專利名稱：一種高純度雷莫拉寧單組份的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及藥品原料的制備方法，具體地說涉及到一種從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離純化雷莫拉寧三種單組份的制備方法。
背景技術(shù)：
許多臨床嚴(yán)重感染的病源菌是革蘭氏陽性菌。由于抗生素的大量使用，細(xì)菌耐藥性問題日趨突出。尋找新的糖肽類抗生素逐漸成為醫(yī)藥行業(yè)迫切的需要。目前，已有幾種具有很好前途的新型抗生素正處于開發(fā)階段，雷莫拉寧便是其中之一。雷莫拉寧單組份Al、A2和A3的結(jié)構(gòu)式如下
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組份IrI分子量
Al_-CO-CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-CH2_2540
Α2~ -CQ-CH=CH-CH=CH-CH2-CH (CH3) 22555
A3 I-CO-CH=CH-CH=CH-CH2-CH2 二 CH (CH3) 2丨2568
雷莫拉寧(Ramoplanin、A16686、MDL62198)是一種從游動放線菌 iActinoplanes sp.)
培養(yǎng)液中分離出的由17個氨基酸組成的一種新型的糖肽類抗生素，主要抑制革蘭氏陽性
菌的生長。其純品是由Al、A2、A3三個組份組成的混合物，其中A2為主要成分，占80%。
雷莫拉寧能夠特異而迅速地抑制革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的生物合成。這種抑制作用與萬古霉
素(Vancomycin)和替考拉寧(Teicoplanin)的抑菌機制不同。體外試驗表明，雷莫拉寧
對葡萄球菌的抑菌率是萬古霉素和替考拉寧的4 8倍，而對鏈球菌、腸球菌、棒狀桿菌、
梭菌等多種革蘭氏陽性菌都有很強的抑菌活性。另外，雷莫拉寧對許多具有耐藥性的病原
菌有很好的抑菌效果。雷莫拉寧的細(xì)胞毒性較小且無交叉耐藥問題。但因其分子量較大，故胃腸道難于吸收，目前雷莫拉寧主要開發(fā)為外用藥物。雷莫拉寧在治療痤瘡、感染性外傷以及腹瀉感染等病癥上已取得了良好的效果，并且已進入了臨床試驗。美國專利US5491128報道了將雷莫拉寧粗提物溶解后，用硅膠柱吸附。然后依次用不同濃度的酸水和乙腈梯度洗脫，分別得到A2及A3。再用半制備色譜分離，得到Al單組份。該方法存在以下缺點(1)濾液未經(jīng)脫色除雜，直接得到粗提物，含雜質(zhì)較多，對下游純化介質(zhì)造成的損傷大；(2)硅膠柱層析用不同濃度的酸水和乙腈梯度洗脫，水會造成硅膠層析能力下降，再生后才能重復(fù)使用，無法實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。中國專利CN200610024152和美國專利US4427656公開了雷莫拉寧單組份的制備方法，所用的分離介質(zhì)都是C18反相硅膠。該介質(zhì)價格昂貴，每升售價達到I萬元以上，制備成本很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，研究設(shè)計一種制備高純度、低成本的雷莫拉寧單組份的制備工藝。本發(fā)明首次采用聚合物微球分離純化發(fā)酵液粗提物，介質(zhì)的成本 是C18反相硅膠的30%，且分離效果相當(dāng)。以聚合物微球為分離介質(zhì)，通過梯度解析，有效地去除了發(fā)酵代謝過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，得到高含量的雷莫拉寧Al、A2和A3單組份，含量大于98. 0%，總收率大于70%，適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)高純度雷莫拉寧Al、A2和A3單組份。下面對本發(fā)明進行具體描述
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的在雷莫拉寧發(fā)酵液中加入助濾劑，攪拌均勻，過濾，脫色，吸附、解吸、濃縮得到粗提物；粗提物用極性溶劑溶解后上樣至聚合物微球?qū)游鲋?，使用水與極性溶劑的混合液梯度解析，高壓液相色譜儀(以下簡稱HPLC)在線檢測，分別收集雷莫拉寧A1、A2和A3洗脫液，經(jīng)濃縮、結(jié)晶、干燥，分別得到高純度雷莫拉寧A1、A2和A3單組份精粉。本發(fā)明所得雷莫拉寧可供藥品使用。雷莫拉寧單組份A1、A2和A3含量可達98. 0%以上,樣品回收率大于70%。具體地，本發(fā)明涉及一種高純度雷莫拉寧單組份Al、A2和A3的制備方法，包括下述步驟
1)常溫條件下在雷莫拉寧發(fā)酵液中加入助濾劑，攪拌50分鐘-I.5小時至助濾劑分散均勻，過濾，固液分離得到雷莫拉寧濾液；
2)濾液使用大孔脫色樹脂脫色；
3)脫色液導(dǎo)入大孔吸附樹脂進行吸附，飽和樹脂用解吸劑解吸，得到解吸液；
4)解吸液濃縮得到雷莫拉寧粗提物；
5)將雷莫拉寧粗提物用極性溶劑溶解，注入聚合物微球?qū)游鲋?br> 6)使用不同濃度的極性溶劑水溶液進行梯度洗脫，收集雷莫拉寧洗脫液；
7)洗脫液濃縮、結(jié)晶，固液分離得到雷莫拉寧精粉。其中，步驟I)中調(diào)節(jié)發(fā)酵液中加入的助濾劑為珍珠巖或硅藻土，優(yōu)選為珍珠巖，助濾劑的用量為每升發(fā)酵液加入助濾劑O. 01-0. I千克，優(yōu)選為O. 02-0. 04 (克/升)；攪拌時間為50分鐘-I. 5小時。步驟2)中的大孔脫色樹脂為D151、SDA-7、LX-700、D290、D309、D301樹脂，優(yōu)選為D290 或 LX-700 樹脂。
步驟3)中的大孔吸附樹脂為DM130、HZ816、D71、D312、AB-8、DlOl樹脂，優(yōu)選為D312樹脂及HZ816樹脂，解吸劑為甲醇或乙醇的水溶液，優(yōu)選為乙醇的水溶液。步驟4)所述的濃縮為30°C -50°C條件下，優(yōu)選為30_40°C，將解吸液真空濃縮至雷莫拉寧濃度100g/L-120g/L，得到雷莫拉寧粗提物。步驟5)中使用的聚合物微球是采用聚苯乙烯、聚丙烯酸酯及其衍生物制備的，優(yōu)選氨基化聚苯乙烯微 球、磺酸化聚苯乙烯微球及羧基化聚苯乙烯微球。步驟6)中的極性溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈中的一種。步驟6)中梯度洗脫的極性溶劑水溶液的體積百分比濃度為25-50%。步驟7)所述的結(jié)晶，結(jié)晶析出溶劑可以是乙酸乙酯或丙酮中的一種，優(yōu)選為乙酸乙酯，析出溶劑加入量與結(jié)晶液體積之比為2:1-10:1，優(yōu)選為3:1-8:1，結(jié)晶液過濾后真空干燥，得到白色的雷莫拉寧三種單組份Al、A2及A3精粉。本發(fā)明所得產(chǎn)品可供藥品使用，雷莫拉寧三種單組份Al、A2及A3的HPLC含量大于98. 0%，樣品提取總收率大于70%。本發(fā)明有如下優(yōu)點1.通過在發(fā)酵液中加入助濾劑，然后進行固液分離，可有效去除其中的菌絲體、未用完的培養(yǎng)基、雜蛋白和金屬離子，提高了過濾速度，縮短了工藝周期，并得到澄清的濾液。2.大孔脫色樹脂及吸附樹脂的應(yīng)用，去除了大部分色素和極性大的雜質(zhì)，提高了濾液的澄清度和質(zhì)量。3.解吸過程采用非連續(xù)梯度解吸法，低濃度的乙醇沖洗樹脂柱可除去樹脂吸附上的大部分多糖、色素和強極性雜質(zhì)，之后采用高濃度的乙醇解吸，解吸液質(zhì)量大幅提高。4.首次使用聚合物微球?qū)游?，大幅度提高了產(chǎn)品純度。5.工藝簡潔，溶媒消耗量少，溶媒易回收，樣品收率高，全程總收率達到70%以上，提取成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。6.質(zhì)量可控，為生產(chǎn)藥用級原料提供了更加安全的技術(shù)保障。


圖I :雷莫拉寧的粗提物液相色譜圖 圖2 :雷莫拉寧Al單組份的液相色譜圖 圖3 :雷莫拉寧A2單組份的液相色譜圖 圖4 :雷莫拉寧A3單組份的液相色譜圖。
具體實施例下述實施例僅用于闡述實現(xiàn)本發(fā)明的方法，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。除非特別言明，本發(fā)明中所有百分比均為體積百分比。本發(fā)明所使用的雷莫拉寧發(fā)酵液均為華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司用微生物培養(yǎng)手段得到的雷莫拉寧發(fā)酵液。大孔樹脂HZ816、HZ801、D290、D312，上海華震公司生產(chǎn)；大孔樹脂D151、D301，安徽三星公司生產(chǎn)；大孔樹脂D309、SDA-7，西安電力樹脂廠；LX-700、AB-8，西安藍曉公司生產(chǎn)；DM130、D101，滄州寶恩樹脂廠生產(chǎn)；聚合物微球為蘇州納微科技公司生產(chǎn)，乙醇、甲醇等試劑均為市售。本發(fā)明使用的HPLC為996型檢測器，515 栗(Waters 公司)。實施例I
取雷莫拉寧發(fā)酵液10L，發(fā)酵單位1036μ g/mL(以A1+A2+A3計)，含I. 55克Al，8. 08克A2，0. 73克A3。常溫下發(fā)酵液中加入IOOg珍珠巖，攪拌50分鐘后板框過濾，濾液以1-2BV/h的流速通過大孔樹脂D290柱進行脫色，脫色液以lBV/h的流速導(dǎo)入大孔樹脂D312柱進行吸附富集，吸附后用30%乙醇/水溶液和60%的乙醇/水溶液非連續(xù)梯度解吸，解吸流速控制在O. 5BV/h，HPLC檢測有雷莫拉寧流出時開始收集解吸液，解吸完畢后，在30°C條件下將解吸液真空濃縮至雷莫拉寧濃度100g/L-120g/L，得到粗提物(見圖I) 19. 2g (含量為
51.6%)。粗提物加入甲醇15mL溶解，注入長度31cm、直徑為2. 6cm、裝量為150mL的PS30型聚合物微球?qū)游鲋?，依次使?0%濃度甲醇、40%濃度甲醇及50%濃度甲醇作為流動相洗滌至雷莫拉寧洗脫完畢，流速為200mL/h，根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，分別收集Al、A2及A3的HPLC含量大于95%的洗脫液，40°C分別減壓濃縮洗脫液至雷莫拉寧Al、A2及A3單組份濃度為100g/L (Al、A2及A3體積分別為llmL、55 mL和5mL)，分別在Al、A2及A3濃縮液中加入55mL、275mL和25mL乙酸乙酯，緩慢降溫到2V _8°C，結(jié)晶12小時，過濾、洗滌、干燥，最后得到白色雷莫拉寧精粉單組份Al粉I. 13克、A2粉5. 45克，和A3粉O. 53克(見附圖2-4)，平均收率為72. 0%。Al粉HPLC含量為98. 2%，A2粉HPLC含量為98. 5%, A3粉HPLC含量為98. 1%。 實施例2
取雷莫拉寧發(fā)酵液100L，發(fā)酵單位1137μ g/mL(以A1+A2+A3計)，含15. 92克Al，89. 82克A2，7. 96克A3。在常溫下的發(fā)酵液中加入3Kg硅藻土，攪拌90分鐘后板框過濾，濾液以
I.5BV/h的流速通過大孔樹脂LX-700柱進行脫色，脫色液以I. 5BV/h的流速導(dǎo)入大孔樹脂HZ816柱進行吸附富集，吸附后用40%甲醇/水溶液和60%的甲醇/水溶液非連續(xù)梯度解吸，解吸流速控制在O. 5BV/h，HPLC檢測有雷莫拉寧流出時開始收集解吸液，解吸完畢后，在解吸液40°C條件下真空濃縮至雷莫拉寧濃度110g/L-120g/L，得到粗提物210. 8g (含量為50. 1%)。粗提物加入甲醇200mL溶解，注入長度為92cm、直徑為4. 9cm、裝量為1500mL的PS30型聚合物微球?qū)游鲋来问褂?5%濃度乙醇、40%濃度乙醇及50%濃度乙醇作為流動相洗滌至雷莫拉寧洗脫完畢，流速為2000mL/h，根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，分別收集Al、A2及A3的HPLC含量大于95%的洗脫液，35°C分別減壓濃縮洗脫液至雷莫拉寧A1、A2及A3單組份濃度為110g/L (A1、A2及A3體積分別為IlOmL,810 mL和70mL)，分別在A1、A2及A3濃縮液中加入660mL、4860mL和420mL丙酮，緩慢降溫到2V _8°C，結(jié)晶12小時，過濾、洗滌、干燥，最后得到白色雷莫拉寧精粉單組份Al粉11. 62克、A2粉66. 47克，和A3粉5. 89克，平均收率為73. 8%。Al粉HPLC含量為98. 3%, A2粉HPLC含量為98. 7%, A3粉HPLC含量為98. 3%。A1-A3精粉HPLC色譜圖見圖2-4。實施例3
取雷莫拉寧發(fā)酵液1000L，發(fā)酵單位1058 μ g/mL (以A1+A2+A3計)含148. 12克Al，825. 24克A2，84. 64克A3。常溫下在發(fā)酵液中加入IOOKg珍珠巖，攪拌90分鐘后板框過濾，濾液以I. 5BV/h的流速通過大孔樹脂LX-700柱進行脫色，脫色液以I. 5BV/h的流速導(dǎo)入大孔樹脂D312柱進行吸附富集，吸附后用30%乙醇/水溶液和60%的乙醇/水溶液非連續(xù)梯度解吸，解吸流速控制在O. 5BV/h-lBV/h, HPLC檢測有雷莫拉寧流出時開始收集解吸液，解吸完畢后，解吸液在50°C條件下真空濃縮至雷莫拉寧濃度110g/L-120g/L，得到粗提物1978. 5g(含量為50. 8%)。粗提物加入甲醇1500mL溶解，注入長度為92cm、直徑為10cm、裝量為7200mL的PS30型聚合物微球的層析柱，依次使用30%濃度甲醇、40%濃度甲醇及50%濃度甲醇作為流動相洗滌至雷莫拉寧洗脫完畢，流速為7000mL/h，根據(jù)HPLC檢測結(jié)果分別收集A1、A2及A3的HPLC含量大于95%的洗脫液，40°C分別減壓濃縮洗脫液至雷莫拉寧Al、A2及A3單組份濃度為120g/L (A1、A2及A3體積分別為910mL、5100 mL和520mL)，分別在 Al、A2及A3濃縮液中加入6300mL、35000mL和3500mL乙酸乙酯，緩慢降溫到2°C -8°C，結(jié)晶12小時，過濾、洗滌、干燥，最后得到白色雷莫拉寧精粉單組份Al粉108. 13克、A2粉609. 03克，和A3粉62. 63克，平均收率為73. 7%。Al粉HPLC含量為98. 2%, A2粉HPLC含量為98. 5%, A3粉HPLC含量為98. 2%。
權(quán)利要求
1.一種雷莫拉寧單組份的制備方法，包括下述步驟 1)常溫條件下，在雷莫拉寧發(fā)酵液中加入助濾劑，攪拌50分鐘-I.5小時至助濾劑分散均勻，過濾，固液分離得到雷莫拉寧濾液； 2)濾液使用大孔脫色樹脂脫色； 3)脫色液導(dǎo)入大孔吸附樹脂進行吸附，飽和樹脂用解吸劑解吸，得到解吸液； 4)解吸液濃縮，得到雷莫拉寧粗提物； 5)將雷莫拉寧粗提物用極性溶劑溶解，注入聚合物微球?qū)游鲋? 6)使用極性溶劑與水的混合液進行梯度洗脫，高效液相色譜儀(以下簡稱為HPLC)在線監(jiān)測，分別收集HPLC含量大于95%的雷莫拉寧單組份Al、A2及A3洗脫液； 7)洗脫液分別濃縮、結(jié)晶，固液分離得到雷莫拉寧單組份粉末Al、A2及A3。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟I)所述的助濾劑為珍珠巖或硅藻土，助濾劑的用量為每升發(fā)酵液加入助濾劑O. 01-0. I千克。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟2)所述大孔脫色樹脂為D151、SDA-7、LX-700、D290、D309、D301 樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟3)所述的大孔吸附樹脂為DM130、HZ816、D71、D312、AB-8、D101 樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟4)所述的濃縮、結(jié)晶，要求解吸液在300C _50°C條件下真空濃縮，濃縮至雷莫拉寧濃度100g/L-120g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟5)和6)所述的極性溶劑各為甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟5)所述聚合物微球是采用聚苯乙烯或聚丙烯酸酯及其衍生物制備的。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟7)所述的結(jié)晶，要求雷莫拉寧三種單組份Al、A2及A3濃縮后濃度均控制在120g/L-150g/L，然后分別緩慢加入2_10倍結(jié)晶液體積的乙酸乙酯或丙酮，結(jié)晶液過濾后真空干燥，得到白色的雷莫拉寧三種單組份A1、A2及A3純品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用游動放線菌(Actinoplanessp.)發(fā)酵培養(yǎng)物制備雷莫拉寧三種單組份的制備方法。該方法包括將雷莫拉寧發(fā)酵液通過大孔脫色樹脂脫色后，再用大孔吸附樹脂吸附、解吸，濃縮后得到含有三種單組份A1、A2、A3的雷莫拉寧粗提物。對粗提物再用溶劑溶解后借助聚合物微球進行層析分離，得到高純度的雷莫拉寧三種單組份A1、A2及A3產(chǎn)品。本發(fā)明的優(yōu)點在于使用聚合物微球?qū)υ摦a(chǎn)品進行層析分離時，樣品處理量大，得到的單組份純度高。因聚合物微球介質(zhì)的價格為反相硅膠C18的30%，且分離效果相當(dāng)，從而大大降低了制備成本。
文檔編號C07K1/16GK102838662SQ20111039376
公開日2012年12月26日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者段寶玲, 張雪霞, 李寧, 李曉露, 任風(fēng)芝, 陳書紅, 成曉迅, 林毅, 王海燕, 李麗紅, 張金娟, 林旸, 張麗, 張艷立, 高月麒, 張艷哲, 蔣沁, 董愛華 申請人:華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司