專利名稱：一種雙功能肽修飾的基因載體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因載體技術領域，具體地說，是一種雙功能肽修飾的基因載體及其制備方法。
背景技術：
基因治療是近年來建立在基因工程技術和分子遺傳學原理基礎上的新型治療方法，因腫瘤發(fā)生與發(fā)展的生物學基礎是基因突變，所以基因治療現(xiàn)已成為攻克腫瘤最具希望的手段，也是研究最為活躍的領域。基因治療有三個重要環(huán)節(jié)，即目的基因、轉(zhuǎn)基因載體和靶細胞，其核心技術是基因?qū)胂到y(tǒng)的建立?，F(xiàn)階段基因治療面臨的最大難題在于尚未找到理想的基因載體。目前應用的載體可分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體轉(zhuǎn)染效率較高但存在運載能力低、有潛在安全威脅等缺點，因此，非病毒載體近年來發(fā)展迅速，尤其是陽離子聚合物。其中，聚乙烯亞胺(p0lyethylenimine，PEI)是近年來研究最為廣泛的陽離子多聚物非病毒基因載體，富含陽離子，具有強大的緩沖能力，有較強結(jié)合DNA和黏附細胞的能力，可縮聚DNA分子形成顆粒并轉(zhuǎn)入真核細胞進行表達。然而，PEI作為基因載體使用仍存在二個突出問題第一，轉(zhuǎn)染效率與細胞毒性存在矛盾。小分子PEI雖細胞毒性低， 但在生理的離子濃度下與DNA易發(fā)生解離，造成轉(zhuǎn)染效果差；分子量在20 kDa以上的PEI 雖具有較理想轉(zhuǎn)染效率，但由于PEI的表面富含陽性電荷以及體內(nèi)不可降解性，致使高分子量PEI表現(xiàn)出較強的細胞毒性。第二，聚乙烯亞胺靶向性差。它是利用自身所帶的正電荷，與細胞表面帶負電荷的受體通過靜電作用相結(jié)合，所以細胞的選擇特異性差，解決靶向性問題已成為非病毒載體中最為關注的問題。因此，如何將PEI改造成細胞毒性低、靶向性強、轉(zhuǎn)染效率高的基因載體材料是解決PEI應用難題的突破口。普朗尼克P123(PluroniC P123)是一種由中部疏水的聚氧丙烯鏈側(cè)面連接兩段親水聚氧乙烯(EO)構(gòu)成的非離子式三嵌段共聚物。該物質(zhì)無毒、無刺激、無免疫原性，可通過化學交聯(lián)的方法連接PEI，尤其低分子量PEI (如PEI 600/800/2000 kDa)，以形成多分枝狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子量PEI衍生物，該衍生物可保證較高轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染進入體內(nèi)細胞后， 這些交聯(lián)的化學鍵又可以通過水解等反應斷開，高分子量PEI衍生物斷裂成易代謝的低分子量低毒性的PEI，這就使得其在保證一定轉(zhuǎn)染效率的前提下，大大降低了高分子PEI所帶來的細胞毒性；另一方面，P123的親水親油平衡值適中，同時具有親水性的聚氧乙烯(EO) 鏈和疏水性的聚環(huán)氧乙烷(PO)鏈，它在水中可自發(fā)形成穩(wěn)定的多分子球形膠束樣結(jié)構(gòu)，該膠束尺寸可達納米級，因此適宜基因藥物在體內(nèi)的傳輸。整合素在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，有研究表明，在腫瘤誘導的新生血管中表達豐富的整合素α νβ 3對腫瘤血管的生成起重要作用。利用整合素ανβ3在人腫瘤細胞和腫瘤新生血管高表達的特點，可將其作為基因治療的靶點，針對整合素亞基設計一段特異的反義寡核苷酸，并通過轉(zhuǎn)基因載體將其轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞中，從而調(diào)節(jié)整合素 α νβ 3介導的生物學作用。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，是整合素和其配體相互作用的識別位點，能以一定的親和力結(jié)合整合素α νβ 3，成為腫瘤治療新的靶向策略，RGD肽在腫瘤治療中的應用已成為研究熱點。細胞穿膜肽(Cell-Penetrating Peptides, CPPs)能夠有效地引導蛋白質(zhì)甚至納米粒子進入細胞，并可靶向細胞核，其穿膜能力不依賴經(jīng)典的胞吞作用。研究發(fā)現(xiàn)全長86 個氨基酸的細胞穿膜肽TAT中49-57位氨基酸殘基組成的線性序列即可完全行使細胞穿膜功能，TAT(49-57)氨基酸序列為 Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (RKKRRQRRR)，這是TAT肽既有穿膜特性又無細胞毒性的最小片段。因此，理論上可將RGD短肽與細胞穿膜肽TAT (49-57)連接，合成具有靶向于整合素α ν β 3和促進載體穿膜的含RGD和TAT (49-57)的雙功能肽，用于修飾PEI衍生物，提高其腫瘤細胞選擇性，又可促進載體穿膜，從而增加DNA的轉(zhuǎn)染效率。中國專利文獻CN 2008100Μ757. 9，公告日2011年6月22日，公開了一種透明質(zhì)酸接枝聚乙烯亞胺共聚物、制備方法及其作為基因載體的應用，該發(fā)明的基因載體是由 PEI共價連接在透明質(zhì)酸二糖單元中被氧化的2位和3位上共聚而成；中國專利文獻CN 200710171722. 3，公告日2010年11月10日，公開了一種非離子表面活性劑修飾的聚乙烯亞胺及其制備與應用，本發(fā)明的基因載體是由聚氧乙烯硬質(zhì)酸酯修飾的PEI。但是目前關于雙功能肽修飾的普朗尼克Ρ123-聚乙烯亞胺及其制備方法和應用還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種雙功能肽。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種基因載體。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種上述基因載體的制備方法。本發(fā)明的第四個目的是，提供一種復合物。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是
一種雙功能肽，所述的雙功能肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是 所述的基因載體被上述雙功能肽所修飾。所述的基因載體是由雙功能肽和聚乙烯亞胺衍生物偶聯(lián)而成的。所述的聚乙烯亞胺衍生物是普郎尼克修飾的聚乙烯亞胺即普郎尼克-聚乙烯亞胺。所述的普郎尼克與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:1-1:20，所述的聚乙烯亞胺的分子量范圍為 600-70000 Da。所述的雙功能肽與聚乙烯亞胺衍生物的摩爾比為1:1-10:1。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是 一種上述基因載體的制備方法，它包括以下步驟
(a)雙功能肽的合成合成上述雙功能肽；
(b)普朗尼克P123-聚乙烯亞胺的制備將活化后的普郎尼克和除水后的聚乙烯亞胺分別溶于無水二氯甲烷，再將所得的兩液同時加入無水二氯甲烷底液，氮氣飽和后磁力攪拌過夜，離心取上清，將所述的上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；
(c)雙功能肽對普朗尼克P123-聚乙烯亞胺的修飾表面活性劑溶解于二甲基亞砜，步驟(a)所述的雙功能肽和步驟(b)所述的普朗尼克P123-聚乙烯亞胺分別溶解于PBS溶液； 表面活性劑溶液加入到普朗尼克P123-聚乙烯亞胺液得到maleimided P123-PEI液；雙功能肽液加入到所述的maleimided P123-PEI液，反應過夜，離心凍干。為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術方案是 一種上述基因載體與DNA形成的復合物。所述的DNA含報告基因、抗癌基因和/或細胞因子基因。本發(fā)明優(yōu)點在于
1、本發(fā)明的基因載體含有雙功能肽，該雙功能肽可靶向整合素α νβ 3并可促進載體穿膜，增強了 PEI這種陽離子多聚物非病毒基因載體的靶向性，提高了轉(zhuǎn)染效率。2、由于雙功能肽的存在，使得基因載體可使用小分子PEI取代大分子ΡΕΙ，既能保證一定轉(zhuǎn)染效率，又能降低對細胞的毒性。3、本發(fā)明所使用的陽離子多聚物非病毒基因載體是Ρ123修飾的PEI衍生物，通過 Ρ123的修飾，既可降低細胞毒性，又適宜基因藥物在體內(nèi)的傳輸。4、本發(fā)明的雙功能肽、基因載體和復合物為疾病的基因治療提供了一種有效的手段。


附圖1是Ρ123-ΡΕΙ -R13細胞毒性實驗結(jié)果。附圖2是Ρ123-ΡΕΙ -R13體外轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細說明。本發(fā)明的研究思路是
1、選用Ρ123連接ΡΕΙ，得到多分枝狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子量PEI衍生物Ρ123-ΡΕΙ。2、選擇特異親和整合素α νβ 3的RGD短肽，與細胞穿膜肽Tat (49-57)連接，合成具有靶向于α νβ 3和促進載體穿膜的雙功能肽。3、利用交聯(lián)技術將R13與PEI衍生物偶聯(lián)，構(gòu)建新型非病毒基因載體系統(tǒng)。4、檢驗構(gòu)建的新型非病毒基因載體系統(tǒng)的細胞毒性。5、檢驗構(gòu)建的新型非病毒基因載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率。實施例1 UP123-PEI的制備
稱取0. 6mmol除水后的P123，溶于40ml，無水甲苯與無水二氯甲烷體積比為3:1的無水甲苯和無水二氯甲烷的混合溶液中，加入1. 2mmol雙(三氯甲基)碳酸酯，室溫下180rpm 磁力攪拌反應過夜。真空旋蒸除去溶劑，再用30ml，無水甲苯與無水二氯甲烷體積比為2:1 的無水甲苯和無水二氯甲烷混合液溶解，然后加入2. Ommol N-羥基琥珀酰亞胺，ISOrpm 磁力攪拌下，將2. Ommol無水三乙胺逐滴加入反應液中，繼續(xù)攪拌反應約4h。待反應完全后，將反應液過濾并再次真空旋蒸除去溶劑，所得殘渣溶解于50ml乙酸乙酯中，SOOOrpm離心15min后取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮去乙酸乙酯，冷卻固化反應物，即得活化后的P123。PEI (2KDa, 0. 20 g, 0. 10 mmol)除水后溶于IOmL無水二氯甲烷中，活化后的P123 (0. Olmmol) 溶于IOml無水二氯甲烷中，同時將上述兩液緩慢的滴入IOmL無水二氯甲烷底液中，氮氣飽和后室溫磁力攪拌過夜，透析，凍干，得到P123-PEI。2、雙功能肽Rl3的合成
根據(jù)R⑶肽的氨基酸序列Arg-Gly-Asp (RGD)，TAT(49-57)氨基酸序列=Arg-Lys-LyS-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (RKKRRQRRR)，由上海吉爾生化有限公司采用固相法合成雙功能肽 RGD-Tat (49-57)，其氨基酸序列為 Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg -Arg (SEQ ID NO. 1)，并命名為 R13。3、R13 對 P123-PEI 的修飾
將表面活性劑SMCC溶解于二甲基亞砜(DMSO)溶液中至終濃度為3. 33mg/mL，雙功能肽 R13與P123-PEI分別溶解于PBS溶液中至終濃度分別為10mg/mL、9mg/mL，再將SMCC液按摩爾比10 1、5 1、2 1逐滴加入P123-PEI液中，邊加邊攪拌，在室溫下反應30mim，通過凝膠色譜柱除去未結(jié)合的SMCC，即得maleimided Plu-PEI0將R13液按摩爾比10:1、5:1、2:1 WAmaleimided Plu-PEI液中，4°C搖動反應過夜。然后用超濾離心管離心，凍干，即得三種不同R13濃度的R13和P123-PEI相偶聯(lián)的非病毒基因載體P123-PEI-R13，分別命名為 P123-PEI-R13-h、P123-PEI-R13_m、P123-PEI-R13-1。4、P123-PEI_R13的細胞毒性實驗
將Hela細胞接種于96孔板上，培養(yǎng)M h，使細胞匯合度達到70%_80%。吸去培養(yǎng)基， 每孔加入不同濃度陽離子聚合物(4，6，8，16，對，32，48118/1^，無血清1640作為溶劑)，繼續(xù)培養(yǎng)Mh，MTT法檢測細胞毒性，統(tǒng)計細胞存活率，結(jié)果如圖1所示。從圖1可看出，未修飾的PEI (25 KDa)細胞毒性很強，而P123-PEI-R13與未修飾的PEI (25 KDa)分子量相當， 但是二者細胞毒性相比具有顯著性差異，P123-PEI-R13幾乎無毒。5、P123-PEI_R13的體外轉(zhuǎn)染實驗
將Hela細胞接種于M孔板上，培養(yǎng)M h，使細胞匯合度達到70%-80%。將 P123-PEI-R13與蟲熒光素酶報告基因按質(zhì)量比2 1、5 1、10 1、20 1和30 1制成復合物，加入M孔板上，培養(yǎng)5h，替換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，檢測蟲熒光素酶表達，統(tǒng)計轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，P123-PEI-R13具備很高的轉(zhuǎn)染效率，遠遠高于對照組 PEI (2KDa)與 PEI (25KDa)的最佳表達(1. 18E+07) 士 (6. 20E+06)相比，也高近 2 倍。實施例2 UP123-PEI的制備
稱取0. 6mmol除水后的P123，溶于40ml，無水甲苯與無水二氯甲烷體積比為3:1的無水甲苯和無水二氯甲烷的混合溶液中，加入0. 6mmol雙(三氯甲基)碳酸酯，室溫下180rpm 磁力攪拌反應過夜。真空旋蒸除去溶劑，再用30ml，無水甲苯與無水二氯甲烷體積比為2:1 的無水甲苯和無水二氯甲烷混合液溶解，然后加入2. Ommol N-羥基琥珀酰亞胺，ISOrpm 磁力攪拌下，將2. Ommol無水三乙胺逐滴加入反應液中，繼續(xù)攪拌反應約4h。待反應完全后，將反應液過濾并再次真空旋蒸除去溶劑，所得殘渣溶解于50ml乙酸乙酯中，SOOOrpm離心15min后取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮去乙酸乙酯，冷卻固化反應物，即得活化后的P123。PEI (40KDa, 0. 20 g, 0. 10 mmol)除水后溶于IOmL無水二氯甲烷中，活化后的P123(0. Olmmol) 溶于IOml無水二氯甲烷中，同時將上述兩液緩慢的滴入IOmL無水二氯甲烷底液中，氮氣飽和后室溫磁力攪拌過夜，透析，凍干，得到P123-PEI。2、雙功能肽Rl3的合成
根據(jù)R⑶肽的氨基酸序列Arg-Gly-Asp (RGD)，TAT(49-57)氨基酸序列=Arg-Lys-Ly S-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (RKKRRQRRR),由上海吉爾生化有限公司采用固相法合成雙功能肽 RGD-Tat (49-57)，其氨基酸序列為 Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (SEQ ID NO. 1)，并命名為 R13。3、R13 對 P123-PEI 的修飾
將表面活性劑SMCC溶解于二甲基亞砜(DMSO)溶液中至終濃度為3. 33mg/mL，雙功能肽 R13與P123-PEI分別溶解于PBS溶液中至終濃度分別為10mg/mL、9mg/mL，再將SMCC液按摩爾比10 1、5 1、2 1逐滴加入P123-PEI液中，邊加邊攪拌，在室溫下反應30mim，通過凝膠色譜柱除去未結(jié)合的SMCC，即得maleimided Plu-PEI0將R13液按摩爾比10:1、5:1、2:1 WAmaleimided Plu-PEI液中，4°C搖動反應過夜。然后用超濾離心管離心，凍干，即得三種不同R13濃度的R13和P123-PEI相偶聯(lián)的非病毒基因載體P123-PEI-R13，分別命名為 P123-PEI-R13-h、P123-PEI-R13_m、P123-PEI-R13-1。4、P123-PEI_R13的細胞毒性實驗
將Hela細胞接種于96孔板上，培養(yǎng)M h，使細胞匯合度達到70%_80%。吸去培養(yǎng)基， 每孔加入不同濃度陽離子聚合物(4，6，8，16，對，32，48118/1^，無血清1640作為溶劑)，繼續(xù)培養(yǎng)Mh，MTT法檢測細胞毒性，統(tǒng)計細胞存活率，結(jié)果如表1所示。從表1可看出，未修飾的PEI (25 KDa)細胞毒性很強，而P123-PEI-R13與未修飾的PEI (25 KDa)分子量相當， 但是二者細胞毒性相比具有顯著性差異，P123-PEI-R13幾乎無毒。表1細胞毒性實驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種雙功能肽，其特征在于，所述的雙功能肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種基因載體，其特征在于，它被如權(quán)利要求1所述的雙功能肽所修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因載體，其特征在于，它是由雙功能肽和聚乙烯亞胺衍生物偶聯(lián)而成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因載體，其特征在于，所述的聚乙烯亞胺衍生物是普郎尼克修飾的聚乙烯亞胺即普郎尼克P123-聚乙烯亞胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因載體，其特征在于，所述的普郎尼克與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:1-1:20，所述的聚乙烯亞胺的分子量范圍為600-70000 Da0
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的基因載體，其特征在于，所述的雙功能肽與聚乙烯亞胺衍生物的摩爾比為1:1-10:1。
7.—種如權(quán)利要求4所述的基因載體的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟(a)雙功能肽的合成合成如權(quán)利要求1所述的雙功能肽；(b)普朗尼克P123-聚乙烯亞胺的制備將活化后的普郎尼克P123和除水后的聚乙烯亞胺分別溶于無水二氯甲烷，再將所得的兩液同時加入無水二氯甲烷底液，氮氣飽和后磁力攪拌過夜，離心取上清，將所述的上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；(c)雙功能肽對普朗尼克P123-聚乙烯亞胺的修飾表面活性劑溶解于二甲基亞砜，步驟(a)所述的雙功能肽和步驟(b)所述的普朗尼克P123-聚乙烯亞胺分別溶解于PBS溶液； 表面活性劑溶液加入到普朗尼克PU3-聚乙烯亞胺液得到maleimided Plu-PEI液；雙功能肽液加入到所述的maleimided Plu-PEI液，反應過夜，離心凍干。
8.—種如權(quán)利要求2或3所述的基因載體與DNA形成的復合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的復合物，其特征在于，所述的DNA含報告基因、抗癌基因和/ 或細胞因子基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙功能肽修飾的基因載體及其制備方法和應用。所述雙功能肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的基因載體是由雙功能肽和聚乙烯亞胺衍生物偶聯(lián)而成的，所述的聚乙烯亞胺衍生物是普郎尼P123修飾的聚乙烯亞胺。本發(fā)明還涉及上述基因載體的制備方法，以及上述雙功能肽和基因載體在基因治療中的應用。本發(fā)明的雙功能肽具有強靶向性和穿膜能力，本發(fā)明的基因載體轉(zhuǎn)染細胞效率高且細胞毒性低，為疾病的基因治療提供了一種有效的手段。
文檔編號C07K7/08GK102399267SQ20111037284
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月22日
發(fā)明者劉克海, 朱青, 王曉宇, 高申 申請人:上海海洋大學