專利名稱：產(chǎn)生四連蛋白-載脂蛋白a-i脂質(zhì)顆粒的方法，脂質(zhì)顆粒本身及其應(yīng)用的制作方法
產(chǎn)生四連蛋白-載脂蛋白A-1脂質(zhì)顆粒的方法，脂質(zhì)顆粒本身及其應(yīng)用
本發(fā)明涉及脂蛋白和脂質(zhì)顆粒領(lǐng)域。本文報(bào)道了產(chǎn)生包含載脂蛋白、磷脂酰膽堿和脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒的方法，以及四連蛋白-載脂蛋白A-1。
發(fā)明背景
血漿脂蛋白是可溶性的蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物，其在血液中進(jìn)行脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝?；谒鼈兊拿芏取⒊叽?、化學(xué)組成和功能，對(duì)數(shù)種主要種類的脂蛋白進(jìn)行了區(qū)分。在它們之中， 也被稱為高密度脂質(zhì)顆粒的高密度脂蛋白(HDL)顆粒由平均分子量從180kD變化到360kDa 的數(shù)個(gè)亞類組成。它們的平均脂質(zhì)和蛋白含量分別是50重量％。磷脂酰膽堿(PC)占總脂質(zhì)的38%，其次是膽固醇酯和小量的其他極性和非極性脂質(zhì)，包括游離的膽固醇。主要的蛋白成分是載脂蛋白A-1 (Apo A-1)，代表人HDL中約60%的總蛋白重量。
在人體中的膽固醇，尤其是在循環(huán)的體液如血液中的膽固醇，不以分離的分子形式存在，而是以與某些蛋白的復(fù)合物(脂蛋白)形式存在。膽固醇的主要級(jí)分與低密度脂蛋白(LDL)或與高密度脂蛋白(HDL)復(fù)合。LDL顆粒包含載脂蛋白B作為主要的蛋白質(zhì)化合物，而HDL顆粒包含載脂蛋白A-1作為主要的蛋白質(zhì)化合物。
由HDL顆粒吸收的膽固醇被酶卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)酯化。膽固醇酯具有增加的疏水性并朝向HDL顆粒的核心擴(kuò)散。HDL-膽固醇-酯顆?？梢员贿f送到肝臟并從循環(huán)中去除。
HDL顆粒和其主要的多肽載脂蛋白A-1參與反向膽固醇運(yùn)輸(RCT)。其中載脂蛋白A-1增加膽固醇從細(xì)胞中的流出(例如從血管壁的細(xì)胞中流出)，脂質(zhì)的結(jié)合和卵磷脂膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的激活，并由此通過肝臟經(jīng)血漿流動(dòng)清除膽固醇。這是主動(dòng)運(yùn)輸過程，涉及細(xì)胞膜蛋白ATP-結(jié)合-盒式-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-A-1 (ABCA-1)。
基于載脂蛋白A-1和載脂蛋白的治療劑，例如重構(gòu)的HDL顆粒已經(jīng)在上世紀(jì)的70 年代晚期和80年代早期進(jìn)行了鑒定。對(duì)于包含脂質(zhì)顆粒的載脂蛋白A-1-Mi Iano，可以顯示臨床證據(jù)(意味著在動(dòng)脈硬化患者中顯著的斑塊減少)。載脂蛋白A-1-Milano是一種野生型載脂蛋白A-1的二聚體形式，根據(jù)載脂蛋白A-1分子天然存在的突變體進(jìn)行設(shè)計(jì)。通過將氨基酸殘基173 (精氨酸)改變?yōu)榘腚装彼釓亩试S形成二硫鍵能夠形成二聚體。
在W02009/13170`4中，報(bào)道了適合螯合膽固醇和其他分子的包含含有無機(jī)材料核心的納米結(jié)構(gòu)。在W02009/097587中報(bào)道了用于產(chǎn)生納米級(jí)別的界面雙層的方法，包括在獲得混合物的約I小時(shí)內(nèi)從中間體混合物中消除洗滌劑。在W02006/125304中，報(bào)道了治療或預(yù)防冠狀動(dòng)脈疾病的藥物組合物。在US2002/10142953中報(bào)道了涉及脂質(zhì)代謝和心血管疾病的編碼載脂蛋白的組合物。在W02005/084642中，報(bào)道了脫輔基蛋白質(zhì)-共螯合劑 (apoprotein-cochelate)組合物。在W02007/137400中，報(bào)道了治療瓣膜狹窄的方法和化合物。在W02005/041866中報(bào)道了用于治療和預(yù)防急性冠狀動(dòng)脈綜合征的藥物制劑、方法和給藥方案。
在US6，287，590中，報(bào)道了通過共-冷凍干燥形成的肽/脂質(zhì)復(fù)合物。 在US6，037，323中報(bào)道了載脂蛋白A-1激動(dòng)劑以及它們用于治療血脂異常疾病(dislipidemic disorders)的應(yīng)用。
在W02009/097587中，報(bào)道了納米級(jí)別的界面雙層、應(yīng)用和產(chǎn)生方法。在 W02005/065708中報(bào)道了具有提高的耐受性的在免疫原性組合物中的疏水蛋白制劑。在 W02006/069371中，報(bào)道了預(yù)防、抑制和/或逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化的血漿脂質(zhì)化方法。在 FR2915490中報(bào)道了包含膜蛋白的蛋白脂質(zhì)體(proteoliposomes)的形成。
發(fā)明概述
本文報(bào)道了一種用于產(chǎn)生包含蛋白的脂質(zhì)顆粒的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以從包含變性蛋白的溶液通過快速稀釋到包含至少一種脂質(zhì)和洗滌劑的溶液中形成脂質(zhì)顆粒。在該步驟中，洗滌劑的濃度被減少到CMC以下。使用這種方法，可以省去前面的產(chǎn)生天然性質(zhì) (naturation)步驟，并且因此，使用如本文報(bào)道的方法，能夠更快的產(chǎn)生脂質(zhì)顆粒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，稀釋是約1: 3(v V)到約1: 20(v V)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，稀釋是約1: 5 (V V)到約1: 10(v V)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，稀釋是約1: 5 (V V)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，洗漆劑被稀釋至少約3倍。在一個(gè)實(shí)施方案中,洗漆劑被稀釋至少約5倍。
本文報(bào)道的一個(gè)方面是用于產(chǎn)生脂質(zhì)顆粒的方法，所述方法包括下述步驟
i)提供包含變性蛋白的第一溶液，
ii)將第一溶液加入包含至少一種脂質(zhì)和洗滌劑但不包含所述蛋白的第二溶液中，和
iii)從在步驟ii)中獲得的溶液去除洗滌劑并且由此產(chǎn)生脂質(zhì)顆粒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第一溶液不包含脂質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白是重組產(chǎn)生的蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白是載脂蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載脂蛋白是純化的載脂蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載脂蛋白具有選自SEQ ID NO :01，02和04-52和66_67的氨基酸序列的氨基酸序列或包含至少一個(gè)含有SEQ ID NO 01,02和04-52和66和67的氨基酸序列的至少80%的連續(xù)片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載脂蛋白具有氨基酸序列或是選自SEQ ID N0:01，02和 04-52和66和67的氨基酸序列的至少80%的連續(xù)片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載脂蛋白是載脂蛋白A-1。在一個(gè)實(shí)施方案中，載脂蛋白A-1 是人載脂蛋白A-1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載脂蛋白是四連蛋白-載脂蛋白A-1，其具有氨基酸序列 SEQ ID NO 01 或 SEQ ID NO 02 或 SEQ ID NO 66 或 SEQ ID NO :67。
在一個(gè)實(shí)施方案中，載`脂蛋白具有帶有選自R151C和R197C的突變SEQ ID NO 06 的氨基酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二溶液具有是所述第一溶液體積的至少兩倍的體積。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二溶液具有所述第一溶液體積的約3倍到約20倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二溶液具有所述第一溶液體積的約5倍到約10倍。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種脂質(zhì)選自磷脂、脂肪酸和類固醇脂質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種脂質(zhì)是任選地彼此獨(dú)立地選自磷脂、脂肪酸和類固醇脂質(zhì)的至少兩種脂質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種脂質(zhì)來自1-4種脂質(zhì)，即選自包括一種脂質(zhì)、兩種脂質(zhì)、三種脂質(zhì)和四種脂質(zhì)的組。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二溶液包含磷脂、脂質(zhì)和洗滌劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二溶液由磷脂、脂質(zhì)、洗滌劑和緩沖鹽組成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，脂質(zhì)是兩種不同的磷脂。在另一種實(shí)施方案中，脂質(zhì)是兩種不同的磷脂酰膽堿。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一磷脂酰膽堿和第二磷脂酰膽堿的不同之處在于一個(gè)或兩個(gè)脂肪酸殘基或脂肪酸殘基衍生物，其被酯化為磷脂酰膽堿的甘油主鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一磷脂酰膽堿是P0PC，第二磷脂酰膽堿是DPPC。
在一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌劑選自基于糖的洗滌劑，基于聚氧乙烯的洗滌劑，基于膽汁鹽的洗滌劑，合成洗滌劑或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌劑選自膽酸，兩性洗滌劑 (Zwittergent)或它們的鹽。
在本文報(bào)道的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，第一溶液基本不含脂質(zhì)顆粒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在步驟ii)之后和步驟iii)之前包括一個(gè)下述步驟 iia):溫育在步驟ii)中獲得的溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫育和/或去除在從4°C-45°C 的溫度進(jìn)行。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用洗滌劑溫育多肽約O. 5小時(shí)到約60小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用洗滌劑溫育多肽約O. 5小時(shí)到約20小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用洗滌劑溫育多肽約 2小時(shí)到約60小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用洗滌劑溫育多肽約12小時(shí)到約20小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用洗滌劑溫育多肽約16小時(shí)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌劑是具有高CMC的洗滌劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌劑是具有至少5mM的CMC的洗滌劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌劑是具`有至少IOmM的CMC的洗滌劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌劑的濃度在第二溶液中是至少O. 5XCMC。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過滲濾或透析或吸附來進(jìn)行去除。在一個(gè)實(shí)施方案中，吸附選自親和色譜法或疏水色譜法。在一個(gè)實(shí)施方案中，去除通過透析進(jìn)行。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第一溶液具有第一體積，第二溶液具有第二體積，在第一溶液中的蛋白具有限定的濃度，并且在第二溶液中的脂質(zhì)和洗滌劑各具有限定的濃度，并且在步驟ii)中，載脂蛋白的濃度，脂質(zhì)的濃度和洗滌劑的濃度被改變/減少，允許形成脂質(zhì)顆粒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟
iv)純化脂質(zhì)顆粒并由此制備脂質(zhì)顆粒。
本文報(bào)道的一個(gè)方面是通過如本文報(bào)道的方法獲得的脂質(zhì)顆粒。
本文報(bào)道的一個(gè)方面是藥物組合物，所述藥物組合物包含用本文報(bào)道的方法獲得的含有載脂蛋白的脂質(zhì)顆粒，以及將本文報(bào)道的脂質(zhì)顆粒用于制備治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物的應(yīng)用。
發(fā)明詳述
定義
術(shù)語“載脂蛋白”指分別在脂質(zhì)或脂蛋白顆粒中包含的蛋白。
術(shù)語“載脂蛋白A-Ι”指具有蛋白-脂質(zhì)和蛋白-蛋白相互作用性質(zhì)的兩親性螺旋多肽。載脂蛋白A-1作為267個(gè)氨基酸殘基的前載脂蛋白原(prepro-apoliprotein) 由肝臟和小腸合成，所述前載脂蛋白原作為載脂蛋白原(pro-apolipoprotein)被分泌,其被切割為具有243個(gè)氨基酸殘基的成熟多肽。載脂蛋白A-1由被接頭部分分隔的6-8個(gè)不同的氨基酸重復(fù)序列組成，所述氨基酸重復(fù)序列分別由22個(gè)氨基酸殘基組成，所述接頭部分通常是脯氨酸，并且在某些情形中，由數(shù)個(gè)殘基組成的片段組成。示例性的人載脂蛋白A-1氨基酸序列在GenPept數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)NM-000039或數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X00566 ；GenBank NP-000030.1(gi4557321)中報(bào)道。人載脂蛋白A-1 (SEQ ID NO :06)存在天然存在的變體，如 P27H, P27R, P28R, R34L, G50R, L84R, D113E, A-A119D，D127N,缺失 K131, K131M, W132R, E133K，R151C(氨基酸殘基 151 由 Arg 變化為 Cys，載脂蛋白 A-1-Paris)，E160K， E163G，P167R，L168R，E171V，P189R，R197C(氨基酸殘基 173 由 Arg 改變?yōu)?Cys，載脂蛋白 A-1-Milano)和E222K。還包括具有保守氨基酸修飾的變體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，四連蛋白-載脂蛋白A-1包含免疫球蛋白A蛋白酶(IgA蛋白酶)的切割位點(diǎn)的片段。從IgA蛋白酶已知的識(shí)別位點(diǎn)包含下述序列，其中“丨”表示切割鍵的位置
Pro-Ala-Pro 丨 Ser-Pro(SEQ ID NO 61)
Pro-ProSer-Pro(SEQ ID NO 62)
Pro-Pro 丨 Ala-Pro(SEQ ID NO :63)
Pro-Pro 丨 Thr-Pro(SEQ ID NO :64)
Pro-Pro I Gly-Pro(SEQ ID NO :65),
其中更頻繁地選擇和切割前三個(gè)。
術(shù)語“載脂蛋白模擬物”指模擬各個(gè)載脂蛋白的功能的合成多肽。例如，“載脂蛋白 A-1模擬物”是顯示關(guān)于去除膽固醇(即反向膽固 醇流出)與天然載脂蛋白A-1相當(dāng)?shù)纳锕δ艿暮铣啥嚯?。在一個(gè)實(shí)施方案中，載脂蛋白A-1模擬物包含至少一個(gè)兩親性α-螺旋， 其具有在疏水-親水界面集簇的帶正電荷的氨基酸殘基和在親水性面的中心集簇的帶負(fù)電荷的氨基酸殘基。為了模擬載脂蛋白A-1的功能，載脂蛋白模擬物包含從15-29個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)多肽，在一個(gè)實(shí)施方案中，包含22氨基酸殘基(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK(SEQ ID NO :04) ；PVLDLFRELLNELLEAL KQKLK(SEQ ID NO :05))的重復(fù)多肽。
術(shù)語“至少一個(gè)”指一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)或更多。術(shù)語“至少兩個(gè)”指兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)，五個(gè)，六個(gè)，七個(gè)，八個(gè)，九個(gè)，十個(gè)或更多。
術(shù)語“心血管疾病”一般指關(guān)于心臟或血管的疾病或病癥，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈心臟病、腦血管疾病、主動(dòng)脈疾病(aortoiliac disease)、局部缺血性心臟病或外周血管疾病。這些疾病在作為疾病結(jié)果的惡性事件發(fā)生之前可能不會(huì)被發(fā)現(xiàn)，所述惡性事件如心肌梗塞、卒中、心絞痛、短暫性腦缺血性發(fā)作、充血性心力衰竭、主動(dòng)脈瘤，這些惡性事件大多數(shù)情況下會(huì)導(dǎo)致受試者死亡。
術(shù)語"膽酸鹽"指3α，7α，12α-三羥基-5β-膽-24-酸或其鹽，尤其是其鈉鹽?？梢酝ㄟ^在它們各自的轉(zhuǎn)變溫度與洗滌劑溶解的脂質(zhì)一起溫育載脂蛋白來形成脂質(zhì)顆粒。
術(shù)語“臨界膠束濃度”及其縮寫“CMC”，可以交互使用，指這樣的表面活性劑或洗滌劑濃度，超過所述濃度，個(gè)體洗滌劑分子(單體)自發(fā)團(tuán)聚為膠束(膠束，圓桿，層狀結(jié)構(gòu)等)。
術(shù)語“保守氨基酸修飾”指不會(huì)影響或改變根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)顆?；蜉d脂蛋白的特性的氨基酸序列修飾。修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)弓丨入，如位點(diǎn)定向誘變和 PCR-介導(dǎo)的突變。保守氨基酸修飾包括其中氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代的修飾。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有支鏈側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此“變體”蛋白，在本文指這樣的分子，其氨基酸序列與“母體”蛋白氨基酸序列的不同在于至多10個(gè)添加、缺失和/或置換，在一個(gè)實(shí)施方案中，從約2個(gè)到約5個(gè)的添加、缺失和/ 或置換?？梢酝ㄟ^基于 Riechmann，L.，等，Nature(自然)332 (1988) 323-327，和 Queen, C.， 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA86(1989) 10029-10033.所述的分子建模的誘變來進(jìn)行氨基酸序列修飾。
術(shù)語“洗滌劑”指表面活性化學(xué)物質(zhì)?！跋礈靹蓖ǔＪ蔷哂蟹菢O性疏水部分和極性親水部分的兩親性分子。術(shù)語“兩性離子洗漆劑(zwitterionicdetergent) ”指總電荷為零并且同時(shí)包含至少一個(gè)帶正電荷的部分和至少一個(gè)帶負(fù)電荷的部分的表面活性化學(xué)化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌劑選自基于糖的洗滌劑，基于聚氧化烯的洗滌劑，基于膽汁鹽的洗滌劑，合成洗滌劑或其組合。術(shù)語“基于糖的洗滌劑”指選自正辛基-β -D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-β -D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-β -D-吡喃麥芽糖苷或5-環(huán)已基戊基-β -D-吡喃麥芽糖苷及其衍生物的洗滌劑。術(shù)語“基于膽汁鹽的洗滌劑”指選自膽酸鈉、 膽酸鉀、膽酸鋰、3-[ (3-氯酰氨基丙基)二甲基銨基]-基-丙烷磺酸酯(CHAPS)、3-[(3氯酰氨基丙基)二甲基銨基]-2-羥基丙烷磺酸酯(CHAPSO)，和其衍生物的洗滌劑。術(shù)語“基于聚氧化烯的洗漆劑”指選自Tween20、Triton X-100,Pluronic F68和其衍生物的洗漆劑。 術(shù)語“合成洗滌劑”指選自兩性洗滌劑3-6、兩性洗滌劑3-8、兩性洗滌劑3-10、兩性洗滌劑 3-12和其衍生物的洗滌劑。
術(shù)語“高密度脂蛋白顆粒”或其縮寫“HDL顆粒”，可以交互使用，指包含載脂蛋白 A-1作為主要的蛋白化合物的脂質(zhì)-蛋白復(fù)合物。
術(shù)語“免疫測(cè)定法”指用單克隆抗體進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)固相免疫測(cè)定法，包括在吸附/固定在固相上的抗體(捕獲抗體)，抗原和與酶綴合的針對(duì)抗原的另一表位的抗體(示蹤抗體)之間形成復(fù)合物。因此，形成多層結(jié)構(gòu)固相-捕獲抗體-抗原-示蹤抗體。在由多層結(jié)構(gòu)催化的反應(yīng)中，抗體-綴合的酶的活性與溫育介質(zhì)中的抗原濃度成比例。標(biāo)準(zhǔn)夾心式方法也被稱為雙抗原橋連免疫測(cè)定法，因?yàn)椴东@抗體和示蹤抗體結(jié)合于抗原的不同表位。 其它類型的測(cè)定法是放射性免疫測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法和酶聯(lián)免疫測(cè)定法。進(jìn)行所述測(cè)定法的方法以及實(shí)際應(yīng)用和程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。免疫測(cè)定法可以以均相免疫測(cè)定法或異相免疫測(cè)定法形式進(jìn)行。
術(shù)語"增加脂質(zhì)流出"和其語法等同成分指自細(xì)胞或斑塊增加的脂質(zhì)流出的水平和/或速率，促進(jìn)脂質(zhì)流出，增強(qiáng)脂質(zhì)流出，協(xié)助脂質(zhì)流出，上調(diào)脂質(zhì)流出，提高脂質(zhì)流出，和/或加強(qiáng)脂質(zhì)流出。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂質(zhì)流出包括磷脂、甘油三酯、膽固醇和/或膽固醇酯的流出。
術(shù)語“DMPC”指磷脂二豆蘧酰磷脂酰膽堿。
術(shù)語“DPPC”指磷脂I，2- 二-棕櫚酰-sn-甘油_3_磷脂酰膽堿，也被稱為I，2_ 二棕櫚酰-磷脂酰膽堿。
術(shù)語“多聚體”指由兩個(gè)以上單體組成的復(fù)合物。多聚體在單體之間通過非共價(jià)相互作用形成。每個(gè)單體包含多聚化的結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚體包含2或3個(gè)單體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚化結(jié)構(gòu)域通過在包含在每個(gè)單體中的個(gè)體多聚化結(jié)構(gòu)域之間的非共價(jià)相互作用來相互作用。術(shù)語"多聚化結(jié)構(gòu)域"指能夠共價(jià)或非共價(jià)締合兩個(gè)以上單體分子的氨基酸序列。多聚化結(jié)構(gòu)域能夠與不同、類似或相同氨基酸序列的多聚化結(jié)構(gòu)域相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚化結(jié)構(gòu)域是四連蛋白三聚化結(jié)構(gòu)元件或其衍生物，其具有與SEQ ID NO :53的共有氨基酸序列具有至少68%同一性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在SEQ ID NO :53的位置50的半胱氨酸殘基被不同的氨基酸殘基置換，在另一個(gè)實(shí)施方案中，被絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基或甲硫氨酸殘基置換。包含多聚化結(jié)構(gòu)域的多肽可以與一個(gè)或多個(gè)也包含多聚化結(jié)構(gòu)域的其它多肽締合?？梢院?jiǎn)單地通過在適合的條件下混合多肽來起始多聚體形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚化結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID N053 的氨基酸序列，其中在氨基酸序列的N端或C端缺失或添加1-10個(gè)殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚化結(jié)構(gòu)域具有SEQID NO 53的氨基酸序列，其中在氨基酸序列的N-端缺失6或 9個(gè)氨基酸殘基。在又一個(gè)實(shí)施方案中，多聚化結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO :53的氨基酸序列， 其中缺失了 N端氨基酸殘基L或N端氨基酸殘基C和L。在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚化結(jié)構(gòu)域是四連蛋白三聚化結(jié)構(gòu)元件并且具有SEQ IDNO 54的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚體是同聚體。
多聚體可以是同聚體或異聚體，因?yàn)榘嗑刍Y(jié)構(gòu)域的不同載脂蛋白可以組合結(jié)合到所述多聚體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚體是三聚體同聚體。
按照一個(gè)實(shí)施方案，多聚化結(jié)構(gòu)域獲自四連蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，多聚化結(jié)構(gòu)域包含具有SEQ ID NO :54的氨基酸序列的四連蛋白三聚化結(jié)構(gòu)元件。四連蛋白三聚化結(jié)構(gòu)元件三聚化作用由卷曲的螺旋結(jié)構(gòu)導(dǎo)致，所述卷曲的螺旋結(jié)構(gòu)與兩個(gè)其他四連蛋白三聚化結(jié)構(gòu)元件的卷曲的螺旋結(jié)構(gòu)相互作用以形成三聚體。四連蛋白三聚化結(jié)構(gòu)元件可以獲自人四連蛋白，獲自兔四連蛋白，獲自鼠 四連蛋白，或獲自鯊魚軟骨的C-型凝集素。在一個(gè)實(shí)施方案中，四連蛋白三聚化結(jié)構(gòu)元件包含與SEQ ID N053的共有序列具有至少68%，或至少 75%，或至少81%，或至少87%，或至少92%同一性的序列。
術(shù)語“非共價(jià)相互作用”指非共價(jià)結(jié)合力如離子相互作用力(例如鹽橋)，非離子相互作用力(例如，氫鍵)，或疏水相互作用力(例如，范德華力或η -堆積相互作用)。
術(shù)語"相變溫度"指誘導(dǎo)脂質(zhì)物理狀態(tài)從有序的凝膠相(，其中烴鏈充分延伸并且緊密包裝)向無序的液晶相(其中烴鏈隨機(jī)定向并且流動(dòng))變化所需要的溫度。可以在所用的磷脂/磷脂混合物的相變溫度或相變溫度以上的溫度進(jìn)行脂質(zhì)顆粒的形成。在下表 I中列出數(shù)種磷脂酰膽堿和其混合物的相變溫度。
表1:純的磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿混合物的相變溫度
權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生脂質(zhì)顆粒的方法，所述方法包括下述步驟i)提供包含變性蛋白的第一溶液，ii)將所述第一溶液加入包含至少一種脂質(zhì)和洗滌劑但不含所述蛋白的第二溶液中，和iii)從在步驟ii)中獲得的溶液中去除所述洗滌劑并且由此產(chǎn)生脂質(zhì)顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述第二溶液具有所述第一溶液體積的約 3倍到約20倍的體積。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述第一溶液不含脂質(zhì)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述蛋白具有選自SEQID NO 01，02，04-52，66或67的氨基酸序列的氨基酸序列，或包含至少一種包含SEQ ID NO 01, 02，04-52，66或67的氨基酸序列的至少80%的連續(xù)片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述蛋白是具有SEQIDN0:01或SEQ ID NO 02或SEQ ID NO 66或SEQ ID NO 67的氨基酸序列的四連蛋白-載脂蛋白A-1。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述至少一種脂質(zhì)是兩種不同的磷脂酰膽堿。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于第一磷脂酰膽堿是P0PC，并且第二磷脂酰膽堿是DPPC。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述洗滌劑選自膽酸、兩性洗滌劑或它們的鹽。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法在步驟ii)之后和步驟iii)之前包括下述步驟iia)溫育在步驟ii)中獲得的溶液。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述溫育和/或去除在 4 0C -45 °C的溫度進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求9和10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述溫育進(jìn)行約2小時(shí)到約60小時(shí)。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述洗滌劑是具有高CMC的洗滌劑。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述去除通過滲濾或透析或吸附進(jìn)行。
14.通過權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法獲得的脂質(zhì)顆粒。
15.藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求14所述的脂質(zhì)顆粒。
全文摘要
本文報(bào)道一種用于產(chǎn)生脂質(zhì)顆粒的方法，所述方法包括下述步驟i)提供包含變性載脂蛋白的第一溶液，ii)將所述第一溶液加入第二溶液中，所述第二溶液包含至少兩種脂質(zhì)和洗滌劑，但是不含載脂蛋白，和iii)從步驟ii)獲得的溶液中去除所述洗滌劑并且由此產(chǎn)生脂質(zhì)顆粒。
文檔編號(hào)C07K14/775GK103068368SQ201180038671
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者馬丁·巴德爾, 莫妮卡·貝納, 阿德爾伯特·格羅斯曼, 西爾克·莫爾 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司