或Erb-Bl，并且在本文中稱作"EGFR")是170kDa的跨膜受體，其由c-erbB原癌基因編碼，并且顯示固有的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi, H.，等，英國癌癥雜志(Br. J. Cancer) 73 (1996) :228-235 ;Herbst，R. S.和Shin, D. M.，癌癥(Cancer) 94 (2002) :1593-1611)。SwissProt 數(shù)據(jù)庫登錄號(hào) P00533 提供了 EGFR的序列。還存在EGFR的同種型和變體(例如，可變RNA轉(zhuǎn)錄物，截短形式，多態(tài)性等)，包括但不限于 Swissprot 數(shù)據(jù)庫登錄號(hào) P00533-1，P00533-2, P00533-3，和 P00533-4確定的那些。已知EGFR結(jié)合包括以下各項(xiàng)的配體表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-a 0^卜0)，雙調(diào)蛋白，肝素結(jié)合￡6 0*46 )，^動(dòng)物纖維素，和印iregulin(Herbst，R.S.和 Shin，D.M.，癌癥(Cancer)94(2002) 1593-1611 ；Mendelsohn, J.,和 Baselga，J.， 原癌基因(Oncogene) 19 (2000) 6550-6565)。EGFR經(jīng)由酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過程，包括但不限于激活控制細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞存活、程序性細(xì)胞死亡、血管發(fā)生、有絲分裂發(fā)生和轉(zhuǎn)移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Atalay等，Ann. Oncology14(2003) 1346-1363 ；Tsao,A. S.和 Herbst,R. S.信號(hào)(Signal) 4 (2003) 4-9 ；Herbst,R. S.，和 Shin, D. M.，癌癥(Cancer) 94 (2002) 1593-1611 ；Modjtahedi, H.，等，英國癌癥雜志(Br.J. Cancer)73(1996)228-235)。EGFR的過量表達(dá)已經(jīng)在許多人類惡性病癥中報(bào)道，包括膀胱癌、腦癌、頭和頸癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和腎癌。(Atalay，G.，等，Ann. Oncology14(2003) 1346-1363 ；Herbst, R. S.，和 Shin, D. M.，癌癥(Cancer)94(2002) 1593-1611 ；Modjtahedi，H.，等，英國癌癥雜志(Br. J. Cancer) 73 (1996) 228-235)。在這些病癥的許多中，EGFR的過量表達(dá)與患者的差的預(yù)后相關(guān)或關(guān)聯(lián)。(Herbst，R. S.，和Shin，D.M.，癌癥(Cancer)94(2002) 1593-1611 ；Modjtahedi, H.，等，英國癌癥雜志(Br.J. Cancer) 73 (1996) 228-235)。EGFR也在正常組織的細(xì)胞中表達(dá)，特別是皮膚、肝臟和胃腸道的上皮組織，盡管通常水平比在惡性細(xì)胞中低(Herbst，R. S.，和Shin，D.M.，癌癥(Cancer)94(2002)1593-1611)。未綴合的單克隆抗體(mAbs)可以是用于治療癌癥的有用的藥,如由美國食品和藥物管理局(U. S. Food and Drug Administration)所批準(zhǔn)的下列藥物所證明用于治療晚期乳腺癌的曲妥珠單抗(Herceptin ；Genentech Inc,) (GriIIo-Lopez, A. -J.,等，Semin.Oncol. 26(1999)66-73 ；Goldenberg, M. M.，臨床治療(Clin. Ther.) 21 (1999) :309-18),用于治療CD20陽性B細(xì)胞，低級(jí)或?yàn)V泡性非霍奇金氏淋巴瘤的利妥昔單抗(Rituxan ;IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA,和 Genentech Inc. , San Francisco, CA),用于治療復(fù)發(fā)性急性骨髓白血病的吉妥珠單抗(Mylotarg ，Celltech/Wyeth_Ayerst)，和用于治療B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病的阿侖珠單抗(CAMPATH ，Millenium Pharmaceuticals/Schering AG)。這些產(chǎn)品的成功不僅依賴于它們的功效，還依賴于它們突出的安全模式(GriIlo-Lopez, A. -J ,等 ，Semin. Oncol. 26(1999) :66-73 ；Goldenberg, M. M.，臨床治療(Clin. Ther). 21 (1999)309-18)。盡管在這些藥物上所取得的成就，目前在獲得更高特異性抗體活性方面存在巨大的興趣，所述特異性活性比典型地由未綴合的mAb療法所提供的要聞許多研究的結(jié)果顯示Fe-受體依賴性機(jī)制相當(dāng)大地有利于對(duì)針對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒性抗體的作用，并且指示針對(duì)腫瘤的最佳抗體將優(yōu)先結(jié)合以激活Fe受體，并且與抑制性配偶體 Fe Y RIIB 結(jié)合程度最小。(Clynes, R.A ,等,自然藥物(Nature Medicine) 6 (4)443-446 (2000) ；Kalergis, A. M.，和 Ravetch, J. V.，J. Exp. Med. 195 (12) (2002) 1653-1659。例如，至少一項(xiàng)研究的結(jié)果顯示Fe YRIIIa受體中的多態(tài)性特別地與抗體療法的功效緊密相關(guān)(Cartron, G.，等，血液(Blood) 99 (3) (2002)754-757。該研究顯示對(duì)于 Fe Y RIIIa 是純合的患者，與對(duì)于Fe YRIIIa是雜合的患者相比，具有更好的針對(duì)利妥昔單抗的應(yīng)答。作者得出結(jié)論為更優(yōu)的應(yīng)答是由于抗體與Fe Y RIIIa的更好的體內(nèi)結(jié)合，其導(dǎo)致了針對(duì)淋巴瘤細(xì)胞的更好的 ADCC 活性(Cartron, G.，等，血液(Blood) 99 (3) (2002)754-758)。已經(jīng)報(bào)道了靶向EGFR和阻斷EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的各種策略。小分子酪氨酸激酶抑制劑如吉非替尼，厄洛替尼和CI-1033在胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域內(nèi)阻斷EGFR的自磷酸化，由此抑制下游信號(hào)傳導(dǎo)事件(Tsao，A. S.，和Herbst，R. S.，信號(hào)(Signal) 4 (2003) 4_9)。另一方面，單克隆抗體，靶向EGFR的胞外部分，導(dǎo)致阻斷配體結(jié)合并由此抑制下游事件如細(xì)胞增殖(Tsao, A. S.，和 Herbst, R. S.，信號(hào)(Signal) 4 (2003) 4-9)。已經(jīng)產(chǎn)生了幾種鼠單克隆抗體，其獲得這種體外阻斷并且已經(jīng)在小鼠異種移植模型中評(píng)估它們影響腫瘤生長的能力(Masui,等，癌癥研究(CancerRes. )46(1986)5592-5598 ；Masui, H.，等，癌癥研究(Cancer Res) 44 (1984) 1002-1007 ；Goldstein,等，臨床癌癥研究(Clin. Cancer Res.) (1995) 11311-1318)。例如，EMD55900 (EMD Pharnaceuticals)是針對(duì)人表皮樣癌細(xì)胞系A(chǔ)431產(chǎn)生的鼠抗-EGFR單克隆抗體，并且在喉或下咽部晚期鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床研究中檢驗(yàn)(Bier，H.，等，Eur. Arch.Otohinolaryngol. 252 (1995) 433-9)。另外，結(jié)合EGFR胞外結(jié)構(gòu)域的大鼠單克隆抗體ICR16，ICR62，和ICR80已經(jīng)顯示有效抑制EGF和TGF-a受體的結(jié)合(Modjtahedi，H.，等，Int. J. Cancer 75(1998)310-316)。鼠單克隆抗體425是另一種針對(duì)人A431癌細(xì)胞系產(chǎn)生的Mab并且發(fā)現(xiàn)在人表皮生長因子受體的外部結(jié)構(gòu)域上與多肽表位結(jié)合。(Murthy，U.，等，生物化學(xué)生物物理進(jìn)展(Arch. Biochem. Biophys). 252 (2) (1987) 549-560。在治療性治療中使用鼠抗體的潛在問題是非人單克隆抗體可以被人宿主識(shí)別為外源蛋白；因此，重復(fù)注射這些外源抗體可導(dǎo)致誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致有害的超敏反應(yīng)。對(duì)于基于鼠的單克隆抗體，這經(jīng)常被稱為人抗小鼠抗體應(yīng)答，或"HAMA"應(yīng)答，或人抗大鼠抗體，或"HARA"應(yīng)答。此外，這些“異源”抗體可以被宿主的免疫系統(tǒng)所攻擊從而使它們，在達(dá)到它們的靶位點(diǎn)前被有效地中和。另外，非人單克隆抗體(例如，鼠單克隆抗體)典型地缺乏人效應(yīng)子功能性，即它們不能，特別是通過抗體依賴性細(xì)胞毒性或Fe-受體介導(dǎo)的吞噬作用來介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性的裂解或溶解人靶細(xì)胞。已經(jīng)開發(fā)了嵌合抗體作為“綴合”抗體的置換物，所述嵌合抗體包含來自兩種或多種不同物種(例如，小鼠和人類)的抗體的部分。例如US5, 891，996 (Mateo de Acosta delRio, C.M.，等)討論了小鼠/人嵌合抗體，R3，針對(duì)EGFR，并且US 5，558，864討論了產(chǎn)生
嵌合和人源化形式的鼠抗-EGFR MAb 425。此外，IMC-C225 (Erbitux ； ImClone)是嵌合
小鼠/人抗-EGFR單克隆抗體(基于 小鼠M225單克隆抗體，其在人臨床試驗(yàn)中導(dǎo)致HAMA應(yīng)答)，其已經(jīng)報(bào)道在各種人異種移植模型中顯示抗腫瘤功效。(Herbst，R. S.，和Shin，D.M.，癌癥(Cancer) 94 (2002) 1593-1611)。IMC-C225的功效已經(jīng)歸因于幾個(gè)機(jī)制，包括抑制通過EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑，和可能通過增加的抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)活性調(diào)節(jié)的細(xì)胞事件(Herbst, R. S.，和 Shin，D.M·，癌癥(Cancer)94(2002) 1593-1611)。IMC-C225也用于臨床試驗(yàn)中，包括與放射療法和化學(xué)療法聯(lián)合(Herbst，R. S.，和Shin，D. Μ.，癌癥(Cancer)94(2002) 1593-1611)。最近，Abgenix, Inc. (Fremont, CA)開發(fā)了用于癌癥治療的 ABX-EGF。ABX-EGF 是一種完全人的抗-EGFR 單克隆抗體。(Yang，X. D.，等，Crit. Rev.Oncol. /HematoI. 38(2001) 17-23)。WO 2006/082515涉及源自大鼠單克隆抗體ICR62的人源化的抗-EGFR單克隆抗體并且涉及它們用于癌癥治療的糖改造形式。IGF-IR 和抗-IGF-IR 抗體胰島素樣生長因子I受體(IGF-1R，IGF-IR，⑶221抗原)屬于跨膜蛋白酪氨酸激酶家族)(LeRoith, D.,等,內(nèi)分泌學(xué)綜述(Endocrin. Rev.) 16(1995) 143-163 ;和 Adams,Τ. E.，等，細(xì)胞分子生命科學(xué)(Cell. Mol. Life Sci.) 57 (2000) 1050-1093)。IGF-IR 以高親和性結(jié)合IGF-I并在體內(nèi)起始針對(duì)這種配體的生理反應(yīng)。IGF-IR還與IGF-II結(jié)合，但是以稍微更低的親和性結(jié)合。IGF-IR的過量表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的致瘤性轉(zhuǎn)化，并且存在這樣的證據(jù)，即IGF-IR涉及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化并且因此成為有用的靶標(biāo)用于開發(fā)治療癌癥的治療劑(Adams, Τ. E.，等，細(xì)胞分子生命科學(xué)(Cell. Mol. Life Sci.) 57 (2000) 1050-1093)。針對(duì)IGF-IR的抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的并且關(guān)于它們?cè)隗w外和體內(nèi)的抗腫瘤功效進(jìn)行了研究(Benini, S.，等，臨床癌癥研究(Clin. CancerRes.) 7 (2001) 1790-1797 ；Scotlandi，K.，等，癌癥基因治療(Cancer Gene Ther.) 9 (2002) 296-307 ；Scotlandi,K.,等,國際癌癥雜志(Int. J. Cancer) 101 (2002) 11-16 ；Brunetti, A.，等，生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem. Biophys. Res. Commun. ) 165 (1989) 212-218 ；Prigent, S. A.，等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 265 (1990) 9970-9977 ;Li，S. L.，等，癌癥免疫學(xué)免疫治療(Cancer Immunol. Immunother.) 49 (2000) 243-252 ；Pessino, A.，等，生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem. Biophys. Res. Commun. ) 162 (1989) 1236-1243 ；Surinya,K. H.,等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 277 (2002) 16718-16725 ；Soos, M. A.,等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. 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Comm.) 149 (1987) 276-281 ；和 Kalebic, Τ.，等，癌癥研究(Cancer Res.) 54 (1994) 5531-5534 ；Adams, Τ. Ε.，等，細(xì)胞分子生命科學(xué)(Cell. Mol. Life Sci.) 57 (2000) 1050-1093 ；Dricu, A.,等，糖生物學(xué)(Glycobiology) 9(1999) 571-579 ;Kanter_Lewensohn, L.,等，黑素瘤研究(Melanoma Res.) 8 (1998) 389-397 ；Li, S. L.,等,癌癥免疫學(xué)免疫治療(Cancer Immunol.Immunother.) 49 (2000) 243-252)。針對(duì)IGF-IR的抗體在許多其他的文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述，例如 Arteaga, C. L.，等，乳腺癌研究治療(Breast Cancer Res. Treatment) 22 (1992) 101-106 ；和 Hailey, J.，等，分子癌癥治療(Mol. Cancer Ther.) I (2002) 1349-1353。具體地，針對(duì)IGF-IR被稱為a IR3的單克隆抗體廣泛用于研究IGF-IR介導(dǎo)的過 程和IGF-I介導(dǎo)的疾病如癌癥的研究中。a -IR-3由Kull，F(xiàn). C.，生物化學(xué)雜志(J. Biol.Chem. )258(1983)6561-6566描述。同時(shí)，約有百篇已經(jīng)出版的出版物涉及a IR3抗腫瘤效果的研究和治療應(yīng)用，其中a IR3單獨(dú)地和與細(xì)胞生長抑制劑如多柔比星(doxorubicin)和長春新堿(vincristine) —起進(jìn)行治療。a IR3是一種已知抑制IGF-I與IGF受體的結(jié)合，但是不抑制IGF-II與IGF-IR結(jié)合的鼠單克隆抗體。a IR3以高濃度刺激腫瘤細(xì)胞增殖和 IGF-IR 磷酸化作用(Bergmann, U.，等，癌癥研究(Cancer Res.) 55 (1995) 2007-2011 ；Kato, H.,等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem. )268(1993)2655-2661)。存在其他的抗體(例如，1H7，Li，S.，L.，等，癌癥免疫學(xué)免疫療法(Cancer Immunol.Immunother. )49(2000)243-252)，所述抗體抑制 IGF-II 與 IGF-IR 的結(jié)合比抑制 IGF-I 結(jié)合更有效?？贵w和它們的性質(zhì)和特征的現(xiàn)有技術(shù)的簡(jiǎn)述由Adams，T.E.，等，細(xì)胞分子生命科學(xué)(Cell. Mol. Life Sci.) 57 (2000) 1050-1093 描述。在現(xiàn)有技術(shù)中描述的大多數(shù)抗體是小鼠起源的。所述抗體，如在現(xiàn)有技術(shù)中所公知的，如果不經(jīng)過進(jìn)一步改變?nèi)缜逗匣蛉嗽椿瘜?duì)于人患者的治療是無效的?；谶@些缺陷，明顯地優(yōu)選人抗體作為治療劑用于治療人患者。人抗體在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的(van Dijk,Μ. Α.,和 van de ffinkel, J. G.，Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374)。基于這些技術(shù),可以產(chǎn)生針對(duì)多種靶標(biāo)的人抗體。將針對(duì)IGF-IR的人抗體的實(shí)例描述在WO 02/053596中。WO 2005/005635 涉及人抗-IGF-IR 抗體 <IGF-1R>HUMAB 克隆 18 (DSM ACC 2587)或〈16 -11 >皿祖8克隆22(051 ACC 2594)以及它們?cè)诎┌Y治療中的應(yīng)用。雙特異性抗體最近已經(jīng)開發(fā)了廣泛多樣的重組抗體形式，例如通過融合例如IgG抗體形式和單鏈結(jié)構(gòu)域的四價(jià)雙特異性抗體(參見例如Coloma, M. J.,等，自然生物技術(shù)(NatureBiotech.) 15(1997) 159-163 ；W0 2001/077342 和 Morrison，S. L.等，自然生物技術(shù)(NatureBiotech.)25 (2007) 1233-1234)。此外，開發(fā)了能夠結(jié)合兩種以上抗原的若干其他新型形式，其中抗體核心結(jié)構(gòu)(IgA, IgD, IgE, IgG或IgM)不再保持諸如雙抗體(diabodies)、三鏈抗體或四鏈抗體(tetrabodies),微型抗體(minibodies),若干單鏈形式(scFv,雙-scFv) (Holliger P,等，Nature Biotech (自然生物技術(shù))23 (2005) 1126-11362005 ；FischerN.，和 L6ger，O.,病理學(xué)(Pathobiology) 74 (2007) 3-14 ；Shen J,等，免疫學(xué)方法雜志(Journalof Immunological Methods) 318 (2007) 65-74 ；ffu, C.等，自然生物技術(shù)(NatureBiotech)25 (2007) 1290-1297)。所有這樣的形式使用接頭將抗體核心(IgA，IgD, IgE, IgG或IgM)與其他結(jié)合蛋白(例如scFv)融合或融合例如兩個(gè)Fab片段或scFv (Fischer N. , Leger O.,病理學(xué)(Pathobiology) 74 (2007) 3-14)。人們可能一直希望保持效應(yīng)子功能，諸如例如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，它們通過保持與天然存在的抗體的高度相似性而通過Fe受體結(jié)合來介導(dǎo)。在WO 2007/024715中，報(bào)道了雙重可變的結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白作為改造的多價(jià)和多特異性結(jié)合蛋白。在US 6，897，044中報(bào)道了具有生物活性的抗體二聚體的制備方法。在 US 7，129，330中報(bào)道了具有至少四個(gè)彼此通過肽接頭連接的可變結(jié)構(gòu)域的多價(jià)Fv抗體構(gòu)建體。在US 2005/0079170中報(bào)道了二聚體和多聚體抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。在US 6，511，663中報(bào)道了三價(jià)或四價(jià)單特異性抗原結(jié)合蛋白，其包含通過連接結(jié)構(gòu)彼此共價(jià)結(jié)合的三個(gè)或四個(gè)Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報(bào)道了這樣的四價(jià)雙特異性抗體，其可以在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中有效表達(dá)，并且用于治療和診斷方法中。在US2005/0163782中報(bào)道了在包含兩種類型的多肽二聚體的混合物中將通過至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體與不通過至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體分離或優(yōu)先合成通過至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。在US 5，959，083中報(bào)道了雙特異性四價(jià)受體。在WO 2001/077342中報(bào)道了具有三個(gè)或多個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的改造的抗體。在WO 1997/001580中報(bào)道了多特異性和多價(jià)抗原結(jié)合多肽。WO 1992/004053報(bào)道了共軛對(duì)配合物(homoconjugate),其典型地由結(jié)合相同抗原決定簇的IgG類的單克隆抗體制備，通過合成交聯(lián)共價(jià)連接。在WO 1991/06305中報(bào)道了對(duì)于抗原具有高親和力的低聚單克隆抗體，其中分泌典型地是IgG類的低聚物，其具有兩種以上的免疫球蛋白單體，所述免疫球蛋白單體締合在一起形成四價(jià)或六價(jià)IgG分子。在US 6，350，860中報(bào)道了綿羊來源的抗體和改造的抗體構(gòu)建體，其可以用于治療其中干擾素Y活性是致病性的疾病。在US 2005/0100543中，報(bào)道了可靶向的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體是雙特異性抗體的多價(jià)載體，即可靶向的構(gòu)建體的每個(gè)分子可以作為兩種以上雙特異性抗體的載體。在WO 1995/009917中報(bào)道遺傳改造的雙特異性四價(jià)抗體。在WO 2007/109254中，報(bào)道了由穩(wěn)定的scFv組成或包含穩(wěn)定的scFv的穩(wěn)定的結(jié)合分子。自Lu, D.,等，生物化學(xué)和生物物理研究通訊(Biochemical and BiophysicalResearch Communications)318 (2004)507-513 ；生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.),279 (2004) 2856-2865 ;和生物化學(xué)雜志(J. Biol Chem.) 280 (2005) 19665-72 已知針對(duì)EGFR和IGF-IR的雙特異性抗體。然而，當(dāng)與母體單特異性抗體的組合比較，這些雙特異性抗-EGFR/抗-IGF-IR抗體清楚地顯示減少的腫瘤生長抑制(尤其在這兩者，即EGFR和IGF-IR具有相等(高)表達(dá)水平的腫瘤細(xì)胞中)。發(fā)明簡(jiǎn)述
我們目前令人驚奇地發(fā)現(xiàn)新的雙特異性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗體，與母體單特異性抗體的組合比較，其顯示至少類似的腫瘤生長抑制(僅使用減少量的雙特異性抗體)(尤其在這兩者，即EGFR和IGF-IR具有相等(高)表達(dá)水平的腫瘤細(xì)胞中)。
本發(fā)明的第一方面是結(jié)合EGFR和IGF-1R的雙特異性抗體，其包含結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述雙特異性抗體特征在于i)所述抗原結(jié)合位點(diǎn)每個(gè)是一對(duì)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；ii)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO :I的⑶R3區(qū)域，SEQ ID NO :2的CDR2區(qū)域，和SEQ ID NO :3的CDRl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 4 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 區(qū)域；和iii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO : 11的⑶R3區(qū)域，SEQ ID NO 12的CDR2區(qū)域，和SEQ ID NO 13的CDRl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含 SEQ ID NO 14 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 15 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 16 的 CDRl 區(qū)域；或所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 17的⑶R3區(qū)域，SEQ ID NO : 18的⑶R2區(qū)域，和SEQ ID N0:19的⑶Rl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 20 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 21 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 22 的 CDRl 區(qū)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體特征在于i)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQ ID NO :9或SEQ ID NO : 10作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，ii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO 23或SEQ ID NO 24作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQ ID N0:25或SEQ ID NO :26作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體特征在于i)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO :8作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQ IDNO 10作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，ii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO 23作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQID NO :25作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。所述雙特異性抗體至少是二價(jià)的，并且可以是三價(jià)、四價(jià)或多價(jià)的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體是二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)的。本發(fā)明的另一方面是編碼所述雙特異性抗體的鏈的核酸分子。本發(fā)明的另一方面是包含所述雙特異性抗體的藥物組合物，所述組合物用于治療癌癥，所述雙特異性抗體用于制備治療癌癥的藥物的應(yīng)用，通過向需要所述治療的患者施用所述雙特異性抗體來治療患有癌癥的患者的方法。根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體對(duì)于需要EGFR和IGF-IR靶向療法的患者顯示益處。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體具有新的和有創(chuàng)造性的性質(zhì)，從而導(dǎo)致對(duì)于患有所述疾病的患者，尤其是患有癌癥的患者的益處。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是結(jié)合EGFR和IGF-1R的雙特異性抗體，其包含結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述雙特異性抗體特征在于i)所述抗原結(jié)合位點(diǎn)每個(gè)是一對(duì)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；
ii)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO :I的⑶R3區(qū)域，SEQ ID NO :2的CDR2區(qū)域，和SEQ ID NO :3的CDRl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 4 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 區(qū)域；和iii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO : 11的⑶R3區(qū)域，SEQ ID NO 12的CDR2區(qū)域，和SEQ ID NO 13的CDRl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含 SEQ ID NO 14 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 15 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 16 的 CDRl 區(qū)域。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是結(jié)合EGFR和IGF-1R的雙特異性抗體，其包含結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述雙特異性抗體特征在于i)所述抗原結(jié)合位點(diǎn)每個(gè)是一對(duì)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；ii)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO :I的⑶R3區(qū)域，SEQ ID NO :2的CDR2區(qū)域，和SEQ ID NO :3的CDRl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID NO 4 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 區(qū)域；和iii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID N0:17的⑶R3區(qū)域，SEQ ID NO 18的CDR2區(qū)域，和SEQ ID NO 19的CDRl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含 SEQ ID NO 20 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO :21 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 22 的 CDRl 區(qū)域。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是結(jié)合EGFR和IGF-1R的雙特異性抗體，其包含結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述雙特異性抗體特征在于i)所述抗原結(jié)合位點(diǎn)每個(gè)是一對(duì)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；ii)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQ ID NO :9或SEQ ID NO : 10作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域iii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO 23或SEQ ID NO 24作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQ ID N0:25或SEQ ID NO :26作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是結(jié)合EGFR和IGF-1R的雙特異性抗體，其包含結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述雙特異性抗體特征在于i)所述抗原結(jié)合位點(diǎn)每個(gè)是一對(duì)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；ii)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO :7作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQID NO 10作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域iii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO :23作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQID NO :25作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是結(jié)合EGFR和IGF-IR的雙特異性抗體，其包含結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述雙特異性抗體特征在于i)所述抗原結(jié)合位點(diǎn)每個(gè)是一對(duì)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；ii)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO :8作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQID NO 10作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域iii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO :23作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQID NO :25作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是結(jié)合EGFR和IGF-1R的雙特異性抗體，其包含結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述雙特異性抗體特征在于
i)所述抗原結(jié)合位點(diǎn)每個(gè)是一對(duì)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；ii)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO :7作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQID NO 10作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域iii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO :24作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQID NO :26作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是結(jié)合EGFR和IGF-1R的雙特異性抗體，其包含結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述雙特異性抗體特征在于i)所述抗原結(jié)合位點(diǎn)每個(gè)是一對(duì)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；ii)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO :8作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQID NO 10作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域iii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO :24作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQID NO :26作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。用于本文時(shí)，"抗體"指包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合蛋白。術(shù)語“結(jié)合位點(diǎn)”或“抗原結(jié)合位點(diǎn)”用于本文時(shí)，指配體實(shí)際上結(jié)合的抗體分子的區(qū)域。在根據(jù)本發(fā)明所述的抗體中的結(jié)合位點(diǎn)每個(gè)可以由兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的對(duì)形成，即一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的一對(duì)形成。在抗體中的最小結(jié)合位點(diǎn)決定簇是重鏈CDR3區(qū)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)包含抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和/或抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，和優(yōu)選地由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)組成的對(duì)形成?？贵w特異性指抗體對(duì)于抗原的特定表位的選擇性識(shí)別。天然抗體，例如是單特異性的。根據(jù)本發(fā)明所述的“雙特異性抗體”是具有兩種不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。如果抗體具有超過一種特異性，識(shí)別的表位可以與單抗原或一種以上的抗原相關(guān)。本發(fā)明的抗體特異于兩種不同的抗原，即作為第一抗原的EGFR和作為第二抗原的IGF-1R。術(shù)語“單特異性”抗體，用于本文時(shí)指具有一個(gè)或多個(gè)分別結(jié)合于相同抗原的相同表位的結(jié)合位點(diǎn)的抗體。術(shù)語“價(jià)”在本申請(qǐng)中使用時(shí)指結(jié)合位點(diǎn)在抗體分子上存在的具體數(shù)量。象這樣，術(shù)語“二價(jià)”，“四價(jià)”，和“六價(jià)”指在抗體分子上分別存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，和六個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體是至少“二價(jià)的”，并且可以是“三價(jià)”或“多價(jià)”的(例如(“四價(jià)”或六價(jià))的)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體是二價(jià)，三價(jià)或四價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是二價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是三價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是四價(jià)的。本發(fā)明的抗體具有兩個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)，并且是雙特異性的。即，即使是在存在兩個(gè)以上結(jié)合位點(diǎn)(即，抗體是三價(jià)或多價(jià)的)的情形中，所述抗體可以是雙特異性的。本發(fā)明的雙特異性抗體包括，例如多價(jià)單鏈抗體、雙抗體和三鏈抗體，以及具有全長抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的抗體，另外的抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如單鏈Fv、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ab,或(Fab) 2))通過一個(gè)或多個(gè)肽接頭連接所述全長抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。所述抗體可以是來自單一物種的全長抗體，或可以是嵌合化或人源化的。對(duì)于具有超過兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體，一些結(jié)合位點(diǎn)可以是相同的，只要所述蛋白具有對(duì)于兩個(gè)不同抗原的結(jié)合位點(diǎn)。即，當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)合位點(diǎn)特異于EGFR時(shí)，第二結(jié)合位點(diǎn)特異于IGF-1R。象天然抗體一樣，本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)典型地包含六個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)，其在不同程度上有助于結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于抗原的親和性。存在三個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域CDRs (CDRH1，CDRH2 和 CDRH3)和三個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域 CDRs (CDRL1，CDRL2 和 CDRL3)。CDR 和構(gòu)架區(qū)(FRs)的程度通過與氨基酸序列的匯編數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較來確定，所述氨基酸序列中那些區(qū)域根據(jù)序列之間的可變性來確定。此外，還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是包含更少⑶Rs的功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)(即，在結(jié)合特異性由三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)CDRs決定的情形中)。例如，少于6個(gè)⑶Rs的完整組對(duì)于結(jié)合可能是足夠的。在一些情形中，VH或VL結(jié)構(gòu)域是足夠的。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體還包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白種類的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球蛋白種類包括IgG, IgM, IgA, IgD, IgE同種型，并且在IgG和IgA的情形中，包括它們的亞型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有IgG型抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，但是具有四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。這是通過將兩個(gè)特異性結(jié)合EGFR的完整抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如，單鏈Fv)與特異性結(jié)合IGF-IR的完整抗體的N端或C端重鏈或輕鏈進(jìn)行連接來實(shí)現(xiàn)。這四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)選地對(duì)于兩種不同結(jié)合特異性的每種包含兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”用于本文中時(shí)，指單一氨基酸組成的抗體分子制劑。術(shù)語“嵌合抗體”指一種抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)，以及源自不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，其通常通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備。優(yōu)選包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它優(yōu)選形式是這樣的那些，其中恒定區(qū)已經(jīng)被從初始抗體的恒定區(qū)開始進(jìn)行修飾或改變以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fe受體(FcR)結(jié)合。也將這種“嵌合”抗體稱作“類別轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是被表達(dá)的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，該基因包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。制備嵌合抗體的方法包括目前在本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。見，例如，Morrison，S. L.，等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad Sci. USA) 81 (1984) 6851-6855 ；US 5，202，238 和 5，204，244。術(shù)語“人源化抗體”指這樣的抗體，其中的構(gòu)架或“互補(bǔ)性決定區(qū)”(CDR)已經(jīng)被修飾為包括與母體免疫球蛋白相比特異性不同的免疫球蛋白的CDR。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將鼠⑶R移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)以制備“人源化抗體”。見，例如，Riechmann, L.，等，自然(Nature) 332 (1988) 323-327 ;和 Neuberger，Μ· S.，等，自然(Nature) 314 (1985) 268-270。特別優(yōu)選的CDRs對(duì)應(yīng)于識(shí)別以上指出的關(guān)于嵌合抗體的抗原的那些代表性序列。本發(fā)明涵蓋的“人源化抗體”的其它形式是這樣的那些，其中恒定區(qū)已經(jīng)另外被從初始抗體的恒定區(qū)開始進(jìn)行修飾或改變以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fe受體(FcR) 彡口口
用于本文時(shí)，術(shù)語“人抗體”意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(van Dijk, Μ. A.,和van de ffinkel, J. G.,當(dāng)前化學(xué)生物學(xué)觀點(diǎn)(Curr. Opin. Chem. Biol). 5 (2001) 368-374)。人抗體還可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在免疫時(shí)能夠在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的條件下產(chǎn)生人抗體的全部所有組成成分或選擇部分(selection)。在所述種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白基因陣列將導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體(見，例如Jakobovits，A.，等·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))90 (1993) 2551-2555 Jakobovits,A.,等·，Nature (自然)362(1993)255-258 ；Bruggemann, Μ·,等·，Year Tmmunol.(免疫學(xué)年度)7(1993) 33-40)。人抗體還可以在噬菌體展示文庫中產(chǎn)生(Hoogenboom，H. R.，和Winter, G.，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等.，J. Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)222 (1991) 581-597)。Cole，等和Boerner等的技術(shù)也可以用于制備人單克隆抗體(Cole, S. P. C.,等·，Monoclonal antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌癥治療)，Alan R. Liss, (1985)77-96 ;和 Boerner, P.,等·，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)147(1991)86-95)。如已經(jīng)對(duì)按照本發(fā)明的嵌合和人源化抗體所提及地，術(shù)語“人抗體”用于本文中時(shí)還包括這樣的抗體，其在恒定區(qū)內(nèi)進(jìn)行修飾以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性， 特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié)合，例如通過“類別轉(zhuǎn)換”即改變或突變Fe部分(例如由 IgGl 到 IgG4 和 / 或 IgGl/IgG4 突變。)用于本文時(shí)，術(shù)語“重組人抗體”意欲包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，諸如分離自宿主細(xì)胞，諸如NSO或CHO細(xì)胞的抗體或分離自人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)的抗體，或利用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。這種重組人抗體具有處于重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。按照本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)經(jīng)歷了體內(nèi)體細(xì)胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列是盡管源自并涉及人種系VH和VL序列，但在體內(nèi)可能不天然存在于人抗體種系所有組成成分中的序列。“可變結(jié)構(gòu)域”(輕鏈(VL)的可變結(jié)構(gòu)域，重鏈(VH)的可變區(qū))用于本文中時(shí)，表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對(duì)輕鏈和重鏈對(duì)?？勺?nèi)溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，所述構(gòu)架區(qū)的序列普遍保守，其通過3個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)性決定區(qū)，⑶Rs)相連接。構(gòu)架區(qū)采用β-折疊構(gòu)象且⑶R可以形成連接β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過構(gòu)架區(qū)以其三維結(jié)構(gòu)保持并與來自另一條鏈的CDR —起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和性方面發(fā)揮特別重要的作用并因此提供本發(fā)明的另一個(gè)目的。用于本文時(shí)，術(shù)語“高變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分”指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來自“互補(bǔ)性決定區(qū)”或“⑶Rs”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR”區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FRl，CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各條鏈上的CDR通過所述構(gòu)架氨基酸分開。特別地，重鏈的⑶R3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。按照Kabat等，免疫目的的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公眾健康服務(wù)，國家健康研究所(Public Health Service,National Institutes of Health),Bethesda, MD. (1991))的標(biāo)準(zhǔn)定義確定CDR和FR區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體還包括具有“保守序列修飾”的這些抗體(這是指雙特異性抗體的“變體”)。這意味著不影響或改變根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的上述特征的核苷酸和氨基酸序列修飾。可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)弓I入修飾，如位點(diǎn)定向誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。保守氨基酸置換包括其中氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代的置換。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β支鏈側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在雙特異性〈EGFR-IGF1R 〉抗體中的預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基可以優(yōu)選地被來自相同側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基置換。因此，“變體”雙特異性〈EGFR-IGF1R〉抗體在本文是指這樣的分子，其氨基酸序列與“母體”雙特異性〈EGFR-IGF1R〉抗體氨基酸序列的不同之處在于在母體抗體的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)或恒定區(qū)中至多10個(gè)，優(yōu)選約2個(gè)到約5個(gè)添加、缺失和/或置換。氨基酸置換可以通過基于分子建模的誘變進(jìn)行，如在Riechmann,L.,等，自然(Nature) 332 (1988) 323-327 和 Queen, C.，等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci.USA) 86 (1989) 10029-10033 中所述。在本文將關(guān)于所述序列的同一性或同源性定義為在比對(duì)序列和引入間隙(如果需要)以獲得最大的百分比序列同一性后，在候選序列中與母體序列相同的氨基酸殘基的百分比。N端、C端或內(nèi)部延伸、缺失或插入抗體序列都不應(yīng)該被認(rèn)為影響序列同一性或同源性。變體保留結(jié)合人EGFR和人IGF-IR的能力。用于本文時(shí)，術(shù)語“結(jié)合”或“特異性結(jié)合”指在體外測(cè)定法中，優(yōu)選地在用表達(dá)野生型抗原的CHO細(xì)胞進(jìn)行的基于細(xì)胞的ELISA中，抗體與抗原的表位的結(jié)合。結(jié)合意為10_8M以下，優(yōu)選地10_13M到10_9M的結(jié)合親和性(Kd)?？贵w與抗原或Fe y RIII的結(jié)合可以通過 BIAcore 測(cè)定法(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)進(jìn)行研究。結(jié)合的親和性由術(shù)語ka(來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的締合的速率常數(shù))，kD (解離常數(shù))和Kd (kD/ka)定義。術(shù)語“表位”包括能夠特異性結(jié)合抗體的任何多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面分組(groupings),諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷酰基或磺?；?，在某些實(shí)施方案中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和或特定的帶電特性。表位是被抗體結(jié)合的抗原區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)抗體在蛋白和/或大分子的復(fù)雜混合物中優(yōu)選識(shí)別其靶抗原時(shí)，將該抗體稱為與抗原特異性結(jié)合。人表皮生長因子受體(也已知為HER-I或Erb-Bl，并且在本文中稱作"EGFR")是170kDa的跨膜受體，其由c-erbB原癌基因編碼，并且顯示固有的酪氨酸激酶活性(Modjtahedi, H·，等，英國癌癥雜志(Br. J. Cancer) 73 (1996) :228-235 ;Herbst，R. S.和Shin, D.M.，癌癥(Cancer)94(2002) :1593-1611) SwissProt 數(shù)據(jù)庫登錄號(hào) P00533 提供了 EGFR的序列。還存在EGFR的同種型和變體(例如，可變RNA轉(zhuǎn)錄物，截短形式，多態(tài)性等)，包括但不限于 Swissprot 數(shù)據(jù)庫登錄號(hào) P00533-1，P00533-2, P00533-3，和 P00533-4確定的那些。已知EGFR結(jié)合包括以下各項(xiàng)的配體α)，表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-α (TGf-α)，雙調(diào)蛋白，肝素結(jié)合EGF(hb-EGF)，β動(dòng)物纖維素，和印iregulin(Herbst，R. S.和 Shin，D.M.，癌癥(Cancer)94(2002) 1593-1611 ；Mendelsohn, J.,和 Baselga，J.，原癌基因(Oncogene) 19 (2000) 6550-6565)。EGFR經(jīng)由酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過程，包括但不限于激活控制細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞存活、程序性細(xì)胞死亡、血管發(fā)生、有絲分裂發(fā)生和轉(zhuǎn)移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Atalay, G.,等，Ann. Oncology14(2003) 1346-1363 ；Tsao,A. S.和 Herbst,R. S.信號(hào)(Signal) 4 (2003) 4-9 ；Herbst,R. S.,和 Shin, D.M.，癌癥(Cancer)94(2002) 1593-1611 ；Modjtahedi, H.，等，英國癌癥雜志(Br.J. Cancer)73(1996)228-235)。胰島素樣生長因子I受體(IGF-IR，⑶221抗原)屬于跨膜蛋白酪氨酸激酶家族)(LeRoith, D.，等，內(nèi)分泌學(xué)綜述(Endocrin. Rev.) 16 (1995) 143-163 ;和 Adams, Τ. E.，等,細(xì)胞分子生命科學(xué)(Cell. Mol. Life Sci.) 57 (2000) 1050-1093)。SwissProt 數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)P08069提供IGF-IR的序列。IGF-IR以高親和性結(jié)合IGF-I并在體內(nèi)起始針對(duì)這種配體的生理反應(yīng)。IGF-IR還與IGF-II結(jié)合，但是以稍微更低的親和性結(jié)合。IGF-IR的過量表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的致瘤性轉(zhuǎn)化，并且存在這樣的證據(jù)，即IGF-IR涉及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化并且因此成為有用的靶標(biāo)用于開發(fā)治療癌癥的治療劑(Adams，T.E.，等，細(xì)胞分子生命科學(xué)(Cell. Mol.Life Sci. )57(2000) 1050-1093)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體包含全長母體抗體作為支架。術(shù)語“全長抗體”指由兩條“全長抗體重鏈”和兩條“全長抗體輕鏈”組成的抗體(見

圖10，不具有CH4結(jié)構(gòu)域的“全長抗體”的示意性結(jié)構(gòu)。還見圖I和12中，具有單鏈Fv連接物(XGFR)和具有單鏈Fab連接物(scFab-XGFR)的四價(jià)雙特異性形式的全長部分)?！叭L抗體重鏈”是這樣的多肽，其在N端到C端方向由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)、抗體恒定重鏈結(jié)構(gòu)域I (CHl)，抗體鉸鏈區(qū)(HR)，抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)，和抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3(CH3)組成，縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3 ;并且在IgE亞類的抗體的情形中，任選地還包括抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域4 (CH4)。優(yōu)選地，“全長抗體重鏈”是在N端到C端方向由VH，CHl，HR, CH2和CH3組成的多肽?！叭L抗體輕鏈”是在N端到C端方向由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)組成的多肽，縮寫為VL-CL。所述抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)可以是K (kappa)或λ (lambda)。兩條全長抗體鏈通過在CL結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間的多肽間二硫鍵和全長抗體重鏈的鉸鏈區(qū)之間的多肽間二硫鍵連接在一起。典型的全長抗體的實(shí)例是天然抗體如IgG(例如，IgG I和IgG2)，IgM, IgA, IgD，和IgE0根據(jù)本發(fā)明所述的全長抗體可以來自單一物種，例如人，或它們可以是嵌合的或人源化的抗體。根據(jù)本發(fā)明所述的全長抗體包含分別由VH和VL對(duì)形成的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，這兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)都特異性結(jié)合于相同的抗原。因此，包含第一抗原結(jié)合位點(diǎn)并且由兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈組成的單特異性二價(jià)(=全長)抗體是全長抗體。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C端指在所述重鏈或輕鏈的C端的最后的氨基酸。所述全長抗體的重鏈或輕鏈的N端指在所述重鏈或輕鏈的N端的最后的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是二價(jià)的-使用如例如a)在WO2009/080251, WO 2009/080252 或 WO 2009/080253 (結(jié)構(gòu)域交換的抗體-見實(shí)施例 14)中所述的形式或基于scFab-Fc融合抗體的形式，其中一個(gè)單鏈Fab片段特異于EGFR，而另一個(gè)單鏈Fab片段特異于IGF-IR(見實(shí)施例17)或c)在EP申請(qǐng)?zhí)?7024867. 9 (W02009/080251)，Ridgway, J.B.，Protein Eng. 9 (1996)617-621 ；W0 96/027011 !MerchantA. Μ,等,自然生物技術(shù)(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681 ；Atwell, S.,等，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol. )270(1997) 26-35和EP 1870459A1中所述的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體特征在于包含SEQ ID NO 30,SEQ ID NO 31,SEQ ID NO :32和SEQID NO :33的氨基酸序列或其變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體特征在于包含 SEQ ID NO 34, SEQ ID NO :35，SEQ ID NO 36 和 SEQ ID NO 37 的氨基酸序列或其變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體特征在于包含SEQ ID NO :38 JPSEQID NO :39的氨基酸序列或其變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體特征在于包含SEQ ID NO :38 JPSEQ ID NO :39的氨基酸序列或其變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體特征在于包含SEQ ID NO :40 JPSEQ ID NO :41的氨基酸序列或其變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體特征在于包含SEQ ID NO :42 JPSEQID NO :43的氨基酸序列或其變體。這些氨基酸序列基于作為結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)的SEQ ID NO :8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO : 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(來自人源化的<EGFR>ICR62)，并且基于作為結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的SEQ ID NO 23的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO :25的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(來自人抗-IGF-IR抗體<IGF-1R>HUMAB克隆 18 (DSMACC 2587))。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是三價(jià)的，使用例如基于特異性結(jié)合兩種受體EGFR或IGF-IR之一的全長抗體的形式，僅在一條重鏈的一個(gè)C端scFab片段融合在所述全長抗體上，所述scFab片段特異性結(jié)合于兩種受體EGFR或IGF-IR的另一種上，包括凸起-進(jìn)入-孔洞技術(shù)(knobs-into holes technology)，如在EP申請(qǐng)?zhí)?9004909. 9中所述，或例如基于特異性結(jié)合兩種受體EGFR或IGF-IR之一的全長抗體的形式，在一條重鏈的一個(gè)C端，所述全長抗體融合VH或VH-CHl片段，并且在第二重鏈的另一個(gè)C端融合VL或VL-CL片段，所述VL或VL-CL片段特異性結(jié)合兩種受體EGFR或IGF-IR的另一種，包括凸起-進(jìn)入-孔洞技術(shù)，如在EP申請(qǐng)?zhí)?9005108. 7中所述。對(duì)于凸起-進(jìn)入-孔洞技術(shù)及其變化還見 Ridgway，J. B.，Protein Eng. 9 (1996) 617-621 ；W0 96/027011, MerchantA.M.等，自然生物技術(shù)(Nature Biotech) 16 (1998) 677-681 ；AtwelI, S.,等，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 270 (1997) 26-35 ;和EP1870459A1。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性三價(jià)抗體特征在于包含SEQ ID NO 44, SEQ ID NO :45和SEQ ID NO :46的氨基酸序列或其變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性三價(jià)抗體特征在于包含SEQ ID NO:47，SEQ ID NO :48 JPSEQ ID NO :49的氨基酸序列或其變體。這些氨基酸序列基于作為結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)的SEQ ID NO :8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID N0:10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(來自人源化的<EGFR>ICR62)，并且基于作為結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的SEQ ID NO :23的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO :25的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(來自人抗-IGF-IR抗體 <IGF-1R>HUMAB 克隆 18 (DSM ACC2587))。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是四價(jià)的，使用如例如在WO 2007/024715,或TO 2007/109254或EP申請(qǐng)?zhí)?9004909. 9中所述的形式(結(jié)合第一抗原的全長抗體，結(jié)合其它抗原的兩種scFab片段融合在所述全長抗體上)(見，例如實(shí)施例I或9)在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是四價(jià)的，并且由下列各項(xiàng)組成a)單特異性二價(jià)抗體，其包含所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)并且由每條鏈僅包含一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈組成，
b)兩個(gè)肽接頭,和c)包含所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的兩種單價(jià)單特異性單鏈抗體(單特異性單價(jià)單鏈Fv)，其分別由輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，重鏈可變結(jié)構(gòu)域和在所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的單鏈接頭組成；
其中所述單鏈抗體(所述單鏈Fv)連接于單特異性二價(jià)抗體輕鏈或抗體重鏈的相同末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是四價(jià)的，并且由下列各項(xiàng)組成a)單特異性二價(jià)抗體，其包含所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)并且由每條鏈僅包含一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈組成，b)兩個(gè)肽接頭,和c)包含所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)的兩種單價(jià)單特異性單鏈抗體(單特異性單價(jià)單鏈Fv)，其分別由輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，重鏈可變結(jié)構(gòu)域和在所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的單鏈接頭組成；其中所述單鏈抗體(所述單鏈Fv)連接于單特異性二價(jià)抗體輕鏈或抗體重鏈的相同末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是四價(jià)的，并且由下列各項(xiàng)組成a)全長抗體，其包含所述抗原結(jié)合位點(diǎn)并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成；和b)包含所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段，其中在b)下的所述單鏈Fab片段通過在所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C端或N端的肽連接體融合于在a)下的所述全長抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體是四價(jià)的，并且由下列各項(xiàng)組成a)全長抗體，其包含所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成；和b)包含所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段，其中在b)下的所述單鏈Fab片段通過在所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C端或N端的肽連接體融合于在a)下的所述全長抗體。優(yōu)選地，在b)下的所述單鏈Fab片段通過在所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C端的肽連接體融合于所述全長抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過在所述全長抗體的每個(gè)重鏈或輕鏈的C端的肽連接體融合于所述全長抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過在所述全長抗體的每個(gè)重鏈的C端的肽連接體融合于所述全長抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過在所述全長抗體的每個(gè)輕鏈的C端的肽連接體融合于所述全長抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述四價(jià)雙特異性抗體具有下列特征_其由下列各項(xiàng)組成a)由兩條全長抗體重鏈和兩條全長抗體輕鏈組成的單特異性二價(jià)母體(全長)抗體，其中每條鏈僅包含一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，
b)兩個(gè)肽接頭，c)兩種單特異性單價(jià)單鏈抗體(單特異性單價(jià)單鏈Fv),每種由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域，抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和在所述抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和所述抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的單鏈接頭組成；和優(yōu)選地,所述單鏈抗體(所述單鏈Fv)連接于單特異性二價(jià)抗體重鏈的相同末端(C端和N端)，或備選地連接于單特異性二價(jià)抗體輕鏈的相同末端(優(yōu)選地C端)，和更優(yōu)選地連接于單特異性二價(jià)抗體重鏈的相同末端(C端和N端)。術(shù)語“肽接頭”用于本發(fā)明時(shí)指具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選地是合成來源的。這些根據(jù)本發(fā)明所述的肽接頭用于連接不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)和/或最終包含不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段(例如單鏈Fv，全長抗體，VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ab, (Fab) 2，F(xiàn)e部分)從而在一起形成根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體。所述肽接頭可以包含下列在表I中列出的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)以及另外任意選擇的氨基酸。所述肽接頭是具有至少5個(gè)氨基酸長度，優(yōu)選地至少10個(gè)氨基酸長度，更優(yōu)選地10-50個(gè)氨基酸長度的氨基酸 序列的肽。優(yōu)選地，在b)下的所述肽接頭是具有至少10個(gè)氨基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽接頭是(GxS)η,其中G =甘氨酸，S =絲氨酸，(X = 3和η = 3,4,5或6)或(X = 4和η = 2, 3,4或5),優(yōu)選地χ = 4和η = 2或3,更優(yōu)選地x = 4,η =2 ((G4S) 2)。還可以將另外的G =甘氨酸，例如GG，或GGG加入所述(GxS) η肽接頭。術(shù)語“單鏈接頭”用于本發(fā)明時(shí)指具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選地是合成起源的。這些根據(jù)本發(fā)明所述的單鏈接頭用于連接VH和VL結(jié)構(gòu)域從而形成單鏈Fv。優(yōu)選地，在c)下的所述單鏈接頭是具有至少15個(gè)氨基酸長度，更優(yōu)選地具有至少20個(gè)氨基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單鏈接頭是(GxS)n,其中G =甘氨酸,S =絲氨酸，(X = 3和η = 4, 5或6)或(χ = 4和η = 3,4或5),優(yōu)選地χ = 4,η = 4或5,更優(yōu)選地χ=4，η = 4。此外，所述單鏈(單鏈Fv)抗體優(yōu)選地是二硫化物穩(wěn)定的。這樣的單鏈抗體的進(jìn)一步的二硫化物穩(wěn)定通過在單鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域之間引入二硫鍵實(shí)現(xiàn)，并且例如在WO94/029350，Rajagopal，V.，等，Prot. Engin. 10(12) (1997) 1453-59 ；Kobayashi, H.，等，核酸藥物和生物學(xué)(Nuclear Medicine & Biology) 25 (1998) 387-393 ;或 Schmidt, Μ·，等,原癌基因(Oncogene) 18(1999) 1711-1721 中進(jìn)行描述。在二硫化物穩(wěn)定的單鏈(單鏈Fv)抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，包含在根據(jù)本發(fā)明所述的抗體中的單鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵獨(dú)立于每種單鏈抗體選自i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100，ii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43，或iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置101到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在根據(jù)本發(fā)明所述的抗體中的單鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在根據(jù)本發(fā)明所述的抗體中的單鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選在單鏈抗體(單鏈Fv)的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間不存在所述任選的二硫化物穩(wěn)定的所述單鏈(單鏈Fv)抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體特征在于-兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)分別由單特異性二價(jià)母體抗體的兩對(duì)重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域形成，并且都結(jié)合于相同的表位，-另外的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)分別由一個(gè)單鏈抗體的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域形成，-所述單鏈抗體分別通過肽接頭連接于一條重鏈或一條輕鏈，其中每個(gè)抗體鏈末端僅連接于單鏈抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述四價(jià)雙特異性抗體特征在于在a)下的所述單特異性二價(jià)(全長)抗體部分結(jié)合EGFR并且在c)下的所述兩種單價(jià)單特異性單鏈抗體結(jié)合IGF-IR0在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述四價(jià)雙特異性抗體特征在于在a)下的所述單特異性二價(jià)(全長)抗體部分結(jié)合IGF-IR并且在c)下的所述兩種單價(jià)單特異性單鏈抗體結(jié)合 EGFR。結(jié)合EGFR和IGF-IR的根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體的該第一四價(jià)實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)，其中抗原A或B之一是EGFR，而另一個(gè)是IGF-1R。所述結(jié)構(gòu)基于結(jié)合抗原A的全長抗體，結(jié)合抗原B的兩條(任選地二硫化物穩(wěn)定的)單鏈Fv’s通過肽接頭連接于所述全長抗體，所述結(jié)構(gòu)在圖I和圖2的示意圖中例示。在第二個(gè)四價(jià)實(shí)施方案中，所述四價(jià)、雙特異性抗體包含a)特異性結(jié)合于所述第一抗原(兩種抗原EGFR或IGF-IR之一)并且由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的全長抗體；和b)特異性結(jié)合于所述第二抗原(兩種抗原EGFR或IGF-IR的另一種)的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段，其中在b)下的所述單鏈Fab片段通過在所述全長抗體的重鏈或輕鏈的C端或N端的肽連接體融合于在a)下的所述全長抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過在所述全長抗體的每條重鏈或輕鏈的C端的肽連接體融合于所述全長抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過在所述全長抗體的每條重鏈的C端的肽連接體融合于所述全長抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合第二抗原的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過在所述全長抗體的每條輕鏈的C端的肽連接體融合于所述全長抗體?！皢捂淔ab片段”(見圖11)是由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，抗體恒定結(jié)構(gòu)域I (CHl)，抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和接頭組成的多肽，其中所述抗體結(jié)構(gòu)域和所述接頭從N端到C端方向具有下列順序之一 a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b)VL-CL-接頭-VH-CHl，c) VH-CL-接頭-VL-CHl或d) VL-CHl-接頭-VH-CL ;和其中所述接頭是至少30個(gè)氨基酸的多肽，優(yōu)選地32-50個(gè)氨基酸的多肽。所述單鏈Fab片段a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CH1，c) VH-CL-接頭-VL-CH1 和 d) VL-CHl-接頭-VH-CL，通過在CL結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間的天然二硫鍵穩(wěn)定。術(shù)語“N-端”指N端的最后氨基酸。術(shù)語“C-端”指C端的最后的氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述單鏈Fab片段中的所述抗體結(jié)構(gòu)域和所述接頭具有從N端到C端方向的下列順序之一
a) VH-CHl-接頭-VL-CL，或 b)VL_CL_ 接頭-VH-CH1，更優(yōu)選地 VL-CL-接頭-VH-CHl。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述單鏈Fab片段中的所述抗體結(jié)構(gòu)域和所述接頭具有從N端到C端方向的下列順序之一a) VH-CL-接頭-VL-CH1 或 b) VL-CHl-接頭-VH-CL。術(shù)語“肽連接體”用于本發(fā)明時(shí)指具有氨基酸序列的肽，所述肽優(yōu)選地是合成來源的。將根據(jù)本發(fā)明所述的這些肽連接體用于將單鏈Fab片段與全長抗體的C端或N端融合從而形成根據(jù)本發(fā)明所述的多特異性抗體。優(yōu)選地，在b)下的所述肽連接體是具有至少5個(gè)氨基酸長度的氨基酸序列的肽，優(yōu)選地具有5-100個(gè)氨基酸長度的氨基酸序列的肽，更優(yōu)選地具有10-50個(gè)氨基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽連接體是(GxS)n或(GxS)nGm,其中G =甘氨酸，S =絲氨酸,和(叉=3,11 = 3,4,5或6,和111 = 0,1,2或3)或(x = 4,n = 2,3,4 或 5和m = 0,1,2或3),優(yōu)選地x = 4和n = 2或3,更優(yōu)選地x = 4, η = 2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽連接體是(G4S)215術(shù)語“接頭”用于本發(fā)明時(shí)指具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選地是合成來源的。將根據(jù)本發(fā)明所述的這些肽用于連接a) VH-CHl與VL-CL，b) VL-CL與VH-CH1，c) VH-CL與VL-CHl或d) VL-CHl與VH-CL從而形成下列根據(jù)本發(fā)明所述的單鏈Fab片段a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CH1，c) VH-CL-接頭-VL-CH1 或 d) VL-CHl-接頭-VH-CL。在所述單鏈Fab片段中的所述接頭是具有至少30個(gè)氨基酸長度的氨基酸序列，優(yōu)選地具有32-50個(gè)氨基酸長度的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭是(GxS) n，其中G=甘氨酸，S =絲氨酸，(叉=3,11 = 8,9或10和111 = 0,1,2或3)或(x = 4 和 n = 6,7 或 8 和 m=0,1,2或3),優(yōu)選地其中叉=4,11 = 6或7和111 = 0,1,2或3,更優(yōu)選地χ = 4,η = 7和m= 2。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述接頭是(G4S)6G2。任選地在所述單鏈Fab片段中，除了在CL-結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間的天然二硫鍵之外，還通過在下列位置之間引入二硫鍵來對(duì)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)進(jìn)行二硫化物穩(wěn)定i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100，ii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43，或iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置101到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100 (總是根據(jù)Kabat的EU索引進(jìn)行編號(hào))。單鏈Fab片段的這些另外的二硫化物穩(wěn)定通過在單鏈Fab片段的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間引入二硫鍵來實(shí)現(xiàn)。引入非天然的二硫化物橋來穩(wěn)定單鏈Fv的技術(shù)例如描述在WO 94/029350, Rajagopal, V.,等,Prot. Engin. (1997) 1453-59 ；Kobayashi, H.,等；核藥物和生物學(xué)(Nuclear Medicine & Biology),卷 25, (1998) 387-393 ;或 Schmidt, Μ·,等，原癌基因(Oncogene) (1999) 18，1711-1721中。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在根據(jù)本發(fā)明所述的抗體中的單鏈Fab片段的可變結(jié)構(gòu)域之間的任選的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置44和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置100之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在根據(jù)本發(fā)明所述的抗體中的單鏈 Fab片段的可變結(jié)構(gòu)域之間的任選的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域位置105和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域位置43之間(總是根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選在單鏈Fab片段的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間不具有所述任選的二硫化物穩(wěn)定的單鏈Fab片段。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的四價(jià)雙特異性抗體的所述第二實(shí)施方案包含兩個(gè)相同的單鏈Fab片段(優(yōu)選地VL-CL-接頭-VH-CH1)，所述單鏈Fab片段都融合于在a)下的所述全長抗體的兩條重鏈的兩個(gè)C端或融合于在a)下的所述全長抗體的兩條輕鏈的兩個(gè)C端。這樣的融合導(dǎo)致形成兩個(gè)相同的融合肽((i)重鏈和單鏈Fab片段或ii)輕鏈和單鏈Fab片段))，所述融合肽與i)全長抗體的輕鏈或重鏈共同表達(dá)從而提供根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體(見圖12，13和14)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述四價(jià)雙特異性抗體特征在于在a)下的所述全長抗體部分結(jié)合于EGFR并且在b)下的所述兩個(gè)單鏈Fab片段結(jié)合于IGF-1R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述四價(jià)雙特異性抗體特征在于在a)下的所述全長抗體部分結(jié)合于IGF-IR并且在b)下的所述兩個(gè)單鏈Fab片段結(jié)合于EGFR。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體特征在于所述恒定區(qū)是人來源的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體特征在于根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體的恒定區(qū)是人IgGl亞類的，或是具有突變L234A和L235A的人IgGl亞類的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體特征在于根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體的恒定區(qū)是人IgG2亞類的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體特征在于根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體的恒定區(qū)是人IgG3亞類的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體特征在于根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體的恒定區(qū)是人IgG4亞類的，或具有另外的突變S228P的IgG4亞類的。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體具有改善的特征。與僅應(yīng)用一個(gè)個(gè)體抗體或兩個(gè)個(gè)體抗體的組合比較，或與Lu，D.，等，生物化學(xué)和生物物理研究通訊(Biochemical and Biophysical Research Communications)318(2004)507-513 ;生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.)，279 (2004) 2856-2865 ;和生物化學(xué)雜志(J. BiolChem.) 280 (2005) 19665-72的雙特異性抗體比較，它們顯示至少相同或增加的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性/功效。與Lu, D.,等，生物化學(xué)和生物物理研究通訊(Biochemical andBiophysical Research Communications) 318 (2004) 507-513 ;生物化學(xué)雜志(J. Biol.Chem.), 279 (2004) 2856-2865 ;和生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 280 (2005) 19665-72 的雙特異性抗體比較，它們顯示提高的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。另外，與僅應(yīng)用一種個(gè)體抗體或兩種個(gè)體抗體的組合比較，根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體顯示調(diào)節(jié)的受體下調(diào)/內(nèi)在化。此外，根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體可以提供益處如減少的劑量和/或施用頻率和伴隨的費(fèi)用節(jié)省。術(shù)語“恒定區(qū)”用于本申請(qǐng)時(shí)指除了可變區(qū)之外的抗體的結(jié)構(gòu)域的總合。恒定區(qū)不直接涉及抗原的結(jié)合，但是顯示不同的效應(yīng)子功能。取決于它們重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體被分為下述類別IgA, IgD, IgE, IgG和IgM,并且這些中的一些可以被進(jìn)一步分為類別如IgGl，IgG2，IgG3，和IgG4，IgAl和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同種類的抗體的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α、δ、ε、Y和μ。可以在所有5種抗體種類中發(fā)現(xiàn)的輕鏈恒定區(qū)被稱為K (kappa)和 λ (lambda)。
術(shù)語“來自人來源的恒定區(qū)”在本申請(qǐng)中使用時(shí)，指亞類IgGl，IgG2，IgG3，或IgG4的人抗體的恒定重鏈區(qū)和/或恒定輕鏈K或λ區(qū)域。這樣的恒定區(qū)是現(xiàn)有技術(shù)中公知的并且例如由Kabat, Ε. Α.,描述(見，例如Johnson, G.和Wu, Τ. T.，核酸研究(NucleicAcids Res. )28(2000)214-218 ；Kabat, E. A.，等·，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad.Sci. USA) 72 (1975) 2785-2788)。當(dāng)IgG4亞類的抗體顯示減少的Fe受體(Fe y RIIIa)結(jié)合時(shí)，其它IgG亞類的抗體顯示強(qiáng)烈的結(jié)合。然而，Pro238，Asp265，Asp270，Asn297(失去Fe糖)，Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311,Asn434,和His435是這樣的殘基，其如果改變的話，還提供減少的Fe受體結(jié)合(Shields，R. , L.，等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 276 (2001) 6591-6604 ；Lund, J.，等，F(xiàn)ASEBJ. 9(1995) 115-119 ；Morgan, A.，等，免疫學(xué)(Immunology) 86 (1995) 319-324 ；EP 0307434)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體與IgGl抗體比較具有減少的FcR結(jié)合，并且所述單特異性二價(jià)(全長)母體抗體涉及IgG4亞類的FcR結(jié)合或具有突變S228，L234，L235和/或D265的IgGl或IgG2亞類的FcR結(jié)合，和/或包含PVA236突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，在單特異性二價(jià)(全長)母體抗體中的突變是S228P，L234A，L235A，L235E和/或PVA236。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在單特異性二價(jià)(全長)母體抗體中的突變?cè)贗gG4中是S228P，在IgGl中是L234A和L235A。恒定重鏈區(qū)在SEQ ID NO :27和28中顯示。在一個(gè)實(shí)施方案中， 單特異性二價(jià)(全長)母體抗體的恒定重鏈區(qū)是具有突變L234A和L235A的SEQ ID NO 27的恒定重鏈區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單特異性二價(jià)(全長)母體抗體的恒定重鏈區(qū)是具有突變S228P的SEQ ID NO :28的恒定重鏈區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單特異性二價(jià)(全長)母體抗體的恒定輕鏈區(qū)是SEQ ID N029的恒定輕鏈區(qū)?？贵w的恒定區(qū)直接涉及ADCC(抗體依賴性細(xì)胞毒作用)和CDC(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性)。補(bǔ)體激活(CDC)由補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的恒定區(qū)結(jié)合而起始。Clq與抗體的結(jié)合由在所謂的結(jié)合位點(diǎn)的定義的蛋白-蛋白相互作用所導(dǎo)致。這樣的恒定區(qū)結(jié)合位點(diǎn)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，并且例如由Lukas，T. J.，等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 127 (1981) 2555-2560 ；Brunhouse, R.，和 Cebra, J. J.，分子免疫學(xué)(Mol. Immunol.) 16(1979)907-917 ；Burton, D. R.,等，自然(Nature)288(1980)338-344 ；Thommesen, J. E.，等，分子免疫學(xué)(Mol. Immunol.) 37 (2000) 995-1004 ;Idusogie, Ε. E.，等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 164 (2000) 4178-4184 ；Hezareh, Μ.，等，病毒學(xué)雜志(J. Virol. )75(2001) 12161-12168 ；Morgan,A.，等，免疫學(xué)(Immunology) 86 (1995) 319-324 ；和EP 0307434所描述。所述恒定區(qū)結(jié)合位點(diǎn)例如特征在于氨基酸L234，L235，D270，N297，E318, K320, K322, P331，和 P329 (根據(jù) Kabat 的 EU 索引編號(hào))。術(shù)語“抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC) ”指在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，由根據(jù)本發(fā)明的抗體裂解人靶細(xì)胞。ADCC優(yōu)選地通過用根據(jù)本發(fā)明的抗體在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)處理表達(dá)IGF-IR和EGFR的細(xì)胞的制備物進(jìn)行測(cè)量，所述效應(yīng)細(xì)胞如新鮮分離的PBMC或來自暗黃覆蓋層的純化的效應(yīng)細(xì)胞，如單核細(xì)胞或天然殺傷(NK)細(xì)胞或永久生長的NK細(xì)胞系。術(shù)語“補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(⑶C)”指由補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的Fe部分結(jié)合而起始的過程。Clq與抗體的結(jié)合由在所述結(jié)合位點(diǎn)的限定的蛋白-蛋白相互作用所導(dǎo)致。這些Fe部分結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)已知的(見上)。這些Fe部分結(jié)合位點(diǎn)例如特征在于氨基酸 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331，和 P329 (根據(jù) Kabat 的EU索引編號(hào))。亞類IgGl，IgG2，和IgG3的抗體通常顯示包括Clq和C3結(jié)合的補(bǔ)體激活，而IgG4不激活補(bǔ)體系統(tǒng)并且不結(jié)合Clq和/或C3。單克隆抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能可以通過改造它們的寡糖成分而得以增強(qiáng)，如在 Umana, P.，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol.) 17 (1999) 176-180,和US 6，602，684中所述。IgGl型抗體是最常用的治療性抗體，其是在每個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297具有保守的N-連接的糖基化位點(diǎn)的糖蛋白。與Asn297附著的兩個(gè)復(fù)合雙觸角寡糖隱藏在CH2結(jié)構(gòu)域之間，形成了與多肽主鏈的廣泛接觸，并且它們的存在對(duì)于抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能諸如抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)是必要的(Lifely, M. R.,等，糖生物學(xué)(Glycobiolo gy) 5 (1995) :813-822 ; Jefferis, R.,等，免疫學(xué)綜述(Tmmunol Rev). 163(1998) :59-76 ；Wright, A.和 Morrison, S. L.，生物技術(shù)趨勢(shì)(Trends Biotechnol.) 15 (1997) :26-32)。Umana, P.，等自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol. ) 17(1999) 176-180 和 WO 99/54342 顯示，β (I,4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶111( “GnTIII”)，一種催化分叉(bisected)寡糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶，在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中的過量表達(dá)，顯著增加了抗體的體外ADCC活性。在Asn297糖的組成上的改變或其消除也影響Fe Y R和Clq的結(jié)合(Umana，P.,等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol. ) 17 (1999) 176-180 ；Davies, J.,等，生物技術(shù)生物工程(Biotechnol. Bioeng.) 74 (2001) 288-294 ;Mimura, Y·,等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem. )276(2001)45539-45547 ;Radaev，S.,等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 276 (2001) 16478-16483 ；Shields, R. L.,等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem. )276(2001)6591-6604 !Shields, R. L.，等，生物化學(xué)雜志(J. Biol.Chem.) 277 (2002) 26733-26740 ；Simmons, L. C.，等，免疫學(xué)方法雜志(J. ImmunoI.Methods)263(2002)133-147)。增強(qiáng)單克隆抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的方法例如在WO 2005/044859, WO2004/065540, W02007/031875, Umana, P.，等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol.) 17 176-180(1999), WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 和 WO 2000/061739 中進(jìn)行報(bào)道，或例如在 Niwa, R.,等,免疫方法雜志(J. Immunol. Methods) 306 (2005) 151-160 ；Shinkawa, Τ·,等,生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)，278 (2003) 3466-3473 ;W0 03/055993 和 US2005/0249722 中進(jìn)行報(bào)道。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體是糖基化的(如果其包含IgGl，IgG2，IgG3或IgG4亞類的Fe部分，優(yōu)選地IgGl或IgG3亞類的Fe部分)，在Asn297具有糖鏈，其中在所述糖鏈中的巖藻糖的量是65%以下(根據(jù)Kabat的編號(hào))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，巖藻糖在所述糖鏈中的量在5% -65%，優(yōu)選地20%-40%o根據(jù)本發(fā)明所述的“Asn297”意為在Fe區(qū)域的約位置297定位的氨基酸天冬酰胺?；诳贵w的微小序列變化，Asn297也可以在定位在位置297上游或下游的一些氨基酸上(通常不超過±3個(gè)氨基酸)，即在位置294-300之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的糖基化的抗體IgG亞類是人IgGl亞類的，具有突變L234A和L235A的人IgGl亞類，或IgG3亞類的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述糖鏈中N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA)的量是1%以下和/或N端α-1，3-半乳糖的量是1%以下。糖鏈優(yōu)選地顯示與在CHO細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體的Asn297連接的N-連接的聚糖的特征。
術(shù)語“糖鏈顯示與在CHO細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體的Asn297附著的N-連接的聚糖的特征”指在根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體的恒定區(qū)的Asn297的糖鏈具有與在未修飾的CHO細(xì)胞中表達(dá)的相同抗體，例如如在WO 2006/103100中報(bào)道的那些抗體相同的結(jié)構(gòu)和糖
殘基序列，除了巖藻糖殘基之外。術(shù)語“NGNA”用于本申請(qǐng)時(shí)指糖殘基N-羥乙酰神經(jīng)氨酸。人IgGl或IgG3在Asn297發(fā)生糖基化，如核心巖藻糖基化的雙觸角復(fù)合寡糖糖基化，末端為多至兩個(gè)Gal殘基。IgGl或IgG3亞類的人恒定重鏈區(qū)由Kabat，Ε. A.，等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版·公眾健康服務(wù)(Public Health Service),國家健康研究所(National Institutes of Health),Bethesda, MD. (1991),和由 Briiggemann, Μ.，等，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 ；Love,T. ff.，等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol. ) 178 (1989) 515-527中詳細(xì)報(bào)道。根據(jù)末端Gal殘基的量，將這些結(jié)構(gòu)稱為G0，Gl ( α -I，6-或α -I，3_)，或G2聚糖殘基(Raju，T. S.，BioprocessInt. I (2003) 44-53) ο抗體Fe部分的CHO型糖基化例如由Routier，F(xiàn). H.，糖綴合物雜志(Glycoconjugate J). 14 (1997) 201-207描述。在未進(jìn)行糖修飾的CHO宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體通常在Asn297進(jìn)行巖藻糖基化，量為至少85%。根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體的恒定區(qū)的修飾的寡糖可以是雜合的或復(fù)合的。優(yōu)選地，所述分叉，還原/未巖藻糖基化的寡糖是雜合的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分叉、還原/未巖藻糖基化的寡糖是復(fù)合的。根據(jù)本發(fā)明，“巖藻糖的量”意為與在Asn297附著的所有糖結(jié)構(gòu)的總和(例如，復(fù)合、雜合和高甘露糖結(jié)構(gòu))相比的在Asn297的糖鏈中所述糖的量，所述糖的量通過MALDI-T0F質(zhì)譜測(cè)量并且計(jì)算為平均值。巖藻糖的相對(duì)量是包含巖藻糖的結(jié)構(gòu)相對(duì)于在N-糖苷酶F處理的樣品中由MALDI-T0F鑒定的所有糖結(jié)構(gòu)(例如，復(fù)合、雜合和低聚和高甘露糖結(jié)構(gòu)，分別的)的百分比。對(duì)于所有的根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體，“GE”意為糖改造的。在本發(fā)明的一個(gè)其它方面中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體是具有ADCC和/或CDC的抗體，并具有來自人來源的IgGl或IgG3(優(yōu)選地IgGl)亞類的恒定區(qū)，其結(jié)合Fe Y受體和/或補(bǔ)體因子Clq。結(jié)合Fe受體和/或補(bǔ)體因子Clq的這樣的抗體確實(shí)激發(fā)抗體依賴性的細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體由重組方式產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是編碼根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的核酸，并且另一個(gè)方面是包含編碼根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的核酸的細(xì)胞。用于重組生產(chǎn)的方法是現(xiàn)有技術(shù)中廣泛已知的并且包含在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)，以及隨后的抗體分離和通常純化為藥用純度。對(duì)于將前述抗體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，將編碼各個(gè)修飾的輕鏈和重鏈的核酸通過標(biāo)準(zhǔn)方法插入表達(dá)載體中。在適合的原核或真核宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞，NSO細(xì)胞，SP2/0細(xì)胞，HEK293細(xì)胞，COS細(xì)胞，PER. C6細(xì)胞，酵母，或大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并且將所述抗體從細(xì)胞(裂解后的上清液或細(xì)胞)中回收。用于重組生產(chǎn)抗體的一般方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的,并且例如在Makrides，S. C.，ProteinExpr. Purif. 17(1999) 183-202 ；Geisse, S.，等，Protein Expr. Purif 8(1996)271-282 ；Kaufman, R. J.，分子生物技術(shù)(Mol. Biotechnol.) 16 (2000) 151-160 ；fferner, R. G. , DrugRes. 48(1998)870-880的綜述文章中描述。雙特異性抗體適當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基中通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法分離，所述純化方法如，例如蛋白A-瓊脂糖，羥基磷灰石層析法，凝膠電泳，透析或親和層析法。編碼所述單克隆抗體的DNA和RNA容易地使用常規(guī)方法進(jìn)行分離和測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可以充當(dāng)所述DNA和RNA的來源。一旦被分離，可以將DNA插入表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體接著被轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞如HEK 293細(xì)胞，CHO細(xì)胞，或骨髓瘤細(xì)胞中，從而在宿主細(xì)胞中獲得重組單克隆抗體的合成。雙特異性抗體的氨基酸序列變體(或突變體)通過將適合的核苷酸變化引入抗體DNA中，或通過核苷酸合成進(jìn)行制備。然而，這樣的修飾可以僅在例如如上述的非常有限的范圍內(nèi)進(jìn)行。例如，修飾不改變上述提及的抗體特征如IgG同種型和抗原結(jié)合，但是可以提高重組生產(chǎn)的產(chǎn)率、蛋白穩(wěn)定性或有利于純化。根據(jù)本發(fā)明所述的結(jié)合EGFR和IGF-IR的雙特異性抗體下調(diào)EGFR。在A549細(xì)胞中，在一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR的下調(diào)是至少約30%，在另一個(gè)實(shí)施方案中，下調(diào)是至少約 35%，和在另一個(gè)實(shí)施方案中，下調(diào)是至少約40%。根據(jù)本發(fā)明所述的結(jié)合EGFR和IGF-IR的雙特異性抗體下調(diào)IGF-1R。在H322M細(xì)胞中，在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性Cross-Mab (VH/VL)或Cross-Mab (CH/CL)下調(diào)IGF-IR至多約15%，在另一個(gè)實(shí)施方案中，下調(diào)至多約20%，和在另一個(gè)實(shí)施方案中，下調(diào)至多40% (75 Ug 蛋白/mL)。術(shù)語“宿主細(xì)胞”用于本申請(qǐng)時(shí)是指可以被改造從而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的細(xì)胞系統(tǒng)的任何種類。在一個(gè)實(shí)施方案中，將HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞用作宿主細(xì)胞。用于本文時(shí)，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可交替使用，且全部這些名稱都包括后代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代受試者細(xì)胞和由其來源的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)。還理解所有的后代的DNA含量可能不精確一致，這歸因于有意或無意的突變。包括在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的變異后代。在NSO細(xì)胞中的表達(dá)記述在，例如，Barnes, L. Μ.，等.，細(xì)胞技術(shù)學(xué)(Cytotechnology) 32 (2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ·,等·，生物技術(shù)和生物工程(Biotech.Bioeng.) 73 (2001) 261-270 中。瞬時(shí)表達(dá)記述在,例如,Durocher, Y.,等·，核酸研究(Nuc I.Acids. Res. )30E9 (2002)中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的克隆記述在Orlandi，R.，等.，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.，等·，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 89 (1992) 4285-4289 ;和 Norderhaug, L.，等·，免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Method) 204 (1997) 77-87中。優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(HEK 293)記述在Schlaeger, E. -J.,和 Christensen, K.，在細(xì)胞技術(shù)學(xué)(Cytotechnology) 30 (1999) 71-83 中和 Schlaeger, E. -J.，在免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Methods) 194 (1996) 191-199 中。適合用于原核生物的控制序列，例如包括啟動(dòng)子，任選地操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和多腺苷酸化信號(hào)。當(dāng)核酸在被置于與另一個(gè)核酸序列的功能關(guān)系中，是“可操作地連接的”。例如，前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與多肽的DNA可操作地連接，條件是其表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作地連接，條件是其影響序列的轉(zhuǎn)錄；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列可操作地連接，條件是其被定位為促進(jìn)翻譯。一般地，“可操作地連接的”意指被連接的DNA序列是連續(xù)的，且在分泌前導(dǎo)序列的情形中，是連續(xù)的且在可讀框中。然而，增強(qiáng)子不必須是連續(xù)的。連接通過在方便的限制性位點(diǎn)處的連接來實(shí)現(xiàn)。如果所述位點(diǎn)不存在，則合成的寡核苷酸適體或接頭根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用。具有減少量的巖藻糖的根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可以在被改造以表達(dá)編碼具有GnTIII活性的多肽和具有ManII活性的多肽的至少一種核酸的糖修飾的宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述表達(dá)以根據(jù)本發(fā)明使Fe區(qū)域中的寡糖巖藻糖基化的量進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。備選地，宿主細(xì)胞的α 1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性可以根據(jù)US 6，946，292減少或消除從而產(chǎn)生糖修飾的宿主細(xì)胞?？贵w巖藻糖基化的量可以例如通過發(fā)酵條件或通過至少兩種抗體與不同巖糖基化的量組合來進(jìn)行預(yù)先確定。具有減少量的巖藻糖的根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可以在宿主細(xì)胞中，通過包括下列步驟的方法產(chǎn)生(a)在容許所述抗體產(chǎn)生，并容許以根據(jù)本發(fā)明的量對(duì)存在于所述抗體的Fe區(qū)域上的寡糖進(jìn)行巖藻糖基化的條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被改造從而表達(dá)編碼具有GnTIII活性和/或ManII活性的融合多肽的至少一種多核苷酸；和(b)分 離所述抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽，優(yōu)選含有GnTIII的催化結(jié)構(gòu)域和異源高爾基體定居(resident)多肽的高爾基體定位結(jié)構(gòu)域,所述定位結(jié)構(gòu)域選自由下列組成的組甘露糖苷酶II的定位結(jié)構(gòu)域，β (I, 2)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶I ( “GnTI”)的定位結(jié)構(gòu)域,甘露糖苷酶I的定位結(jié)構(gòu)域，β (1，2)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶IK “GnTII”)的定位結(jié)構(gòu)域，和α 1-6核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的定位結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，該高爾基體定位結(jié)構(gòu)域來自甘露糖苷酶II或GnTI。用于本文時(shí)，“具有GnTIII活性的多肽”指這樣的多肽，所述多肽能夠催化以β -1-4連接將N-乙酸基匍糖胺(GlcNAc)殘基添加到N-聯(lián)寡糖中的二甘露糖基核心的β連接的甘露糖苷上。這包括融合多肽，所述多肽顯示類似于但不必須相同于β (1，4)-Ν-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III的活性的酶活性，如在具體的生物測(cè)定中所測(cè)量的，具有或不具有劑量依賴性，按照國際生化和分子生物學(xué)命名委員會(huì)(NC-IUBMB)，其也被稱為β-1，4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙?；咸前坊?轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4. I. 144)。在其中確實(shí)存在劑量依賴性的情形中，其不需要與GnTIII的劑量依賴性相同，但是與GnTIII活性相比，基本類似于在給定活性中的劑量依賴(即，相對(duì)于GnTIII，候選多肽將顯示更大的活性或不超過約25倍更少，并且優(yōu)選地，不超過約10倍更少的活性，并且最優(yōu)選地，不超過約三倍更少的活性)。用于本文時(shí)，術(shù)語“高爾基體定位結(jié)構(gòu)域”指負(fù)責(zé)將多肽錨定在高爾基復(fù)合體的位置中的高爾基體定居多肽的氨基酸序列。通常，定位結(jié)構(gòu)域包括酶的氨基末端“尾”。對(duì)于生產(chǎn)具有減少量的巖藻糖的根據(jù)本發(fā)明所述的抗體，同樣地也可以使用能夠并被改造以容許產(chǎn)生具有修飾的糖形的抗體的宿主細(xì)胞?？梢赃M(jìn)一步操作所述宿主細(xì)胞從而表達(dá)增加水平的具有GnTIII活性的一種或多種多肽。優(yōu)選將CHO細(xì)胞作為這樣的宿主細(xì)胞。同樣地，產(chǎn)生具有增加的ADCC的抗體組合物的細(xì)胞在US 6，946，292中報(bào)道。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括堿/SDS處理，CsCl分級(jí)(CsCl banding),柱層析法，瓊脂糖凝膠電泳，和其它本領(lǐng)域公知的技術(shù)，進(jìn)行抗體的純化從而消除細(xì)胞成分或其它污染物，例如其它細(xì)胞核酸或蛋白。見Ausubel，F(xiàn).，等，編輯，現(xiàn)代分子生物學(xué)中的方法(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing 和 WileyInterscience, New York (1987) 不同的方法是充分建立的并且廣泛用于蛋白純化，如用微生物蛋白進(jìn)行的親和層析法(例如，蛋白A或蛋白G親和層析法)，離子交換層析法(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)，陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式的交換)，親硫吸附(例如，用巰基乙醇和其它SH配體)，疏水相互作用或芳香吸附層析法(例如用苯基-瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂，或間氨基苯基硼酸)，金屬螯合親和層析法(例如用Ni (II)-和Cu(II)-親和性材料)，大小排阻層析和電泳方法(如凝膠電泳，毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi, Μ.，Α.,應(yīng)用生物化學(xué)生物技術(shù)(Appl. Biochem.Biotech).75(1998)93-102)。本發(fā)明的一個(gè)方面是包含根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面是將根據(jù)本發(fā)明所述的抗體用于制備藥物組合物的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于制備包含根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的藥物組合物的方法。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含與藥用載體一起配制的根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的組合物，例如藥物組合物。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)當(dāng)與單特異性母體抗-EGFR抗體和抗-IGF-1R抗體比較，或與自Lu, D.,等，生物化學(xué)和生物物理研究通訊(Biochemical and BiophysicalResearch Communications)318 (2004)507-513 ；生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.),279(2004)2856-2865 ;和生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 280 (2005) 19665-72 已知的針對(duì) EGFR和針對(duì)IGF-IR的雙特異性抗體比較(如這些雙特異性抗體與各個(gè)母體抗體的組合比較僅顯示在表達(dá)EGFR/IGF-1R的腫瘤細(xì)胞中的減少的功效)，根據(jù)本發(fā)明的針對(duì)EGFR和針對(duì)IGF-IR的雙特異性抗體具有針對(duì)癌細(xì)胞的提高的抗增殖性質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于治療癌癥的所述藥物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明所述的抗體用于制備治療癌癥的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過向需要所述治療的患者施用根據(jù)本發(fā)明所述的抗體治療遭受癌癥的患者的方法。用于本文時(shí)，“藥物載體”包括生理相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲試劑和吸附延緩試劑等。優(yōu)選地，所述載體適合用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊或表皮施用(例如通過注射或輸注)。本發(fā)明的組合物可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法施用。如技術(shù)人員清楚地，施用的路徑和/或方式將根據(jù)需要的結(jié)果變化。為了通過某些施用路徑施用本發(fā)明的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物與防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在適合的載體中施用于受試者，所述載體例如是脂質(zhì)體或稀釋齊U。藥用稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。藥物載體包括無菌水溶液或分散體和用于即時(shí)制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。這些介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)是本領(lǐng)域已知的。術(shù)語“腸胃外施用”和“腸胃外地施用”用于本文時(shí)意為除了腸和局部施用之外的施用方式，通常通過注射施用，并且包括，但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、目艮內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、角質(zhì)下(subcuticular)、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。術(shù)語癌癥用于本文時(shí)指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴細(xì)胞性白血病(lymphocytic leukemias),肺癌(lung cancer),非小細(xì)胞肺(NSCL)癌(non small celllung (NSCL) cancer),支氣管肺泡細(xì)胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer),骨癌(bone cancer)，膜腺癌(pancreatic cancer)，皮膚癌(skin cancer)，頭或頸癌(cancerof the head or neck)，皮膚或眼內(nèi)黑素瘤(cutaneous or intraocular melanoma)，子宮癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，直腸癌(rectal cancer)，肛區(qū)癌(cancerof the anal region)，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，結(jié)腸癌(coloncancer)，乳腺癌(breast cancer)，子宮癌(uterine cancer)，輸卵管癌(carcinomaof the fallopian tubes)，子宮內(nèi)膜癌(carcinoma of the endometrium)，子宮頸癌(carcinoma of the cervix)，陰道癌(carcinoma of the vagina)，夕卜陰癌(carcinomaofthe vulva)，霍奇金病(Hodgkin, s Disease)，食管癌(cancer of the esophagus)，小腸癌(cancer of the small intestine)，內(nèi)分泌系統(tǒng)癌(cancer of the endocrinesystem),甲狀腺癌(cance r of the thyroid gland)，甲狀旁腺癌(cancer of theparathyroid gland)，腎上腺癌(cancer of the adrenal gland)，軟組織肉瘤(sarcoma ofsoft tissue)，尿道癌(cancer of the urethra)，陰莖癌(cancer of the penis)，前列腺癌(prostate cancer)，膀胱癌(cancer of thebladder)，腎癌或輸尿管癌(cancer of thekidney or ureter)，腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma)，腎盂癌(carcinoma of the renalpelvis)，間皮瘤(mesothelioma)，肝細(xì)胞癌(hepatocellular cancer)，膽管癌(biliarycancer)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤(neoplasms of the central nervous system (CNS))，脊椎軸腫瘤(spinal axis tumors)，腦干膠質(zhì)瘤(brain stem glioma)，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme)，星形細(xì)胞瘤(astrocytomas)，神經(jīng)鞘瘤(schwanomas)，室管膜瘤(ependymonas)，成髓細(xì)胞瘤(medulloblastomas)，腦膜瘤(meningiomas)，鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinomas)，垂體腺瘤(pituitary adenoma)，和埃文斯肉瘤(Ewing’ s sarcoma)，包括上述癌癥任一的難治性形式，或一種或多種上述癌癥的組合。這些組合物還可以包含佐劑如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。防止微生物的存在可以通過滅菌方法，見上文和通過包含各種抗細(xì)菌和抗真菌藥劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸等來確保。可能需要在組合物中包含等滲劑，如糖、氯化鈉等。此夕卜，可以通過包含延緩吸附的試劑如單硬脂酸鋁和明膠來導(dǎo)致可注射藥物形式的延長的吸附。不管所選擇的施用路徑為何，可以以適合的水合形式使用的本發(fā)明的化合物，和/或本發(fā)明的藥物組合物通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方式配制到藥用劑型中。在本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可以變化從而獲得這樣的活性成分的量，其對(duì)于特定的患者、組合物和施用方式有效獲得需要的治療反應(yīng)，而不會(huì)對(duì)于患者具有毒性。選定的劑量水平將取決于多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素包括所用的本發(fā)明的特定組合物的活性、施用路徑、施用時(shí)間、使用的特定化合物的排泄速率、治療的延續(xù)時(shí)間、與所用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、待治療的患者的年齡、性另O、體重、病癥、一般健康和以前的醫(yī)療病史，以及醫(yī)療領(lǐng)域已知的類似因素。所述組合物必需是無菌和可流動(dòng)的，到所述組合物可通過注射器遞送的程度。除了水之外，所述載體優(yōu)選地是等滲緩沖的鹽水溶液。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以例如通過使用涂層如磷脂酰膽堿，在分散體的情形中通過維持需要的顆粒大小和通過使用表面活性劑來維持。在許多情形中，優(yōu)選在所述組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇，和氯化鈉。
用于本文中時(shí)，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可交替使用，且全部這些名稱都包括子代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞和由其來源的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還理解所有的子代的DNA含量可能不精確一致，這歸因于有意或無意的突變。包括在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的變異子代。在意指不同名稱時(shí)，通過上下文其將是清楚的。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”用于本文中時(shí)，指將載體/核酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的過程。如果將無難以克服的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞用作宿主細(xì)胞，則轉(zhuǎn)染例如通過如Graham, F. L.和van derEb. A. J.，Virology (病毒學(xué))52(1973)456-467所述的磷酸鈣沉淀法來進(jìn)行。然而，還可以使用其他將DNA引入細(xì)胞的方法，諸如通過核注射或通過原生質(zhì)體融合。如果使用原核細(xì)胞或包含實(shí)質(zhì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，例如一種轉(zhuǎn)染方法是利用氯化鈣的鈣處理，如Cohen，S. N，等，PNAS (美國科學(xué)院院報(bào))· 69 (1972) 2110-2114所述。用于本文中時(shí)，“表達(dá)”指將核酸轉(zhuǎn)錄為mRNA的過程和/或?qū)⑥D(zhuǎn)錄的mRNA(也稱為轉(zhuǎn)錄物)隨后翻譯為肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄物和被編碼的多肽共同稱為基因產(chǎn)物。如果多核苷酸源自基因組DNA，則在真核細(xì)胞中的表達(dá)可以包括mRNA的剪接。“載體”是核酸分子，特別是自體復(fù)制的，其將插入的核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞之中和/或之間。該術(shù)語包括主要功能為將DNA或RNA插入細(xì)胞(例如，染色體整合)的載體，主要功能是復(fù)制DNA或RNA的復(fù)制載體，和功能是轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA的表達(dá)載體。還包括提供多于一種上述功能的載體?！氨磉_(dá)載體”是多核苷酸，其在引入到合適的宿主細(xì)胞中時(shí)能夠被轉(zhuǎn)錄和翻譯為多肽?！氨磉_(dá)系統(tǒng)”通常指包括表達(dá)載體的適當(dāng)宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體可以起作用產(chǎn)生所需的表達(dá)產(chǎn)物。氨基酸序列描述SEQ ID NO 1 重鏈 CDR3，人源化的 <EGFR>ICR62SEQIDN0 2 重鏈 CDR2，人源化的 <EGFR>ICR62SEQIDN0 3 重鏈 CDRl，人源化的 <EGFR>ICR62SEQIDN0 4 輕鏈 CDR3，人源化的 <EGFR>ICR62SEQ ID NO 5 輕鏈 CDR2，人源化的 <EGFR>ICR62SEQ ID NO 6 輕鏈 CDRl，人源化的 <EGFR>ICR62SEQ ID NO :7重鏈可變結(jié)構(gòu)域，人源化的〈EGFR>ICR62-I_HHBSEQ ID NO :8重鏈可變結(jié)構(gòu)域，人源化的〈EGFR>ICR62-I_HHDSEQ ID NO :9輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，人源化的<EGFR>ICR62-I_KASEQ ID NO : 10輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，人源化的<EGFR>ICR62-I_KCSEQ ID NO 11 重鏈 CDR3，<IGF-1R>HUMAB-克隆 18SEQ ID NO :12 重鏈 CDR2，〈IGF_1R>HUMAB-克隆 18SEQ ID NO 13 重鏈 CDRl，〈IGF_1R>HUMAB-克隆 18SEQ ID NO 14 輕鏈 CDR3，〈IGF_1R>HUMAB-克隆 18SEQ ID NO 15 輕鏈 CDR2,〈IGF_1R>HUMAB-克隆 18
SEQ ID NO 16 輕鏈 CDRl，〈IGF_1R>HUMAB-克隆 18SEQ ID NO 17 重鏈 CDR3，〈IGF_1R>HUMAB-克隆 22
SEQ ID NO :18 重鏈 CDR2，〈IGF_1R>HUMAB-克隆 22
SEQ ID NO :19 重鏈 CDRl，〈IGF_1R>HUMAB-克隆 22SEQ ID NO :20 輕鏈 CDR3，〈IGF_1R>HUMAB-克隆 22SEQ ID NO :21 輕鏈 CDR2，<IGF-1R>HUMAB-克隆 22SEQ ID NO :22 輕鏈 CDRl，〈IGF_1R>HUMAB-克隆 22SEQ ID NO :23 重鏈可變結(jié)構(gòu)域，<IGF-1R>HUMAB-克隆 18SEQ ID NO :24 重鏈可變結(jié)構(gòu)域，<IGF-1R>HUMAB-克隆 22SEQ ID NO 25 輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，〈IGF_1R>HUMAB-克隆 18SEQ ID NO 26 輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，<IGF-1R>HUMAB-克隆 22SEQ ID NO :27來自IgGl的人重鏈恒定區(qū)SEQ ID NO :28來自IgG4的人重鏈恒定區(qū)SEQ ID NO :29kappa 輕鏈恒定區(qū)SEQ ID NO :30雙特異性、二價(jià)結(jié)構(gòu)域交換的〈EGFR-IGF1R〉抗體分子Cross-Mab (VH/VL)的重鏈 ISEQ ID NO :31雙特異性、二價(jià)結(jié)構(gòu)域交換的〈EGFR-IGF1R〉抗體分子Cross-Mab (VH/VL)的重鏈 2SEQ ID NO :32雙特異性、二價(jià)結(jié)構(gòu)域交換的〈EGFR-IGF1R〉抗體分子Cross-Mab (VH/VL)的輕鏈 ISEQ ID NO :33雙特異性、二價(jià)結(jié)構(gòu)域交換的〈EGFR-IGF1R〉抗體分子Cross-Mab (VH/VL)的輕鏈 2SEQ ID NO :34雙特異性、二價(jià)結(jié)構(gòu)域交換的〈EGFR-IGF1R〉抗體分子Cross-Mab (CH/CL)的重鏈 ISEQ ID NO :35雙特異性、二價(jià)結(jié)構(gòu)域交換的〈EGFR-IGF1R〉抗體分子Cross-Mab (CH/CL)的重鏈 2SEQ ID NO :36雙特異性、二價(jià)結(jié)構(gòu)域交換的〈EGFR-IGF1R〉抗體分子Cross-Mab (CH/CL)的輕鏈 ISEQ ID NO :37雙特異性、二價(jià)結(jié)構(gòu)域交換的〈EGFR-IGF1R〉抗體分子Cross-Mab (CH/CL)的輕鏈 2SEQ ID NO :38 雙特異性、二價(jià) scFab-Fc 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子scFab-Fc的重鏈ISEQ ID NO :39 雙特異性、二價(jià) scFab-Fc 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子scFab-Fc的重鏈2SEQ ID NO :40 雙特異性、二價(jià) scFab-Fc 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子N-scFabSS-鹽橋-s3的重鏈ISEQ ID NO 41 雙特異性、二價(jià) scFab-Fc 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子N-scFabSS-鹽橋-s3的重鏈2SEQ ID NO :42 雙特異性、二價(jià) scFab-Fc 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子N-scFabSS-鹽橋-w3C的重鏈ISEQ ID NO :43 雙特異性、二價(jià) scFab-Fc 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子N-scFabSS-鹽橋-w3C的重鏈2SEQ ID NO :44 雙特異性、三價(jià) scFab-IgG 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子KiH-C-scFab-1 的重鏈 ISEQ ID NO :45 雙特異性、三價(jià) scFab-IgG 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子KiH-C-scFab-1 的重鏈 2SEQ ID NO :46 雙特異性、三價(jià) scFab-IgG 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子KiH-C-scFab-1 的輕鏈SEQ ID NO :47 雙特異性、三價(jià) scFab-IgG 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子KiH-C-scFab-2 的重鏈 ISEQ ID NO :48 雙特異性、三價(jià) scFab-IgG 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子 KiH-C-scFab-2 的重鏈 2SEQ ID NO :49 雙特異性、三價(jià) scFab-IgG 融合〈EGFR-IGF1R〉抗體分子KiH-C-scFab-2 的輕鏈提供以下實(shí)施例、序列表和附圖來幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍在所附權(quán)利要求中給出。要理解在不偏離本發(fā)明精神的條件下可以對(duì)所述程序作出改動(dòng)。附圖簡(jiǎn)述圖I.結(jié)合EGFR和IGF-IR的根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體的一個(gè)四價(jià)實(shí)施方案的示意性結(jié)構(gòu)，其中抗原A或B之一是EGFR，而另一個(gè)是IGF-1R。所述結(jié)構(gòu)基于結(jié)合抗原A的全長抗體，結(jié)合抗原B的兩個(gè)(任選地二硫化物穩(wěn)定的)單鏈Fv’s通過肽-接頭連接于所述全長抗體。圖2.結(jié)合EGFR和IGF-1R的根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體的四個(gè)可能的四價(jià)實(shí)施方案A-D的示意性結(jié)構(gòu)，其中抗原A或B之一是EGFR，而另一個(gè)是IGF-1R。所述結(jié)構(gòu)基于結(jié)合抗原A的全長抗體，結(jié)合抗原B的兩個(gè)(任選地二硫化物穩(wěn)定的)單鏈Fv’s通過位于下列位置的肽-接頭連接于所述全長抗體A :全長抗體重鏈的C端B :全長抗體重鏈的N端C :全長抗體輕鏈的C端D :全長抗體輕鏈的C端圖3. 3a :純化的雙特異性抗體XGFR1-2421的SDS-PAGE3b :純化的雙特異性抗體XGFR1-2421 (3mg, /ml)的HP-大小排阻層析法(SEC)分析3c :純化的雙特異性抗體XGFR1-2421 (lmg, /ml)的HP-大小排阻層析(SEC)分析圖4. 4a :雙特異性抗體XGFR1-2320 (無二硫化物穩(wěn)定)的HP-大小排阻層析(SEC)純化(8. 7%團(tuán)聚體)4b :雙特異性抗體XGFR1-2321 ( 二硫化物穩(wěn)定的)的HP-大小排阻層析(SEC)純化(0%團(tuán)聚體)圖5.在用固定的XGFR1-2320進(jìn)行的Biacore測(cè)定法中雙特異性抗-EGFR/抗-IGF-IR抗體(XGFR1-2320)與EGFR和IGFlR的同時(shí)結(jié)合圖6.由雙特異性抗體下調(diào)在A549NSCLC腫瘤細(xì)胞系中的IGFR(6a)和EGFR(6b)
圖7.雙特異性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗體分子(XGFR)在H322M NSCLC腫瘤細(xì)胞系中抑制IGF-IR磷酸化(7a)和EGFR磷酸化(7b)7a :在用各種雙特異性抗體XGFR分子和它們的母體抗體在H322M NSCLC腫瘤細(xì)胞中抑制后的Phospho-EGF-R-ELISA，抗體濃度與溫育有關(guān)，在用IGF1/EGF抗體刺激的情形中，濃度被稀釋到起始濃度的一半7b :在用各種雙特異性抗體XGFR分子和它們的母體抗體在H322M NSCLC腫瘤細(xì)胞中抑制后的Phospho-EGF-R-ELISA，抗體濃度與溫育有關(guān)，在用IGF1/EGF抗體刺激的情形中，抗體濃度被稀釋到起始濃度的一半圖8.雙特異性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗體分子(XGFR)和它們的母體抗體對(duì)表達(dá)EGFR-和IGF-IR的H322M NSCLC腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤生長抑制圖9.雙特異性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗體分子(XGFR)的體外ADCC活性
圖10.特異性結(jié)合EGFR或IGFl-R的無CH4結(jié)構(gòu)域的全長抗體的示意性結(jié)構(gòu)，其具有兩對(duì)重鏈和輕鏈，以典型的順序包含可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域。圖11.特異性結(jié)合例如EGFR或IGFl-R的四個(gè)可能的單鏈Fab片段的示意性結(jié)構(gòu)圖12.根據(jù)本發(fā)明所述的四價(jià)、雙特異性抗體的示意性結(jié)構(gòu)，其包含特異性結(jié)合兩種抗原EGFR或IGFl-R之一的全長抗體和特異性結(jié)合兩種抗原EGFR或IGFl-R的另一個(gè)的兩個(gè)單鏈Fabs (scFab-XGFR分子)圖13.包含特異性結(jié)合IGF-IR的全長抗體和特異性結(jié)合EGFR的兩個(gè)相同的單鏈Fabs的根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體-ScFab-XGFRl分子A，B，C，和D以及在純化后的表達(dá)水平A :與重鏈的C端融合的scFab (VH-CHl-接頭-VL-CL)B :與重鏈的C端融合的scFab (VH-CHl-接頭-VL-CL，融合另外的VH44-VL100 二硫化物橋)C :與輕鏈的C端融合的scFab (VH-CHl-接頭-VL-CL)D :與輕鏈的C端融合的scFab (VH-CH1-接頭-VL-CL，融合另外的VH44-VL100 二硫化物橋)圖14.包含特異性結(jié)合EGFR的全長抗體和特異性結(jié)合IGF-1R的兩個(gè)相同的單鏈Fabs的根據(jù)本發(fā)明所述的雙特異性抗體-ScFab-XGFR2分子A，B, C，和DA :與重鏈的C端融合的scFab (VH-CH1-接頭-VL-CL)B :與重鏈的C端融合的scFab (VH-CH1-接頭-VL-CL，融合另外的VH44-VL100 二硫化物橋)C :與輕鏈的C端融合的scFab (VH-CHl-接頭-VL-CL)D :與輕鏈的C端融合的scFab (VH-CH1-接頭-VL-CL，融合另外的VH44-VL100 二硫化物橋)圖15.包含單鏈Fab的雙特異性抗體衍生物scFab_XGFRl的SDS-PAGE分析I scFab-XGFRl_4720 (未還原) 2 scFab_XGFRl_4721 (未還原)3 scFab-XGFRl_4720 (還原)4 scFab_XGFRl_4721 (還原)
圖16.包含scFab的雙特異性抗體衍生物scFab-XGFRl的HP-SEC分析圖Ife scFab-XGFRl-4720 ；7. 7%，團(tuán)聚體(用盒標(biāo)記)圖1 scFab-XGFRl-4721 ；3. 5%，團(tuán)聚體(用盒標(biāo)記)圖 17. scFab-XGFRl 和 scFab_XGFR2 與 EGFR 和 IGF IR 的結(jié)合圖 17a =Biacore 圖-scFab_XGFRl_2720 與 EGFR 的結(jié)合，KD = 2nM圖 17b =Biacore 圖-scFab_XGFRl_2720 與 IGF-1R 的結(jié)合，KD = 2nM圖 17c =Biacore 圖-scFab_XGFR2_2720 與 EGFR 的結(jié)合，KD = O. 5nM圖 17d =Biacore 圖-scFab_XGFR2_2720 與 IGF-IR 的結(jié)合，KD = IlnM 圖18.示意圖-用FACS競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法分析的scFab-XGFR與細(xì)胞的結(jié)合，使用下列一般方法-平行加入用Alexa647(lμ g/mL)標(biāo)記的<IGFlR>Mab+未標(biāo)記的scFab-XGFR(100 μ g/mL-Ο, 001 μ g/mL)-在冰上溫育45分鐘，洗滌并去除未結(jié)合的抗體-用I% HCHO固定，接著進(jìn)行FACS圖19.通過FACS競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法分析的scFab_XGFR_2721和母體〈IGF1R〉克隆18與細(xì)胞的結(jié)合圖19a :比較〈IGF-1R〉克隆 18(0，18μ g/ml)和 scFab_XGFR_2721 (0，15 μ g/ml)的IC50 值圖19b :〈IGF-1R>克隆18的結(jié)合曲線(轉(zhuǎn)折點(diǎn)0，11 μ g/ml)-y-軸=RLU ;χ-軸抗體濃度μ g/ml)圖19c scFab-XGFR_2721 的結(jié)合曲線(轉(zhuǎn)折點(diǎn) 0，10 μ g/ml)-y-軸=RLU ;x-軸抗體濃度(μ g/ml)圖20.用不同的雙特異性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗體分子(scFab-XGFR ； IOOnM)溫育24小時(shí)后在H322M細(xì)胞上下調(diào)IGFl-R圖21.用不同的雙特異性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗體分子(scFab-XGFR ; IOOnM)溫育24小時(shí)后在H322M細(xì)胞上下調(diào)EGFR圖22.用不同的雙特異性抗-EGFR/抗-IGF-1R抗體分子(scFab-XGFR ； IOOnM)抑制H322M-細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)程序?qū)嵤├O(shè)計(jì)雙特異性〈EGFR-IGF-1R〉抗體根據(jù)本發(fā)明所述的結(jié)合EGFR和IGF-IR的雙特異性抗體包含結(jié)合于EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合于IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)?？梢允褂肧EQ ID NO :7或SEQ ID NO:8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO :9或SEQ ID NO : 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域作為結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域都來自人源化的大鼠抗-EGFR抗體ICR62，其在WO 2006/082515中詳細(xì)描述?？梢允褂肧EQ ID NO :23或SEQ ID NO :24的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域作為結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域都來自人抗-16 -11 抗體〈16 -11 >皿1^8克隆18(031 ACC 2587)或 <IGF-1R>HUMAB 克隆 22(DSM ACC 2594)，其詳細(xì)描述在 WO 2005/005635 中。
在下面所有的實(shí)施例1-20中，雙特異性〈EGFR-IGF-1R〉抗體基于作為結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)的SEQ ID NO :8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO : 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(來自人源化的<EGFR>ICR62)，并且基于作為結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的SEQID NO :23的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和SEQ ID NO :25的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(來自人抗-IGF-IR抗體 <IGF-1R>HUMAB 克隆 18 (DSM ACC 2587))。A)設(shè)計(jì)具有 scFv 連接物(attachment)的雙特異性〈EGFR-IGF_1R> 抗體(XGFR1和XGFR2命名法，指scFv-XGFR分子)為了產(chǎn)生組合兩種抗體特征的試劑，構(gòu)建各種新的四價(jià)雙特異性抗體來源的蛋白實(shí)體。在這些分子中，一種抗體的重組單鏈結(jié)合分子通過重組蛋白融合技術(shù)連接于另一種抗體，其保留全長IgGl的形式。該第二抗體具有需要的第二結(jié)合特異性?；谌丝?IGF-IR抗體 <IGF-1R>HUMAB 克隆 18 (DSM ACC 2587)和衍生自 SEQ IDNO 8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和SEQ ID NO 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的結(jié)合EGFR的單鏈Fv(ScFv)的設(shè)計(jì)的形式的總結(jié)顯示在圖I中，并且在表I和2中列舉。通過基因合成和重組分子生物學(xué)技術(shù)，將SEQ ID NO :8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和SEQ ID N010的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)通過甘氨酸絲氨酸(G4S)n單鏈接頭連接從而提供結(jié)合EGFR的單鏈Fv (scFv)，其連接于抗-IGF-1R抗體<IGF_1R>HUMAB克隆18(DSM ACC 2587)輕鏈或重鏈的N端或C端的可變位置。此外，將半胱氨酸殘基引入結(jié)合EGFR的scFv的VH結(jié)構(gòu)域(包括Kabat位置44)和VL結(jié)構(gòu)域(包括Kabat位置100)的不同位置，如前所述(例如，WO 94/029350 ；Reiter, Y.，等，自然生物技術(shù)(Nature biotechnology)14(1996)1239-1245 ；Young, N. ， Μ·，等，F(xiàn)EBS Letters卷 377(1995) 135-139 ；或 Rajagopal, V.,等，蛋白工程(Protein Engineering)卷101453-59(1997)。隨后，評(píng)估蛋白表達(dá)，穩(wěn)定性和生物學(xué)活性。此外，在〈IGF1R〉抗體的重鏈或輕鏈的C端和結(jié)合EGFR的scFv之間的包含(甘氨酸4-絲氨酸)η的肽接頭長度是變化的。此外，作為結(jié)合EGFR的單鏈Fv組件的完整部分的甘氨酸4-絲氨酸(G4S)單鏈接頭的長度是變化的。所有這些分子重組產(chǎn)生，純化并表征。在表I和2中提供了用于產(chǎn)生四價(jià)雙特異性〈EGFR-IGF1R〉抗體的所有雙特異性抗體設(shè)計(jì)的總結(jié)。對(duì)于該研究，我們使用術(shù)語‘XGFR’來描述同時(shí)識(shí)別EGFR以及IGFlR并包含特異性結(jié)合EGFR或IGFlR之一的全長抗體以及特異性結(jié)合EGFR或IGFlR的另一個(gè)的兩個(gè)scFv片段的各種蛋白實(shí)體。表I-具有N端和C端scFv連接物的不同雙特異性〈EGFR-IGF1R〉抗體形式，和相應(yīng)的XGFRl-命名法和XGFR2-命名法。XGFRl 形式基于 a)人抗-IGF-1R 抗體 <IGF_1R>HUMAB 克隆 18 (DSM ACC 2587)和b)來自SEQ ID NO 8的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和SEQ ID NO 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的兩條結(jié)合EGFR的單鏈Fv (scFv)，其連接于抗-IGF-1R抗體<IGF_1R>HUMAB克隆18的重鏈(HC)或輕鏈(LC)的相同端(C端或N端)。XGFR2形式基于a)人源化的大鼠抗-EGFR抗體ICR62的可變區(qū)VH (SEQ ID NO 8)和 VL (SEQ ID NO 10)和 b)結(jié)合抗-IGF-IR 抗體 <IGF-1R>HUMAB 克隆 18 的人抗-IGF-IR抗體 <IGF-1R>HUMAB 克隆 18(DSM ACC 2587) VH (SEQ ID NO :23) VL (SEQ ID NO :25)的兩條單鏈Fv(scFv)。
表中的“表示“不存在”
scFv與全長抗體的肽-接頭在二硫化物穩(wěn)
分子名稱單鏈接頭
連接位置(G4S)n 定的scFv中
XGFR-命名法(G4S；)ii
η= 的Cys-位置
Il=
抗-IGF-1R 抗 體 <IGF-1R>
IIUMAB克隆 18
人源化的大鼠 抗-EGFR抗體 ICR62 ,具有
SEQID NO: 8----
的VH，和 SEQ ID NO:10 白勺 VL_____
XGFRl-2320C-端 HC32-
XGFRl-3320N-端 HC32-
XGFRl-4320C-端 LC32-
XGFRl-5320N-端 LC32-
XGFRl-2321C-端 HC32VH44/VL100
XGFRl-3321N-端 HC32VH44/VL100
XGFRI-4321C-端 LC32VH44/VL100
XGFRl-5321N-端 LC32VH44/VL100
XGFR2-2420C-端 HC42-
XGFR2-2421C-端 HC42VH44/VL100
XGFR2-3421N-端 HC42VH44/VL100
XGFR2-4421C-端 LC42VH44/VL100scFv與全長抗體的肽-接頭在二硫化物穩(wěn)
分子名稱單鏈接頭
連接位置 (G4S)n定的scFv中XGFR-命名法(G4S)n
η=的Cys-位置
Il=
XGFR2-5421 N-端 LC 4 2VH44/VL100表2-具有可變的單鏈接頭和肽接頭長度的XGFRl雙特異性抗體。表中的“表示“不存在
分子名在二硫化物 ScFv與全單鏈接頭單鏈接頭肽-接頭肽-接頭
稱穩(wěn)定的 長抗體的連(G4S)n (G3S)n (G4S)n (G3S)n
XGFR- ^scFv 中的 接位置 η= η= η= η=
命名法Cys-位置
XGFRl-VH44/VL10C-端 HC 4 - 2 -
2421O
XGFRl-VH44/VL10N-端 HC 4 - 2 -
3421O
XGFRl-VH44/VL10C-端 LC 4 - 2 -4421_______0
XGFRl-VH44/VL10N-端 LC 4 - 2 -
5421_______O
XGFRl-VH44/VL10C-端 HC 4 - 5 -
2451O
XGFRl-VH44/VL10C-端 HC 4 - 5 -
4451O
XGFRl-VH44/VL10C-端 HC- 5-3
2421CO實(shí)施例1-8涉及具有scFv連接物的四價(jià)XGFRl和XGFR2分子B)設(shè)計(jì)具有單鏈Fab (scFab)連接物的四價(jià)、雙特異性 <EGFR-IGF_1R> 抗體(scFab-XGFRl 和 scFab_XGFR2 命名法)術(shù)語scFab-XGFR用于描述同時(shí)識(shí)別EGFR以及IGFlR并包含特異性結(jié)合EGFR或IGFlR之一的全長抗體；和特異性結(jié)合EGFR或IGFlR的另一個(gè)的兩個(gè)scFab片段的各種蛋白實(shí)體。在下面本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，列舉了這樣的四價(jià)雙特異性抗體，其包含結(jié)合于第一抗原(IGF-1R或EGFR)的全長抗體，具有結(jié)合第二不同抗原(IGF-1R或EGFR的另一個(gè))的兩個(gè)單鏈Fab片段，所述單鏈Fab片段通過肽連接體連接于全長抗體(在重鏈的兩個(gè)C端的兩個(gè)單鏈Fab片段或在輕鏈的兩個(gè)C端的兩個(gè)單鏈Fab片段)。在所述單鏈Fab片段中的抗體結(jié)構(gòu)域和接頭具有從N端到C端方向的下列順序VL-CL-接頭-VH-CHl。使用SEQ ID NO 23作為<IGF_1R>抗原結(jié)合位點(diǎn)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域VH。使用SEQID NO 25作為〈IGF-1R〉抗原結(jié)合位點(diǎn)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域VL。使用SEQ ID NO 8作為<EGFR>抗原結(jié)合位點(diǎn)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域VH。使用SEQ ID NO 10作為<EGFR>抗原結(jié)合位點(diǎn)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域VL。通過基因合成和重組分子生物學(xué)技術(shù)，將包含各個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的VH和VL的VL-CL和VH-CHl通過甘氨酸絲氨酸(G4S)nGm接頭連接從而提供單鏈Fab片段VL-CL-接頭-VH-CHl，所述Fab片段使用(G4S) η肽連接體連接于抗體重鏈或輕鏈的C端。任選地，根據(jù)前述技術(shù)(例如WO 94/029350 ；Reiter, Y.，等，自然生物技術(shù)(Nature biotechnology) (1996) 1239-1245 ；Young, N. Μ.,等，F(xiàn)EBSLetters (1995) 135-139 ；或 Rajagopal, V. , et al，蛋白工程(Protein Engineering)(1997) 1453-59)將半胱氨酸殘基引入單鏈Fab片段的VH (包括Kabat位置44)和VL (包括Kabat位置100)結(jié)構(gòu)域。將所有這些分子進(jìn)行重組產(chǎn)生、純化和表征并評(píng)估蛋白表達(dá)、穩(wěn)定性和生物學(xué)活性。在表3中提供用于產(chǎn)生四價(jià)、雙特異性scFab〈EGFR-IGF-lR>，<IGF_1R-EGFR>抗體的抗體設(shè)計(jì)的總結(jié)。對(duì)于該研究，我們使用術(shù)語‘scFab-Ab’來描述各種四價(jià)蛋白實(shí)體。將設(shè)計(jì)的形式的表示顯示在圖13和14中并在表3中列舉。表3-具有C端單鏈Fab片段連接物的不同的雙特異性抗-IGFlR和抗-EGFRscFab-四價(jià)抗體形式和相應(yīng)的scFab-Ab-命名法
權(quán)利要求
1.結(jié)合EGFR和IGF-IR的雙特異性抗體，其包含結(jié)合EGFR的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合IGF-IR的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述雙特異性抗體特征在于 i)所述抗原結(jié)合位點(diǎn)每個(gè)是一對(duì)抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域； ii)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO 1的⑶R3區(qū)域，SEQID N0:2的CDR2區(qū)域，和SEQ ID NO :3的CDRl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ IDNO 4 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 區(qū)域；和 iii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO : 11的⑶R3區(qū)域，SEQID NO 12的⑶R2區(qū)域，和SEQ ID NO 13的⑶Rl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO 14 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 15 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 16 的 CDRl 區(qū)域； 或所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ ID N0:17的⑶R3區(qū)域，SEQID NO 18的⑶R2區(qū)域，和SEQ ID NO 19的⑶Rl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO 20 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 21 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 22 的 CDRl 區(qū)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙特異性抗體，其特征在于 i)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO 1的⑶R3區(qū)域，SEQID NO :2的CDR2區(qū)域，和SEQ ID NO :3的CDRl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ IDNO 4 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 區(qū)域；和 ii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO : 11的⑶R3區(qū)域，SEQID NO 12的⑶R2區(qū)域，和SEQ ID NO 13的⑶Rl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO 14 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 15 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 16 的 CDRl 區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙特異性抗體，其特征在于 i)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO 1的⑶R3區(qū)域，SEQID NO :2的CDR2區(qū)域，和SEQ ID NO :3的CDRl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQ IDNO 4 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 5 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 區(qū)域；和 ii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO 17的⑶R3區(qū)域，SEQID NO 18的⑶R2區(qū)域，和SEQ ID NO 19的⑶Rl區(qū)域，并且在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中包含SEQID NO 20 的 CDR3 區(qū)域，SEQ ID NO 21 的 CDR2 區(qū)域，和 SEQ ID NO 22 的 CDRl 區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙特異性抗體，其特征在于 i)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQID NO :7或SEQ ID NO :8作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 10作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域， ii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQID N0:23或SEQ ID NO :24作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQ ID NO 25或SEQ ID NO 26作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙特異性抗體，其特征在于 i)所述第一抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQID NO :8作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQ ID NO:10作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域， ii)所述第二抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQID NO :23作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQ IDNO 25作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的雙特異性抗體，其特征在于所述抗體是二價(jià)的、三價(jià)的或四價(jià)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其特征在于所述抗體是通過在Asn297具有糖鏈而被糖基化的，其中在所述糖鏈中的巖藻糖的量是65%以下。
8.藥物組合物,其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的雙特異性抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，用于治療癌癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的雙特異性抗體，其用于治療癌癥。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的雙特異性抗體用于制備治療癌癥的藥物的應(yīng)用。
12.治療患有癌癥的患者的方法，所述方法通過向需要所述治療的患者施用根據(jù)權(quán)利要求1-7的雙特異性抗體進(jìn)行。
全文摘要
針對(duì)EGFR和針對(duì)IGF-1R的雙特異性抗體，制備它們的方法，包含所述抗體的藥物組合物及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102643345SQ20121008230
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日
發(fā)明者麗貝卡·克羅斯代爾, 烏爾里?！げ剂挚寺? 克勞斯-彼得·金克勒, 克里斯蒂安·克萊因, 克里斯蒂安·吉爾德斯, 埃克·霍夫曼, 巴勃羅·烏馬納, 揚(yáng)·奧拉夫·斯特拉克, 沃爾夫?qū)ぶx弗, 維爾馬·勞 申請(qǐng)人:羅氏格黎卡特股份公司