專利名稱：利用晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白及其編碼基因培育抗旱轉(zhuǎn)基因棉花的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬農(nóng)作物的生物工程育種領(lǐng)域，具體說，涉及晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)及其編碼基因在培育抗旱轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水資源短缺是目前公認(rèn)的全球性環(huán)境焦 點問題之一。據(jù)1950-1999年統(tǒng)計，我國平均每年受旱面積達(dá)2173. 33萬hm2，成災(zāi)面積893. 33萬hm2，直接減收糧食100億kg以上，約占各種自然災(zāi)害造成糧食損失的60 %。干旱不僅造成農(nóng)業(yè)的重大損失，還加劇了生態(tài)環(huán)境的惡化及土地沙漠化和水土流失。面對我國人口不斷增長、耕地和水肥資源日益減少、環(huán)境狀況急劇惡化、糧食供需矛盾日益尖銳的嚴(yán)峻現(xiàn)實，如何通過提高作物的抗旱能力和水分利用效率來增加糧食產(chǎn)量、節(jié)約資源和改善環(huán)境，已成為我國農(nóng)業(yè)持續(xù)高效發(fā)展的重大需求?；蚬こ痰难杆侔l(fā)展與完善，為人類進(jìn)一步改良作物的抗逆性、提高資源利用效率提供了新的策略和強有力的工具。近年來，該領(lǐng)域的研究已引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛的興趣和重視，在擬南芥、水稻、小麥等許多植物克隆了干旱脅迫應(yīng)答基因，對其表達(dá)調(diào)控和編碼蛋白的功能進(jìn)行了研究，并通過基因工程技術(shù)分子改良水稻、玉米、馬鈴薯等農(nóng)作物而取得顯著進(jìn)展。很多水分脅迫誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物具有保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)免受失水造成傷害的功能(Bray, 1993) 0這種推測的依據(jù)是蛋白質(zhì)的氨基酸序列及其基因表達(dá)的特性。其中，晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Protein, LEA)基因是第一個鑒定的在種子成熟和發(fā)育階段表達(dá)的基因，這些基因也在因受到干旱、低溫和鹽潰等環(huán)境脅迫而脫水的營養(yǎng)組織中表達(dá)。目前，至少發(fā)現(xiàn)了 6組這樣的基因，稱為LEA基因。推測LEA蛋白可能有以下三方面的作用①作為脫水保護(hù)劑。由于LEA蛋白在結(jié)構(gòu)上富含不帶電荷的親水氨基酸，它們既能像脯氨酸那樣，通過與細(xì)胞內(nèi)的其它蛋白發(fā)生相互作用，使其結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，又可能給細(xì)胞內(nèi)的束縛水提供了一個結(jié)合的襯質(zhì)，從而使細(xì)胞結(jié)構(gòu)在脫水中不致遭受更大的破壞；②作為一種調(diào)節(jié)蛋白而參與植物滲透調(diào)節(jié)；③通過與核酸結(jié)合而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)其它基因的表達(dá)。LEA基因及其表達(dá)產(chǎn)物在植物耐干旱、耐鹽脅迫方面具有可觀的應(yīng)用前景。Xu (1996)將來自大麥的LEA基因HVAl導(dǎo)入水稻，在水稻啟動子Actl基因的調(diào)控下，大麥HVAl基因得到高水平的表達(dá)，在脅迫條件下轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻相比，明顯具有較高的生長速率。這個研究表明，在水分虧缺和鹽分脅迫下，LEA蛋白在植物保護(hù)中發(fā)揮重要作用。Jai等(2002)將大麥的HAVl基因轉(zhuǎn)移入水稻，結(jié)果轉(zhuǎn)基因的水稻葉片中積累高水平的LEA3蛋白，從而顯著提高轉(zhuǎn)基因品系干旱和鹽脅迫耐受性。Byong等(2005)第一次將來自油菜LEA基因轉(zhuǎn)移入中國卷心菜，轉(zhuǎn)基因卷心菜在受脅迫時損傷癥狀顯著延遲，而且鹽脅迫和干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株具有增強的生長能力，表明轉(zhuǎn)LEA基因增強了植物對鹽和干旱的耐受性。Wang等(2006)從紫桿檉柳中克隆到一個新的LEA基因(DQ663481)，轉(zhuǎn)基因煙草實驗表明其丙二醛(MDA)含量和相對電導(dǎo)率在干旱脅迫條件下顯著地更低，推測該基因通過保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷從而提高了植物對干旱脅迫耐受性。棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物。在棉花主栽區(qū)，干旱和土壤鹽潰化是影響棉花產(chǎn)量的主要因素。在嚴(yán)重干旱情況下，棉花會出現(xiàn)生長緩慢以及落蕾落鈴等現(xiàn)象，從而嚴(yán)重影響棉花的生產(chǎn)。隨著我國淡水資源的逐年匱乏和氣候變暖，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐旱棉花具有重要的戰(zhàn)略意義。目前，棉花的轉(zhuǎn)基因工作主要集中在抗鱗翅目昆蟲方面，抗蟲棉已在國內(nèi)外大面積推廣。而采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制耐旱棉花的工作在國內(nèi)外尚處起步階段。迄今 國內(nèi)外僅見幾例獲得耐旱性提高轉(zhuǎn)基因棉花的報道，包括“New protein, being a proteincomposed of amino acid sequences, useful for culturing a plant with improvedanti-drought capability”(專利申請?zhí)朇N101481410_A) ,Generation of plant withimproved drought tolerance”(專利申請?zhí)朥S7968768B2)一種利用聚合抗逆基因提高棉花耐鹽抗旱性的方法”(專利申請?zhí)朇N 101624604A)等，其實用價值尚有待考證；但利用晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)及其編碼基因培育抗旱轉(zhuǎn)基因棉花尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)及其編碼基因在培育抗旱轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng)用。所述晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)的氨基酸序列如Genebank號ABG54481所示；所述編碼基因的核苷酸序列如Genebank號DQ663481所示；將LEA基因重組到一個植物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化入棉花細(xì)胞并讓其表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植株，從轉(zhuǎn)基因植株及其后代中篩選出穩(wěn)定遺傳的T3代植株，培育出棉花抗旱育種新種質(zhì)，進(jìn)而創(chuàng)建出棉花抗旱育種新材料，以用于棉花的常規(guī)品種或雜交品種培育。本發(fā)明所述的一種利用晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白及其編碼基因在培育抗旱轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng)用，其特征在于按下列步驟進(jìn)行a、將晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白基因通過常規(guī)分子生物學(xué)方法插入到植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體中，并通過花粉管通道法導(dǎo)入到棉花受體材料中，獲得轉(zhuǎn)基因植株；b、通過大田卡那霉素檢測和室內(nèi)分子檢測，經(jīng)過繼代培養(yǎng)并每代進(jìn)行嚴(yán)格的陽性植株篩選，直至獲得穩(wěn)定遺傳的T3代轉(zhuǎn)基因植株；C、轉(zhuǎn)基因抗旱材料的抗逆性鑒定和利用，根據(jù)目的基因過表達(dá)的生理作用，進(jìn)行相應(yīng)的生理生化指標(biāo)檢測，并通過盆栽試驗和大田抗逆性測定試驗，篩選出抗旱性能明顯提高的轉(zhuǎn)基因育種材料，獲得的優(yōu)異材料用于棉花育種或生產(chǎn)實踐。所述晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白的氨基酸序列如Genebank號ABG54481所示。所述晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白編碼基因的核苷酸序列如Genebank號DQ663481所
/Jn o所述用于遺傳轉(zhuǎn)化的棉花品種為早熟棉新陸早18號。本發(fā)明對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行篩選，從抗性植株及其后代中篩選出轉(zhuǎn)基因T3代植株的方法是通過對3-4葉期轉(zhuǎn)基因棉花葉片涂抹卡那霉素(5g/L)檢測轉(zhuǎn)基因植株，對篩選出的陽性植株利用常規(guī)的分子檢測技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步驗證，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株T1代；次年，將收獲的T1代種子進(jìn)行大田種植，重復(fù)上述步驟，直至獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的T3代轉(zhuǎn)基因植株。
所述獲得的轉(zhuǎn)基因T3代植株耐旱性鑒定方法是采用生理生化指標(biāo)和盆栽鑒定相結(jié)合的策略，篩選出耐旱能力明顯提高的株系，從中選擇優(yōu)異材料培育棉花耐旱新種質(zhì)。本發(fā)明所述獲得的轉(zhuǎn)基因棉花為轉(zhuǎn)LEA基因陸地棉新陸早18號棉花T3代轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的實驗證明與野生型和轉(zhuǎn)空載體植株相比，轉(zhuǎn)LEA基因棉花的抗旱性得至IJ增強。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植株可直接應(yīng)用于棉花的常規(guī)品種或雜交品種培育。本發(fā)明的基本思路是依據(jù)植物抗逆生理和植物抗逆基因工程研究的新進(jìn)展，利用從本土抗逆植物紫桿檉柳中克隆的、與抗逆性密切相關(guān)的晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)基因，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將能夠顯著提高植物細(xì)胞中抗旱特性的LEA基因?qū)朊藁ㄆ贩N中，實現(xiàn)該基因的過表達(dá)，從而大幅度提高植株的耐旱性。轉(zhuǎn)基因棉花采用花粉管通道法，轉(zhuǎn)基因植株用PCR檢測、RT-PCR驗證；外源基因表達(dá)研究采用實時熒光定量PCR方法。植株抗逆 性采用植物生理學(xué)和作物栽培學(xué)方法，其中轉(zhuǎn)基因植株抗旱性測定采用水培試驗-生理指標(biāo)測定，同時結(jié)合盆栽試驗進(jìn)行驗證。在棉花的遺傳轉(zhuǎn)化中，以我國新疆地區(qū)主載的陸地棉品種新陸早18號為受體材料，采用花粉管通道法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。采用夏季在新疆育種，冬季到海南加代的方法，一年可繼代育種2次，直至獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因T3代植株。轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性測定采用經(jīng)典的遺傳學(xué)方法，結(jié)合于PCR檢測。本發(fā)明實施的具體步驟為將LEA基因通過常規(guī)分子生物學(xué)方法插入到植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體中，并通過花粉管通道法導(dǎo)入到棉花受體材料中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過大田卡那霉素檢測和室內(nèi)分子檢測，經(jīng)過繼代培養(yǎng)并每代進(jìn)行嚴(yán)格的陽性植株篩選，直至獲得穩(wěn)定遺傳的T3代轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因抗旱材料的抗逆性鑒定和利用，根據(jù)目的基因過表達(dá)的生理作用，進(jìn)行相應(yīng)的生理生化指標(biāo)檢測，并通過盆栽試驗和大田抗逆性測定試驗，篩選出抗旱性能明顯提高的轉(zhuǎn)基因育種材料，獲得的優(yōu)異材料用于棉花育種或生產(chǎn)實踐。


圖I為本發(fā)明pROKII-LEA植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。圖2 為本發(fā)明 pROKII-LEA 質(zhì)粒 PCR 電泳圖。其中 M DNA marker ；Lanel,2 pROKII-Lea質(zhì)粒；A為LEA基因特異引物PCR電泳圖，B為載體引物PCR電泳圖。圖3為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因棉花的RT-PCR電泳圖。其中Lane M DL2000marker ；Lane2,4，6，7 :轉(zhuǎn)基因棉花陽性植株；Lane 3,5 :轉(zhuǎn)基因棉花陰性植株；Lane8 :pR0KII-Lea質(zhì)粒。圖4為本發(fā)明12% (w/v)PEG-6000模擬干旱處理12小時后LEA基因?qū)崟r熒光定量PCR圖。WT :轉(zhuǎn)空載體樣品，即對照；L1，L2，L3 :轉(zhuǎn)基因植株干旱處理前樣品；dLl，dL2，dL3 :轉(zhuǎn)基因植株干旱處理12小時后樣品。圖5為本發(fā)明12% (w/v)PEG-6000模擬干旱處理12小時后棉花生長圖。從左至右分別為WT，LI，L2，L3.圖6為本發(fā)明12% (w/v)PEG-6000模擬干旱處理12小時后棉花葉片丙二醛(MDA)含量。
圖7為本發(fā)明12% (w/v)PEG-6000模擬干旱處理12小時后棉花葉片游離脯氨酸含量。圖8為本發(fā)明12% (w/v)PEG-6000模擬干旱處理12小時后棉花葉片可溶性糖含量。圖9為本發(fā)明12% (w/v)PEG-6000模擬干旱處理12小時后棉花葉片可溶性蛋白含量。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。 下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例(抗旱轉(zhuǎn)基因棉花創(chuàng)制)I、植物表達(dá)載體的構(gòu)建LEA基因克隆自紫桿檉柳(Tamarix androssowii),由東北林業(yè)大學(xué)王玉成博士饋贈。紫桿檉柳LEA基因的核苷酸序列如Genebank號DQ663481所示，基因序列為lgcacgaggcc tcgtgccgaa ttcggcacga ggattcattc ttcaaagaaagtgggaatca6lgagagagaaa gagagagcgg tagtccaccc tatctgtgct cctgtattgccgacgaacag121aacctcggtt cagaaattaa ctttggaaaa ggagaaaatg gctcgctgctcttactctaa181tgctaagctc gtctctaccc tcgtcgtcga caatctctcc cttgctctctccaggaggag241ttacgcgcaa ggcatggtga tgtccaactc cagcaacgtc atgcgaagagcaggcggtag301taataatgct acatctacca ccccaaacga tgagaattca tgggtgccggatcctgttac361cggttactac aggccggcta atcatgccga tgacgtcgac gtcgctgagcttcgtgagat421gcttctgact accagcaatg cgaacaagtt caatcgatcc tctcactgaatgatttgaat481tttgattttg aggcggtggg aaaccatggc tgattgggtt ttgttccatatgtgatgccg541cgtgtttcgc cgcctcgtga tttattgctg ttgttgttgt tgttcggatttcggaagttt601tgtacccttg ctagcccggt cctttaattt catgcggttt gcgtgtatttttatcagatt661caacttcgag ttgaagaaaa aaaaa其中，158至469堿基序列為開放閱讀框ORF ；由該基因編碼的紫桿檉柳晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)氨基酸如Genebank號ABG54481所示，其氨基酸序列為MARCSYSNAKLVSTLVVDNLSLALSRRSYAQGMVMSNSSNVMRRAGGSNNATSTTPNDENSWVPDPVTGY YRPANHADDVDVAELREMLLTTSNANKFNRSSHo將上述LEA基因插入含有35S啟動子的pROKII植物表達(dá)載體中，構(gòu)建pROKII-LEA植物表達(dá)載體，Lea基因的酶切位點Sma I和Sac I。植物表達(dá)載體構(gòu)建過程參見圖I。將上述構(gòu)建的pROKII-LEA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，為了驗證載體和質(zhì)粒的可靠性，用了兩對引物進(jìn)行PCR檢測及酶切驗證。兩對引物分別為LEA 基因特異引物(Lea-fj, ccggaatggctcgctgctcttactc-3 1 , Lea~r 5 1 -cccttgttcgcattgctggtagtca-3 ');載體弓丨物(prl 5 ' -gttgcagcaagcggtcc-3 ' , pr2 5' -cgcacatcccactatcc-3'),其中，載體引物跨越35S啟動子及Nos終止區(qū)域序列,包含載體918bp片段部分；兩種引物PCR結(jié)果一致(圖2A，B)，表明Lea基因確實構(gòu)建至pROKII載體上，測序表明基因準(zhǔn)確連接并成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌。2、轉(zhuǎn)基因棉花T3代植株獲得用改進(jìn)的堿裂解法大量提取pROKII-LEA質(zhì)粒。棉花首次于2009年I月在海南三亞中國農(nóng)科院棉花基地利用花粉管通道法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入量為每朵花0. I i! g質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化的棉花品種為新陸早18號。收獲的Ttl代種子于2009年5月在新疆農(nóng)科院庫爾勒棉花實驗基地播種，至3片葉期時經(jīng)田間卡那霉素檢測和室內(nèi)PCR檢測的陽性株于2009年10月收獲種子，得到T1代種子。同樣方法重復(fù)冬季在海南加代繁殖(T2代)、夏季在新疆繼代繁殖(T3代)，并每代經(jīng)田間卡那霉素檢驗，直至收獲T3代種子，并于2011年5月在新疆庫爾勒棉花實驗基地播種，種植至2 3片葉期時，將40株卡那霉素檢測陽性的T3代棉花幼苗從庫爾勒棉花基地轉(zhuǎn)移至烏魯木齊中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所植物逆境生物 學(xué)實驗室，進(jìn)行陽性植株檢測。首先用5g/L的卡那霉素溶液涂抹葉片同一部位連續(xù)涂抹3天以進(jìn)一步驗證大田卡檢結(jié)果，結(jié)果40株中有31株為卡那霉素檢測陽性植株。7天后對31株陽性株進(jìn)行室內(nèi)分子檢測。室內(nèi)利用改良的CTAB法提取棉花基因組DNA，通過PCR法確定陽性株系。最終獲得5株轉(zhuǎn)化陽性苗(見圖3)，然后進(jìn)行Southern和Northern分析，最終選擇T3代LEA基因能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá)、并單拷貝插入基因組的3個株系，31號、56號、63號，并選擇陰性株36號做對照。將棉花重新編號，36號是轉(zhuǎn)pROKII空表達(dá)載體的T3代棉花植株，用WT表示；31號、56號、63號植株分別被編號為LI、L2、L3。3、轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性檢測將上述T3RLl, L2，L3轉(zhuǎn)基因棉花及WT的棉花幼苗小心地從花盆土中挖出，挖取時用細(xì)水沖洗細(xì)根保證所有細(xì)根從土中剝離，使細(xì)根不受損傷，然后將從土中取出的棉花幼苗放入直徑15cm高30cm的圓柱形培養(yǎng)瓶中液體培養(yǎng)，并用支持板固定植株，培養(yǎng)液為holgland營養(yǎng)液，每周更換一次，充分通氣；培養(yǎng)瓶外周用錫箔紙包好，進(jìn)行遮光處理，將水培棉花放到組培室中進(jìn)行培養(yǎng)，組培室條件為溫度28°C，濕度45%，關(guān)照時間14h (光照)/10h (黑暗)，光強 7000Lux(TES1330A Digital Lux Meter)。2周后，待棉花生長穩(wěn)定，對其進(jìn)行干旱處理。將棉花放入12% (w/v)的PEG-6000holgland營養(yǎng)液中處理12個小時，分別選取干旱處理前、干旱處理12小時后生長狀態(tài)一致的同一部位葉片進(jìn)行如下(I)、(2)的研究(I)轉(zhuǎn)基因植株LEA基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量分析分別提取12% (w/v)PEG-6000處理前、后的棉花葉片總RNA。利用實時熒光定量RT-PCR分析LEA基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量，以檢測LEA基因?qū)Ω珊档捻憫?yīng)情況，以18srRNA和UBQ7為實時熒光定量RT-PCR的內(nèi)參基因；結(jié)果如圖4所示結(jié)果表明，相比較干旱處理前，轉(zhuǎn)基因棉花在模擬干旱處理12小時后LEA基因表達(dá)量顯著增加3-5倍，說明干旱脅迫誘導(dǎo)LEA基因的表達(dá)及積累。(2)轉(zhuǎn)基因植株抗旱性生理指標(biāo)測定
實驗重復(fù)3次。①丙二醛(MDA)含量變化丙二醛(MDA)含量變化結(jié)果見圖6，結(jié)果表明干旱脅迫前，WT和轉(zhuǎn)基因棉花MDA含量差別不顯著；模擬干旱脅迫12小時后，WT和轉(zhuǎn)基因棉花的丙二醛含量都呈現(xiàn)上升趨勢，但WT的丙二醛含量極顯著高于轉(zhuǎn)基因棉花；結(jié)果表明在干旱脅迫發(fā)生的情況下，轉(zhuǎn)LEA基因棉花植株可以顯著減少丙二醛的生成量。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，具有很強的毒性。膜脂過氧化會引起膜中蛋白質(zhì)聚合、交聯(lián)以及類脂的變化，使膜上的孔隙變大，通透性增加，離子大量外泄引起細(xì)胞代謝紊亂，嚴(yán)重時導(dǎo)致植物受傷或死亡，因此丙二醛含量高低可用以衡量植物在逆境脅迫下生物膜受活性氧傷害的程度，在模擬干旱脅迫試驗中，轉(zhuǎn)LEA基因棉花植株可 以有效減少丙二醛的生成量，降低膜脂的氧化程度，保護(hù)膜脂的穩(wěn)定性。因此，轉(zhuǎn)LEA基因棉花有助于在干旱脅迫時保護(hù)膜脂穩(wěn)定，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜的完整性與穩(wěn)定性，對于植株正常生命活動的維持發(fā)揮重要作用。②游離脯氨酸含量變化結(jié)果游離脯氨酸含量變化結(jié)果見圖7，結(jié)果表明干旱脅迫前，WT和轉(zhuǎn)基因棉花游離脯氨酸含量差別不顯著；模擬干旱脅迫12小時后，WT和轉(zhuǎn)基因棉花的游離脯氨酸含量都呈現(xiàn)上升趨勢，并且轉(zhuǎn)基因植株的增幅為WT的4-7倍，LI的游離脯氨酸含量極顯著高于WT，L2的游離脯氨酸含量顯著高于WT，L3的游離脯氨酸含量與WT雖然無顯著性差異，但是從圖中仍可以看出L3的值高于WT，總體結(jié)果顯示在干旱脅迫發(fā)生的情況下，轉(zhuǎn)LEA基因棉花植株可以提高游離脯氨酸的含量。游離脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強的品種積累的脯氨酸多。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱性的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強，能穩(wěn)定原生質(zhì)體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能有效防止細(xì)胞脫水的作用。本研究創(chuàng)制的轉(zhuǎn)LEA基因棉花植株在干旱脅迫發(fā)生的情況下，可顯著提高游離脯氨酸的含量，對于增加棉花的抗旱性能有貢獻(xiàn)。這可能與LEA基因可作為一種調(diào)節(jié)蛋白而參與植物滲透調(diào)節(jié)的功能有關(guān)。③可溶性糖含量變化可溶性糖含量變化結(jié)果見圖8，結(jié)果表明干旱脅迫前，WT和轉(zhuǎn)基因棉花可溶性糖含量差別不顯著；模擬干旱脅迫12小時后，WT和轉(zhuǎn)基因棉花的可溶性糖含量都呈現(xiàn)上升趨勢，并且轉(zhuǎn)基因植株的增幅為非轉(zhuǎn)基因植株的3倍左右，LI、L2的可溶性糖含量顯著高于WT，L3的可溶性糖含量極顯著高于WT。總體結(jié)果表明在干旱脅迫發(fā)生的情況下，轉(zhuǎn)LEA基因棉花植株可以提可溶性糖的含量。在干旱脅迫下，植物通過滲透調(diào)節(jié)保持細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)積累，保證組織水勢下降時細(xì)胞膨壓得以維持，細(xì)胞內(nèi)可溶性糖濃度的提高可增強細(xì)胞的滲透吸水能力從而增強植物的抗旱性。本研究創(chuàng)制的轉(zhuǎn)LEA基因棉花植株在干旱脅迫發(fā)生的情況下，可顯著提高可溶性糖含量和生成量，提高植株的抗旱性。④可溶性蛋白含量變化可溶性蛋白含量變化結(jié)果見圖9，結(jié)果表明干旱脅迫前，WT和轉(zhuǎn)基因棉花可溶性蛋白含量差別不顯著；模擬干旱脅迫12小時后，WT和轉(zhuǎn)基因棉花的可溶性蛋白含量都呈現(xiàn)上升趨勢，并且轉(zhuǎn)基因植株的增幅為非轉(zhuǎn)基因植株的5倍左右，LI、L2、L3的可溶性蛋白含量均顯著高于WT。結(jié)果表明在干旱脅迫發(fā)生的情況下，轉(zhuǎn)LEA基因棉花植株可以提可溶性蛋白的含量。如細(xì)胞內(nèi)可溶性糖一樣，在干旱脅迫下，可溶性蛋白濃度的提高可增強細(xì)胞的滲透吸水能力從而增強植物的抗旱性。本研究創(chuàng)制的轉(zhuǎn)LEA基因棉花植株在干旱脅迫發(fā)生的情況下，可顯著提高可溶性蛋白含量和生成量，提高植株的抗旱性。(3)轉(zhuǎn)基因植株生物量及抗旱 性形態(tài)指標(biāo)測定當(dāng)用12% (w/v)PEG-6000模擬干旱處理水培棉花時，4小時后，WT出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，6小時后，轉(zhuǎn)基因棉花開始出呈現(xiàn)萎蔫狀態(tài)。處理12小時后，WT葉片枯萎，有3片葉子卷葉嚴(yán)重，且頂端葉片邊緣也出現(xiàn)枯萎跡象。相比較而言，轉(zhuǎn)基因棉花受干旱脅迫影響較小，只有最基部2個葉片表現(xiàn)出枯萎跡象，雖然L3個體比WT小，但它的葉片枯萎程度明顯好于WT，頂端葉片邊緣也無枯萎跡象(如圖5)?？梢?，在水分脅迫實驗中轉(zhuǎn)LEA基因棉花植株表現(xiàn)出更強的抗旱性。12% (w/v)PEG-6000模擬干旱處理12小時后，繼續(xù)水培棉花45天，holgland營養(yǎng)液每周更換一次，充分通氣。至棉花開花前測定它們的生物量指標(biāo)，如表I所示；測定它們的抗旱性形態(tài)指標(biāo)，如表2所示。表I棉花生物量數(shù)據(jù)表
植株編號葉干重(g)莖干重(g)根干重(g)總生物量(g)
WT 1.483 0.9740.3542.811LI 2.697 1.8850.7965.378 L2 3.203 2.1550.966.318 L3 1.69 0.990.5863.266表2棉花形態(tài)指標(biāo)數(shù)據(jù)表
植株編
葉片數(shù)株高(cm) 莖直徑(cm)主根長(cm)
號
WT13430.74511.9
LI16480.76625.1
L215500.86417.4
L314440.71321.6結(jié)果表明轉(zhuǎn)LEA基因棉花與WT相比，其葉片數(shù)增多，植株高大，莖直徑變大，主根長度增加；烘干后發(fā)現(xiàn)，無論是根、莖、葉分營養(yǎng)器官組分還是總生物量，轉(zhuǎn)基因植株的生物量均高于WT。結(jié)果表明植物在受到水分脅迫時，轉(zhuǎn)LEA基因棉花的植株生長，地上及地下干物質(zhì)積累程度都明顯優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因棉花。
權(quán)利要求
1.一種利用晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白及其編碼基因在培育抗旱轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng)用，其特征在于按下列步驟進(jìn)行 a、將晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白基因通過常規(guī)分子生物學(xué)方法插入到植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體中，并通過花粉管通道法導(dǎo)入到棉花受體材料中，獲得轉(zhuǎn)基因植株； b、通過大田卡那霉素檢測和室內(nèi)分子檢測，經(jīng)過繼代培養(yǎng)并每代進(jìn)行嚴(yán)格的陽性植株篩選，直至獲得穩(wěn)定遺傳的T3代轉(zhuǎn)基因植株； C、轉(zhuǎn)基因抗旱材料的抗逆性鑒定和利用，根據(jù)目的基因過表達(dá)的生理作用，進(jìn)行相應(yīng)的生理生化指標(biāo)檢測，并通過盆栽試驗和大田抗逆性測定試驗，篩選出抗旱性能明顯提高的轉(zhuǎn)基因育種材料，獲得的優(yōu)異材料用于棉花育種或生產(chǎn)實踐。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白的氨基酸序列如 Genebank 號 ABG54481 所不。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白編碼基因的核苷酸序列如Genebank號DQ663481所不。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的應(yīng)用，其特征在于所述用于遺傳轉(zhuǎn)化的棉花品種為早熟棉新陸早18號。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白及其編碼基因在培育抗旱轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng)用。所述晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)的氨基酸序列如Genebank號ABG54481所示；所述編碼基因的核苷酸序列如Genebank號DQ663481所示；將LEA基因重組到一個植物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化入棉花細(xì)胞并讓其表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植株，從轉(zhuǎn)基因植株及其后代中篩選出穩(wěn)定遺傳的T3代植株，培育出棉花抗旱育種新種質(zhì)，進(jìn)而創(chuàng)建出棉花抗旱育種新材料，以用于棉花的常規(guī)品種或雜交品種培育。
文檔編號C07K14/415GK102732552SQ20111039321
公開日2012年10月17日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者張道遠(yuǎn), 李小雙, 楊紅蘭, 蔡明 , 裴金玲 申請人:中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所