專利名稱：Kir等位基因及kir-配體的基于分子決定簇的分型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及進行基于分子決定簇的功能性殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)等位基因分型和配體分型的測定。具體地本發(fā)明提供了用于基于KIR2DL1的位置245、HLA-C的位置77以及HLA-B和HLA-A的位置83上的多態(tài)性對具有獨特功能性質(zhì)的KIR2DL1和KIR配體的不同等位基因組群進行分型的單核苷酸多態(tài)性(SNP)測定的方法、組合物和試劑盒。所述測定適合用于預(yù)測健康、疾病和移植中的NK細胞活性。
背景技術(shù)：
天然殺傷(NK)和T細胞在針對轉(zhuǎn)化或病毒感染的細胞的免疫力中起著中心和補充作用(Vely等人2001)。NK細胞通過使用控制其激活、增殖和效應(yīng)子功能的細胞表面受體的集庫區(qū)分健康與異常細胞(Lanier等人2005)。人NK細胞的標(biāo)志是I類HLA特異性殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)的表達(Uhrberg等人2005)。KIR不僅在單個NK細胞的水平上變化性地表達而且它們還是高度多態(tài)性和多基因性的，這樣，KIR簇的基因含量在個體間是變化的(Uhrberg等人2005)。迄今為止已知存在15個KIR基因(+2個假基因)，11個編碼具有兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(KIR2D基因)的受體，4個編碼具有3個結(jié)構(gòu)域(KIR3D)的受體。KIR家族被進一步分成抑制性KIR和刺激性KIR。抑制性KIR基因的特征在于，特征性的基于免疫受體酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的長細胞質(zhì)尾(在其名稱中通過“L”來表示長)。相反地，刺激性KIR具有缺乏ITIM的短細胞質(zhì)尾(在其名稱中通 過“S”來表示短)，但在跨膜區(qū)中具有帶電荷的氨基酸，所述氨基酸為激活分子提供了停泊位點(Uhrberg等人2005)。許多人類疾病據(jù)報道與KIR基因含量的差異相關(guān)，包括自身免疫性疾病、炎癥性障礙、感染性疾病、免疫缺乏癥、癌癥和生殖系統(tǒng)障礙(Kulkarni等人2008)。由于缺乏用于KIR等位基因的不同功能組群的高通量分型的快速方法，此類疾病與KIR的等位基因間的功能異質(zhì)性之間的關(guān)系仍不清楚。在下列參考文獻中公開了除其它醫(yī)學(xué)方法外，KIR基因型分型用于移植的用途:Lebedeva 等人，，，Comprehensive Approach to High-Resolution KIR Typing，，HumTmmun., 68 (9): 789-96 (2007) ；Gonzalez 等人，，，Killer Cell Immunoglobulin-LikeReceptor Allele Discrimination by High-Resolution Melting^ HumTmmun., 70 (10): 858-63 (2009) ；Yun 等人，，，A Novel Method for KIR-Ligand Typingby Pyrosequencing To Predict NK Cell Alloreactivity”Blood (ASH Annual MeetingAbstracts)106:Abstractl407(2005)(也參見 Yun 等人，”A Novel Method forKIR-Ligand Typing by Pyrosequencing To Predict NK Cell Alloreactivity，，ClinImmunol.123 (3): 272-280 (2007).) ；Leung 等人，，，Comparison of Killer Ig-LikeReceptor Genotyping and Phenotyping for Selection of Allogeneic Blood StemCell Donors，，J Immun.174:6540-6545 (2005) ；Dinauer 等人，，，Primers, Methods andKits For Detecting Killer-Cell Immunoglobulin-Like Receptor Alleles，， 美國專利申請公布號US2008/0280289 (也參見國際申請公布號W02005/046459選擇的部分；和 KIR Genotyping Product Brochure2004.) ；Chen 等人，”Natural KillerImmunoglobul in-Like Receptor (KIR) Assay ”國際申請公布號 W02009/051672。也參見 PCT/US2008/011671 ;Trachtenberg 等人，”Methods and Compositions For KIR Genotyping^美國專利申請公布號US2008/0213787 (也參見國際申請公布號W02007/041067.)；Houtchens 等人，，，High-Throughput Killer Cell Immunoglobulin-Like ReceptorGenotyping By MALD1-TOF Mass Spectrometry With Discovery of Novel Alleles，，Immunogenetics.59 (7): 525-37 (2007).；Gomez-Lozano 等人，，，Genotyping of HumanKiller-Cell Immunoglobulin-Like Receptor Genes by Polymerase Chain Reactionwith Sequence-Specific Primers:An Update” Tissue Antigens 59 (3):184-193(2002)；和Shilling等人，，，Allelic Polymorphism Synergizes with Variable Gene Content toIndividualized Human KIR Genotype，，J Immunol.168:2307-2315 (2002)。將所述每一篇參考文獻通過引用整體并入本文。此外，一些可獲得的KIR基因分型試劑盒包括Inno-Train, ”KIR-Ready Gene”產(chǎn)品手冊 9/2005 ；Miltenyi Biotec, ”KIR 分型試劑盒”產(chǎn)品手冊 2009 ；Invitrogen, ”KIR 基因分型SSP試劑盒”產(chǎn)品手冊11/2006 ;和Tepnel Lifecodes, ”KIR分型”6/2005。將所述每一個產(chǎn)品手冊通過引用整體并入本文。因此，由于疾病易感性與各種KIR配體群(constellation)關(guān)聯(lián)以及等位基因分型在移植的成功中起著重要作用，所以需要用于檢測KIR及其配體的分子決定簇的新型方法、組合物和試劑盒。發(fā)明概述本發(fā)明涉及進行基于分子決定簇的功能性殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)等位基因分型和配體分型的測定。具體地，本發(fā)明`提供了用于基于KIR2DL1的位置245、HLA-C的位置77以及HLA-B和HLA-A的位置83上的多態(tài)性對具有獨特功能性質(zhì)的KIR2DL1和KIR配體的不同等位基因組群進行分型的單核苷酸多態(tài)性(SNP)測定的方法、組合物和試劑盒。所述測定適合用于預(yù)測健康、疾病和移植中的NK細胞活性。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)調(diào)節(jié)NK細胞功能。KIR及其HLA配體在自然界中是高度多態(tài)的，具有大量等位基因多態(tài)性。目前，不存在利用相關(guān)功能信息進行KIR-和HLA-等位基因分型的方便方法。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及基于位置245上的多態(tài)性對具有獨特功能性質(zhì)的KIR2DL1的不同等位基因組群進行分型的單核苷酸多態(tài)性(SNP)測定。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及基于HLA-C的位置77以及HLA-B和-A的位置83上的多態(tài)性對不同KIR-配體進行分型的SNP測定。據(jù)信，用于KIR和KIR-配體分型的本SNP測定遠較現(xiàn)有的高分辨率分型便宜和快速得多。重要地，本高通量法提供了在預(yù)測健康、疾病和移植中的NK細胞活性中的信息性結(jié)果。無意將本發(fā)明限定于KIR等位基因分型，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及探針，所述探針包含選自SEQ.1D.NO:9的核酸序列、SEQ.1D.NO: 10的核酸序列、與SEQ.1D.NO:9具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO: 10具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.N0:9具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO: 10具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:9具有大于90%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO: 10具有大于90%的同源性的核酸序列的核酸序列，其中所述探針能夠區(qū)分編碼KIR2DL1的位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在與不存在。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括:a)提供:1.來自上述的探針和i1.使用說明書。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了方法，其包括:a)提供:1.來自受試者的樣品，其中所述樣品包括編碼KIR的核酸；i1.多個引物，其中所述引物能擴增KIR2DL1的所有等位基因；ii1.多個探針，其中所述探針能識別編碼位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在；和幻將所述樣品與所述引物接觸足以擴增KIR2DL1的所有等位基因的足量時間；和c)利用所述多個探針測定編碼精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在和不存在。在一些實施方案中，所述方法還包括:取決于精氨酸的編碼序列的存在，利用第一療法治療受試者。在其它實施方案中，所述方法還包括:取決于半胱氨酸的編碼序列的存在，利用第二療法治療受試者。在另一個實施方案中，本發(fā)明提 供了試劑盒，其包括:a)提供:1.用于KIR分型的多個引物和多個探針，其中所述分型包括區(qū)分編碼KIR2DL1的位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在和不存在；和i1.使用說明書。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了探針，所述探針包含選自SEQ.1D.N0:7的核酸序列、SEQ.1D.N0:8的核酸序列、與SEQ.1D.N0:7具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:8具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.N0:7具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:8具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO: 7具有大于90%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.N0:8具有大于90%的同源性的核酸序列列的核酸序列，其中所述探針能夠區(qū)分編碼HLA-C1/C2的位置77上的絲氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括:a)提供:1.上述探針；和
i1.使用說明書。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了方法，其包括:a)提供:1.來自受試者的樣品，其中所述樣品包括編碼KIR配體的核酸；i1.多個引物，其中所述引物能擴增HLA-C1/C2的所有等位基因多個探針，其中所述探針能識別編碼HLA-C1/C2的位置77上的絲氨酸和天冬酰胺的核酸的存在；和《將所述樣品與所述引物接觸足以擴增HLA-C1/C2的所有等位基因的足量時間；和c)利用所述多個探針測定編碼絲氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在。在一些實施方案中，所述方法還包括:取決于絲氨酸的編碼序列的存在，利用第一療法治療受試者。在一些實施方案中，所述方法還包括:取決于天冬酰胺的編碼序列的存在，利用第二療法治療受試者。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，包括:a)提供:1.用于KIR配體分型的多個引物和多個探針，其中所述分型包括區(qū)分編碼HLA-C1/C2的位置77上的絲氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在；和i1.使用說明書。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及探針，所述探針包含選自SEQ.1D.NO:3的核酸序列、SEQ.1D.N0:4的核酸序列、與SEQ.1D.N0:3具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.N0:4具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.N0:3具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:4具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO: 3具有大于90%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.N0:4具有大于90%的同源性的核酸序列列的核酸序列，其中所述探針能夠區(qū)分編碼HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA_Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸序列的存在和不存在。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括:a)提供:1.來自上面的探針:和i1.使用說明書。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及方法，其包括:a)提供:1.來自受試者的樣品，其中所述樣品包含編碼KIR配體HLA-B和-A的核酸；i1.多個引物，其中所述引物能擴增HLA-B/A的所有等位基因；ii1.多個探針，其中所述探針能識別編碼HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA-Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸的存在；和b)將所述樣品與所述引物接觸足以擴增HLA-B/A的所有等位基因的足量時間；和(3)使用所述多個探針測定編碼精氨酸和甘氨酸的核酸序列的存在和不存在。在一些實施方案中，所述方法還包括:取決于精氨酸的編碼序列的存在，利用第一療法治療受試者。在一些實施方案中，所述方法還包括:取決于甘氨酸的編碼序列的存在，利用第二療法治療受試者。在其它實施方 案中，本發(fā)明提供了試劑盒，包括:a)提供:1.用于KIR配體分型的多個引物和多個探針，其中所述分型包括區(qū)分編碼HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA-Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸序列的存在與不存在；和i1.使用說明書。雖然提供了特定的正向和反向引物以及探針，但所述特定的序列并不意味著是限定性的，并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的互補和反向互補(有義和反義串，相當(dāng)?shù)纳矸?具有約70-100%，優(yōu)選約80-100%，更優(yōu)選約85-100%，更優(yōu)選約90_100%，最優(yōu)選約95-100%的相似性和同一性)、同源物、模擬物、其部分/片段，5’ -3’或3’ -5’的順序)序列。此外，所顯示的實施方案的描述無意是限定性的，并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有等同物、相當(dāng)?shù)募夹g(shù)、試劑、來源、稀釋劑、用途等。此外，KIR等位基因分型和配體分型預(yù)期與哺乳動物的基因組內(nèi)的其它多態(tài)性基因座的應(yīng)用一起，被廣泛地用于疾病檢測/診斷、管理以及治療性/非治療性處理。例如，僅舉例說明但無意是限定性的，更具體地人，而且還包括狗、貓、馬、大鼠、小鼠、倉鼠、牛、綿羊、山羊、豬等等其它非人動物。附圖概述

圖1顯示基于分子決定簇的KIR分型預(yù)測NK細胞活性。使用Automacs (MiltenyiBiotech)從供體PBMC分離⑶56+細胞。將分離的⑶56+細胞與靶721.221_Cw7或721.221-Cw6混合。在進行⑶107標(biāo)記程序后，利用不同的KIR mAb對細胞進行染色。對KIR2DL1+NK細胞亞組進行門控，使用流式細胞術(shù)檢測⑶107的表面表達。(A).在無任何靶細胞的情況下，NK細胞上的CD107的表面表達；(B).KIR2DL1R245/R245陽性NK細胞亞組針對表達KIR2DL1非配體HLA-Cw7的721.221細胞的脫粒；(C).KIR2DL1R245/R245陽性NK細胞亞組針對表達KIR2DL1配體HLA_Cw6的721.221細胞的脫粒；(D).KIR2DL1C245/C245陽性NK細胞亞組針對表達KIR2DL1非配體HLA_Cw7的721.221細胞的脫粒；(E).KIR2DL1C245/C245陽性NK細胞亞組針對表達KIR2DL1配體HLA_Cw6的721.221細胞的脫粒。圖2顯示KIR-配體組群分型預(yù)測NK細胞活性。利用⑶45預(yù)標(biāo)記供體PBMC并且與K562混合。使用抗KIR mAb門控單個KIR+NK細胞亞組。圖框的順序顯示單個KIR+(前兩個圖框)的門控策略和KIR2DLI + (最下方的圖框)NK細胞亞組的脫粒。圖3顯示利用⑶45預(yù)標(biāo)記的并且與K562混合的供體PBMC。如圖2中所述對單個KIR+NK細胞亞組進行門控。(A).KIR2DL2/2DL3+亞組的脫粒；(B).KIR3DL1+亞組的脫粒；和(C).5個供體KIR2DL1+和KIR2DL2/2DL3+NK細胞亞組對K562細胞的反應(yīng)性。圖4顯示NK細胞亞組的反應(yīng)性可基于KIR配體組群分型來預(yù)測。使用SNP測定進行供體細胞的KIR-配體分型，隨后預(yù)測NK細胞許可(licensing)。使用抗KIR mAb對單個KIR+NK細胞亞組進行門控，使用⑶107標(biāo)志測量NK細胞脫粒。測定NK細胞亞組對異位表達它們的配體的靶細胞的反應(yīng)性。顯示了(A).馴化(左圖框，P值〈0.05)和未馴化(右圖框)的KIR2DL1+NK細胞亞組對表達其配體Cw6或非配體Cw7的721.221細胞的反應(yīng)性；和(B)馴化(左圖框，P值〈0.05)和未馴化(右圖框)的KIR2DL2/2DL3+NK細胞亞組對表達其非配體Cw6或配體Cw7的721.221的反應(yīng)性。圖5顯示了 KIR2DL1的功能組群分型。從供體PBMC提取DNA。基于單核苷酸多態(tài)性設(shè)計用于KIR2DL1等位基因的不同功能組群的探針。設(shè)計可特異性擴增KIR2DL1的所有等位基因的引物。使用來自Applied Biosystems的HT7900進行KIR2DL1等位基因分型。KIR2DL1C245/C245 以藍點顯示；KIR2DL1R245/C245 以綠點顯示;KIR2DL1R245/R245 以紅點顯示;陰性對照顯示為黑框；未確定的顯示為黑色X。圖6顯示KIR配體的功能組群分型。從供體PBMC提取DNA?；趩魏塑账岫鄳B(tài)性設(shè)計用于對KIR-配體分型的探針。A)KIR2DL1和KIR2DL2/2DL3配體HLA-C的分型，(HLA-C2/HLA-C2以藍點 顯示；HLA-C1/HLA-C2以綠點顯示；HLA-CI/HLA-CI以紅點顯示；陰性對照顯示為黑框；B)KIR3DL1配體HLA-Bw4的分型(HLA-Bw4/HLA_Bw4以藍點顯示；HLA_Bw4/HLA-Bw6以綠點顯示；HLA-Bw6/HLA-Bw6以紅點顯示；陰性對照顯示為黑框)。定義為了有利于理解本發(fā)明，下面定義了許多術(shù)語(在本定義部分中在引號中顯示的)。本文中定義的術(shù)語(除非另有所指)具有與與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。除非另外指出，否則說明書和權(quán)利要求中使用的表達成分、性質(zhì)例如分子量、反應(yīng)條件等等的量的所有數(shù)字將被理解為在所有情況下由術(shù)語“約”修飾。因此，除非相反地指出，否則說明書和權(quán)利要求中的數(shù)字參數(shù)是取決于試圖通過本發(fā)明獲得的期望性質(zhì)可變化的近似值。最起碼，并且未將等同原則的應(yīng)用限制到權(quán)利要求的范圍，每一個數(shù)值參數(shù)應(yīng)當(dāng)至少根據(jù)報告的有效數(shù)字的數(shù)目并應(yīng)用常用舍入技術(shù)來解釋。盡管描述本發(fā)明的廣泛范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但在具體的實施例中盡可能精確地報告數(shù)值。然而，任何數(shù)值固有地包含必定由在數(shù)值的測試測量中發(fā)現(xiàn)的誤差引起的標(biāo)準(zhǔn)差。如本文中所用，術(shù)語”試劑盒〃是指用于遞送材料的任何遞送系統(tǒng)。在反應(yīng)測定的上下文中，此類遞送系統(tǒng)包括允許貯存反應(yīng)試劑(例如，適當(dāng)?shù)娜萜髦械墓押塑账?、酶?和/或支持材料(例如，緩沖液、用于進行測定的書面說明書等)、將所述反應(yīng)試劑和/或支持材料從一個位置運輸或遞送至另一個位置的系統(tǒng)。例如，試劑盒包括一個或多個包含相關(guān)反應(yīng)試劑和/或支持材料的外殼(例如，盒子)。如本文中所用，術(shù)語”分散試劑盒(fragmented kit) 〃是指包括兩個或更多個單獨容器的遞送系統(tǒng),每一個容器包含總試劑盒組分的子部分?？蓪⑷萜饕黄鸹騿为毜剡f送至期望的受者。例如，第一容器可包含用于測定的酶，而第二容器包含寡核苷酸。術(shù)語”分散試劑盒〃意欲包括包含聯(lián)邦食品、藥品和化妝品法(Federal Food, Drug, and Cosmetic Act)的第520(e)節(jié)下規(guī)定的分析物特異性試劑(ASR)(但不限于其)的試劑盒。事實上，包含兩個或更多個單獨的容器(各自包含總試劑盒組分的子部分)的任何遞送系統(tǒng)包括在術(shù)語”分散試劑盒"內(nèi)。相反地，"組合試劑盒(combined kit) 〃是指在單個容器中(例如,在裝有每一種期望的組分的單個盒子中)包含反應(yīng)測定的所有組分的遞送系統(tǒng)。術(shù)語”試劑盒"包括分散和組合試劑盒。如本文中所用，術(shù)語”受試者〃或〃患者〃是指可對其施用根據(jù)本發(fā)明的組合物(例如，為了實驗、診斷、預(yù)防和/或治療目的)的任何生物。典型受試者包括動物(例如，哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類動物和人；昆蟲；蠕蟲等)。如本文中所用，術(shù)語”單核苷酸多態(tài)性〃或"SNP"，是指沿著核苷酸序列具有一個或多個變體核苷酸的任何位置。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是在人基因組中發(fā)現(xiàn)的DNA序列變異的最常見形式，通常定義為與作為人基因組計劃的一部分產(chǎn)生的基線參照DNA序列的差異，或定義為在從一般群體抽取的個體的亞組之間發(fā)現(xiàn)的差異。當(dāng)比較兩個隨機選擇的人染色體時，SNP以約1SNP/1000個堿基對的平均比率發(fā)生?？设b定極罕見的SNP (其可被限制于特定的個體或家族)，或相反地，可發(fā)現(xiàn)極罕見的SNP在一般人群中是極普通的(存在于許多不相關(guān)的個體中)。SNP可因DNA復(fù)制中的錯誤(S卩，自發(fā)地)或因誘變劑(即，來自特定的DNA損傷物質(zhì))而增加，并且可在生物的繁殖過程中傳遞給個體的后代。如本文中所用，術(shù)語”基因〃是指包含產(chǎn)生多肽、前體或RNA(例如，rRNA、tRNA)所必需的編碼序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可由全長編碼序列或由編碼序列的任何部分編碼，只要全長或片段的期望的活性或功能性質(zhì)(例如，酶促活性、配體結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫原性等)得到保留即可。該術(shù)語還包括結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)以及與編碼區(qū)的5’和3’末端相鄰的序列(所述相鄰的序列在任一末端延續(xù)約IKB或更長的距離，以便基因相應(yīng)于全長mRNA的長度)。位于編碼區(qū)的5’并且存在于mRNA上的序列稱為5’非翻譯序列。位于編碼區(qū)的3’或下游并且存在于mRNA上的序列稱為3’非翻譯序列。術(shù)語”基因〃包括基因的cDNA和基因組形式。 基因的基因組形式或克隆包含被稱為“內(nèi)含子”或“間插區(qū)(intervening region) ”或“間插序列”的非編碼序列打斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子是基因的被轉(zhuǎn)錄為核RNA(hnRNA)的區(qū)段；內(nèi)含子可包含調(diào)控元件例如增強子?？蓮募毎嘶虺跫夀D(zhuǎn)錄物除去或“剪接掉”內(nèi)含子；內(nèi)含子因而不存在于信使RNA (mRNA)轉(zhuǎn)錄物中。mRNA在翻譯過程中用于指定新生多肽的氨基酸的序列或順序。如本文中所用，術(shù)語”異源基因"是指不在其天然環(huán)境中的基因。例如，異源基因包括被引入另一物種的來自一個物種的基因。異源基因還包括已以一定的方式(例如，突變、多個拷貝的添加、連接至非天然調(diào)控序列等)改變的對于生物而言為天然的基因。異源基因與內(nèi)源基因的區(qū)別在于:異源基因序列通常被連接至那些發(fā)現(xiàn)在染色體中與所述基因序列非天然聯(lián)接的DNA序列或與非在自然界中發(fā)現(xiàn)的染色體的部分聯(lián)接(例如，在基因通常不在其中表達的基因座中表達的基因)。如本文中所用，術(shù)語”轉(zhuǎn)基因〃是指被整合進入生物(例如，非人動物)的基因組并且在有性生殖過程中被傳遞給生物的后代的異源基因。如本文中所用，術(shù)語〃互補的〃或〃互補性〃用于指通過堿基配對法則發(fā)生關(guān)系的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，對于序列” 5’ -A-G-T-3’ 〃，其與序列〃3’ -T-C-A-5’ 〃互補。互補性可以是“部分的”，其中核酸的堿基中僅有一些按照堿基配對法則進行匹配?；蛘撸怂嶂g存在“完全”或“總的”互補性。核酸鏈之間的互補性程度對核酸鏈間的雜交效率和強度具有重大影響。這在擴增反應(yīng)以及依賴于核酸之間結(jié)合的檢測方法中是特別重要的。如本文中所用，術(shù)語”同源性〃是指互補性的程度。存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。部分互補序列是至少部分地抑制完全互補核酸分子與靶核酸雜交的核酸分子，其是“大體上同源的”。完全互補的序列對靶序列的雜交的抑制可在低嚴(yán)格度條件下使用雜交測定(Southern或Northern印跡、溶液雜交等)來檢查。大體上同源的序列或探針將在低嚴(yán)格度條件下競爭和抑制完全同源的核酸分子對靶的結(jié)合(即雜交)。這并非說低嚴(yán)格度條件是允許非特異性結(jié)合的條件；低嚴(yán)格度條件要求兩個序列彼此的結(jié)合是特異性(即，選擇性)相互作用。非特異性結(jié)合的不存在可通過使用大體上非互補的(例如，低于約30%的同一性)的第二靶來測試；在非特異性結(jié)合不存在的情況下，探針將不與第二非互補革El雜交。如本文中所用，術(shù)語”聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)〃 ("PCR")是指描述用于在DNA混合物中增加靶序列的區(qū)段的濃度而無需克隆或純化的方法的K.B.Mullis美國專利N0.4，683，195、4，683，202和4，965，188 (通過引用并入本文)的方法。因為靶序列的期望的擴增區(qū)段在混合物中成為占優(yōu)勢的序列(就濃度而言)，因此它們被稱作是“PCR擴增的”。類似地，如本文中所用，術(shù)語”改良PCR"是 指其中在RNA聚合酶存在的情況下從DNA模板擴增RNA序列或在逆轉(zhuǎn)錄酶存在的情況下從RNA模板擴增DNA序列的擴增方法。如本文中所用，術(shù)語”嚴(yán)格度〃用于指溫度、離子強度以及存在其它化合物例如有機溶劑的條件，在該條件下進行核酸雜交?！皣?yán)格度”通常在約Tm至低于Tm約20° C至25。C的范圍內(nèi)發(fā)生。“嚴(yán)格雜交”可用于鑒定或檢測相同的多核苷酸序列或鑒定或檢測相似或相關(guān)的多核苷酸序列。例如，當(dāng)在嚴(yán)格條件下將片段用于雜交反應(yīng)時，有利于包含獨特序列(即，為非同源的或包含低于約50%的同源性或互補性的區(qū)域)的片段的雜交?；蛘?，當(dāng)使用“弱的”或“低”嚴(yán)格度的條件時，對于來源于通常在遺傳上是多樣的生物的核酸(即，例如，互補序列的頻率在此類生物之間通常較低)，雜交可發(fā)生?！暗蛧?yán)格度條件”包括這樣的條件，所述條件等同于在42 ° C下于由5x SSPE (43.8g/l NaCl, 6.9g/l NaH2PO4.H2O 和 1.85g/l EDTA,利用 NaOH 調(diào)整至
7.4 的 pH)、0.l%SDS、5x Denhardt's 試劑{每 500ml 的 50x Denhardt's 包含:5gFicoll (Type400, Pharmacia), 5g BSA (Fraction V ；Sigma)}和 100 μ g/ml 變性鮭精 DNA 組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在42° C下于包含5x SSPE、0.1%SDS的溶液中洗滌(當(dāng)使用長度約500個核苷酸的探針時)。許多等同條件還可用于包括低嚴(yán)格度條件；因素例如探針的長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)和靶的性質(zhì)(存在于溶液中的或固定的DNA、RNA、堿基組成等)和鹽及其它組分的濃度(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)以及雜交溶液的組分可以變化，以產(chǎn)生與上文所列的條件不同但與其等同的低嚴(yán)格度雜交的條件。此外，還可使用在高嚴(yán)格度條件下促進雜交的條件(例如，增加雜交和/或洗滌步驟的溫度，在雜交溶液中使用甲酰胺等)?！ㄖ械葒?yán)格度條件"，當(dāng)用于指核酸雜交時，包括這樣的條件，所述條件等同于在42°C下于由 5X SSPE (43.8g/l NaCl, 6.9g/l NaH2PO4H2O 和 1.85g/l EDTA,利用 NaOH 調(diào)整至7.4的pH)、0.5%SDS、5XDenhardt’ s試劑和100 μ g/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在42°C下于包含1.0X SSPEU.0%SDS的溶液中洗滌(當(dāng)使用長度為約500個核苷酸的探針時)?！ǜ邍?yán)格度條件"，當(dāng)用于指核酸雜交時，包括這樣的條件，所述條件等同于在42°C下于由 5X SSPE (43.8g/l NaCl, 6.9g/l NaH2PO4H2O 和 1.85g/l EDTA,利用 NaOH 調(diào)整至7.4的pH)、0.5%SDS、5X Denhardt's試劑和100 μ g/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在42°C下于包含0.1X SSPEU.0%SDS的溶液中洗滌(當(dāng)使用長度為約500個核苷酸的探針時)。如本文中所用，術(shù)語”雜交〃用于指通過使用任何方法(通過所述方法，核酸的鏈通過堿基配對與互補鏈結(jié)合形成雜交復(fù)合物)進行的互補核酸的配對。雜交和雜交的強度(即，核酸之間締合的強度)受這樣的因素如核酸之間的互補性程度、使用的條件的嚴(yán)格度、形成的雜交體的Tni以及核酸內(nèi)的g:c比率影響。 如本文中所用，術(shù)語“雜交復(fù)合物”是指通過互補的G與C堿基之間以及互補的A與T堿基之間的氫鍵的形成在兩個核酸序列之間形成的復(fù)合物；這類氫鍵可通過堿基堆積相互作用被進一步穩(wěn)定。兩個互補的核酸序列的氫鍵以反向平等構(gòu)型存在。雜交復(fù)合物可在溶液(例如，Cd或RJ分析)中或在存在于溶液中的一個核酸序列與固定至固體載體(例如，用于Southern和Northern印跡、斑點印跡中的尼龍膜或硝酸纖維素濾膜或原位雜交包括FISH(熒光原位雜交)中使用的載玻片)的另一個核酸序列之間形成。如本文中所用，術(shù)語”Tm"用于指“解鏈溫度”。解鏈溫度是一群雙鏈核酸分子一半分離成單鏈時的溫度。如通過標(biāo)準(zhǔn)參照預(yù)測的，當(dāng)核酸存在于IM NaCl的水溶液中時，Tm值的簡單估計可利用公式:Tm=81.5+0.41 (%G+C)來計算。Anderson等人，”QuantitativeFilter Hybridization”In:Nucleic Acid Hybridization(1985)。更復(fù)雜的計算要考慮結(jié)構(gòu)以及序列特征來計算Tm。如本文中所用，術(shù)語”可擴增的核酸"用于指可通過任何擴增方法擴增的核酸?！翱蓴U增的核酸”通常包括“樣品模板”。如本文中所用，術(shù)語”樣品模板”是指針對目標(biāo)靶序列的存在對其進行分析的源自樣品的核酸。相反地，“本底模板”用于指除樣品模板外的核酸，其可以存在于或可以不存在于樣品中。本底模板最常見地是不經(jīng)意的。其可以是遺留物(carryover)的結(jié)果，或其可由于試圖從樣品純化掉的核酸污染物的存在而引起。例如，來自除待檢測的生物外的生物的核酸可作為本底存在于測試樣品中。如本文中所用，術(shù)語”引物"是指寡核苷酸(無論是天然存在的(如在純化的限制酶切消化物中)還是合成產(chǎn)生的)，當(dāng)置于其中誘導(dǎo)與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下(即，在核苷酸和誘導(dǎo)劑例如DNA聚合酶存在的情況下以及在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H下)時，其能夠用作合成起始的點。為了擴增的最大效率，引物優(yōu)選是單鏈的，但可選擇地是雙鏈的。如果是雙鏈的，則首先處理引物以在用于制備延伸產(chǎn)物之前將其鏈分開。優(yōu)選地，弓丨物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠地長以在誘導(dǎo)劑存在的情況下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度可取決于許多因 素，包括溫度、引物的來源和方法的使用。如本文中所用，術(shù)語”探針"是指寡核苷酸(S卩，核苷酸的序列)(無論是天然存在的(如在純化的限制酶切消化物中)還是合成地、重組地或通過PCR擴增產(chǎn)生的)，其能夠與另一個目的寡核苷酸雜交。探針可以是單鏈或雙鏈的?？刂朴糜跈z測、鑒定和分離特定基因序列?？紤]到本發(fā)明的中使用的任何探針將用任何“報告分子”標(biāo)記，以便其在任何檢測系統(tǒng)中可被檢測到，包括但不限于酶(例如，ELISA，以及基于酶的組織化學(xué)測定)、熒光、放射性和發(fā)光系統(tǒng)。本發(fā)明無意被限定于任何特定的檢測系統(tǒng)或標(biāo)記物。如本文中所用，術(shù)語"限制性核酸內(nèi)切酶"和"限制性內(nèi)切酶"是指細菌的酶，其每一種在特定的核苷酸序列上或附近切割雙鏈DNA。DNA分子被稱作具有"5’末端〃和"3’末端"，因為單核苷酸以這樣的方式反應(yīng)來產(chǎn)生寡核苷酸，所述方式使得一個單核苷酸的戊糖環(huán)的5’磷酸通過磷酸二酯鍵以一個方向連接至其相鄰戊糖環(huán)的3’氧。因此，如果寡核苷酸的5’磷酸未連接至單核苷酸的戊糖環(huán)的3’氧，則該末端稱為〃5’末端"。如果寡核苷酸的3’氧未連接至另一個單核苷酸的戊糖環(huán)的5’磷酸，則該末端稱為"3’末端"。如本文中所用，核酸序列，即使在更大寡核苷酸的內(nèi)部，也可被稱作具有5’和3’末端。在線性或環(huán)狀DNA分子中，分散元件(discreteelement)被稱為在“下游”或3’元件的“上游”或5’。該術(shù)語反映下列事實:轉(zhuǎn)錄以5’至3’的方式沿著DNA鏈進行。指導(dǎo)連接的基因的轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子元件通常位于編碼區(qū)的5’或上游。然而，增強子元件，當(dāng)位于啟動子元件和編碼區(qū)的3’時，可發(fā)揮其作用。轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號位于編碼區(qū)的3’或下游。如本文中所用，術(shù)語”核酸序列"是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及其片段或部分，并且反之亦然，以及指基因組或合成來源的DNA或RNA，其可以是單鏈或雙鏈的，并且代表有義或反義鏈。類似地，如本文中所用，“氨基酸序列”是指肽或蛋白質(zhì)序列。

如本文中所用，術(shù)語”反義〃，當(dāng)用于指DNA時，是指與DNA雙鏈的有義鏈互補的序列。DNA雙鏈體的〃有義鏈〃是指DNA雙鏈體中被細胞以其天然的狀態(tài)轉(zhuǎn)錄成“有義mRNA”的鏈。因此，"反義"序列是與DNA雙鏈體中的非編碼鏈具有相同序列的序列。如本文中所用，術(shù)語”擴增試劑"是指除引物、核酸模板以及擴增酶外進行擴增所需要的那些試劑(脫氧核糖核苷三磷酸、緩沖液等)。通常，將擴增試劑與其它反應(yīng)組分一起置于和裝于反應(yīng)容器(試管、微孔等)中。如本文中所用，術(shù)語”寡核苷酸"是指短的長度的單鏈多核苷酸鏈。寡核苷酸的長度通常少于200個核苷酸(例如，15至100個)，然而，如本文中所用，該術(shù)語還意欲包括更長的多核苷酸鏈。寡核苷酸通常根據(jù)其長度來稱呼。例如，24個殘基的寡核苷酸被稱為“24聚體”。寡核苷酸可通過自身雜交(self-hybridizing)或通過與其它多核苷酸雜交來形成二級和三級結(jié)構(gòu)。此類結(jié)構(gòu)可包括但不限于雙鏈體、發(fā)夾、十字形結(jié)構(gòu)(cruciform)、彎曲(bend)和三鏈體。如本文中所用，術(shù)語”載體"是指用于將核酸序列從一個細胞轉(zhuǎn)移至另一個細胞或從一個生物轉(zhuǎn)移至另一個生物的系統(tǒng)，包括但不限于將包含核酸序列的組合物遞送至細胞或組織的任何方法。例如，載體包括但不限于質(zhì)粒(例如，pcDNA3.1)、人工染色體、細菌、真菌和病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒以及其它基于核酸的遞送系統(tǒng)等)。如本文中所用，術(shù)語〃表達載體〃、〃表達構(gòu)建體〃、〃表達盒〃和〃質(zhì)?！ㄊ侵高@樣的重組核酸分子，所述核酸分子包含期望的編碼序列和在特定宿主生物中表達有效連接的編碼序列所必需的適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄?。序列可以是雙鏈的或單鏈的。在原核生物中表達所必需的核酸序列通常包括通常與其它序列一起的啟動子、操縱子(任選的)和核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子、增強子以及終止和多腺苷酸化信號。如本文中所用，術(shù)語〃以有效的組合"、〃以有效的順序〃和〃有效連接的〃是指以這樣的方式連接核酸序列以便產(chǎn)生能夠指導(dǎo)給定的基因轉(zhuǎn)錄和/或期望的蛋白質(zhì)分子合成的核酸分子。該術(shù)語還指以這樣的方式連接氨基酸序列以便產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)。如本文中所用，術(shù)語”轉(zhuǎn)染〃是指外源核酸(例如，DNA)至細胞內(nèi)的引入。轉(zhuǎn)染可通過本領(lǐng)域已知的多種方法(包括磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體融合、脂轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、基因槍法(biolistics)(即,微粒轟擊)等)來實現(xiàn)。

如本文中所用，術(shù)語”抗體"是指由免疫原(抗原)在動物中引發(fā)的免疫球蛋白。期望抗體顯示針對免疫原中包含的表位的特異性。術(shù)語”多克隆抗體〃是指從超過一個漿細胞克隆產(chǎn)生的免疫球蛋白；相反地“單克隆抗體”是指從單個漿細胞克隆產(chǎn)生的免疫球蛋白。抗體包括但不限于重組地制備的和修飾的抗體及其抗原結(jié)合片段，例如嵌合抗體、人源化抗體、多功能抗體、雙特異性或寡特異性抗體、單鏈抗體以及(Fab)或F(ab)2片段。如本文中所用，術(shù)語"特異結(jié)合"和“特異性結(jié)合"，當(dāng)用于指抗體與蛋白質(zhì)或肽的相互作用時，意指該相互作用依賴于蛋白質(zhì)上的特定結(jié)構(gòu)(即，例如，抗原決定簇或表位)的存在；換句話說，抗體識別和結(jié)合特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而非結(jié)合整個蛋白質(zhì)。例如，如果抗體是特異于表位“A”的，那么包含表位A(或游離的未標(biāo)記的A)的蛋白質(zhì)在包含標(biāo)記的“A”和抗體的反應(yīng)中的存在將減少結(jié)合至抗體的標(biāo)記的A的量。如本文中所用，術(shù)語“FACS”、“流式細胞術(shù)”和“熒光激活細胞分選儀”可互換使用，并且廣義地指用于測量和分析當(dāng)顆粒在液流中流過光束時由它們產(chǎn)生的信號的系統(tǒng)。例如，僅舉例說明而無意是限定性的，人外周血單核細胞(PBMC)具有可直接熒光染色或使用利用熒光染料標(biāo)記的抗體間接熒光染色的表面標(biāo)志。當(dāng)染色的細胞通過光束時，它們產(chǎn)生被捕獲并且展現(xiàn)在屏幕上的信號。信號包括前向散射(基于尺寸折射的光)、側(cè)向散射(基于粒度而偏離的光)以及從染料產(chǎn)生的突光(參見，Givan, A.L.，’Tlow Cytometry FirstPrinciples,第2版，2001,通過引用并入本文)。如本文中所用，術(shù)語”檢測測定"是指用于檢測變體核酸序列(例如，亞型、多態(tài)性或突變)在給定的等位基因或核酸中存在或不存在的測定(例如，KIR等位基因分型)。如本文中所用，術(shù)語“功能性許可”、“許可”和“馴化”可互換使用并且是指NK細胞能夠區(qū)分或識別自我與非我的過程。更具體地，例如僅舉例說明而無意是限定的，NK細胞根據(jù)表面HLA分子的存在或不存在識別自我與非自我之間的差異。具有針對自我HLA配體的受體的NK細胞是“許可的”并且作好了殺死具有丟失的HLA配體的靶細胞的準(zhǔn)備。如本文中所用，術(shù)語〃細胞培養(yǎng)物〃是指細胞的任何體外培養(yǎng)物。包括在該術(shù)語中的是連續(xù)細胞系(例如，具有永生化表型)、原代細胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)化的細胞系、有限細胞系(finite cell line)(例如,非轉(zhuǎn)化細胞)以及體外維持的任何其它細胞群體。如本文中所用，術(shù)語”樣品〃在其最廣義上使用，包括環(huán)境和生物樣品。環(huán)境樣品包括來自環(huán)境例如土壤和水的材料。生物樣品可以是動物，包括人、液體(例如，血液、血漿和血清)、固體(例如，糞便)、組織、液體食物(例如，奶)以及固體食物(例如，蔬菜)。例如，肺樣品可通過支氣管肺泡灌洗(BAL)來收集，其包括來源于肺組織的液體和細胞。生物樣品可包括細胞、組織提取物、體液、從細胞分離的染色體或染色體外元件、基因組DNA(溶液中的或結(jié)合至固體載體的，例如用于Southern印跡分析)、RNA(溶液中的或結(jié)合至固體載體的，例如用于Northern印跡分析)、cDNA(溶液中的或結(jié)合至固體載體的)等。如本文中所用，術(shù)語”療法"以其最廣義使用，包括對自身免疫疾病、移植相關(guān)障礙、炎癥性障礙、感染性疾病、免疫缺乏癥、癌癥和生殖系統(tǒng)障礙的治療。具體的治療將取決于待治療的病況和受試者的醫(yī)學(xué)需要。本發(fā)明無意僅限定于其中疾病被治愈的療法或治療。在一些實施方案中，通過這樣的治療減輕疾病的一個或多個癥狀就足夠了，例如，減輕炎癥，緩解發(fā)熱，減少感染，抑制癌癥生長等。在其它實施方案中，患者的一個或多個病況通過治療得到改善就足夠了，例如改善免疫功能。發(fā)明詳述天然殺傷(NK)細胞是先天性免疫系統(tǒng)的成員，它們對于感染控制(Lodoen等人2006 ；Cerwenka 等人 2001)、癌癥監(jiān)測(Caligiuri, MA2008 ；ffaldhauer 等人 2008 ；Kim 等人2007)和成功懷孕(Santoni等人2008 ;Moffett-King, A.2002)是非常重要的。NK細胞功能受存在于細胞表面上的各種激活和抑制性受體調(diào)節(jié)(Lanier，LL2008)。抑制性受體的主要種類是殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR) (Long等人1996 ;Parham，P.2008)，其在自然界中是高度多態(tài)的(Robinson等人2007)。等位基因多態(tài)性在相同KIR基因的等位基因間產(chǎn)生功能異質(zhì)性。例如，先前已顯示在氨基酸位置245上具有精氨酸的KIR2DL1等位基因，當(dāng)與在相同位置上具有半胱氨酸的等位基因相比較時，具有更高的抑制性活性以及在相同的配體銜接(engagement)后更持久的表面表達(Bari等人2009)。還已報道KIR3DL1的不同等位基因具有不同的對穩(wěn)態(tài)細胞表面表達的抑制性能力和水平(Yawata等人2006)。一些其它的KIR也在其等位基因間顯示可區(qū)別的功能差異(Steiner等人2008 ；Goodridge等人2007 ；Carr等人2005)，盡管確切的分子決定簇還未被闡明。許多人類疾病據(jù)報道與KIR基因含量的差異相關(guān)，包括自身免疫疾病、炎癥性障礙、感染性疾病、免疫缺乏癥、癌癥和生殖系統(tǒng)障礙(Kulkarni等人20 08)。由于缺乏用于KIR等位基因的不同功能組群的高通量分型的方便方法，此類疾病與KIR的等位基因間的功能異質(zhì)性之間的關(guān)系還不清楚。KIR以獨特的特異性識別高度多態(tài)的人白細胞抗原(HLA)I類蛋白(Long等人1996 ；Parham, P.2006)。當(dāng)抑制性KIR識別它們在靶細胞上的特異性配體時，NK細胞功能被抑制。例如，KIR2DL1和KIR2DL2/2DL3識別同種異型的HLA-C，而KIR3DL1識別同種異型的HLA-B和-A。基于成熟蛋白質(zhì)的氨基酸位置80上的天冬酰胺或賴氨酸的存在，HLA-C配體被分成兩大組群(分別是HLA-Cl和HLA-C2) (Mandelboim等人1996)。此外，HLA-Cl在氨基酸位置77上包含保守的絲氨酸殘基，而在HLA-C2中，相同位置上存在天冬酰胺。KIR2DL1識別 HLA-C2，KIR2DL2/2DL3 識別 HLA-Cl (Colonna 等人 1993)?；谠诎被嵛恢?77-83中的差異，HLA-B也被分成兩個組群HLA-Bw4和HLA_Bw6。具有HLA_Bw4表位的HLA-B和HLA-A (A*23, A*24, A*32)等位基因被 KIR3DL1 識別(Gumperz 等人 1995)。HLA_Bw6 不是 KIR的配體。疾病易感性與各種KIR配體群關(guān)聯(lián)。在生物學(xué)上，NK細胞針對靶細胞的反應(yīng)性部分基于KIR及其同源配體的存在。因為某些抑制性KIR的所有等位基因并非以相同的程度與相同配體組群的不同HLA等位基因相互作用(De Santis等人2010)，所以，等位基因多態(tài)性使得難以預(yù)測最終的NK細胞的反應(yīng)性。NK活性的精確預(yù)測需要了解KIR及其配體的分子決定簇。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明涉及關(guān)于如何基于我們關(guān)于獨特分子決定簇的知識，開發(fā)基于實時PCR的方法來評估KIR2DL1的不同功能組群的新型方法。此外，在其它實施方案中，本發(fā)明還涉及用于功能性KIR-配體分型的平行方法。此類方法提供了具有生物學(xué)和臨床重要意義的快速經(jīng)濟的信息。1.討論雖然許多研究已確定了 KIR及其HLA配體在健康、疾病和移植結(jié)果中的重要性，但這兩個組群最具多態(tài)性的基因家族間的等位基因多態(tài)性的重要性仍未得到闡明。障礙是雙重的:第一，雖然毫無疑問在不同等位基因之間存在功能異質(zhì)性，但分子決定簇遠未弄清；第二，即使已知分子決定簇，但仍然沒有用于大容量測試的方便的實驗室方法。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于在分子決定簇被鑒定后對KIR等位基因和KIR配體進行快速經(jīng)濟的分型的新型方法。重要地，結(jié)果提供了生物學(xué)信息性數(shù)據(jù)，其對于臨床診斷是有用的。在過去，可部分基于KIR及其配體的存在來預(yù)測NK細胞反應(yīng)性。然而，等位基因多態(tài)性產(chǎn)生了另一層功能異質(zhì)性。為了精確地預(yù)測NK細胞反應(yīng)性(例如在選擇用于NK細胞移植的供體時)，KIR及其配體的特定功能等位基因組群的存在的知識是非常重要的。例如，僅舉例說明而無意是限定性的，通過使用基于分子決定簇的知識的功能性KIR等位基因組群分型，正確地預(yù)測了當(dāng)與KIR2DL1C245/C245細胞相比較，KIR2DL1R245/R245NK細胞對失去自我更具反應(yīng)性。因此，臨床假說可能是:對于缺乏HLA-C2配體的患者，具有KIR2DL1R245/R245的骨髓移植供體比具有KIR2DL1C245/C245的供體更好。另一個實例(無意是限定性的)是懷孕。當(dāng)缺乏大部分或全部激活性KIR的懷孕母親懷有具有KIR2DL1配體HLA-C2組群的胎兒時，她們處于增加的先兆子癇的風(fēng)險中(Hiby等人2004)。即使母親自己也具有HLA-C2，情況亦如此。由于KIR2DL1R245/R245比KIR2DL1C245/C245抑制性更強，因此可預(yù)測母親是否具有KIR2DL1R245/R245，當(dāng)懷有HLA-C2陽性嬰兒時，她可能處于更高的發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險中。因此在懷孕過程中應(yīng)當(dāng)更密切地監(jiān)測這些母親。類似的預(yù)測對于KIR2DL1相關(guān)疾病也是可能的。例如，據(jù)信，具有KIR2DL1R245/R245等位基因的個體當(dāng)與具有抑制性較弱的KIR2DL1C245/C245等位基因的個體相比較時，可具有減小的發(fā)生自身免疫疾病的機會。相反地，具有KIR2DL1C245/C245等位基因的個體可處于更低的發(fā)生癌癥或慢性感染的風(fēng)險中。借助于本文中描述的高通量KIR2DL1功能組群分型，我們現(xiàn)在應(yīng)當(dāng)能夠快速地研究這些假說。與KIR等位基因類似，現(xiàn)有的HLA-配體分型需要高分辨率的等位基因分型，這是非常昂貴和耗時的。本文中提供的SNP測定可在4小時內(nèi)對94個個體進行KIR-配體分型，成本為每樣品約4美元。相反地，高分辨率HLA分型花費數(shù)周，并且每一個樣品耗費約200美元(Yun等人2007)。
總而言之，本發(fā)明的一些實施方案涉及可在臨床診斷實驗室中被容易地采用的用于KIR等位基因和KIR-配體分型的新型方法。重要地，相信，在NK細胞活性的預(yù)測中結(jié)果是生物學(xué)信息性的。該信息對于NK細胞在健康和疾病中的未來生物學(xué)研究以及對于預(yù)測的臨床醫(yī)學(xué)和移植供體選擇是非常有價值的。這種基于功能分子決定簇的方法對于整個人類基因組中許多其它高度多態(tài)性基因座的快速SNP測定的開發(fā)也是有用的。
I1.材料和方法A.細胞、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)用于KIR2DL1等位基因和KIR-配體分型的DNA樣品獲自St.JudeChildren’sResearch Hospital的健康供體的PBMC。B-淋巴母細胞細胞系721.221購自國際組織相容性工作組(International Histocompatibility Working Group)并且培養(yǎng)在補充有20%FBS和ImM青霉素/鏈霉素的RPMI1640中。利用含有HLA_Cw6和HLA_Cw7的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MMP-1C-GFP-W轉(zhuǎn)導(dǎo)721.221細胞。使用GFP表達，通過流式細胞分選術(shù)分選高表達細胞。K562細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并且培養(yǎng)在補充有10%FBS和ImM青霉素/鏈霉素的RPMI1640中。B.效應(yīng)NK細胞對靶細胞的反應(yīng)性的檢測為了將效應(yīng)細胞與靶細胞分離，利用全白細胞標(biāo)志CD45預(yù)標(biāo)記效應(yīng)細胞。充分洗滌預(yù)標(biāo)記的效應(yīng)細胞，隨后將其與靶細胞混合。如由Bari等人所描述的，進行CD107細胞毒性測定。簡而言之，將預(yù)標(biāo)記的效應(yīng)PBMC與靶K562或721.221細胞混合，隨后在抗-⑶107amAb抗體,克隆H4A3 (BD Pharmingen)存在的情況下于37° C溫育。在I小時的溫育后,添加Golgi stop (BD Biosciences)至終濃度5mM，隨后在細胞培養(yǎng)箱中溫育3小時。隨后洗滌細胞，用包含適當(dāng)?shù)目贵w(抗KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、KIR3DL1和NKG2a的單克隆抗體)的抗體混合物標(biāo)記細胞。從CD45+細胞群門控單個KIR+NK細胞群，利用流式細胞術(shù)(LSR II細胞儀)基于⑶107的表面表達測量細胞毒性。使用下式來計算單個KIR+NK細胞亞組中的⑶107+細胞的絕對數(shù)目:
權(quán)利要求
1.一種探針，包含選自下列的核酸序列:SEQ.1D.NO:9的核酸序列、SEQ.1D.NO: 10的核酸序列、與SEQ.1D.NO: 9具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO: 10具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:9具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO: 10具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:9具有大于90%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO: 10具有大于90%的同源性的核酸序列，其中所述探針能夠區(qū)分編碼KIR2DL1的位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在與不存在。
2.一種試劑盒，其包括: a)提供: 1.來自權(quán)利要求1的探針；和 .使用說明書。
3.一種方法，其包括: a)提供: 1.來自受試者的樣品，其中所述樣品包括編碼KIR的核酸； .多個引物，其中所述引物能擴增KIR2DL1的所有等位基因；ii1.多個探針，其中所述探針能識別編碼位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在；和 b)將所述樣品與所述引物接觸足以擴增KIR2DL1的所有等位基因的足量時間；和 c)利用所述多個探針測定編碼精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在和不存在。
4.權(quán)利要求2的方法，其還包括:取決于精氨酸的編碼序列的存在，利用第一療法治療受試者。
5.權(quán)利要求2的方法，其還包括:取決于半胱氨酸的編碼序列的存在，利用第二療法治療受試者。
6.—種試劑盒,其包括: a)提供: 1.用于KIR分型的多個引物和多個探針，其中所述分型包括區(qū)分編碼KIR2DL1的位置245上的精氨酸和半胱氨酸的核酸序列的存在和不存在；和 .使用說明書。
7.一種探針，包含選自下列的核酸序列:SEQ.1D.NO:7的核酸序列、SEQ.1D.NO:8的核酸序列、與SEQ.1D.NO:7具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:8具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:7具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:8具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO: 7具有大于90%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:8具有大于90%的同源性的核酸序列，其中所述探針能夠區(qū)分編碼HLA-C1/C2的位置77上的絲氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在。
8.一種試劑盒，其包括: a)提供: 1.來自權(quán)利要求7的探針；和 .使用說明書。
9.一種方法，其包括: a)提供:i.來自受試者的樣品，其中所述樣品包括編碼KIR配體的核酸； .多個引物，其中所述引物能擴增HLA-C1/C2的所有等位基因；ii1.多個探針，其中所述探針能識別編碼HLA-C1/C2的位置77上的絲氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在；和 b)將所述樣品與所述引物接觸足以擴增HLA-C1/C2的所有等位基音的足量時間；和 c)利用所述多個探針測定編碼絲氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在。
10.權(quán)利要求9的方法，其還包括:取決于絲氨酸的編碼序列的存在，利用第一療法治療受試者。
11.權(quán)利要求9的方法，其還包括:取決于天冬酰胺的編碼序列的存在，利用第二療法治療受試者。
12.—種試劑盒，其包括: a)提供: 1.用于KIR配體分型的多個引物和多個探針，其中所述分型包括區(qū)分編碼HLA-C1/C2的位置77上的絲氨酸和天冬酰胺的核酸序列的存在和不存在；和 .使用說明書。
13.一種探針，包含選自下列的核酸序列:SEQ.1D.NO:3的核酸序列3、SEQ.1D.NO:4的核酸序列、與SEQ.1D.NO:3具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.N0:4具有大于98%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:3具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.N0:4具有大于95%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.NO:3具有大于90%的同源性的核酸序列、與SEQ.1D.N0:4具有大于90%的同源性的核酸序列，其中所述探針能夠區(qū)分編碼HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA_Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸序列的存在和不存在。
14.一種試劑盒，其包括: a)提供: 1.來自權(quán)利要求13的探針；和 .使用說明書。
15.一種方法，其包括: a)提供: 1.來自受試者的樣品，其中所述樣品包含編碼KIR配體HLA-B和HLA-A的核酸； .多個引物，其中所述引物能擴增HLA-B/A的所有等位基因；ii1.多個探針，其中所述探針能識別編碼HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA_Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸的存在；和 b)將所述樣品與所述引物接觸足以擴增HLA-B/A的所有等位基因的足量時間；和 c)使用所述多個探針測定編碼精氨酸和甘氨酸的核酸序列的存在和不存在。
16.權(quán)利要求15的方法，其還包括:取決于精氨酸的編碼序列的存在，利用第一療法治療受試者。
17.權(quán)利要求15的方法，其還包括:取決于甘氨酸的編碼序列的存在，利用第二療法治療受試者。
18.—種試劑盒，其包括:a)提供:i.用于KIR配體分型的多個引物和多個探針，其中所述分型包括區(qū)分編碼HLA-Bw4和HLA-A中的精氨酸以及HLA-Bw6的位置83上的甘氨酸的核酸序列的存在與不存在；和ii.使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及進行基于分子決定簇的功能性殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)等位基因分型和配體分型的測定。具體地本發(fā)明提供了用于基于KIR2DL1的位置245、HLA-C的位置77以及HLA-B和HLA-A的位置83上的多態(tài)性對具有獨特功能性質(zhì)的KIR2DL1和KIR配體的不同等位基因組群進行分型的單核苷酸多態(tài)性(SNP)測定的方法、組合物和試劑盒。所述測定適合用于預(yù)測健康、疾病和移植中的NK細胞活性。
文檔編號C07H21/00GK103209988SQ201180055075
公開日2013年7月17日 申請日期2011年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月6日
發(fā)明者W·梁, R·巴里 申請人:圣朱德兒童研究醫(yī)院