專利名稱：一種β-伴大豆球蛋白單克隆抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種β-伴大豆球蛋白單克隆抗體制備方法。
背景技術(shù)：
大豆及其制品含有豐富的蛋白質(zhì)和平衡的氨基酸，是人和畜禽優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白源。但大豆中含有胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素、致敏原、低聚糖、植酸、脲酶及致甲狀腺腫素等抗?fàn)I養(yǎng)因子，干擾人和動物腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，破壞正常的新陳代謝，誘發(fā)過敏反應(yīng)(尤其是嬰幼兒及幼齡畜禽)，在很大程度上限制了其在食品和飼料行業(yè)尤其是嬰幼兒食品及幼齡畜禽飼料中的應(yīng)用。胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素等抗?fàn)I養(yǎng)因子熱穩(wěn)定性較差，可以通過高溫處理消除。大豆中的致敏原主要包括大豆球蛋白(glycinin) 禾口三禾中伴大豆球蛋白(α -conglycinin、β -conglycinin 禾口 γ -conglycinin),其中 β -conglycinin是免疫原性最強的致敏原，其熱穩(wěn)定性較高，常規(guī)加工處理方法很難消除。 大豆與牛奶、雞蛋、魚、貝類、小麥、花生、堅果被列為最易引起人類過敏的8種食物。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，仔豬斷奶前后連續(xù)飼喂含大豆蛋白日糧，會引起過敏反應(yīng)，致腸粘膜受損，腸絨毛脫落，隱窩加深，腸壁通透性增加，肥大細(xì)胞數(shù)量和組胺釋放量增加，進而導(dǎo)致腹瀉、生長受阻。人們一直在探索消減大豆蛋白制品致敏性的方法，包括擠壓膨化加工、微生物發(fā)酵、酶解處理等，并取得了一些進展。高效、靈敏、快捷的致敏原檢測技術(shù)，是大豆及其制品利用技術(shù)開發(fā)取得成功的重要保障。目前，大豆蛋白致敏原檢測常用方法有高效液相色譜(HPLC)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。HPLC具有分離效率高、分析速度快、檢測限低等優(yōu)點，被認(rèn)為是迄今為止對復(fù)雜混合物分離效能最高的一種分離分析技術(shù)，但它并不能區(qū)分被檢物的免疫活性(致敏性)。PCR被廣泛用于大豆、榛子、花生等食品中微量抗原成分的檢測，具有敏感性和特異性高等特點。但該技術(shù)是建立在特異DNA片段PCR擴增基礎(chǔ)上，特異性DNA的檢出，并不能直接反應(yīng)出樣品中含有具免疫活性的致敏原的情況，從而限制了該方法在致敏原檢測中的應(yīng)用。致敏原的免疫原性是發(fā)生過敏反應(yīng)的前提條件。以抗原、抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的ELISA是致敏原檢測的最佳選擇。ELISA能夠快速、準(zhǔn)確地對樣品中致敏原進行定性定量檢測，并且不需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的操作步驟，被廣泛應(yīng)用在食品和飼料行業(yè)。ELISA的關(guān)鍵是合適抗體的研發(fā)。彭楠等(2007)制備了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白多克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了間接競爭ELISA方法(彭楠，劉建峰，梁運祥，葛向陽.間接競爭ELISA檢測大豆IlS球蛋白和7S伴球蛋白.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2007,26 (5) 661-664)。多克隆抗體是大豆蛋白中多個抗原表位同時刺激動物產(chǎn)生的針對不同抗原表位的抗體混合物，既可與大豆蛋白中無致敏性的抗原表位結(jié)合，又可能與大豆蛋白以外的其它蛋白上的抗原表位結(jié)合(即交叉反應(yīng))，因此以其為基礎(chǔ)建立的大豆蛋白致敏原檢測技術(shù)其結(jié)果并不完全可靠。游金明等(2008)采用人工合成伴大豆球蛋白上一段表位肽作為免疫抗原，制備了單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立了 ELISA檢測方法(游金明，王自蕊，譙仕彥，賀平麗，李德發(fā).致仔豬過敏性大豆抗原蛋白β-conglycinin 單克隆抗體的制備與鑒定.中國畜牧雜志，2008，44 (17): 46-48)。但由于該表位是選自 β-伴大豆球蛋白上的任意抗原表位，依然不能解決大豆蛋白中致敏性成分的特異性檢測問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種針對伴大豆球蛋白α亞基 IgE過敏抗原表位的單克隆抗體制備方法。用本發(fā)明方法制備的單克隆抗體，能與伴大豆球蛋白各組成亞基中致敏性最強的α亞基中引起IgE過敏反應(yīng)的抗原表位結(jié)合，表位明確、特異性強，明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)制備的抗體，在大豆品種選育與改良、β -伴大豆球蛋白分離純化與檢測、β -伴大豆球蛋白致敏機理研究等領(lǐng)域具有廣泛用途。本發(fā)明方法包括以下步驟
步驟(1).制備抗原采用化學(xué)法或基因工程技術(shù)制備含β-伴大豆球蛋白α亞基IgE 抗原表位的表位小肽，然后將此表位小肽耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上，制備免疫用抗原； 所述的載體蛋白或載體多肽包括但不限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白。所述的表位小肽中氨基酸序列如下述SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 7的任意1條 ① NH2-repqqpgekeededeqprpC_CONH2 ；
(2) NH2-EffPRKEEKRGEKGC-CONH2 ；
③NH2-khnkcIqscnserdsyrn-CONH2 ；
④NH2-IlefnskpnC-CONH2 ；
⑤Nh2-IjQrfnqrspqlqnlrC-Conh2 ； nh2-selrrhknknpflfgc-conh2 ； ⑦ nh2-knpflfgsnrfetlfc-conh2 ；
所述的表位小肽氨基酸序列，在不改變表位小肽抗原表位結(jié)構(gòu)的前提下，小肽一端或兩端增加有氨基酸。步驟O).免疫動物將耦聯(lián)載體的表位小肽與弗氏佐劑混合免疫動物，第一次用完全弗氏佐劑，以后用不完全弗氏佐劑，每兩周免疫一次，并于融合前2 4天等量抗原加強免疫。其中，供免疫動物包括但不限于小鼠、大鼠、兔。步驟(3).細(xì)胞融合、篩選及克隆化選取抗血清效價最高的動物取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞體外融合，經(jīng)三次亞克隆獲得穩(wěn)定分泌抗β-伴大豆球蛋白單克隆抗體的細(xì)胞株。步驟細(xì)胞培養(yǎng)將上述細(xì)胞株體外擴大培養(yǎng)后，收集上清液。步驟(5).腹水制備將擴大培養(yǎng)后的雜交瘤細(xì)胞株注入動物腹腔，以大量生產(chǎn)腹水，提取、純化后即可得到伴大豆球蛋白單克隆抗體。本發(fā)明與目前常用的多克隆抗體或單克隆抗體相比，具有以下技術(shù)效果(1)與多克隆抗體相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體特異性強，與其它蛋白無交叉反應(yīng)，且來源可靠，質(zhì)量穩(wěn)定均一；(2)與常規(guī)單克隆抗體相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體能與β-伴大豆球蛋白各組成亞基中致敏性最強的α亞基的IgE過敏抗原表位結(jié)合，表位明確、特異性強， 該單克隆抗體使用時反映的是真正具有致敏活性的伴大豆球蛋白；而常規(guī)單克隆抗體所針對的是抗原蛋白中的任意表位，使用此類單克隆抗體時并不能準(zhǔn)確獲取有關(guān)具致敏活性的β -伴大豆球蛋白信息，從而使其應(yīng)用價值受到影響，應(yīng)用范圍受到限制。
具體實施例方式1 材料
雌性Balb/c小鼠購自蘇州愛爾麥特生物科技有限公司，弗氏完全佐劑、HAT、HT、魯米諾、香豆酸、Na2-EDTA、TMB均購自sigma，IMDM培養(yǎng)基和青鏈霉素購自hyclone，DMSO 購自biomol，PEG購自roche，胎牛血清購自上海依科賽公司，HRP標(biāo)記二抗購自蘇州百奇公司，濃硫酸和丙三醇購自上海試一化學(xué)試劑公司，檸檬酸購自國藥化試公司，H2A 購自上海三鷹化學(xué)試劑公司。含伴大豆球蛋白α亞基IgE抗原表位的表位小肽 “NH2-KNPFLFGSNRFETLFC-C0NH2，，及與載體耦聯(lián)的免疫抗原委托蘇州百奇生物公司制備。2 方法
2.1免疫動物將免疫抗原與弗氏完全佐劑混合乳化后注射到小鼠腹腔，分別在初次免疫后第2、4、6、8周將抗原與弗氏不完全佐劑混合后進行加強免疫。取小鼠脾臟前36-48 小時用等量免疫抗原不加佐劑，加強免疫一次。2.2細(xì)胞融合、篩選及克隆化于融合前36-48小時內(nèi)，對經(jīng)間接ELISA法檢測血清效價最高的小鼠，按常規(guī)方法取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞(5 1)融合，HAT選擇培養(yǎng)，用間接 ELISA法篩選，陽性孔經(jīng)3次有限稀釋克隆化。2.3細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)過克隆的雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)后，每隔3天收集1次上清液， 1000r/min離心lOmin，上清液經(jīng)硫酸銨分級沉淀法純化后-20°C凍存。2.4腹水制備在每只BALB/C小鼠腹腔內(nèi)注入0.5ml液體石蠟，7天后每只小鼠腹腔注入已培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞IO6個，1周后可見小鼠腹腔明顯漲大，收集腹水。1500r/min 離心30min，收集上清。小心挑去上層脂肪，使用飽和硫酸銨沉淀粗提抗體，50%的硫酸銨與 33%的硫酸銨先后各沉淀一次，再將粗提后的抗體溶解在PBS緩沖液中，經(jīng)PBS緩沖液透析， 換液2-3次，每次間隔1個小時以上，最后將透析好的抗體加入蛋白G柱子中，以每毫升蛋白G結(jié)合5-10毫克的IgG計算，穿透液可以多次上柱，使未結(jié)合的抗體充分結(jié)合，用PH2. 5 的甘氨酸溶液洗脫結(jié)合抗體，PBS透析，并換液三次，每次間隔1個小時以上，即得到純化抗體。2.5抗體鑒定用間接ELISA法檢測腹水抗體效價。包被抗原為合成的含β-伴大豆球蛋白α亞基IgE抗原表位的表位小肽。采用BD亞型鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體亞型。采用western blot法分析單克隆抗體特異性。3 結(jié)果
3.1雜交瘤細(xì)胞系的建立與克隆免疫小鼠血清ELISA效價均達1:104以上，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后HAT選擇培養(yǎng)，經(jīng)克隆和間接ELISA篩選，獲得了 1株穩(wěn)定分泌抗 β-伴大豆球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。3.2單克隆抗體鑒定用ELISA法檢測腹水型單抗效價為1:3. 2 X 104。單克隆抗體梯度稀釋后ELISA測定OD值如下
稀釋度1/10001/40001/160001/320001/64000陰性對照陽性對照OD值3. 5721. 4070. 4020. 2960. 1290. 0641. 706
經(jīng)鑒定，該單克隆抗體為IgGl型，輕鏈類型為κ。
權(quán)利要求
1.一種β-伴大豆球蛋白單克隆抗體制備方法，其特征在于該方法具體步驟是 步驟(1).制備抗原采用化學(xué)法或基因工程技術(shù)制備含β-伴大豆球蛋白α亞基IgE抗原表位的表位小肽，然后將此表位小肽耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上，制備免疫用抗原；步驟O).免疫動物將耦聯(lián)載體的表位小肽與弗氏佐劑混合免疫動物，第一次用完全弗氏佐劑，以后用不完全弗氏佐劑，每兩周免疫一次，并于融合前2 4天等量抗原加強免疫；步驟(3).細(xì)胞融合、篩選及克隆化選取抗血清效價最高的動物取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞體外融合，經(jīng)三次亞克隆獲得穩(wěn)定分泌抗β-伴大豆球蛋白單克隆抗體的細(xì)胞株； 步驟細(xì)胞培養(yǎng)將上述細(xì)胞株體外擴大培養(yǎng)后，收集上清液； 步驟(5).腹水制備將擴大培養(yǎng)后的雜交瘤細(xì)胞株注入動物腹腔，以大量生產(chǎn)腹水， 提取、純化后即可得到伴大豆球蛋白單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的一種伴大豆球蛋白單克隆抗體制備方法，其特征在于步驟 ⑴所述的表位小肽中氨基酸序列如下述7條的任意1條① NH2-repqqpgekeededeqprpC_CONH2 ； (2) NH2-EffPRKEEKRGEKGC-CONH2 ；③NH2-khnkcIqscnserdsyrn-CONH2 ；④NH2-IlefnskpnC-CONH2 ；⑤Nh2-IjQrfnqrspqlqnlrC-Conh2 ； nh2-selrrhknknpflfgc-conh2 ； ⑦ nh2-knpflfgsnrfetlfc-conh2。
3.如權(quán)利要求1所述的一種β-伴大豆球蛋白單克隆抗體制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的載體蛋白或載體多肽包括但不限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的一種β-伴大豆球蛋白單克隆抗體制備方法，其特征在于步驟 (2)中供免疫動物包括但不限于小鼠、大鼠、兔。
5.如權(quán)利要求2所述的一種伴大豆球蛋白單克隆抗體制備方法，其特征在于所述的表位小肽的氨基酸序列，在不改變表位小肽抗原表位結(jié)構(gòu)的前提下，小肽一端或兩端增加有氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β-伴大豆球蛋白單克隆抗體制備方法。本發(fā)明方法首先采用化學(xué)法或基因工程技術(shù)制備含β-伴大豆球蛋白α亞基IgE抗原表位的表位小肽，然后將表位小肽耦聯(lián)到載體蛋白或載體多肽上免疫動物，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)克隆、篩選獲得分泌β-伴大豆球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，采用細(xì)胞培養(yǎng)和腹水法制備β-伴大豆球蛋白單克隆抗體。本發(fā)明制備的單克隆抗體，針對β-伴大豆球蛋白中的過敏表位，特異性強，明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)制備的抗體，在大豆品種選育與改良、β-伴大豆球蛋白分離純化與檢測、β-伴大豆球蛋白致敏機理研究等領(lǐng)域具有廣泛用途。
文檔編號C07K16/16GK102408482SQ20111032740
公開日2012年4月11日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者劉海軍, 徐子偉, 李永明 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院