專利名稱：一種穩(wěn)定、高效從紅麻葉片中分離蛋白質(zhì)的雙向電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種紅麻蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，更具體地涉及一種穩(wěn)定、高效從紅麻葉片中分離蛋白質(zhì)的雙向電泳方法。
背景技術(shù)：
紅麻(Kenaf)是錦葵科(Malvaceae)木槿屬OYi^MM) —年生韌皮纖維作物，公元前4000年的非洲蘇丹就已栽培，紅麻作為天然纖維作物，具有生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，巨大的生物產(chǎn)量為樹林的3-4倍，極強(qiáng)的二氧化碳吸收能力為森林的4-5倍，是發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)作物。紅麻纖維除傳統(tǒng)上作為加工麻繩、麻袋、地毯等的原料外，還是加工汽車內(nèi)飾、板材、麻碳等的良好材料，其纖維經(jīng)變性可與棉花混紡為面料，具有吸濕、透氣、抑菌等生物功能。澳大利亞科學(xué)家Wilkins等首先提出了蛋白質(zhì)組的概念，蛋白質(zhì)組是生物體內(nèi)一套基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)總稱，蛋白質(zhì)組研究是對(duì)不同時(shí)間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體研究，在蛋白質(zhì)水平上探索蛋白質(zhì)作用模式、功能機(jī)理、調(diào)節(jié)控制以及蛋白質(zhì)群體內(nèi)相互作用。隨著植物功能基因?qū)W的發(fā)展，蛋白組學(xué)技術(shù)已在水稻、擬南芥等模式植物中得到廣泛的應(yīng)用。雙向電泳技術(shù)最早由O，F(xiàn)arrelUKlose,Scheele等于1975年創(chuàng)立，至今已經(jīng)歷了 30多年的發(fā)展，基本技術(shù)已較為成熟。為了更深入研究紅麻發(fā)育、生長(zhǎng)、抗逆等方面的分子機(jī)理，從蛋白組水平上探究其基因表達(dá)差異顯得尤為重要，而紅麻蛋白組學(xué)研究起步較晚，國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，本發(fā)明首先從幾個(gè)方面比較了 TCA-丙酮法、尿素-硫脲法、酚抽提法等方法提取紅麻葉片蛋白的效果，以期找到最適合用于紅麻雙向電泳的蛋白提取方法。在從紅麻蛋白質(zhì)的提取、IPG膠條pH范圍選擇、蛋白上樣方式、上樣量、分離膠濃度這幾個(gè)主要方面優(yōu)化了紅麻蛋白組雙向電泳實(shí)驗(yàn)條件，最終提供了一種高效、穩(wěn)定從紅麻葉片中分離蛋白質(zhì)的雙向電泳方法，為進(jìn)一步開展紅麻蛋白組學(xué)的研究奠定工作基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效、穩(wěn)定從紅麻葉片中分離蛋白質(zhì)的雙向電泳方法。本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明的一種穩(wěn)定、高效從紅麻葉片中分離蛋白質(zhì)的雙向電泳方法，采用PH值為8.0的Tris-飽和酚抽提紅麻葉片中的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行雙向電泳，雙向電泳的條件如下第一向電泳紅麻蛋白質(zhì)上樣量為1. 4mg,使用MCM，pH值為4_7的IPG膠條、pH值為4-6. 5的IPG buffer ；第一向電泳參數(shù)設(shè)置為20°C、50y A/strip、50V 12h ,200V Ih ,500V Ih、IOOOV Ih、梯度1000V 8000V Ih ,8000V 52000vhr ；第二向電泳中采用12%分離膠來(lái)縱向分離蛋白，第二向電泳參數(shù)設(shè)置為JStMOyA/strip Ih U5yA/strip0采用pH值為8. 0的Tris-飽和酚抽提取紅麻葉片中的蛋白質(zhì)的具體操作為取Ig紅麻新鮮葉片，置于冰冷的研缽中，加入聚乙烯吡咯烷酮PVP，用液氮進(jìn)行研磨45min，加入5ml提取液，提取液配方100mmol/LTris、50mmol/L抗壞血酸、100mmol/L氯化鉀、50mmol/L硼砂、Triton X-100J% β -巰基乙醇，繼續(xù)研磨15min，加入等體積的ρΗ 8.0Tris-飽和酚，渦旋，15000r/min，4°C離心15min ；取酚層，加入6倍體積0. lmol/L乙酸銨甲醇溶液，-20°C靜置過(guò)夜，15000r/min，4°C離心15min，棄上清液，沉淀用_20°C預(yù)冷的含2% β 一巰基乙醇的甲醇溶液洗滌2次，沉淀真空干燥成干粉。第一向電泳中采用主動(dòng)上樣方式上樣。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
紅麻葉片含多糖、色素、酚類、核酸等比較多，這些因素極易引起蛋白聚焦時(shí)間延長(zhǎng)、水平拖尾、背景污染等問(wèn)題。本發(fā)明在磨樣時(shí)加入了適量不溶性的聚乙烯吡咯烷酮，減少了植物中色素、酚類和醌類等次生代謝物質(zhì)的干擾。運(yùn)用本發(fā)明中的飽和酚提取法提取的紅麻葉片蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量低，蛋白純度和得率都較高。所以在等電聚焦時(shí)，單根膠條電流才20mA,保證了聚焦過(guò)程的順利進(jìn)行。本發(fā)明優(yōu)化的紅麻雙向電泳體系重復(fù)性極好、實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定、雙向凝膠圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰、數(shù)目較多、分布均勻、背景清楚。在對(duì)* 16cm的凝膠上平均可檢測(cè)到大概1300個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，此發(fā)明為進(jìn)一步開展紅麻及其麻類的蛋白組學(xué)和分子生物學(xué)的研究奠定工作基礎(chǔ)。


圖1為三種提取方法提取的紅麻葉片蛋白的雙向電泳圖譜；其中A. TCA-丙酮法B.尿素-硫脲法C.酚抽提法。圖2為采用ρΗ 3^10線性膠條進(jìn)行分離的紅麻葉片蛋白質(zhì)的2-DE圖譜。圖3為不同上樣方式的2-DE圖譜A.被動(dòng)水化上樣；B.主動(dòng)水化上樣。圖4 為不同上樣量的 2-DE 圖譜 A. 1. Img ；B. 1. 4mg ；C. 1. 7mg。圖5為不同濃度分離膠的2-DE圖譜，A. 12%的分離膠；B. 13%的分離膠。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施步驟如下(1)蛋白樣品的制備
TCA-丙酮法提取紅麻葉片蛋白取Ig紅麻新鮮葉片(采用的紅麻原料為紅麻品種福紅952)，加入適量PVP，用液氮進(jìn)行研磨45min，加入10mL-20°C預(yù)冷的含0. 07%β -巰基乙醇，10%TCA的丙酮溶液，低溫研磨15min, _20°C靜置過(guò)夜。離心(15000r/min，4°C ) 15min，棄上清，加IOmL冷丙酮(含0. 07%β -巰基乙醇)振蕩，_20°C沉淀2小時(shí)。用_20°C預(yù)冷的含0. 07% β -巰基乙醇丙酮再洗滌2次，沉淀真空干燥成干粉。尿素-硫脲法提取紅麻葉片蛋白取Ig紅麻新鮮葉片，加入適量PVP，用液氮進(jìn)行研磨 45min,加入 6ml 提取緩沖液GommovLjTris-BasejmolA^readmoVLthioureai2%CHAPS、5%PVP、^^ -巰基乙醇)低溫研磨 15min。離心(15000r/min，4°C ) 15min，取上清，加入預(yù)冷的含0. 07% β -巰基乙醇的丙酮，-20°C靜置過(guò)夜。用含有0. 07% β -巰基乙醇洗滌2次，沉淀真空干燥成干粉。酚抽提法提取紅麻葉片蛋白取Ig紅麻新鮮葉片置于研缽中，加入適量PVP，用液
4氮進(jìn)行研磨 45min，加入 5ml 由 100mmol/LTris、50mmol/L抗壞血酸、100mmol/LKCl、50mmol/L硼砂、Triton X-100J% β -巰基乙醇組成的提取液，繼續(xù)研磨數(shù)15min，加入等體積的pH8. 0 Tris飽和酚，渦旋，15000r/min，4°C離心15min。取酚層，加入6倍體積0. Imol/L乙酸銨甲醇溶液，-20°C靜置過(guò)夜。按上述方法離心15min，棄上清液，沉淀用_20°C含2%β —巰基乙醇的預(yù)冷甲醇洗滌2次，沉淀真空干燥成干粉。稱取TCA-丙酮法和酚抽提法提取的蛋白干粉30mg，尿素-硫脲法提法提取的蛋白干粉25mg，對(duì)應(yīng)加入300μ 1、600μ 1、300μ 1的裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(W/V) CHAPS,2%(V/V) IPG buffer、40mmol/LDDT)進(jìn)行超聲裂解，離心(15000r/min，4 °C )15min，取上清。(2)蛋白質(zhì)定量
以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Brafford法測(cè)定制備的樣品中蛋白質(zhì)含量。(3)雙向電泳
取1. 4mg的蛋白樣品，與水化液混合為450 μ 1，加入到Ktan IPGphor III等電聚焦盤中，鋪上Mcm，pH4-7的的IPG干膠條，加入礦物油，然后轉(zhuǎn)移到系統(tǒng)上進(jìn)行除鹽和聚焦步驟。主動(dòng)水化上樣在50V低電壓下進(jìn)行。第一向電泳參數(shù)設(shè)置為20 、50μΑ/ ^Ηρ、50ν12 h、200V 1 h、500Vlh UOOOVl h、梯度 IOOOV 8000Vlh、8000V52000vhr。等電聚焦完成后每根膠條用平衡液I和含25mg/mL碘乙酰胺的平衡液II各IOml分別平衡15min。分別配置1 和13%濃度的分離膠來(lái)分離。待溴酚藍(lán)指示劑跑到近底部0. 5cm時(shí)，剝離二相膠，用固定液固定池后考馬斯亮藍(lán)G250染色過(guò)夜，再用蒸餾水脫色，Imag沾canner掃描凝膠，光學(xué)分辨率為300dpi。運(yùn)用ImageMaster 2D Platinum 7. 0軟件進(jìn)行蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)，具體參數(shù)設(shè)置為=Smooth (5)、Min Area (5), Saliency (400)。雙向電泳方法中相關(guān)試劑配置如下水化液7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2%(W/V) CHAPS,0. 2%(V/V) IPG buffer、40mmo 1/LDDT ；平衡液 I :50mmol/L Tris-HCl pH8. 8、6mol/L 尿素、30%(V/V)甘油、2%(W/V) SDS、少量溴酚藍(lán)、lOmg/mLDDT ；平衡液 II :50mmol/LTris-HCl pH8. 8、6mol/L 尿素、30%(V/V)甘油、2%(W/V) SDS、少量溴酚藍(lán)、25mg/mL 碘乙酰胺；固定液(40%甲醇，10%乙酸);考馬斯亮藍(lán)G250染色液10% (W/V)硫酸銨、0. 25% (W/V)G250U. 2% (V/V) 85% 磷酸、98. 8% (V/V) dd H2O ；85% (V/V)的 Bradford 工作液dd H2O,4. 72 (V/V)95% 乙醇，10. 28% ( V/V) 85% 磷酸，0· 00006% (W/V)考馬斯亮藍(lán) G250)，12% 分離膠配置方法為40% ( V/V) 30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺(Acr-Bis)，25% ( V/V) ddH20，25% (V/V) 1. 5M Tris-Cl，1% (V/V) 10% 十二烷基硫酸鈉(SDS)，0· 5% (V/V) 10% 過(guò)硫酸銨(AP), 0. 05% (V/V) N, N, N, N' _ 四甲基乙二胺(TEMED)。采用上述三種提取方法，TCA-丙酮法、酚抽提法和尿素-硫脲法，其蛋白提取效果見表1。三種提取方法得到的電泳圖見圖1，從圖1和表1可以看出，酚抽提法和尿素-硫脲法提取的蛋白質(zhì)所獲得的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)較多，分別達(dá)1436和1009個(gè)點(diǎn)，是TCA-丙酮法的3. 58倍和2. 51倍。比較雙向電泳圖譜可知，酚抽提法提取的蛋白所獲得的蛋白點(diǎn)分布較其他兩種方法均勻，且蛋白點(diǎn)呈圓形，清晰，橫紋和拖尾也較少，整體效果比較理想。綜上所述，酚抽提法相對(duì)于TCA-丙酮法、尿素-硫脲法更適合用于紅麻葉片雙向電泳。表1三種蛋白提取方法的提取效果比較
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定、高效從紅麻葉片中分離蛋白質(zhì)的雙向電泳方法，其特征在于，采用PH值為8.0的Tris-飽和酚抽提紅麻葉片中的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行雙向電泳，雙向電泳的條件如下第一向電泳紅麻蛋白質(zhì)上樣量為1.細(xì)g，使用MCM，pH值為4-7的IPG膠條、pH值為4-6. 5 的 IPG buffer ；第一向電泳參數(shù)設(shè)置為20°C、50y A/strip、50V 12h ,200V Ih、500V Ih U000V Ih、梯度 1000V 8000V Ih ,8000V 52000vhr ；第二向電泳中采用 12%分離膠來(lái)縱向分離蛋白，第二向電泳參數(shù)設(shè)置為15°C、10yA/strip Ih、15yA/strip。
2.如權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定、高效從紅麻葉片中分離蛋白質(zhì)的雙向電泳方法，其特征在于，采用PH值為8.0的Tris-飽和酚抽提取紅麻葉片中的蛋白質(zhì)的具體操作為取Ig紅麻新鮮葉片，置于冰冷的研缽中，加入聚乙烯吡咯烷酮PVP，用液氮進(jìn)行研磨45min，加入5ml提取液，提取液配方100mmol/LTris、50mmol/L抗壞血酸、100mmol/L氯化鉀、50mmol/L硼砂、Triton X-100J% β -巰基乙醇，繼續(xù)研磨15min，加入等體積的pH 8.0Tris-飽和酚，渦旋，15000r/min，4°C離心15min ；取酚層，加入6倍體積0. lmol/L乙酸銨甲醇溶液，-20°C靜置過(guò)夜，15000r/min，4°C離心15min，棄上清液，沉淀用_20°C預(yù)冷的含2% β 一巰基乙醇的甲醇溶液洗滌2次，沉淀真空干燥成干粉。
3.如權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定、高效從紅麻葉片中分離蛋白質(zhì)的雙向電泳方法，其特征在于，第一向電泳中采用主動(dòng)上樣方式上樣。
全文摘要
本發(fā)明研發(fā)了一種高效、穩(wěn)定從紅麻葉片中分離蛋白質(zhì)的雙向電泳方法，本發(fā)明結(jié)合紅麻葉片的生物質(zhì)化學(xué)特性，在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)雙向電泳方法上，對(duì)紅麻葉片蛋白質(zhì)提取方法、IPG膠條pH范圍選擇、蛋白質(zhì)上樣方式、上樣量、分離膠濃度及蛋白質(zhì)點(diǎn)分析軟件參數(shù)設(shè)定等方面加以改進(jìn)和優(yōu)化。運(yùn)用本發(fā)明的方法能獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰、數(shù)目較多、分布均勻、背景清楚的紅麻葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳凝膠圖譜，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，在24cm＊16cm的凝膠上平均可檢測(cè)到1300個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，此發(fā)明為進(jìn)一步開展紅麻及其麻類的蛋白組學(xué)和分子生物學(xué)的研究奠定工作基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K1/26GK102382166SQ20111037248
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月22日
發(fā)明者徐建堂, 方平平, 李小珍, 林培清, 祁建民, 秦先超, 陳濤, 陶愛芬 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)