專利名稱：用于β-伴大豆球蛋白α’提高的大豆的方法和組合物的制作方法
用于β-伴大豆球蛋白α ’提高的大豆的方法和組合物相關(guān)申請的交叉引用本申請根據(jù)35 U.S.C. § 119(e)要求于2008年9月4日提交的美國臨時(shí)申請 61/094, 277的優(yōu)先權(quán)。該申請的全部內(nèi)容本文引入作為參考。
背景技術(shù)：
1.序列表的引入序列表包含于2009年8月22日創(chuàng)建的、38，062字節(jié)(在MS-Windows中確定)的名為“pa_53703D. txt”的文件中。該電子序列表在這里通過電子方式提交，并且通過引用并入本文。2.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及植物育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及具有提高的 β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin) α丨亞基含量的大豆和用于產(chǎn)生這樣的植物的材料。 更具體地說，本發(fā)明包括一種用于培育包含與提高的α ’-亞基相關(guān)的數(shù)量性狀基因座的大豆植物的方法。本發(fā)明還包括包含賦予提高的α ’-亞基的數(shù)量性狀基因座(QTL)的種質(zhì)和該種質(zhì)在育種計(jì)劃中基因滲入優(yōu)良種質(zhì)的用途。3.相關(guān)技術(shù)描述美國種植者種植兩類大豆豆油(oil) /粗粉(meal)和食品級大豆。豆油/粗粉豆的種植主要是為了美國市場。用作食品配料用的大豆通常為粉、濃縮物、分離物或油的形式。由于它們的功能、營養(yǎng)特性、低成本和豐度(abundance)，大豆成分十分搶手(Zayas等人，F(xiàn)unctionality of Proteins in Food, (1997))。組成和構(gòu)象決定蛋白質(zhì)的功能。能夠改變功能的組成上的差異包括，例如，蛋白質(zhì)組分的比例、組分內(nèi)亞基濃度的變化以及氨基酸分布的不同。大豆蛋白質(zhì)具有四個(gè)主要的可用水萃取的組分0S、7S、11S和15S)，它們可以根據(jù)沉降系數(shù)分離。7S(i3-伴大豆球蛋白)和IlS(大豆球蛋白(glycinin))蛋白質(zhì)是大豆內(nèi)的主要組分。大豆球蛋白(lis球蛋白)由五個(gè)不同的亞基組成，它們分別被命名為AlaB2、 A2Bla、AlbBlb、A5A4B3、A3B4。每個(gè)亞基由通過二硫鍵共價(jià)連接的兩個(gè)多肽(一個(gè)為酸性， 一個(gè)為堿性)組成。這兩個(gè)多肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^原大豆球蛋白前體的翻譯后切割產(chǎn)生的；這一步在前體進(jìn)入蛋白質(zhì)體后發(fā)生。已經(jīng)確定了編碼這些多肽亞基的五種主要基因。它們分別被命名為 Gyl、Gy2、Gy3、Gy4 禾口 Gy5 (Nielsen 等人，In :Cellular and molecular biology of plant seed development, Larkins 禾口 Vasil IK(編著)，Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands，151-220 (1997))。另外，也報(bào)道了假基因 gy6 和次要基因 Gy7(Beilinson 等人，Theor. Appl, Genet.，104 (6-7) 1132-1140 (2002)) 多個(gè)研究小組報(bào)道了這些基因的遺傳圖譜(Diers等人，1993，Chen和Shoemaker 1998，Beilinson等人，2002)。Gyl和Gy2相距3kb，并且定位于連鎖群N上(Nielsen等人，Plant Cell.，1 313-3 (1989))，Gy3 定位于連鎖群 L 上(Beilinson 等人，Theor. Appl. Genet. , 104(6-7) 1132-1140 (2002)) ο Gy4和Gy5分別定位于連鎖群0和F上。另一方面，β -伴大豆球蛋白(7S)由α ( 67kda)、α ‘( 7IkDa)和β ( 50kDa)亞基組成，每個(gè)亞基通過共翻譯和翻譯后修飾加工(Ladin等人，Plant Physil.， 84 35-41 (1987) :Utsumi. In :Advances in Food and Nutrition Research, Kinsella(編著)，36 :89-208, Academic Press, San Diego, CA(1992)) β -伴大豆球蛋白亞基分別由基因Cgyl、Cgy2和Cgy3編碼。遺傳分析表明Cgy2與Cgy3緊密連鎖，而Cgyl與另外兩個(gè)獨(dú)立分離。Cgyl 與 α，-亞基相關(guān)(Doyle 等人，J Biol Chem :261 :9225-9238 (1986))，且 Cgy3 與 α -亞基相關(guān)(Yoshino 等人，Genes Genet. Syst. 76 :99-105 (2001))。另外，下調(diào) Cgy3導(dǎo)致Cgyl的上調(diào)。因此，導(dǎo)致減少α-亞基積累的Cgy3突變可能導(dǎo)致提高的α’_亞基的積累。伴大豆球蛋白基因家族包含分為兩個(gè)主要組的至少15個(gè)成員，其分別編碼 2. 5kb 和 1. 7kb 的胚mRNA(Harada 等人，Japan J. Breed.，33 :23-30 (1983))。三聚體中 α，、 α和β鏈的相對百分比分別占總0_伴大豆球蛋白的約35%、45%和20% (Maruyama等人，J. Agric. Food Chem. 47 :5278-528 (1999))。大豆蛋白的功能部分取決于β-伴大豆球蛋白與大豆球蛋白的比例和亞基組成的變化，其可在不同基因型之間不同。伴大豆球蛋白和大豆球蛋白在組成和結(jié)構(gòu)中的差異表現(xiàn)在營養(yǎng)和功能性質(zhì)兩方面。大豆球蛋白每單位比伴大豆球蛋白含有較多的蛋氨酸和半胱氨酸，但是，缺乏大豆球蛋白但富含β -伴大豆球蛋白的大豆可以具有與含有大豆球蛋白的大豆相似的總含硫氨基酸水平。大豆球蛋白對于形成構(gòu)成堅(jiān)固的豆腐凝膠的蛋白質(zhì)微粒是重要的(Tezuka 等人，J. Agric. Food Chem.，48 1111-1117 Q000))，但是在缺乏β-伴大豆球蛋白的情況下比在缺乏大豆球蛋白的情況下形成更弱的凝膠(Tezuka 等人，J. Agric. Food Chem. ,52 =1693-1699 (2004)) 0 β -伴大豆球蛋白的膠凝性質(zhì)和由富含伴大豆球蛋白的大豆制成的大豆蛋白分離物的膠凝性質(zhì)在某些可能適用于食物應(yīng)用的情況下為有利的(Nagano，等人，J. Agric. Food Chem. 44 :3484-3488(1996) ；Rickert, 等人J.Fd Sci. 69 :303(2004)). β -伴大豆球蛋白的膠凝特性可以通過變化顯示優(yōu)勢的 α-亞基的亞基組成來改變(Salleh，2004)。β -伴大豆球蛋白的溶解度和乳化性能良好，部分原因是由于α和α，-亞基的親水延伸區(qū)域(Yamauchi等人，F(xiàn)ood Rev. Int. 7 283-322(1991)，Maruyama等人，JA0CS. 79 =139(2002)) 有可能產(chǎn)生用于食品應(yīng)用的有價(jià)值的具有提高的β-伴大豆球蛋白水平和降低的大豆球蛋白水平的大豆和原料。β -伴大豆球蛋白有明顯的正面影響人類健康的潛力(Baba等人，J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo), 50 (1) :26-31(2004)).尤其是β -伴大豆球蛋白已被發(fā)現(xiàn)可降低膽固醇、甘油三酯和內(nèi)臟脂肪。Kohno等人證明，每天服用5克伴大豆球蛋白的人類受試者中的甘油三酸脂水平和內(nèi)臟脂肪明顯降低(Kohno等人，J Atheroscler Thromb, 13 Μ7-255(2006))。同樣，Nakamura等人發(fā)現(xiàn)，β -伴大豆球蛋白在靈長類動(dòng)物模型中上調(diào)與脂代謝相關(guān)的基因(Nakamura 等人，Soy Protein Res 8:1-7(2005))。此外，Nakamura 等人證明β-伴大豆球蛋白具有顯著的防止骨礦物密度流失的效果(Nakamura等人，Soy Protein Res 7 13-19 (2004)) 0此外，β -伴大豆球蛋白被證明具有降低血清胰島素和血糖的效應(yīng)(Moriyama 等人，Biosci. Biotechnol. Biochem. ,68(2) :352-359 (2004)) 由于 β-伴大豆球蛋白對甘油三酸脂、膽固醇、脂肪、胰島素和糖水平的影響，它可以在健康程序中發(fā)揮重要作用。此外，伴大豆球蛋白抑制小鼠動(dòng)脈斑塊形成，并可能在人類受試者中也具有類似的效應(yīng)(Adams等人，J. Nutr. ,134(3) :511-516 (2004))。另外，β -伴大豆球蛋白可能對于人類腸道菌群具有明顯的效應(yīng)。β-伴大豆球蛋白在許多動(dòng)物模型中抑制有害細(xì)菌諸如大腸桿菌的生長，同時(shí)刺激有益細(xì)菌諸如雙歧桿菌(bifidobacteria)的生長 (Nakamura等人，Soy Protein Res 7 :13-19 (2004) · Zuo 等人，World J Gastroenterol 11 5801-5806(2005))。β -伴大豆球蛋白可以用于減少感染后大腸桿菌的生長和維持健康的腸道微生物群落。β-伴大豆球蛋白α ’ -亞基可能在許多與β-伴大豆球蛋白相關(guān)的健康益處中發(fā)揮主導(dǎo)作用。許多利用動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，大豆伴大豆球蛋白α’_亞基可以降低血漿甘油三酸酯，而且提高從血液去除LDL( “壞”膽固醇)(Duranti等人，J. Nutr.， 134(6) :1334-1339(2004), Moriyama 等人，Biosci. Biotechnol, Biochem. ,68(2) 352-359(2004)，Adams 等人，J. Nutr. , 134(3) :511-516(2004), Nishi 等人，J. Nutr.， 133(2) :352-357(2003)).因此，具有提高的β _伴大豆球蛋白含量的大豆品種比傳統(tǒng)品種具有更高的價(jià)值，并將適用于營養(yǎng)飲料和其他食品。在識(shí)別生物活性多肽的嘗試中， Manzoni等人試圖表征β _伴大豆球蛋白中的生物活性多肽，并間接表明α’-亞基具有降低膽固醇的假定作用(Manzoni 等人，J. Agric. Food Chem. 46 :2481-2484 (1998))。此外， Manzoni等人還證明了 α ’-亞基在提高LDL的攝取和降解及LDL受體mRNA水平方面的作用(Manzoni 等人，J. Nutr. 133 :2149-2155(2003))。Duranti 等人證明 α，-亞基可以在體內(nèi)降低甘油三酸酯和血漿膽固醇(Duranti等人，J. Nutr.，134(6) =1334-1339 (2004)) 0β-伴大豆球蛋白β-亞基也具有許多健康益處。例如，β-亞基通過引起膽囊收縮素(cholecystokinin)分泌增加飽足感(satiety) (Nishi 等人，J. Nutr. 133 :352-357 2003，Hara等人Plant Phys Biochem 42 :657-662 Q004))。膽囊收縮素激素是腸胃系統(tǒng)中負(fù)責(zé)刺激脂肪和蛋白質(zhì)消化的肽激素。膽囊收縮素，以前稱為腸促胰酶素(pancreozymin)， 由I-細(xì)胞合成和在十二指腸(小腸的第一部分)分泌，并導(dǎo)致消化酶和膽汁分別從胰腺和膽囊釋放。它還作為饑餓抑制劑發(fā)揮作用。因此，亞基可以抑制食欲，并可以在總體重控制計(jì)劃中發(fā)揮作用。β -亞基可能也在心理健康方面具有作用。通過用胰彈性蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶消化β -亞基釋放大豆嗎啡-5 (soymorphin-5)。大豆嗎啡_5是一種阿片肽。阿片類藥物是在體內(nèi)具有嗎啡樣作用的化學(xué)物質(zhì)。阿片類藥物主要用于緩解疼痛。這些藥物通過結(jié)合主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道被發(fā)現(xiàn)的阿片受體發(fā)揮作用。大豆嗎啡-5在小鼠口服后顯示出抗焦慮效應(yīng)，這表明β-亞單位的攝入可能會(huì)減少精神壓力(Agui等人P印tide Science 2005 195-198(2005)) 因此，本發(fā)明的目標(biāo)是產(chǎn)生具有提高的伴大豆球蛋白α ’ -亞基水平的大豆。 本發(fā)明提供和包括一種用于篩選和選擇包含針對改變的α ’ -亞基水平的QTL的大豆植物的方法，和單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及大豆種子的增高的α ’-亞基和保持的β亞基的組成，與商業(yè)大豆蛋白質(zhì)成分相比，該種子具有改善的物理和人類健康性質(zhì)。本發(fā)明提供了具有賦予增高的 α ’_亞基表型和降低的種子α-亞基含量的非轉(zhuǎn)基因性狀的大豆植物的選擇方法。因此， 在一方面，本發(fā)明的方法包括選擇具有提高的α’-亞基含量和降低的α-亞基含量的種子。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物的種子α ’-亞基含量為總蛋白含量的大約或者至少大約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20%或更多。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物中α -亞基含量與α，-亞基含量的比值為大約1. 0,0. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2、
0.1或甚至0，在其中可推出。本發(fā)明包括將等位基因基因滲入大豆植物的方法，包括(a)雜交包含選自表3 列出的那些核酸序列的核酸序列的至少第一大豆植物與至少第二大豆植物，以形成分離群體；(b)用一種或多種核酸標(biāo)記篩選該分離群體，以確定來自分離群體的一種或多種大豆植物是否含有列出的核酸序列；和(c)從該分離群體選擇一種或多種包含選自表3列出的那些核酸序列的核酸序列的大豆植物。本發(fā)明包括基因滲入等位基因和選擇賦予大豆植物種子提高的α，-亞基表型的非轉(zhuǎn)基因性狀的方法，包括(a)雜交至少一種在種子中具有提高的種子α ’ -亞基含量的大豆植物與第二大豆植物，以形成分離群體；和(b)用一種或多種核酸標(biāo)記篩選該分離群體，以確定來自該分離群體的一種或多種大豆植物在種子中是否含有與提高的α ’ -亞基表型和提高的種子α ’-亞基含量相關(guān)的基因組區(qū)域的等位基因。本發(fā)明還提供了選擇和基因滲入與賦予種子降低的α -亞基含量所導(dǎo)致的提高的α ’-亞基表型的非轉(zhuǎn)基因性狀相關(guān)的基因組區(qū)域的方法，包括(a)從多種大豆植物分離核酸；(b)在分離的核酸中檢測一種或多種標(biāo)記分子的存在，其中該標(biāo)記分子選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 18，且任何一個(gè)標(biāo)記分子定位在距離標(biāo)記分子30cM或更少以內(nèi)；和(c) 選擇包含一種或多種標(biāo)記分子的大豆植物，從而選擇在種子中具有提高的種子α ’ -亞基含量的大豆植物。作為另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供用于選擇能夠產(chǎn)生具有降低的大豆球蛋白含量、 提高的種子伴大豆球蛋白含量和后來提高的伴大豆球蛋白α’-亞基的種子的大豆植物的方法。因此，在一方面，本發(fā)明的植物包含具有降低的大豆球蛋白含量、提高的 β-伴大豆球蛋白含量和伴大豆球蛋白α’-亞基的種子。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物產(chǎn)生的種子具有占種子總蛋白質(zhì)的大約或低于大約18、17、16、15、14、13、12、11、10、 9、8、7、6、5、4、3、2、1或0%的種子大豆球蛋白含量。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物產(chǎn)生的種子具有占種子總蛋白質(zhì)的大約或至少大約37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60%或更高的種子β-伴大豆球蛋白含量。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物的種子α ’ -亞基含量占種子總蛋白質(zhì)含量的大約或至少大約 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39或40 %或更高。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物能夠產(chǎn)生具有 α -亞基與 α，-亞基比值為大約 1. 0,0. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2,0. 1 或甚至 0 的伴大豆球蛋白組成的種子。本發(fā)明包括用于基因滲入等位基因和選擇在大豆植物種子中具有降低的大豆球蛋白含量、提高的種子伴大豆球蛋白含量和繼而提高的伴大豆球蛋白α ’-亞基含量的等位基因的方法，包括(a)雜交至少一種在種子中具有降低的大豆球蛋白含量、提高的種子伴大豆球白質(zhì)含量和后來提高的伴大豆球蛋白α ’-亞基含量的大豆植物與第二大豆植物，以形成分離群體；和(b)用一種或多種核酸標(biāo)記篩選該分離群體，以確定來自該分離群體的一種或多種大豆植物在種子中是否含有與降低的大豆球蛋白含量、提高的種子伴大豆球蛋白含量和后來降低的α-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的伴大豆球蛋白α ’-亞基含量相關(guān)的基因組區(qū)域的等位基因。本發(fā)明還提供了選擇和基因滲入與種子中降低的大豆球蛋白含量、提高的種子 β-伴大豆球蛋白含量和后來提高的伴大豆球蛋白α ’ -亞基含量相關(guān)的基因組區(qū)域的方法，包括(a)從多種大豆植物分離核酸；(b)在分離的核酸中檢測一種或多種標(biāo)記分子的存在，其中該標(biāo)記分子選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 18，且任何一個(gè)標(biāo)記分子定位在距離標(biāo)記分子30cM或更少以內(nèi)；和(c)選擇包含一種或多種標(biāo)記分子的大豆植物，從而選擇在種子中具有降低的大豆球蛋白含量、提高的種子伴大豆球蛋白含量和繼而降低的α-亞基含量所導(dǎo)致的提高的伴大豆球蛋白α ’-亞基含量的大豆植物。本發(fā)明也提供植物部分。本發(fā)明的植物部分包括但不限于花粉、胚珠、分生組織、 細(xì)胞和種子。本發(fā)明的細(xì)胞可以進(jìn)一步包括可再生細(xì)胞，諸如胚分生組織細(xì)胞、花粉、葉、 根、根尖和花。因此，這些細(xì)胞可以用來再生本發(fā)明的植物。本文也提供了本發(fā)明的植物的種子的部分。因此，也提供了由本發(fā)明的種子制成的碾碎的種子和粗粉或豆粉作為本發(fā)明的部分。本發(fā)明進(jìn)一步包括制造大豆粗粉或豆粉的方法，包括碾碎或研磨本發(fā)明的種子。本發(fā)明的這些大豆粉或粗粉可以包含本發(fā)明的植物的基因組材料。在一個(gè)實(shí)施方式中，食物可以被定義為包含這種植物的基因組。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的大豆粗粉或豆粉可以被定義為，與由具有相同遺傳背景但不含非轉(zhuǎn)基因突變Gy3和Gy4無效等位基因的植物種子制成的粗粉或豆粉相比，具有提高的β _伴大豆球蛋白含量和降低的大豆球蛋白含量。在本發(fā)明的再進(jìn)一步的方面，提供了一種產(chǎn)生大豆種子的方法，包括使本發(fā)明的植物與其自身雜交或與第二大豆植物雜交。因此，該方法可以包括通過使本發(fā)明的植物與不同的第二大豆植物雜交產(chǎn)生雜種大豆種子。本發(fā)明的再另一方面是一種生產(chǎn)用于人類或動(dòng)物食用的食品的方法，包括(a) 獲得本發(fā)明的植物；(b)栽培該植物至成熟；和(c)由該植物制備食品。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，食品可以是蛋白濃縮物、蛋白質(zhì)分離物、粗粉、面粉或大豆殼。在某些實(shí)施方式中，食品可以包括飲料、灌注食物、沙司、咖啡奶油、餅干、乳化劑、面包、糖果速溶奶制飲料、肉湯、面條、黃豆仁醬(soynut butter)、豆奶咖啡、烤大豆、薄餅干、糖果、豆奶、豆腐、 印尼豆豉(tempeh)、烘培大豆、焙烤食品成分、飲料粉、早餐谷類食品、營養(yǎng)棒、肉或肉類似物、果汁、甜點(diǎn)、軟冷凍產(chǎn)品、蜜餞或中間食物。由本發(fā)明的植物生產(chǎn)的食品可以包含提高的 α ’-亞基含量，因此比用典型大豆品種制成的食品具有更高的營養(yǎng)價(jià)值。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面是一種生產(chǎn)營養(yǎng)品的方法，包括(a)獲得本發(fā)明的植物； (b)栽培該植物至成熟；和(c)由該植物制備營養(yǎng)品。由本發(fā)明的植物生產(chǎn)的產(chǎn)品可以包含提高的α ’ -亞基含量，因此比用典型大豆品種制成的食品具有更高的營養(yǎng)價(jià)值。例如， 用具有增高的α ’-亞基的大豆種子制成的產(chǎn)品可以在降脂治療中單獨(dú)使用或者與其他機(jī)制聯(lián)合使用。 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物可以進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因可以被定義為賦予大豆植物優(yōu)選的性質(zhì)，該性質(zhì)選自除草劑耐受性、提高的產(chǎn)量、昆蟲控制、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細(xì)菌病抗性、支原體病抗性、改變的脂肪酸組成、改變的油產(chǎn)量、改變的氨基酸組成、改變的蛋白質(zhì)產(chǎn)量、提高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量、改變的碳水化合物產(chǎn)量、發(fā)芽和幼苗生長的控制、增強(qiáng)的動(dòng)物和人類營養(yǎng)、低棉子糖、干旱和/或環(huán)境應(yīng)激抗性、改變的形態(tài)特征、提高的可消化性、工業(yè)酶、藥用蛋白質(zhì)、肽和小分子、改善的加工性狀、改善的風(fēng)味、固氮、雜種種子的產(chǎn)生、降低的變應(yīng)原性、生物聚合物、生物燃料，或者這些的任何組合。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物可以被定義為是通過一種方法產(chǎn)生的，在該方法中，包含賦予提高的α’-亞基表型和降低的α-亞基含量的非轉(zhuǎn)基因突變的植物與包含農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特征的植物雜交。可以分析該雜交的后代的農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特征和α’_亞基蛋白質(zhì)含量，并且根據(jù)這些特征選擇后代植物，從而產(chǎn)生本發(fā)明的植物。因此在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物可以通過使選擇的起始品種與包含農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特征的第二大豆植物雜交而產(chǎn)生。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物可以被定義為是通過一種方法產(chǎn)生的，在該方法中，包含賦予降低的大豆球蛋白含量和提高的種子伴大豆球蛋白含量的非轉(zhuǎn)基因突變的植物與包含提高的α ’-亞基含量的植物雜交。在本發(fā)明的方法和/或組合物范圍內(nèi)討論的實(shí)施方式可以相對于本文描述的任何其他方法或組合物使用。因此，涉及一種方法或組合物的實(shí)施方式也可以應(yīng)用于本發(fā)明的其他方法和組合物。如在說明書或權(quán)利要求書中使用的，“一個(gè)”或“一種”可指一種或多種。如在權(quán)利要求書中使用的，當(dāng)與“包含”一起使用時(shí)，“一個(gè)”或“一種”可指一種或一種以上。本文使用的“另一”可以指至少一個(gè)第二種或更多種。通過以下詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)將是清楚的。但是應(yīng)當(dāng)理解， 詳細(xì)描述和特定實(shí)施例盡管說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是只是以舉例說明的方式提供的，因?yàn)榛谠撛敿?xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明白本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改。附圖簡述

圖1 如SDS-PAGE測量的，與提高的α ’-亞基含量相關(guān)的標(biāo)記對于α -亞基含量的影響。圖2 如SDS-PAGE測量的，與提高的α，-亞基含量相關(guān)的標(biāo)記對于α / α，-亞基的比例的影響。核酸序列的簡要說明SEQ ID Ν0:1是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆 (Glycine max(L.)Merri 11)的基因組序列。SEQ ID N0:2是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。SEQ ID Ν0:3是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。SEQ ID NO :4是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。SEQ ID Ν0:5是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。SEQ ID Ν0:6是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。
SEQIDNO :7是對應(yīng)于與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序歹[J0
SEQIDNO :8是對應(yīng)于與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序歹[J0
SEQIDNO :9是對應(yīng)于與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序歹[J0
SEQIDNO:10是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。
SEQIDNO11是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。
SEQIDNO:12是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。
SEQIDNO:13是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。
SEQIDNO14是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。
SEQIDNO:15是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。
SEQIDNO16是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。
SEQIDNO:17是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。
SEQIDNO18是對應(yīng)于與降低的α -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域的源自大豆的基因組序列。
SEQIDNO 19是用于擴(kuò)增SEQIDNO1的PCR引物。
SEQIDNO 20是用于擴(kuò)增SEQIDNO1的PCR引物。
SEQIDNO 21是用于擴(kuò)增SEQIDNO2的PCR引物。
SEQIDNO 22是用于擴(kuò)增SEQIDNO2的PCR引物。
SEQIDNO 23是用于擴(kuò)增SEQIDNO3的PCR引物。
SEQIDNO 24是用于擴(kuò)增SEQIDNO3的PCR引物。
SEQIDNO 25是用于擴(kuò)增SEQIDNO4的PCR引物。
SEQIDNO 26是用于擴(kuò)增SEQIDNO4的PCR引物。
SEQIDNO 27是用于擴(kuò)增SEQIDNO5的PCR引物。
SEQIDNO 28是用于擴(kuò)增SEQIDNO5的PCR引物。
SEQIDNO 29是用于擴(kuò)增SEQIDNO6的PCR引物。
SEQIDNO 30是用于擴(kuò)增SEQIDNO6的PCR引物。
SEQIDNO 31是用于擴(kuò)增SEQIDNO7的PCR引物。
SEQIDNO 32是用于擴(kuò)增SEQIDNO7的PCR引物。
SEQIDNO 33是用于擴(kuò)增SEQIDNO8的PCR引物。
SEQIDNO34是用于擴(kuò)增SEQ ID NO8的PCR引物。
SEQIDNO35是用于擴(kuò)增SEQ ID NO9的PCR引物。
SEQIDNO36是用于擴(kuò)增SEQ ID NO9的PCR引物。
SEQIDNO37是用于擴(kuò)增SEQ ID NO10的PCR引物。
SEQIDNO38是用于擴(kuò)增SEQ ID NO10的PCR引物。
SEQIDNO39是用于擴(kuò)增SEQ ID NO11的PCR引物。
SEQIDNO40是用于擴(kuò)增SEQ ID NO11的PCR引物。
SEQIDNO41是用于擴(kuò)增SEQ ID NO12的PCR引物。
SEQIDNO42是用于擴(kuò)增SEQ ID NO12的PCR引物。
SEQIDNO43是用于擴(kuò)增SEQ ID NO13的PCR引物。
SEQIDNO44是用于擴(kuò)增SEQ ID NO13的PCR引物。
SEQIDNO45是用于擴(kuò)增SEQ ID NO14的PCR引物。
SEQIDNO46是用于擴(kuò)增SEQ ID NO14的PCR引物。
SEQIDNO47是用于擴(kuò)增SEQ ID NO15的PCR引物。
SEQIDNO48是用于擴(kuò)增SEQ ID NO15的PCR引物。
SEQIDNO49是用于擴(kuò)增SEQ ID NO16的PCR引物。
SEQIDNO50是用于擴(kuò)增SEQ ID NO16的PCR引物。
SEQIDNO51是用于擴(kuò)增SEQ ID NO17的PCR引物。
SEQIDNO52是用于擴(kuò)增SEQ ID NO17的PCR引物。
SEQIDNO53是用于擴(kuò)增SEQ ID NO18的PCR引物。
SEQIDNO54是用于擴(kuò)增SEQ ID NO18的PCR引物。
SEQIDNO55是用于檢測與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 1的第--探針O
SEQIDNO56是用于檢測與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 1的第二二探針O
SEQIDNO57是用于檢測與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 2的第--探針O
SEQIDNO58是用于檢測與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 2的第二二探針O
SEQIDNO59是用于檢測與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 3的第--探針O
SEQIDNO60是用于檢測與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 3的第二二探針O
SEQIDNO61是用于檢測與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 4的第--探針O
SEQIDNO62是用于檢測與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 4的第二二探針O
SEQIDNO63是用于檢測與降低的α-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 5的第--探針O
SEQ IDNO:64是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 5的第二探針。
SEQ IDNO:65是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 6的第一-探針。
SEQ IDNO:66是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 6的第二探針。
SEQ IDNO:67是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 7的第一-探針。
SEQ IDNO:68是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 7的第二探針。
SEQ IDNO:69是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 8的第一-探針。
SEQ IDNO:70是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 8的第二探針。
SEQ IDNO71是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 9的第一-探針。
SEQ IDNO:72是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 9的第二探針。
SEQ IDNO:73是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 10的第-一探針。
SEQ IDNO:74是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 10的第:二探針。
SEQ IDNO:75是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 11的第-一探針。
SEQ IDNO:76是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 11的第:二探針。
SEQ IDNO:77是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 12的第-一探針。
SEQ IDNO:78是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 12的第:二探針。
SEQ IDNO:79是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 13的第-一探針。
SEQ IDNO:80是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 13的第:二探針。
SEQ IDNO81是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 14的第-一探針。
SEQ IDNO:82是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 14的第:二探針。
SEQ IDNO:83是用于檢測與降低的c[-亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQIDNO 15的第--探針。
SEQ IDNO:84是用于檢測與降低的(ι -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQID15的第二二探針。
SEQ IDNO:85是用于檢測與降低的(ι -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQID16的第--探針。
SEQ IDNO:86是用于檢測與降低的(ι -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQID16的第二二探針。
SEQ IDNO:87是用于檢測與降低的(ι -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQID17的第--探針。
SEQ IDNO:88是用于檢測與降低的(ι -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQID17的第二二探針。
SEQ IDNO:89是用于檢測與降低的(ι -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQID18的第--探針。
SEQ IDNO:90是用于檢測與降低的(ι -亞基水平相關(guān)的基因組區(qū)域SEQID18的第二二探針。
發(fā)明詳述
本文提供的定義和方法限定本發(fā)明，并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明
非另有說明，應(yīng)當(dāng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解術(shù)語。分子生物學(xué)常用術(shù)語的定義也可以在以下文獻(xiàn)中找到Alberts等人，Molecular Biology of The Cell，第 3 版，Garland Publishing, Inc. :New York, 1994 ;Rieger 等人，Glossary of Genetics Classical and Molecular,第 5 版，Springer-Verlag :New York, 1991 ；禾口 Lewin, Genes IX，Oxford University Press :New York, 1994。使用如 37CFR § 1. 822 所述的 DNA 堿基命名法。本發(fā)明提供了包含賦予具有α -亞基水平降低所導(dǎo)致的提高的α，-亞基水平的種子伴大豆球蛋白組成的非轉(zhuǎn)基因突變的植物以及用于生產(chǎn)該植物的方法。因此，本發(fā)明的植物具有極大的價(jià)值，因?yàn)樘岣叩摩?伴大豆球蛋白α ’-亞基水平提供改善的大豆粉和蛋白分離物的營養(yǎng)特征和溶解性。此外，本文提供的植物包括農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特征，從而實(shí)現(xiàn)商業(yè)意義的產(chǎn)量。本發(fā)明還提供了包含賦予提高的伴大豆球蛋白和降低的大豆球蛋白的非轉(zhuǎn)基因突變的植物以及用于生產(chǎn)該植物的方法。提高的伴大豆球蛋白和提高的α ’ -亞基的表型的組合提高了高度功能性的和健康的伴大豆球蛋白α ’-亞基的含量。I.本發(fā)明的植物本發(fā)明第一次提供了組合有賦予降低的α-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的 α ’-亞基含量的非轉(zhuǎn)基因突變的大豆植物及其衍生物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明植物的種子的α，-亞基含量可以大于種子總蛋白質(zhì)的大約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或甚至20%。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明植物的種子的大豆球蛋白含量可以為種子總蛋白質(zhì)的大約或低于大約15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0%，本發(fā)明植物的種子的β-伴大豆球蛋白含量可以為總蛋白質(zhì)含量的大約或至少大約34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50%或更高，本發(fā)明植物的種子的α，-亞基含量可以為總蛋白質(zhì)的大約或至少大約 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、四、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40%。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物的種子具有包含的α -亞基與α，-亞基的比例為大約1. 0,0. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4、 0. 3,0. 2,0. 1或甚至0的β -伴大豆球蛋白組成。因此，本發(fā)明的一方面涉及上述植物及其部分和使用這些植物和植物部分的方法。植物部分包括但不限于花粉、胚珠和細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供這些植物的可再生細(xì)胞的組織培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物再生為能夠表達(dá)起始品種的所有生理和形態(tài)特征的大豆植物。這些可再生細(xì)胞可以包括胚、分生組織細(xì)胞、花粉、葉、根、根尖或花，或由其衍生的原生質(zhì)體或愈傷組織。本發(fā)明也提供由這種組織培養(yǎng)物再生的大豆植物，其中該植物能夠表達(dá)作為可再生細(xì)胞來源的起始植物品種的所有生理和形態(tài)特征。II.用于產(chǎn)生具有賦予提高的β-伴大豆球蛋白α ’-亞基和降低的β-伴大豆球蛋白α-亞基含量的非轉(zhuǎn)基因等位基因的大豆品種的標(biāo)記輔助選擇本發(fā)明描述了生產(chǎn)在種子中具有降低的α-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的 α ’_亞基蛋白質(zhì)含量的大豆植物的方法。此外，本發(fā)明提供了用于將賦予降低的α-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的伴大豆球蛋白α ’-亞基含量的非轉(zhuǎn)基因等位基因引入農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良的大豆植物的遺傳標(biāo)記和方法。本發(fā)明的某些方面也提供了選擇用于培育在種子中具有降低的α-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的α ’-亞基蛋白質(zhì)含量的植物的親本的方法。一種方法包括針對大豆種子α ’ -亞基含量篩選種質(zhì)。另一種方法包括通過針對 ΡΙ88788的存在搜索那些品種的系譜，鑒定可能攜帶降低的α-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的α ’-亞基性狀的品種。因此，本發(fā)明第一次允許產(chǎn)生組合有這些賦予提高的α ’-亞基種子含量的等位基因與商業(yè)意義的產(chǎn)量和農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良遺傳背景的植物。使用本發(fā)明的方法，例如在具有商業(yè)意義的產(chǎn)量和高種子伴大豆球蛋白含量的新品種的生產(chǎn)中，賦予降低的α-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的α ’ -亞基的基因座可以被引入所需的大豆遺傳背景。術(shù)語數(shù)量性狀基因座或QTL用來描述顯示對于表型具有數(shù)量或加性效應(yīng)的基因組的區(qū)域。α ’-亞基基因座代表示例性的QTL，由于多個(gè)α ’-亞基等位基因?qū)е路N子的總 α-亞基含量降低和α ’_亞基含量重要的伴隨提高。本文鑒定出針對導(dǎo)致提高的α’_亞基含量的非轉(zhuǎn)基因、降低的α-亞基等位基因的遺傳標(biāo)記，所述遺傳標(biāo)記使得能夠用農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良植物培育包含非轉(zhuǎn)基因、降低的α-亞基等位基因的大豆植物，并選擇出遺傳了降低的α-亞基的等位基因的后代。因此，本發(fā)明允許使用分子工具以將這些QTL與需要的農(nóng)藝學(xué)性狀組合。在本發(fā)明中，具有降低的α-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的α ’-亞基蛋白質(zhì)含量的基因座位于染色體I上。用于監(jiān)測基因座滲入的SNP標(biāo)記包含那些選自SEQ ID NO 1 至SEQ ID Ν0:18的序列。使用如SEQ ID NO :55至90所示的探針和如SEQ ID Ν0:19至 54所示的引物，可以擴(kuò)增示例性的基因座SNP標(biāo)記DNA序列(SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 18)。本發(fā)明還提供了包含選自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 18及其互補(bǔ)序列的核酸分子的大豆植物。本發(fā)明還提供了包含選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :18、其片段和二者的互補(bǔ)序列的核酸分子的大豆植物。本發(fā)明還提供了包含選自SEQ ID Ν0:19至SEQ ID NO:90、其片段和二者的互補(bǔ)序列的核酸分子的大豆植物。一方面，大豆植物包含2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 或 18 個(gè)選自 SEQ ID N0:1 至 SEQ ID N0:18 及其互補(bǔ)序列的核酸分子。另一方面，大豆植物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18 個(gè)選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :18、其片段和二者的互補(bǔ)序列的核酸分子。進(jìn)一步的方面，大豆植物包含 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 或 18 個(gè)選自 SEQ ID NO 19至SEQ ID NO :90、其片段和二者的互補(bǔ)序列的核酸分子。本發(fā)明還提供了包含基因座的大豆植物，其中，在其一個(gè)或多個(gè)基因座的一個(gè)或多個(gè)等位基因選自等位基因1、等位基因2、等位基因3、等位基因4、等位基因5、等位基因 6、等位基因7、等位基因8、等位基因9、等位基因10、等位基因11、等位基因12、等位基因 13、等位基因14、等位基因15、等位基因16、等位基因17或等位基因18。這種等位基因可能是純合的或雜合的。可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)和再生本發(fā)明的植物或其部分。從各種組織類型再生大豆植物的方法和大豆的組織培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，Widholm等人，h Vitro Selection and Culture-induced Variation in Soybean, In Soybean :Genetics, Molecular Biology and Biotechnology, Verma 禾口 Shoemaker 編，CAB International, Wallingford, Oxon, England(1996))。如大豆的植物的再生技術(shù)可以使用多種組織或細(xì)胞類型作為起始原料。尤其是對于大豆，已經(jīng)開發(fā)了再生方法，其開始于某些分化的組織類型，諸如，分生組織(Cartha 等人，Can. J. Bot. 59 1671-1679 (1981))、下胚軸節(jié)(Cameya 等人，Plant Science Letters 21 :289-294(1981))和蓮節(jié)點(diǎn)段(Saka 等人，Plant Science Letters, 19 :193-201(1980) ；Cheng 等人，Plant Science Letters, 19 :91-99 (1980))。已報(bào)道了由未成熟大豆胚的外植體產(chǎn)生的體細(xì)胞胚再生完整的性成熟的大豆植物(Ranch 等人，In Vitro Cellular & Developmental Biology 21:653-658(1985))。也已報(bào)道了通過器官發(fā)生和胚發(fā)生從組織培養(yǎng)物再生成熟大豆植物(Barwale等人，Planta 167 473-481(1986) ；Wright 等人，Plant Cell Reports 5:150-154(1986))。本發(fā)明還通過篩選大豆植物的種子蛋白質(zhì)含量，提供了在所選種子中具有提高的 α ’-亞基蛋白質(zhì)含量的植物，所述選擇包括對基因組核酸探詢標(biāo)記分子的存在，該標(biāo)記分子遺傳連鎖到與大豆植物種子中提高的α ’-亞基蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL的等位基因，其中 QTL的等位基因也位于與種子中提高的α ’-亞基蛋白質(zhì)含量相關(guān)的連鎖群上。一種將等位基因滲入大豆植物的方法，包括(A)雜交包含選自SEQ ID NO :1至 SEQ ID NO :18的核酸分子的至少第一大豆植物與至少一種第二大豆植物，以形成分離群體；(B)用一種或多種核酸標(biāo)記篩選該分離群體，以確定來自該分離群體的一種或多種大豆植物是否含有該核酸分子；和(C)從該分離群體選擇一種或多種包含選自SEQ ID NO 1 至SEQ ID NO 18的核酸分子的大豆植物。本發(fā)明還包括將等位基因滲入大豆植物的方法，包括(A)雜交至少一種在種子中具有降低的α ’ -亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的α ’-亞基蛋白質(zhì)含量的大豆植物與至少第二大豆植物，以形成分離群體；(B)用一種或多種核酸標(biāo)記篩選該分離群體，以確定來自分離群體的一種或多種大豆植物是否含有與種子中降低的α ’-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的α ’-亞基蛋白質(zhì)含量相關(guān)的等位基因。本發(fā)明包括分離的核酸分子。這些分子包括那些能夠檢測與種子基因座中降低的α-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的α ’-亞基含量遺傳或物理連鎖的多態(tài)性的核酸分子。 這種分子可以被稱為標(biāo)記?？梢酝ㄟ^現(xiàn)有技術(shù)獲得與種子基因座中降低的α-亞基蛋白質(zhì)含量所導(dǎo)致的提高的α ’-亞基含量連鎖的另外的標(biāo)記。一方面，核酸分子能夠檢測是否存在位于距離基因座小于30、20、10、5、2或1厘摩(centimorgan)的標(biāo)記。另一方面，標(biāo)記顯示使用Qgene版本2. 23 (1996)和默認(rèn)參數(shù)測量的為2或更大、3或更大、或4或更大的LOD 得分。另一方面，核酸分子能夠檢測基因座中的標(biāo)記。進(jìn)一步的一方面，核酸分子選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :90、其片段、其互補(bǔ)序列及能夠特異性地與這些核酸分子中的一種或多種雜交的核酸分子。在優(yōu)選的一方面，本發(fā)明的核酸分子包括那些在中度嚴(yán)格條件(例如，大約2. Ox SSC和大約65°C )下特異性地與SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 90所示的一種或多種核酸分子或其互補(bǔ)序列或其中任一個(gè)的片段雜交的核酸分子。在特別優(yōu)選的一方面，本發(fā)明的核酸在高嚴(yán)格條件下特異性地與SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :90所示的一種或多種核酸分子或其互補(bǔ)序列或其中任一個(gè)的片段雜交。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記核酸分子具有SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :90所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列或其中任一個(gè)的片段。 在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記核酸分子與SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :90所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列或其中任一個(gè)的片段共有80%-100%或90%-100%的序列同一性。在本發(fā)明的進(jìn)一步的一方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記核酸分子與SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :90所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列或其中任一個(gè)的片段共有95% -100%的序列同一性。 在本發(fā)明的更優(yōu)選的一方面，本發(fā)明的優(yōu)選的標(biāo)記核酸分子與SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 90所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列或其中任一個(gè)的片段共有98% -100%的序列同一性。核酸分子或其片段在某些情況下能夠特異性地與其他核酸分子雜交。如本文所用，如果兩個(gè)核酸分子能夠形成反平行雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，那么這兩個(gè)分子能夠特異性地彼此雜交。如果一核酸分子與另一核酸分子表現(xiàn)出完全的互補(bǔ)性，那么它們“互補(bǔ)”。如本文所用，當(dāng)一個(gè)分子的每個(gè)核苷酸都與另一分子的核苷酸互補(bǔ)時(shí)，這兩個(gè)分子顯示“完全互補(bǔ)性”。如果兩個(gè)分子在至少常規(guī)的“低嚴(yán)格”的條件下能互相雜交，具有足夠的穩(wěn)定性，從而允許它們保持彼此退火，那么這兩個(gè)分子是“最低限度互補(bǔ)的”。類似地，如果兩個(gè)分子在常規(guī)的“高嚴(yán)格”的條件下能互相雜交，具有足夠的穩(wěn)定性，從而允許它們保持彼此退火，那么這兩個(gè)分子是“互補(bǔ)的，，。Sambrook 等人，In :Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)與Haymes 等人，In :Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC(1985)描述了常規(guī)的嚴(yán)格條件。因而偏離完全互補(bǔ)性是允許的，只要這種偏離沒有完全消除該分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了使核酸分子作為引物或探針，只需要在序列上充分互補(bǔ)，以在所采用的特定的溶劑和鹽濃度下能夠形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。如本文所用，基本上同源的序列是在高嚴(yán)格條件下與所比較的核酸序列的互補(bǔ)序列特異性雜交的核酸序列。本發(fā)明的核酸探針和引物可以在嚴(yán)格條件下與靶DNA序列雜交。術(shù)語“嚴(yán)格的雜交條件”是指在該條件下，探針或引物特異性地與靶序列雜交且不與非靶序列雜交，這可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。術(shù)語“嚴(yán)格的條件”是由如下內(nèi)容功能限定的通過Sambrook等人，1989的9. 52-9. 55所述的具體的雜交程序，核酸探針與靶核酸(即，與感興趣的特定核酸序列)的雜交。也參見Sambrook等人，1989的9. 47-9. 52，9.56-9. 58 ；Kanehisa 1984 Nucl. Acids Res. 12 :203-213 ；Wetmur 等人 1968 J.Mol. Biol. 31 :349-370。促進(jìn)DNA雜交的合適的嚴(yán)格條件是，例如，大約45°C、6. Ox氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，接著50°C、2.0x SSC洗滌，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，或可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，N. Y.，1989,6. 3. 1-6. 3. 6 中找到。 例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從大約2. Ox SSC、50°C的低嚴(yán)格條件到大約0. 2x SSC,50°C 的高嚴(yán)格條件中選擇。另外，洗滌步驟中的溫度可以從低嚴(yán)格條件的室溫大約22°C提高到高嚴(yán)格條件的大約65°C。溫度和鹽都可以變化，或者，溫度或鹽濃度可以保持不變，而另一個(gè)變量發(fā)生變化。例如，可以在高嚴(yán)格條件下，在65°C和6xSSC、0. 5%SDS、5x Denhardt'sUOO μ g/ mL非特異性DNA (例如，超聲處理的鮭精DNA)下利用DNA或RNA探針或引物進(jìn)行雜交，并用 0. 5x SSC,0. 5% SDS 在 65°C下洗滌。本發(fā)明考慮如果保持探針或引物與靶序列結(jié)合的特異性，可以使用如較低的雜交溫度和/或洗滌溫度的較低嚴(yán)格雜交條件，來確認(rèn)具有較低的序列相似性的相關(guān)的序列。因此，本發(fā)明的核苷酸序列可以用于選擇性地與DNA、RNA或cDNA片段的互補(bǔ)延伸形成雙鏈分子的能力。核酸分子片段可以是任何大小的片段，且示例性的片段包括SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :90所示的核酸序列及其互補(bǔ)序列的片段。一方面，片段可以是15-25、15-30、15-40、 15-50、15-100、20-25、20-30、20-40、20-50、20-100、25-30、25-40、25-50、25-100、30-40、 30-50 及 30-100。另一方面，片段可以是大于 10、15、20、25、30、35、40、50、100 或 250 個(gè)核苷酸。另外的遺傳標(biāo)記可以用來選擇具有與本發(fā)明大豆植物種子中的降低的α-亞基含量所導(dǎo)致的提高的α ’-亞基含量相關(guān)的QTL的等位基因的植物。公共標(biāo)記數(shù)據(jù)庫的例子包括，例如，Soybase，美國農(nóng)業(yè)部的農(nóng)業(yè)研究局(Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture)。本發(fā)明的遺傳標(biāo)記包括“顯性”或“共顯性”標(biāo)記?！肮诧@性標(biāo)記”揭示兩個(gè)或多個(gè)等位基因的存在(每個(gè)二倍體個(gè)體中有兩個(gè))?！帮@性標(biāo)記”揭示只存在一個(gè)等位基因。顯性標(biāo)記表型(例如，DNA帶)的存在表明在純合或雜合條件下存在一個(gè)等位基因。不存在顯性標(biāo)記表型(例如，不存在DNA帶)僅能證明存在“某些其他”不明確的等位基因。在群體中的個(gè)體主要是純合的且基因座主要是二態(tài)性(dimorphic)的情況下，顯性和共顯性標(biāo)記可能具有同樣的價(jià)值。隨著群體變得越來越雜合和多等位基因化的(multiallelic)，共顯性標(biāo)記往往比顯性標(biāo)記提供更多的基因型信息。在另一種實(shí)施方式中，可以利用以下各種標(biāo)記，諸如單序列重復(fù)標(biāo)記(SSR)、AFLP 標(biāo)記、RFLP標(biāo)記、RAPD標(biāo)記、表型標(biāo)記、同工酶標(biāo)記、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、插入或缺失 (Indel)、單特征多態(tài)性(SFP，例如，如 Borevitz 等人 2003 Gen. Res. 13 :513-523 所述)、微陣列轉(zhuǎn)錄分布(microarray transcription profile)、DNA衍生的序列和RNA衍生的序列， 它們與本發(fā)明的QTL的等位基因遺傳連鎖或相關(guān)。在一種實(shí)施方式中，對于遺傳多態(tài)性存在與否的基于核酸的分析可以用于在培育群體中選擇種子。用于遺傳多態(tài)性分析的各種遺傳標(biāo)記對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是可用且已知的。該分析可以用于選擇包含遺傳標(biāo)記或與之連接的基因、QTL、等位基因或基因組區(qū)域(單倍型)。在本文中，核酸分析方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于基于PCR的檢測方法 (例如，TaqMan分析)、微陣列方法和核酸測序方法。在一種實(shí)施方式中，可以通過使用核酸擴(kuò)增方法促進(jìn)DNA、RNA或cDNA樣品中的多態(tài)性位點(diǎn)的檢測。這些方法特異性地提高跨越多態(tài)性位點(diǎn)或包含位于其遠(yuǎn)端或近端的位點(diǎn)和序列的多核苷酸的濃度。這些擴(kuò)增的分子可以通過凝膠電泳、熒光檢測方法或其他方法很容易地檢測。實(shí)現(xiàn)這種擴(kuò)增的方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) (Mullis等人1986 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 :263-273 ；歐洲專利 50，424 ；歐洲專利 84，796 ；歐洲專利258，017 ；歐洲專利237，362 ；歐洲專利201，184 ；美國專利4，683，202 ；美國專利 4，582，788 ；和美國專利4，683，194)，該方法使用能夠與以其雙鏈形式限定多態(tài)性的近端序列雜交的引物對。通過本領(lǐng)域熟知的各種有效方法可以檢測DNA序列多態(tài)性或?qū)ζ溥M(jìn)行分型，包括但不限于那些在美國專利 5，468，613 和 5，217，863,5, 210，015,5, 876，930,6, 030，787、 6，004，744,6，013，431,5，595，890,5，762，876,5，945，283,5，468，613,6，090，558, 5，800, 944和5，616，464中公開的方法，本文完整引入這些專利作為參考。然而，本發(fā)明的組合物和方法可以與任何多態(tài)性分型方法結(jié)合使用，以對大豆基因組DNA樣品中的多態(tài)性進(jìn)行分型。所用的這些大豆基因組DNA樣品包括但不限于直接從大豆植物分離出的大豆基因組DNA、克隆的大豆基因組DNA或擴(kuò)增的大豆基因組DNA。例如，如美國專利5，468，613和5，217，863所公開的，通過與等位基因特異性的寡核苷酸(ASO)探針雜交可以檢測DNA序列的多態(tài)性。美國專利5，468，613公開了等位基因特異性的寡核苷酸的雜交，其中，在核酸中通過以下程序可以檢測核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的變異，其中，擴(kuò)增含有核苷酸變異的序列，點(diǎn)樣到膜上，并用標(biāo)記的序列特異性寡核苷酸探針進(jìn)行處理。也可以通過美國專利5，800，944公開的探針連接方法檢測靶核酸序列，其中，擴(kuò)增感興趣的序列，并將其與探針雜交，接著通過連接以檢測探針的標(biāo)記的部分。微陣列也可用于多態(tài)性檢測，其中，以重疊的方式組裝寡核苷酸探針組以代表單一序列，這樣，在靶序列一個(gè)點(diǎn)上的差異會(huì)導(dǎo)致部分探針雜交(Borevitz等人，Genome Res. 13 :513-523(2003) ；Cui 等人，Bioinformatics 21 :3852-3858 Q005))。在任何一個(gè)微陣列上，預(yù)計(jì)會(huì)有多個(gè)靶序列，其可以代表基因和/或非編碼區(qū)，其中每個(gè)靶序列由一系列重疊的寡核苷酸，而不是由單個(gè)探針?biāo)怼Ｔ撈脚_(tái)提供高通量篩選多種多態(tài)性。單特征多態(tài)性(SFP)是通過寡核苷酸陣列中的單個(gè)探針檢測的多態(tài)性，其中，特征是陣列中的探針。美國專利6，799，122,6, 913，879和6，996，476公開了通過基于微陣列的方法對靶序列分型。也可以通過美國專利5，616，464公開的探針連接方法檢測靶核酸序列，該方法采用至少一對探針，該探針具有與靶核酸序列的相鄰部分同源的序列且具有側(cè)鏈，所述側(cè)鏈在所述探針與所述靶核酸序列堿基配對時(shí)非共價(jià)結(jié)合以形成莖。至少一個(gè)側(cè)鏈具有光可活化的基團(tuán)，該基團(tuán)可以與莖的其他側(cè)鏈元件形成共價(jià)交聯(lián)。檢測SNP和hdel的其他方法包括單堿基延伸(SBE)方法。SBE方法的例子包括但不僅限于那些在美國專利 6，004，744,6, 013，431,5, 595，890,5, 762，876 和 5，945，283中公開的方法。SBE方法基于核苷酸引物的延伸，該引物鄰近多態(tài)性以在引物延伸后摻入可檢測的核苷酸殘基。在某些實(shí)施方式中，SBE合成方法使用三種合成的寡核苷酸。其中兩種寡核苷酸作為PCR引物，且與位于含有待測多態(tài)性的區(qū)域兩側(cè)的大豆基因組DNA的基因座序列互補(bǔ)。在對含有多態(tài)性的大豆基因組區(qū)域擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物與第三寡核苷酸(稱為延伸引物)混合，所述第三寡核苷酸設(shè)計(jì)用來在DNA聚合酶和兩種差異標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸的存在下，與鄰近多態(tài)性的擴(kuò)增的DNA雜交。如果模板上存在多態(tài)性，可以在單堿基鏈延伸中將標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸中的一個(gè)添加到引物中。然后通過確定兩個(gè)差異標(biāo)記中的哪一個(gè)添加到延伸引物中推斷存在的等位基因。純合的樣品將導(dǎo)致兩個(gè)標(biāo)記的堿基中只有一個(gè)被摻入，因此兩個(gè)標(biāo)記中只有一個(gè)被檢測到。雜合的樣品存在兩個(gè)等位基因，因此直接摻入兩個(gè)標(biāo)記(進(jìn)入延伸引物中的不同的分子)，因此這兩個(gè)標(biāo)記都被檢測到。在一種優(yōu)選的檢測多態(tài)性的方法中，可以通過美國專利5，210，015,5, 876，930和 6，030，787中公開的方法檢測SNP和hdel，其中，寡核苷酸探針具有與探針的5’和3’末端共價(jià)連接的5’熒光報(bào)告染料和3’淬滅染料。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告染料接近淬滅染料導(dǎo)致報(bào)告染料熒光被抑制，例如通過福斯特型能量轉(zhuǎn)移(Forster-type energy transfer) 0在 PCR正向和反向引物與位于多態(tài)性兩側(cè)的靶DNA的特定序列雜交過程中，雜交探針與位于擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中的含有多態(tài)性的序列雜交。在隨后的PCR循環(huán)中，具有5’ 一3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶切開探針，并分離報(bào)告染料與淬滅染料，導(dǎo)致報(bào)告染料的熒光增強(qiáng)。為了 QTL作圖，包括的標(biāo)記應(yīng)當(dāng)是來源診斷性的，以對隨后的群體作出推斷。SNP 標(biāo)記對于作圖是理想的，因?yàn)樘囟ǖ腟NP等位基因源自特定物種的現(xiàn)存群體中的獨(dú)立來源的可能性較低。因此，SNP標(biāo)記可用于示蹤和協(xié)助QTL的滲入，特別是在單倍型的情況下?？梢酝ㄟ^基因作圖模型建立另外的標(biāo)記分子的遺傳連鎖，所述基因作圖模型例如，但不限于，Lander等人報(bào)道的側(cè)翼標(biāo)記模型(Lander等人，Genetics, 121 185-199(1989))，和區(qū)間作圖(interval mapping)，其基于其中所述的最大似然法，并用軟件包 MAPMAKER/QTL 執(zhí) 亍(Lincoln 禾口 Lander,Mapping Genes Controlling Quantitative Traits Using MAPMAKER/QTL, Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts, (1990))。另夕卜的軟件包括 Qgene，Version 2. 23(1996), Department of Plant Breeding and Biometry,266 Emerson Hall,Cornell University,Ithaca, NY。使用Qgene軟件是一種特別優(yōu)選的方法。對于標(biāo)記的存在，計(jì)算最大似然估計(jì)值(MLE)，以及假設(shè)沒有QTL效應(yīng)的MLE，以避免假陽性。然后計(jì)算優(yōu)勢率(odds ratio)的Iogltl(LOD) :L0D = Iogltl(假定沒有相關(guān)的 QTL,對于QTL/MLE的存在的MLE)。LOD得分基本上指示，假定存在QTL，相對于不存在QTL， 獲得數(shù)據(jù)的可能性增大多少。為了避免比如95%的給定置信度時(shí)的假陽性的LOD閾值取決于標(biāo)記的數(shù)量和基因組的長度。Lander等人(1989)描述了顯示LOD閾值的曲線圖，且 Ariis 禾口 Moreno—Gonzcilez, Plant Breeding, Hayward, Bosemark, Romagosa(編)Chapman & Hall, London，第 314-331 頁(1993)進(jìn)一步對其描述?？梢允褂昧硗獾哪Ｐ?。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了對于區(qū)間作圖的許多修改和可供選擇的方法，包括使用非參數(shù)法(Kruglyak等人，1995 Genetics，139 1421-1428)。也可以使用多元回歸方法或模型，其中，在大量標(biāo)記上對性狀進(jìn)行回歸(Jansen，Biometrics in Plant Breed, van Oi jen，Jansen (編輯)Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia
19Section Biometrics in Plant Breeding, The Netherlands,第 116-124 頁(1994)； Weber 禾口 Wricke, Advances in Plant Breeding, Blackwell, Berlin,16 (1994))。Jansen 等人(Jansen 等人，1994 Genetics, 136 :1447-1455)和 ZengQeng 1994Genetics 136 1457-1468)報(bào)道了組合了區(qū)間作圖與回歸分析的程序，由此將表型回歸到給定的標(biāo)記區(qū)間的單個(gè)假定的QTL上，且同時(shí)回歸到作為’輔助因素’的標(biāo)記數(shù)量上。一般來說，輔助因素的使用減少了估計(jì)的QTL位置的偏差和抽樣誤差(Utz和Melchinger，Biometrics in Plant Breeding,van Oijen,Jansen(1 ) Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, The Netherlands，第 195—204 頁(1994))，從而提高QTL作圖的精度和效率(Zeng 1994)。這些模型可以擴(kuò)展到多環(huán)境實(shí)驗(yàn)，以分析基因型-環(huán)境的相互作用(Jansen 等人，1995 Theor. Appl. Genet. 91 :33-3)。合適的作圖群體的選擇對于圖譜的構(gòu)建是重要的。合適的作圖群體的選擇取決于所用的標(biāo)記系統(tǒng)的類型(Tanksley 等人，Molecular mapping in plant chromosomes, chromosome structure and function Impact of new concepts J.P. Gustafson 禾口 R-Appels(編)· Plenum Press,New York，第 157-173 頁(1988))。必須考慮在作圖群體中所用的親本的來源(適應(yīng)的相對于外來的)。染色體配對和重組率在遠(yuǎn)緣雜交(適應(yīng)的χ 外來的)中會(huì)受到嚴(yán)重干擾(抑制)，且一般產(chǎn)生大大降低的連鎖距離。當(dāng)與近緣雜交(適應(yīng)的χ適合的)的后代相比，遠(yuǎn)緣雜交通常會(huì)提供具有相對較大的多態(tài)性陣列的分離群體。標(biāo)記輔助滲入包括將由一種或多種標(biāo)記定義的染色體區(qū)域從一種種質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一種種質(zhì)。該方法中的初始步驟是通過基因作圖的性狀的定位，這是通過連鎖分析確定一個(gè)基因相對于其他基因和遺傳標(biāo)記的位置的方法。連鎖作圖的基本原則是，兩個(gè)基因在染色體上越接近，它們就越有可能被一起遺傳。簡單地說，雜交一般是在兩個(gè)遺傳兼容但相對于研究的性狀不同的親本之間進(jìn)行。遺傳標(biāo)記然后可以被用來追蹤在雜交后代(經(jīng)常是回交(BCl)、F2或重組近交系群體)中研究性狀的分離。A.連鎖遺傳標(biāo)記的開發(fā)和使用根據(jù)遺傳的遺傳標(biāo)記，可以對第一植物群體樣品基因分型，以形成基因型數(shù)據(jù)庫。 如本文所用，術(shù)語“遺傳的遺傳標(biāo)記”是單一基因座處的等位基因?；蜃侨旧w上的位置，而且等位基因是指基因條件；也就是說，在這些基因座處的不同的核苷酸序列。每個(gè)基因座處的標(biāo)記等位基因組成可以是純合或雜合的。為了從雜交中獲得遺傳標(biāo)記的信息，該標(biāo)記必須是多態(tài)性的；也就是說，它必須以不同的形式存在，使得通過它也攜帶的標(biāo)記的形式，攜帶突變基因的染色體可以與具有正?；虻娜旧w區(qū)別。表型數(shù)據(jù)庫的形成可以通過以下來完成直接觀察源自植物樣品的人工或自然自花授粉的后代的一種或多種性狀，或定量評估植物樣品的配合力(combining ability)。例如，一種植物系可以與或被一種或多種測試系雜交。測試系可以是近交系、單交、雙交或多交的雜種，或通過控制的或自由的雜交產(chǎn)生或維持的植物的任何其他集合，或其任何組合。 對于一些自花授粉植物，優(yōu)選沒有后代測試的直接評估。可以在測交一代和作圖的標(biāo)記基因座中確定標(biāo)記基因型。為了通過連鎖方法對特定性狀作圖，有必要建立特定染色體基因座的遺傳與該性狀的遺傳之間的正相關(guān)。在復(fù)雜遺傳性(諸如數(shù)量性狀，具體包括α-亞基含量和產(chǎn)量)的情況下，連鎖一般會(huì)更加難以辨別。在這種情況下，可能需要統(tǒng)計(jì)程序以建立表型和基因型之間的相關(guān)性。這可能進(jìn)一步使得檢查來自特定雜交的許多后代成為必要，因?yàn)閱为?dú)的基因座可能對于整體表型貢獻(xiàn)較特定性狀和標(biāo)記的共同遺傳(coinheritance)或遺傳連鎖表明它們在染色體上物理地緊密接近。通過分析雜交中的基因和標(biāo)記的遺傳模式確定連鎖。遺傳圖距單位是厘摩(cM)，隨重組的增加而提高。如果兩個(gè)標(biāo)記在減數(shù)分裂中每大約100次必須進(jìn)行的重組機(jī)會(huì)中發(fā)生一次重組，則它們是距離1厘摩。厘摩是遺傳學(xué)量度標(biāo)準(zhǔn)，不是物理學(xué)的。那些位于距離第二基因座小于50cM的標(biāo)記據(jù)說是遺傳連鎖的，因?yàn)樗鼈儾皇窍嗷オ?dú)立遺傳的。 因此，在每代基因座之間觀察的重組百分率低于50%。在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，所用的標(biāo)記可以被定義為位于距離基因座小于大約45、35、25、15、10、5、4、3、2或1或更小的cM。減數(shù)分裂過程中，同源染色體對集合并且在稱為重組的過程中交換片段。標(biāo)記越是來自基因，基因和標(biāo)記之間存在重組的幾率越大。在連鎖分析中，在特定的雜交中，接著進(jìn)行標(biāo)記和基因或性狀的共同遺傳。計(jì)算以下概率它們觀察到的遺傳模式可能會(huì)偶然單獨(dú)發(fā)生，也就是說，它們完全不關(guān)聯(lián)。然后假定存在特定程度的連鎖，進(jìn)行重復(fù)計(jì)算，并確定兩個(gè)概率之比(沒有連鎖相對于特定程度的連鎖)。這個(gè)比率表示連鎖程度的優(yōu)勢率，而且由于使用比例的對數(shù)，已知它為優(yōu)勢率的對數(shù)，例如Iod得分。例如，通過等于或大于3的 Iod得分可以確認(rèn)，基因和標(biāo)記為連鎖的。這代表兩個(gè)基因座連鎖的1000 1的優(yōu)勢率。 通過使用統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用程序(statistical analysis employing program),大大方便了連鎖計(jì)算?？梢酝ㄟ^基因作圖模型建立標(biāo)記分子的遺傳連鎖，所述基因作圖模型例如但不限于，Lander和Botstein (1989)報(bào)道的側(cè)翼標(biāo)記模型，和區(qū)間作圖(interval mapping)，其基于Lander和Botstein (1989)所述的最大似然法，并用軟件包MAPMAKER/QTL執(zhí)行。另外的軟件包括 Qgene, Version 2. 23 (1996) (Department of Plant Breeding and Biometry, 266 Emerson Hall, Cornell University, Ithaca, NY)。B.遺傳的標(biāo)記遺傳標(biāo)記包括在由兩種或多種植物攜帶的遺傳信息中檢測到的差異(多態(tài)性)。 用遺傳標(biāo)記的基因座遺傳作圖通常需要兩個(gè)基本成分可檢測的多態(tài)性等位基因及這些等位基因的重組或分離。在植物中，測量的重組實(shí)質(zhì)上總是減數(shù)分裂的，因此，植物基因作圖的兩個(gè)內(nèi)在需求是多態(tài)性遺傳標(biāo)記和一種或多種其中這些等位基因是分離的植物。標(biāo)記優(yōu)選以共顯性方式遺傳，使得兩個(gè)等位基因在二倍體基因座中的存在是很容易察覺，而且它們不受環(huán)境變化影響，即它們的遺傳性為1。標(biāo)記基因型通常在二倍體生物體諸如大豆中的每個(gè)基因座處包括兩個(gè)標(biāo)記等位基因。每個(gè)基因座處的標(biāo)記等位基因組成可以是純合或雜合的。純合性是一種情形，其中一個(gè)基因座處的兩個(gè)等位基因的特征是相同的核苷酸序列。雜合性是指一個(gè)基因座處的基因不同的情形。許多不同的標(biāo)記類型可以用于遺傳作圖。本發(fā)明所用的示例性的遺傳標(biāo)記包括但不限于，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、核苷酸插入和/或缺失(INDEL)和同工酶。可以以多種方式分析包含盡可能少的單核苷酸變化的多態(tài)性。例如，檢測可以通過電泳技術(shù)來進(jìn)行，所述電泳技術(shù)包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Orita等人，1989)、變性梯度凝膠電泳(Myers等人，1985)或裂解片段長度多態(tài)性(Life Technologies, Inc. , Gathersberg, MD 20877)，但
21DNA測序機(jī)的普及往往使得對于只是序列擴(kuò)增產(chǎn)物的直接檢測更容易。一旦已知多態(tài)序列的差異，快速檢測可以被設(shè)計(jì)用于后代測定，通常包括一些版本的特定等位基因的PCR擴(kuò)增(PASA，Sommer，等人，1992)，或多個(gè)特定等位基因的PCR擴(kuò)增(PAMSA，Dutton和Sommer， 1991)。分析可以用來選擇包括或連接遺傳標(biāo)記的基因、QTL、等位基因或基因組區(qū)域(單倍型)。核酸分析方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，包括但不限于，基于PCR的檢測方法 (例如，TaqMan分析)、微陣列方法和核酸測序方法。通過使用核酸擴(kuò)增方法可以促進(jìn)在 DNA、RNA或cDNA樣品中檢測多態(tài)性位點(diǎn)。如Livak等人，1995和美國專利5，604，099所述(通過參考引入本文)，一種用于檢測DNA、RNA和cDNA樣品中的SNP的方法是使用PCR結(jié)合對于多態(tài)性的熒光探針。這種方法特別提高了跨越多態(tài)性位點(diǎn)或包括該位點(diǎn)和位于其遠(yuǎn)端或近端的序列的多核苷酸的濃度?？梢酝ㄟ^凝膠電泳、熒光檢測方法或其他方法很容易地檢測這種擴(kuò)增的分子。簡單地說，合成寡核苷酸探針，其中一個(gè)與SNP位點(diǎn)退火，另一個(gè)與野生型序列退火。優(yōu)選SNP 位點(diǎn)在探針寡核苷酸的5’末端附近。然后在3’末端用分別降低背景熒光和降低寡核苷酸的Tm的非熒光猝滅劑和小溝結(jié)合部分標(biāo)記每個(gè)探針。用不同的熒光染料標(biāo)記每個(gè)探針的 5’末端，其中熒光取決于從探針切割的染料。這種染料的一些非限制的例子包括VIC 和 6-FAM 。使用具有5’-3’外切酶活性的聚合酶和側(cè)翼引物，然后對懷疑包含特定SNP的DNA 進(jìn)行PCR。在兩種寡核苷酸探針都存在的情況下，進(jìn)行PCR。如果探針結(jié)合測試DNA中的互補(bǔ)序列，那么聚合酶的外切酶活性釋放激活其熒光活性的熒光標(biāo)記。因此，只含有野生型序列的測試DNA顯示與野生型探針的標(biāo)記相關(guān)的熒光。另一方面，只包含SNP序列的DNA具有來自SNP探針的標(biāo)記的熒光活性。然而，在DNA來自異源的情況下，觀察到兩個(gè)標(biāo)記的顯著的熒光。這種在已知的SNP位點(diǎn)間接基因分型的類型使得能夠高通量、廉價(jià)篩選DNA樣品。因此，這種系統(tǒng)對于鑒定包含α ’ -亞基等位基因的后代大豆植物是理想的。限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是通過DNA片段長度可檢測的遺傳差異，通常經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化DNA后由瓊脂糖凝膠電泳顯示。存在大量可用的、以其核苷酸切割位點(diǎn)及其來源為特征的限制性內(nèi)切酶，例如EcoRI。RFLP源自限制性位點(diǎn)序列內(nèi)的單bp多態(tài)性和特定的限制片段內(nèi)的可測量的插入或缺失。RFLP的生成容易且相對便宜(需要克隆的 DNA,但不需要測序)，且是共顯性的。RFLP在分型階段具有勞動(dòng)密集的缺點(diǎn)，盡管這可以通過同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)任務(wù)和再利用印跡而在一定程度上緩解。大多數(shù)RFLP為雙等位基因的，且比微衛(wèi)星具有較低的多態(tài)性含量?；谶@些原因，RFLP在植物遺傳圖譜的使用已減弱。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，許多類型的分子標(biāo)記用作監(jiān)測遺傳性的工具，并不限于利用RFLP、SSR和SNP，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員也明白，多種檢測方法可能會(huì)被用來跟蹤各種分子標(biāo)記。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也認(rèn)識(shí)到，不同類型的標(biāo)記可以用于作圖，特別是隨著技術(shù)的發(fā)展和用于鑒定的新型標(biāo)記和方法的確定。為方便起見，遺傳標(biāo)記基因型可以被轉(zhuǎn)換成數(shù)字得分，例如，如果使用特定的酶， 在特定基因座處存在兩種形式的分別命名為A和B的SNP或其他標(biāo)記，那么二倍體互補(bǔ)物可以轉(zhuǎn)換為數(shù)字得分，例如，AA = 2，AB = UPBB = O ；或AA = 1,AB = O和BB = -1。這些得分的絕對值并不重要。重要的是數(shù)字表示的附加性質(zhì)。上述得分涉及共顯性標(biāo)記。可以得到類似的與顯性標(biāo)記一致的評分系統(tǒng)。
C.標(biāo)記輔助選擇本發(fā)明提供了具有提高的伴大豆球蛋白含量以及商業(yè)意義的產(chǎn)量和農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良特征的大豆植物。根據(jù)本發(fā)明，可以通過標(biāo)記輔助選擇方法產(chǎn)生這樣的植物，所述方法包括分析基因組DNA是否存在與非轉(zhuǎn)基因、α -亞基等位基因1至等位基因18 (包括其所有可能的組合)遺傳連鎖的標(biāo)記。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，可能需要獲得與α-亞基等位基因連鎖的其他標(biāo)記。這可以通過以下方法進(jìn)行，例如，首先通過自交由雜交近交品種產(chǎn)生的F1雜種來制備 F2群體，所述近交品種中只有一個(gè)包含賦予降低的α-亞基含量所導(dǎo)致的提高的α ’ -亞基含量的α-亞基等位基因。重組近交系(RIL)(遺傳相關(guān)的系，通常是> F5，從繼續(xù)自交的&系向純合性發(fā)展)然后被制備，并可以作為作圖群體使用。通過使用RIL可以將從顯性標(biāo)記獲得的信息最大化，因?yàn)樗械幕蜃际羌兒系幕蚪咏兒系?。攜帶之前不存在的性狀的回交群體(例如，通過需要的品種(輪回親本)和另一品種(供體親本)之間雜交產(chǎn)生的)也可以作為作圖群體來使用。可以與輪回親本進(jìn)行一系列回交，以恢復(fù)大部分其需要的性狀。因此，產(chǎn)生由個(gè)體組成的群體，該個(gè)體與輪回親本類似，但每個(gè)個(gè)體攜帶不同量的來自供體親本的基因組區(qū)域。如果輪回親本中的所有基因座都是純合的，且供體親本和輪回親本具有截然不同的多態(tài)性標(biāo)記等位基因，回交群體可以用于對顯性標(biāo)記作圖(Reiter等人(1992))。用于作圖目的的有用的群體是近等基因系(NIL)。通過多次回交產(chǎn)生NIL，以產(chǎn)生除了需要的性狀或基因組區(qū)域之外在遺傳組成上幾乎相同的個(gè)體陣列，它們可用作作圖群體。在用NIL作圖時(shí)，預(yù)計(jì)僅有一部分多態(tài)性基因座定位于選定的區(qū)域。也可以對轉(zhuǎn)化的植物系進(jìn)行作圖。D.植物育種方法本發(fā)明的某些方面也提供了標(biāo)記輔助培育植物的方法，其能夠?qū)⒎寝D(zhuǎn)基因α-亞基等位基因引入異源大豆遺傳背景中。通常，育種技術(shù)利用植物的授粉方法。有兩種常用的授粉方法如果來自一朵花的花粉被轉(zhuǎn)移到同一植物的相同或另一花上時(shí)發(fā)生的自花授粉，和如果花粉來自不同植物上的花時(shí)發(fā)生的異花授粉。已經(jīng)自花授粉并且經(jīng)過多代類型選擇的植物在幾乎全部基因座處成為純合的，并且產(chǎn)生真正育種后代、純合植物的均一群體。在合適的品種的開發(fā)中，可以使用譜系育種。針對特定性狀的譜系育種方法包括雜交兩個(gè)基因型。每個(gè)基因型可以具有一種或多種希望的特征，而該特征在另一基因型中缺乏；或者，每個(gè)基因型可以與另一個(gè)互補(bǔ)。如果兩個(gè)原始親本基因型不提供所有希望的特征，其他基因型可以被包括在育種群體中。作為這些雜交的產(chǎn)物的優(yōu)良植物進(jìn)行自交，并且在每一連續(xù)世代中再次改良。作為自花授粉和選擇的結(jié)果，每一隨后的世代成為更純合的。 這種育種方法一般包括五代或更多代的自交和選擇=S1 — S2 ;S2 — S3 ；S3 — S4 ;S4 — S5,等等。自交代( 可以被認(rèn)為是子代(F)的一種，并且可以被稱為F。在至少五代后，近交植物被認(rèn)為是遺傳學(xué)上純的。每個(gè)育種計(jì)劃應(yīng)當(dāng)包括對育種程序效率的定期的、客觀的評價(jià)。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)目標(biāo)和對象而不同。全面測試有希望的選出的育種系，并且在代表商業(yè)目標(biāo)地區(qū)的環(huán)境中與合適的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行通常三年或更長的比較。遺傳學(xué)上優(yōu)良的個(gè)體的鑒別是困難的，因?yàn)榛蛐椭悼梢员换祀s的植物性狀或環(huán)境因素所掩蓋。一種鑒別優(yōu)良植物的方法是觀察其相對于其他實(shí)驗(yàn)植物和一種或多種廣泛種植的標(biāo)準(zhǔn)品種的表現(xiàn)。單次觀察可能是非結(jié)論性的，而重復(fù)觀察提供對遺傳價(jià)值的更好的評估?；旌线x擇(mass selection)和輪回選擇可以用來改良自花授粉或異花授粉作物的群體。雜合個(gè)體的遺傳變異性群體通過幾個(gè)不同親本的互交來鑒別或產(chǎn)生?；趥€(gè)體優(yōu)勢、突出的后代或出色的組合能力來選擇最佳的植物。將選擇的植物互交，以產(chǎn)生新群體， 在該新群體中繼續(xù)進(jìn)一步的選擇循環(huán)。其他常用于不同性狀和作物的育種方法的描述可見于幾本參考書之一中(例如，Allard, 1960 ；Simmonds, 1979 ；Simmonds, 1979 ；Sneep 等人， 1979 ；Fehr, 1987a, b)。在育種程序中選擇具有感興趣的性狀(例如，高產(chǎn)量、抗病性、脂肪酸分布)的基因型的有效性將取決于1)群體中個(gè)體植物的目標(biāo)性狀的變異性是遺傳因素的結(jié)果并且因此傳遞給選擇的基因型的后代的程度；和2、植物之間目標(biāo)性狀的變異性有多少是由于不同基因型的生長環(huán)境。性狀的遺傳是從被一個(gè)其表達(dá)不受環(huán)境影響的主要基因控制(即質(zhì)量性狀)到被其效應(yīng)受環(huán)境很大影響的許多基因控制(即數(shù)量性狀)。對于數(shù)量性狀諸如產(chǎn)量的育種進(jìn)一步通過以下事實(shí)來表征1)每個(gè)基因的效應(yīng)引起的差異較小，使得難以或不可能單獨(dú)地鑒別它們；幻對性狀有貢獻(xiàn)的基因的數(shù)量較多，使得即使獲得也很少獲得不同的分離比；和幻基因的效應(yīng)可以基于環(huán)境變化以不同方式表達(dá)。因此，具有目標(biāo)性狀的超親分離子(transgressive segregate)或優(yōu)良基因型的準(zhǔn)確鑒別極其困難，其成功依賴于植物育種者使影響群體中數(shù)量性狀表達(dá)的環(huán)境變化最小化的能力。隨著組合為一個(gè)基因型的性狀數(shù)量的增高，鑒別超親分離子的可能性大大降低。 例如，如果在三個(gè)復(fù)合性狀諸如產(chǎn)量、α ’ -亞基含量和至少第一農(nóng)藝學(xué)性狀中不同的栽培種之間進(jìn)行雜交，不使用分子工具極難以通過重組將三個(gè)性狀中每一個(gè)的最大數(shù)量的有利基因同時(shí)恢復(fù)到一個(gè)基因型中。因此，所有育種者通常可能希望的是，除了選擇的基因以外，還獲得第一復(fù)合性狀的有利基因分類與第二性狀的有利基因分類組合為一個(gè)基因型?；亟皇且环N有效的轉(zhuǎn)移希望的特定性狀的方法。這可以如下實(shí)現(xiàn)，例如首先將優(yōu)良近交品種(A)(輪回親本)與攜帶所述性狀的合適的基因的供體近交系(非輪回親本) 雜交(Fehr，1987)。這種雜交的后代然后與優(yōu)良輪回親本(A)回交，然后針對將要從非輪回親本轉(zhuǎn)移的希望的性狀在得到的后代中進(jìn)行選擇。這種選擇可以基于如下所述的遺傳分析，或可以基于后代植物的表型。在進(jìn)行五代或更多代的回交來選擇希望的性狀后，后代對于控制所轉(zhuǎn)移的特征的基因座而言是雜合的，但是在大多數(shù)或幾乎全部其他基因方面類似于優(yōu)良親本。最后一代的回交是自交或者同胞雜交(silked)，產(chǎn)生對于所轉(zhuǎn)移的基因(例如給植物提供降低的種子大豆球蛋白含量的基因座)而言為純的育種后代。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，回交轉(zhuǎn)換過程可以定義為包括以下步驟的過程(a)使含有一種或多種理想基因、DNA序列或元件諸如與提高的種子α -亞基含量相關(guān)的α -亞基的等位基因1至α -亞基的等位基因18的第一基因型植物與缺乏所述理想基因、DNA序列或元件的第二基因型植物雜交；(b)選擇一種或多種含有理想基因、DNA序列或元件的后代植物；(c)使所述后代植物與第二基因型植物雜交；和(d)重復(fù)步驟(b)和(C)，以將所述理想基因、DNA序列或元件從第一基因型植物轉(zhuǎn)移到第二基因型植物中。特定DNA元件或元件的集合向植物基因型中的滲入被定義為回交轉(zhuǎn)換過程的結(jié)果。已經(jīng)滲入DNA序列的植物基因型可以被稱為回交轉(zhuǎn)換的基因型、系、近交系或雜種。類似地，缺乏理想的DNA序列的植物基因型可以被稱為非轉(zhuǎn)換基因型、系、近交系或雜種。在育種過程中，與降低的α-亞基含量所導(dǎo)致的提高的α ’-亞基含量連鎖的遺傳標(biāo)記可以被用來幫助以生產(chǎn)具有提高的α ’ -亞基含量的大豆植物為目標(biāo)的育種。回交和標(biāo)記輔助選擇尤其可以用于本發(fā)明，以通過轉(zhuǎn)換具有有關(guān)的非轉(zhuǎn)基因α ’-亞基等位基因1至等位基因 18的品種，將本發(fā)明的提高的α ’ -亞基含量性狀引入任何品種中。對于成功的回交程序而言，合適的輪回親本的選擇是一個(gè)重要的步驟。回交方案的目標(biāo)是改變或置換原近交系中的性狀或特征。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，將輪回近交系的一種或多種基因座修飾或替換為來自非輪回親本的理想的基因，而保留原近交系的基本上其余全部理想的遺傳學(xué)組成，因此保留其理想的生理和形態(tài)學(xué)組成。特定非輪回親本的選擇取決于回交的目標(biāo)，在本發(fā)明的情況下可以是添加一種或多種賦予提高的α ’-亞基含量的等位基因。精確回交方案取決于經(jīng)過改變以確定合適的測試方案的特征或性狀。盡管當(dāng)被轉(zhuǎn)移的特征是顯性等位基因時(shí)簡化了回交方法，但隱性等位基因也可以被轉(zhuǎn)移。在這種情況下，可能必需引入后代測試，以確定理想的特征是否已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的情況下， 可以測試在回交程序中產(chǎn)生的后代系的大豆球蛋白含量，例如通過SDS-PAGE/考馬斯染色，以及使用本文所述的標(biāo)記系統(tǒng)，以選擇基于標(biāo)記而不是視覺性狀的系。大豆植物(Glycine max L.)可以通過自然或機(jī)械技術(shù)雜交(參見，例如，F(xiàn)ehr, In :Hybridization of Crop Plants,Fehr and Hadley (編)，Am. Soc. Agron. and Crop Sci. Soc. Am.，Madison, WI，90-599 (1980))。自然授粉在大豆中通過自花授粉或自然異花授粉發(fā)生，這一般由傳粉生物輔助。在自然或人工雜交中，開花和開花時(shí)間是重要的考慮因素。 大豆是短日照植物，但是對光周期的敏感性存在顯著的遺傳變異(Hamner，1969 ；Criswell 和Hume，1972)。開花的臨界晝長范圍是從適應(yīng)熱帶緯度的基因型的大約13小時(shí)到在較高緯度生長的光周期不敏感性基因型的M小時(shí)(Shibles等人，1975)。大豆在出苗后9天似乎對晝長不敏感。短于臨界晝長的光周期需要7- 天，以完成開花誘導(dǎo)(Borttwick和 Parker，1938 ；Shanmugasundaram 禾口 Tsou，1978)。使用或者不使用雌花去雄，人工授粉可以如下進(jìn)行通過用鑷子從雄性親本的花上除去雄蕊和雌蕊，并靠著雌花的柱頭輕輕刷花藥。通過除去前萼片和龍骨瓣，或者用閉合的鑷子刺穿龍骨，并且使它們打開來推開花瓣，可以靠近雄蕊。在柱頭上刷花藥使它們破裂，并且當(dāng)花粉在柱頭上清晰可見時(shí)獲得最高比例的成功雜交?；ǚ凵⒙淇梢酝ㄟ^在刷柱頭前拍打花藥來檢查。當(dāng)條件不利時(shí)，可能必須使用幾朵雄花來獲得適量的花粉散落，或者可以用相同的雄花對幾個(gè)具有良好花粉散落的花授粉。遺傳雄性不育性在大豆中可以獲得，并且可以用于在本發(fā)明中促進(jìn)雜交，特別是用于輪回選擇程序(Brim和Muber，1973)。雜交區(qū)組完全分離所需的距離還不清楚；但是， 當(dāng)雄性不育植物距離外源花粉來源1 !或更遠(yuǎn)時(shí)，遠(yuǎn)交小于0. 5% (Boerma和Moradshahi， 1975)。雜交區(qū)組邊界上的植物可能維持大多數(shù)與外源花粉的遠(yuǎn)交，并且可以在收獲時(shí)消除，以使混雜最小化。一旦收獲，豆莢一般在不高于38°C的溫度下風(fēng)干，直到種子含有13%或更低的水分，然后用手取出種子。如果相對濕度為50%或更低，種子可以在大約25°C下令人滿意地貯存長達(dá)一年。在濕潤氣候下，發(fā)芽百分率快速下降，除非種子被干燥到7%的含水量并且室溫貯存在氣密容器中。在任何氣候下的長期貯存最好伴隨將種子干燥到7%的含水量并且在10°C或更低的溫度下在保持50%相對濕度的房間中或氣密容器中貯存。III.用于大豆品種的改件和改良的件狀在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的大豆植物可以包含一種或多種轉(zhuǎn)基因。這種轉(zhuǎn)基因的一個(gè)例子賦予除草劑抗性。常用的除草劑抗性基因包括賦予草甘膦抗性的EPSPS基因、賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II (nptll)基因(Fraley等人，198 、賦予抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Vanden Elzen等人，198 、賦予草丁膦或溴苯腈抗性的基因(Comai等人，1985 ；Gordon-Kamm等人，1990 ；Stalker等人，1988)諸如二氫葉酸還原酶和乙酰乳酸合酶(Eichholtz等人，1987，Shah等人，1986，Charest等人，1990)。 進(jìn)一步的實(shí)例包括賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突變ALS和AHAS酶(Lee等人，1988 ；Miki 等人，1990)、賦予膦絲菌素抗性的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(歐洲申請O 242 246)、賦予苯氧基丙酸類和環(huán)己酮類諸如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾靈(haloxyfop)抗性的基因(Marshall等人，1992)；和賦予三嗪(psbA和gs+基因)和芐腈(腈水解酶基因)抗性的基因(Przibila 等人，1991)。本發(fā)明的植物也可以包含賦予昆蟲、害蟲、病毒或細(xì)菌攻擊抗性的基因。例如，賦予害蟲(諸如大豆胞囊線蟲(Soybean cyst nematode))抗性的基因在PCT申請W096/30517 和PCT申請W093/19181中有描述。Jones等人，(1994)描述了番茄葉霉菌(Cladosporium fulvum)抗性的西紅柿Cf-9基因的克?。籑artin等人，(1993)描述了丁香假單胞菌致病變種(Pseudomonas syringae pv.)抗性的西紅棉 Pto 基因，Mindrinos 等人，(1994)描述了丁香假單胞菌抗性的擬南芥(Arabidopsis)RSP2基因。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)內(nèi)毒素也可以用于昆蟲抗性。(參見，例如，Geiser等人，(1986))。維生素結(jié)合蛋白諸如抗生物素蛋白也可以用作殺幼蟲劑(PCT申請US93/06487)。已知在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中使用病毒外殼蛋白可以提供對病毒感染和/或受該外殼蛋白基因所來源的病毒以及相關(guān)病毒影響的病害發(fā)展的抗性(參見Beachy等人，1990)。 已經(jīng)對轉(zhuǎn)化的植物提供了針對苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒(tobacco streak virus)、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕紋病毒、煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus)和煙草花葉病毒的外殼蛋白介導(dǎo)的抗性。同上。也可以使用由病原體或寄生蟲在自然中產(chǎn)生的發(fā)育阻滯性蛋白。例如，Logemarm等人，(1992)已經(jīng)證明表達(dá)大麥核糖體滅活基因的轉(zhuǎn)基因植物具有提高的真菌病抗性。也可以使用提供提高的營養(yǎng)價(jià)值或另一價(jià)值提高性狀的轉(zhuǎn)基因。一個(gè)例子是改變的脂肪酸代謝，例如，通過用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物，以提高植物的硬脂酸含量。(參見Knutzon等人，199 。也可以引入有義去飽和酶基因以改變脂肪酸含量。 通過引入編碼肌醇六磷酸酶的基因以增強(qiáng)肌醇六磷酸鹽的分解，可以改變肌醇六磷酸鹽的含量，向轉(zhuǎn)化的植物中提供更多的游離磷酸鹽。例如，通過用編碼改變淀粉分支模式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物，也可以實(shí)現(xiàn)改變的碳水化合物組成(參見Siiroza等人，1988)(變異鏈球菌 (Streptococcus mutans)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz等人，(198 (枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen等人，(1992)(表達(dá)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) α -淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生)；Elliot等人，(1993)(西紅柿轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)；S0gaard等人，(1993)(大麥α-淀粉酶基因的定點(diǎn)誘變)；和Fisher等人，(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II))。轉(zhuǎn)基因也可以用來改變蛋白質(zhì)代謝。例如，美國專利5，545, 545描述了對賴氨酸不敏感的玉米二氫吡啶二羧酸合酶(DHPQ，該酶基本耐受會(huì)以其他方式抑制天然DHPS活性的L-賴氨酸的濃度。類似地，EP0640141描述了編碼能夠引起產(chǎn)生高于正常的蘇氨酸的賴氨酸不敏感性天冬氨酸激酶(AK)的序列，以及編碼用于提高賴氨酸的反義賴氨酸酮戊二酸還原酶的亞片段。在另一實(shí)施方式中，可以使用改變植物碳水化合物代謝的轉(zhuǎn)基因。例如，已知果糖激酶基因用于轉(zhuǎn)基因植物及其果實(shí)中果糖激酶基因表達(dá)的代謝工程(參見美國專利 6，031，154)?？梢允褂玫霓D(zhuǎn)基因的另一個(gè)例子是改變谷物產(chǎn)量的基因。例如，美國專利 6，486，383描述了具有腺苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶(“ADPG PPase")的亞單位蛋白質(zhì)的植物中淀粉含量的改變。在EP0797673中討論了轉(zhuǎn)基因植物，其中特定DNA分子的引入和表達(dá)導(dǎo)致在液泡外形成容易移動(dòng)的磷酸鹽池和增高的生物質(zhì)產(chǎn)生和/或改變的開花行為。另外已知用于改變植物成熟的基因。美國專利6，774，284描述了編碼植物脂肪酶的DNA和使用它們控制植物枯萎的方法。美國專利6，140，085討論了改變開花特征，特別是開花時(shí)機(jī)的FCA基因。美國專利5，637，785討論了遺傳學(xué)修飾的植物，該植物具有調(diào)節(jié)的花發(fā)育，例如具有早期花分生組織發(fā)育，并且在其基因組中包含編碼LEAFY蛋白的結(jié)構(gòu)基因。改變植物形態(tài)特征的基因也是已知的，并且可以根據(jù)本發(fā)明使用。美國專利 6，184，440討論了由于表達(dá)細(xì)胞壁調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因而顯示改變的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)的遺傳工程植物。細(xì)胞壁調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的例子包括纖維素結(jié)合域、纖維素結(jié)合蛋白或細(xì)胞壁修飾蛋白或酶， 諸如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖基轉(zhuǎn)移酶(endoxyloglucan transferase)、木糖葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶、棒曲霉素、纖維素合酶或分離的新型內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶。轉(zhuǎn)基因引入方法是本領(lǐng)域公知的，包括生物和物理學(xué)植物轉(zhuǎn)化方案。參見，例如， Miki 等人(1993)。一旦轉(zhuǎn)基因被引入品種中，它可以容易地通過雜交轉(zhuǎn)移。通過使用回交，除了通過回交技術(shù)轉(zhuǎn)移到該品種中的基因座以外，品種的基本上全部希望的形態(tài)和生理特征被恢復(fù)。回交方法可以用于本發(fā)明，以改良或向植物中引入特征(Poehlman等人，1995 ;Fehr， 1987a,b)。IV.大豆植物的組織培養(yǎng)物和體外再生本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的大豆品種的組織培養(yǎng)物。如本文使用的術(shù)語“組織培養(yǎng)物”是指包含分離的相同或不同類型的細(xì)胞的組合物或組織成為植物部分的這些細(xì)胞的集合。示例性的組織培養(yǎng)物類型是在植物或植物部分中為完好的原生質(zhì)體、愈傷組織和植物細(xì)胞，諸如胚、花粉、花、葉、根、根尖、花藥等。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組織培養(yǎng)物包括胚、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、花粉、葉或花藥。用于制備可再生大豆細(xì)胞的組織培養(yǎng)物以及從其再生大豆植物的示例性程序在美國專利4，992，375、美國專利5，015，580、美國專利5，024，944和美國專利5，416，011中公開，上述各專利的公開內(nèi)容均完整引入本文作為參考。組織培養(yǎng)物的一個(gè)重要的能力是能夠再生能育的植物。這允許，例如，轉(zhuǎn)化組織培
27養(yǎng)細(xì)胞，然后再生為轉(zhuǎn)基因植物。為使轉(zhuǎn)化有效和成功，DNA必須引入將產(chǎn)生植物或種系組織的細(xì)胞中。大豆一般通過兩種不同的過程再生芽形態(tài)發(fā)生和體細(xì)胞胚發(fā)生(Finer，1996)。 芽形態(tài)發(fā)生是芽分生組織組織化和發(fā)育的過程。芽從來源組織中長出，并且切下并生根，以獲得完整的植物。在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，由體細(xì)胞植物組織形成含有芽和根軸的胚(類似于合子胚)。完整的植物而不是生根的芽通過體細(xì)胞胚的發(fā)芽而產(chǎn)生。芽形態(tài)發(fā)生和體細(xì)胞胚發(fā)生是不同的過程，并且具體再生途徑主要取決于外植體來源和用于組織培養(yǎng)操作的培養(yǎng)基。盡管其系統(tǒng)是不同的，但這兩種系統(tǒng)都顯示品種特異性的應(yīng)答，其中某些系比其他系對組織培養(yǎng)操作有更強(qiáng)的反應(yīng)性。在芽形態(tài)發(fā)生中具有高度反應(yīng)性的系可能不產(chǎn)生許多體細(xì)胞胚。在“誘導(dǎo)”步驟過程中產(chǎn)生許多胚的系可能不產(chǎn)生快速生長的增殖培養(yǎng)物。因此，可能需要優(yōu)化用于每個(gè)大豆系的組織培養(yǎng)條件。組織培養(yǎng)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員通過小規(guī)模的培養(yǎng)研究可以容易地進(jìn)行這些優(yōu)化。除了系特異性應(yīng)答外，使用芽形態(tài)發(fā)生和體細(xì)胞胚發(fā)生都可以觀察到增殖培養(yǎng)物。增殖對于兩種系統(tǒng)都是有益的，因?yàn)樗试S單個(gè)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞擴(kuò)增到可有助于種系組織的點(diǎn)。芽形態(tài)發(fā)生最早由feight等人(1986)報(bào)道，作為一種由大豆幼苗的子葉節(jié)從頭獲得芽的系統(tǒng)。芽分生組織在表皮下形成，并且形態(tài)發(fā)生組織在含有芐基腺嘌呤(BA)的培養(yǎng)基上可以增生。如果知道芽的表皮下多細(xì)胞來源，并且使用增殖培養(yǎng)，則該系統(tǒng)可用于轉(zhuǎn)化。想法是針對將產(chǎn)生新芽的組織，并且使分生組織內(nèi)的這些細(xì)胞增殖，以減輕與嵌合性有關(guān)的問題。如果轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能充分增殖，并且不產(chǎn)生種系組織，則在分生組織中只有單細(xì)胞轉(zhuǎn)化導(dǎo)致嵌合體形成成為一個(gè)問題。一旦該系統(tǒng)被很好地認(rèn)識(shí)，并且令人滿意地再生，則可以用作用于大豆轉(zhuǎn)化的一種靶組織。大豆中的體細(xì)胞胚發(fā)生最早由Christianson等人(198 報(bào)道，作為一種最初由合子胚軸獲得胚發(fā)生組織的系統(tǒng)。這些胚發(fā)生培養(yǎng)物是增殖性的，但是該系統(tǒng)的可重復(fù)性較低，并且胚的來源沒有報(bào)道。后來對不同增殖性胚發(fā)生大豆培養(yǎng)物的組織學(xué)研究表明，增殖性胚是頂端或表面來源的，少量的細(xì)胞對胚形成有貢獻(xiàn)。初生胚(由最初的外植體產(chǎn)生的第一胚)的來源取決于外植體組織和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長素(auxin)水平(Hartweck等人，1988)。使用增殖性胚培養(yǎng)物，“較老的”體細(xì)胞胚的單細(xì)胞或小組表面細(xì)胞形成“較新的”胚。如果知道胚的來源并且理解增殖性胚發(fā)生培養(yǎng)物的生物學(xué)限制，胚發(fā)生培養(yǎng)物也可以成功用于再生，包括轉(zhuǎn)基因植物的再生。生物學(xué)限制包括難以發(fā)展增殖性胚發(fā)生培養(yǎng)物和與由長期增殖性胚發(fā)生培養(yǎng)物再生的植物相關(guān)的生育性降低問題(培養(yǎng)誘導(dǎo)的變異)。某些這樣的問題在長期培養(yǎng)中被突出。使用更新近培養(yǎng)的細(xì)胞可以減少或消除這些問題。V.大豆植物的應(yīng)用本發(fā)明提供的大豆植物可以用于任何認(rèn)為具有價(jià)值的目標(biāo)。常見的應(yīng)用包括制備供人消費(fèi)的食物、供非人動(dòng)物食用的飼料以及工業(yè)應(yīng)用。如本文使用的“工業(yè)應(yīng)用”或“工業(yè)用途”是指大豆或基于大豆的產(chǎn)品的非食品和非飼料應(yīng)用。大豆通常被加工為兩種主要的產(chǎn)品大豆蛋白質(zhì)(粗粉)和粗大豆油。為了特定用途，這兩種產(chǎn)品通常進(jìn)一步精制。精制油產(chǎn)品可以分解為甘油、脂肪酸和留醇。它們可以用于食品、飼料或工業(yè)用途?？墒秤玫氖称窇?yīng)用實(shí)例包括咖啡奶油、人造黃油、蛋黃醬、藥品、色拉調(diào)料、起酥油、焙烤食品和巧克力糖衣。大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品(例如粗粉)可以分為濃縮大豆粉和分離大豆粉，它們都有食品 /飼料和工業(yè)用途。大豆粉和粗磨粉常用于生產(chǎn)肉增量劑和類似物、寵物食品、焙烤食品配料和其他食品。由大豆粉和分離物制成的食品包括嬰兒食品、糖果、谷物、食品飲料、面條、 酵母、啤酒、麥芽酒等。大豆粗粉尤其常用作家畜(主要是豬和家禽)飼料中的蛋白質(zhì)的來源。飼料應(yīng)用因此包括但不限于水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料、蜜蜂飼料、牛飼料代用品、魚飼料、家畜飼料、家禽飼料和寵物飼料等。完整的大豆產(chǎn)品也可以用作食品或飼料。常見的食品應(yīng)用包括諸如種子、豆芽、烤豆、在各種焙烤食品中使用的全脂豆粉、用作糖果點(diǎn)心的烤大豆、黃豆仁醬、豆奶咖啡和東方食品的其他大豆衍生物等產(chǎn)品。對于飼料用途，常從大豆上除下外殼，并用作飼料。大豆另外還具有許多工業(yè)用途。大豆的一種常見的工業(yè)用途是制備可用于生產(chǎn)復(fù)合材料的粘合劑。例如，木復(fù)合材料可以使用改性的大豆蛋白質(zhì)、水解大豆蛋白質(zhì)與PF樹脂的混合物、含有粉狀樹脂的大豆粉和含有泡沫膠的大豆蛋白質(zhì)來生產(chǎn)。70多年來，基于大豆的粘合劑已經(jīng)用于生產(chǎn)普通木制品諸如膠合板。盡管引入尿素-甲醛和苯酚-甲醛樹脂減少了在木制品中使用基于大豆的粘合劑，但是對環(huán)境的關(guān)注和消費(fèi)者對由可再生原料制成的粘合劑的偏愛重新引起了開發(fā)新的基于大豆的產(chǎn)品用于木材復(fù)合材料工業(yè)的興趣。粘合劑的制備代表大豆的另一個(gè)常見的工業(yè)用途。大豆粘合劑的例子包括大豆水解物粘合劑和大豆粉粘合劑。大豆水解物是一種通過在熱(120°C )和壓力(30psig)下在 5%氫氧化鈉溶液中反應(yīng)大豆蛋白質(zhì)分離物制成的無色水溶液。產(chǎn)生的降解的大豆蛋白質(zhì)溶液在室溫下是堿性的(PH 11)和可流動(dòng)的(大約500cps)。大豆粉是由大豆制成的磨細(xì)的脫脂粗粉。各種粘合劑制劑可以由大豆粉制成，第一步通常需要將大豆粉溶解在氫氧化鈉溶液中。產(chǎn)生的制劑的強(qiáng)度和其他性質(zhì)將隨制劑中的添加劑而變化。大豆粉粘合劑也可以與其他可商購的樹脂潛在地混合。大豆油可以用于許多工業(yè)應(yīng)用中。大豆油是最容易獲得的，并且是世界上成本最低的植物油之一。大豆油常見的工業(yè)用途包括用作抗靜電劑、嵌縫化合物、消毒劑、殺真菌劑、墨水、涂料、保護(hù)性涂層、壁板、消沫劑、醇、人造黃油、涂料、墨水、橡膠、起酥油、化妝品等的成分。大豆油多年來也已作為醇酸樹脂的主要成分，它們?nèi)芙庠谳d體溶劑中，形成油基涂料。在熱和壓力下將植物油轉(zhuǎn)化為醇酸樹脂的基礎(chǔ)化學(xué)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。大豆油在其購買到的未精制或精制的食用級狀態(tài)時(shí)，是相當(dāng)穩(wěn)定的和干燥緩慢的油。大豆油也可以進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)它在環(huán)境條件下的反應(yīng)性，或者利用各種形式的能量的輸入，使油共聚合或固化為干膜。一些這樣的修飾形式包括環(huán)氧化、醇解或酯基轉(zhuǎn)移、直接酯化、復(fù)分解、異構(gòu)化、單體修飾和各種形式的聚合作用，包括熱稠化。具有雙鍵的大豆油的反應(yīng)性亞油酸成分可能比主要的油酸和亞油酸成分在許多工業(yè)應(yīng)用中更有用。也可以使用基于大豆的成分制備溶劑。例如，大豆油甲酯(methyl soyate)，一種基于大豆油的甲酯，作為用于諸如部件清洗和脫脂、涂料和墨水清除、溢油補(bǔ)救等應(yīng)用中的出色的溶劑替代品，逐漸得到市場的接受。它也銷售用于許多配制消費(fèi)產(chǎn)品中，包括洗手劑、汽車蠟和污跡清除劑。大豆油甲酯通過用甲醇對大豆油進(jìn)行酯基轉(zhuǎn)移作用來產(chǎn)生?？梢詮脑S多生產(chǎn)商和供應(yīng)商處獲得。作為溶劑，大豆油甲酯具有重要的環(huán)境和安全性相關(guān)的
29性質(zhì)，使其在工業(yè)應(yīng)用上具有吸引力。其毒性低于其他大多數(shù)溶劑，易于生物降解，并且具有極高的閃點(diǎn)和低水平的揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOC)。大豆油甲酯與金屬、塑料、大部分彈性體和其他有機(jī)溶劑的兼容性是出色的。大豆油甲酯目前的用途包括清潔劑、油漆剝離劑、溢油清除劑和生物修復(fù)劑、殺蟲劑輔劑、防蝕劑和生物柴油燃料添加劑。VI.試劑盒本文所述的任何組合物可以包括在試劑盒中。在非限制性的例子中，用于檢測本文所述的多態(tài)性的組合物和/或附加劑可以包括在試劑盒中。試劑盒可能因此在適當(dāng)?shù)娜萜鞴ぞ咧邪ū景l(fā)明的用于檢測多態(tài)性的探針或底物和/或附加劑。在具體實(shí)施方式
中， 該試劑盒將允許檢測至少一個(gè)與提高的α ’ -亞基的水平相關(guān)的等位基因，例如，通過檢測這些等位基因的多態(tài)性和/或與等位基因連鎖不平衡的其他方面。試劑盒可以包括本發(fā)明的適當(dāng)分裝的試劑組合物，它們可以是標(biāo)記或非標(biāo)記的、 用于檢測這種等位基因的需要的分析格式。試劑盒的組分可以以水介質(zhì)或凍干形式包裝。 試劑盒的容器工具一般包括至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器工具，組分可以放置且優(yōu)選適當(dāng)?shù)胤盅b在其中。當(dāng)試劑盒中存在一種以上的組分時(shí)，該試劑盒一般還包含第二、第三或其他額外的容器，其他組分可以單獨(dú)放置在其中。然而，組分的各種組合可以包含在小瓶中。本發(fā)明的試劑盒還通常包括用于包含檢測組合物的工具和密閉用于商業(yè)銷售的任何其他試劑容器。這些容器可能包括注射成型容器或吹塑容器，所需的小瓶容器被保留在其中。當(dāng)試劑盒的組分以一種和/或多種液體溶液提供時(shí)，液體溶液可能是水溶液，特別優(yōu)選用無菌水溶液。但是，該試劑盒的組分可以提供為干粉。當(dāng)試劑和/或組分以干粉提供時(shí)，這些粉末可以通過加入合適的溶劑來重構(gòu)?？梢灶A(yù)見，也可以在另一個(gè)容器工具中提供溶劑。該容器工具一般包括至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器和/或其他容器工具， 檢測無效等位基因的組分可以放置且優(yōu)選適當(dāng)?shù)胤盅b在其中。試劑盒還包括用于包含無菌緩沖液和/或其他稀釋劑的第二容器工具。本發(fā)明的試劑盒通常還包括包含密閉用于商業(yè)銷售的小瓶的工具，例如，注射成型容器和/或吹塑容器，所需的小瓶容器被保留在其中。不論容器的數(shù)量和/或類型，本發(fā)明的試劑盒還可以包括用于幫助檢測組合物應(yīng)用的儀器，和/或用其包裝。VII.定義在說明書和下面的表格中，使用了大量術(shù)語。為了提供對說明書和權(quán)利要求書的清楚和一致的理解，給出了以下定義α -亞基本文使用時(shí)是指β -伴大豆球蛋白α -亞基。α ’ -亞基本文使用時(shí)是指β -伴大豆球蛋白α ’ -亞基。β -亞基本文使用時(shí)是指β -伴大豆球蛋白β -亞基。一種當(dāng)在權(quán)利要求書中與“包括”或其他開放性詞語一起使用時(shí)，“一種”表示“一種或多種”。農(nóng)藝學(xué)優(yōu)良的本文使用時(shí)是指一種基因型，其具有許多可識(shí)別的性狀的最大值(culmination)，諸如種子產(chǎn)量、發(fā)芽、活力、生長活力、抗病性、結(jié)籽、可直立性和脫粒性 (threshability)，它們允許生產(chǎn)者收獲具有商業(yè)意義的產(chǎn)品。等位基因基因座的一種或多種替代形式中的任一種，所有等位基因都與性狀或特征相關(guān)。在二倍體細(xì)胞或生物體中，給定基因的兩個(gè)等位基因占據(jù)一對同源染色體上相應(yīng)的基因座?；亟挥N者將雜種后代例如第一代雜種(F1)與雜種后代的親本之一反復(fù)雜交的過程?；亟豢梢杂脕韺碜砸粋€(gè)遺傳背景的一種或多種單基因座轉(zhuǎn)換引入到另一個(gè)遺傳背景中。共有序列構(gòu)建的DNA序列，其鑒定基因座處等位基因的SNP和Indel多態(tài)性。共有序列可以基于基因座處DNA的任一鏈，并且表示該基因座中各SNP的任一個(gè)的核苷酸堿基及該基因座中的所有^del的核苷酸堿基。因此，雖然共有序列可能不是一個(gè)實(shí)際的DNA 序列的拷貝，但共有序列可用于精確設(shè)計(jì)用于基因座中的實(shí)際多態(tài)性的引物和探針。具有商業(yè)意義的產(chǎn)量對于種植者而言具有商業(yè)意義的谷物的產(chǎn)量，其由在相同條件下生長的對照系A(chǔ)G2703和DKB23-51的至少95%的實(shí)際谷物產(chǎn)量表示。雜交兩個(gè)親本植物的雜交。異花授粉通過來自不同植物的兩個(gè)配子的融合的受精。下調(diào)性突變對于本申請，下調(diào)性突變定義為降低從給定基因表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的突變。因此下調(diào)性突變包括無效突變。F1雜種兩個(gè)非等基因植物雜交的第一代后代?；蛐图?xì)胞或生物體的遺傳組成，或在生物體中存在的指定基因座中的特定的等位基因?；蚍中蛣澏ㄉ矬w中的指定基因座中的等位基因的類型。這通常是通過對從生物體中提取的DNA樣品進(jìn)行標(biāo)記分析來實(shí)現(xiàn)的。大豆球蛋白無效突變大豆植物，其具有賦予降低的大豆球蛋白含量和提高的 β-伴大豆球蛋白含量的突變。具有提高的伴大豆球蛋白含量的植物可以具有Gyl、 Gy2、Gy3和/或Gy4的非轉(zhuǎn)基因無效等位基因。鄰近描述與包含多態(tài)性的DNA雜交的核酸分子，指的是與直接鄰接該多態(tài)性核苷酸堿基位置的DNA序列雜交的核酸。例如，可在單堿基延伸分析中使用的核酸分子“鄰近”該多態(tài)性。INDEL 核苷酸序列插入或缺失引起的基因突變。工業(yè)應(yīng)用大豆植物的非食品和非飼料應(yīng)用。術(shù)語“大豆植物”包括大豆植物的植物部分和衍生物。探詢位置固體載體上的物理位置，可以對其進(jìn)行查詢以獲得一種或多種預(yù)定的基因組多態(tài)性的基因分型數(shù)據(jù)。單元型由至少一種多態(tài)性分子標(biāo)記限定的單元型窗口內(nèi)的染色體區(qū)域。每個(gè)單元型窗口中的獨(dú)特的標(biāo)記指紋組合限定了該窗口的各個(gè)單元型。此外，例如重組導(dǎo)致的單元型的變化可能導(dǎo)致單元型的修飾，使其只包含與性狀可操作地連鎖的初始(親本)單元型的一部分，例如，通過與基因、QTL或轉(zhuǎn)基因物理連鎖。單元型中的任何這樣的變化都包括在我們對于構(gòu)成單元型的內(nèi)容的定義中，只要該基因組區(qū)域的功能完整性不變或改善。單元型窗口 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的統(tǒng)計(jì)分析建立的，且處于連鎖不平衡的染色體區(qū)域。因此，將位于該區(qū)域內(nèi)的一種或多種分子標(biāo)記基因座處的兩個(gè)近交個(gè)體 (或兩個(gè)配子)之間的狀態(tài)同一性(identity by state)作為整個(gè)區(qū)域的譜系同一性(identity-by-descent)的證據(jù)。每個(gè)單元型窗口包含至少一個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)記。單元型窗口可以沿基因組中的每個(gè)染色體作圖。單元型窗口本身不是固定不變的，且考慮到逐漸提高的分子標(biāo)記密度，本發(fā)明預(yù)計(jì)單元型窗口的數(shù)目和大小將會(huì)發(fā)展，窗口數(shù)目逐漸提高， 其各自的大小逐漸減小，從而導(dǎo)致在根據(jù)標(biāo)記基因座的狀態(tài)同一性確定譜系同一性方面的置信度逐漸提高。連鎖一種現(xiàn)象，其中同一染色體上的等位基因傾向于比偶然預(yù)期的更經(jīng)常地一起分離，如果它們的傳播是獨(dú)立的話。標(biāo)記容易檢測的表型，其優(yōu)選地以共顯性的方式遺傳(二倍體雜合子中一個(gè)基因座處的兩個(gè)等位基因均可容易地檢測到)，沒有環(huán)境變化成分，即遺傳性為1。此外，“標(biāo)記”是指多態(tài)性核酸序列或核酸特征?！岸鄳B(tài)性”是個(gè)體之間的序列、特別是在DNA序列或特征(諸如轉(zhuǎn)錄譜或甲基化模式)的變異。有用的多態(tài)性包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、DNA 序列的插入或缺失anDel)、DNA序列的簡單重復(fù)序列(SSR)、限制性片段長度多態(tài)性、單倍型和標(biāo)記物SNP。遺傳標(biāo)記、基因、DNA衍生的序列、RNA衍生的序列、啟動(dòng)子、基因的5’非翻譯區(qū)域、基因的3’非翻譯區(qū)域、微1 織、811 織、011、衛(wèi)星標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因、1111 織、(18 mRNA、轉(zhuǎn)錄譜和甲基化模式可以包括多態(tài)性。在更廣泛的方面，“標(biāo)記”可以是可檢測的特征，可以用于區(qū)別生物之間的可遺傳的差別。這樣的特征的例子可以包括遺傳標(biāo)記、蛋白質(zhì)組成、蛋白質(zhì)水平、油組成、油水平、碳水化合物組成、碳水化合物水平、脂肪酸組成、脂肪酸水平、氨基酸組成、氨基酸水平、生物聚合物、藥品、淀粉組成、淀粉水平、可發(fā)酵的淀粉、發(fā)酵產(chǎn)量、發(fā)酵效率、能量產(chǎn)量、次生化合物、代謝物、形態(tài)特征和農(nóng)藝學(xué)特征。標(biāo)記分析使用特定方法檢測特定基因座處的多態(tài)性的方法，例如，至少一種表型的測定(諸如種子顏色、花的顏色或其他視覺可檢測的性狀)、限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)、單堿基延伸、電泳、序列比對、等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)、基于微陣列的技術(shù)和核酸測序技術(shù)、單核苷酸多態(tài)性等。非轉(zhuǎn)基因突變天然發(fā)生的或通過常規(guī)方法(例如將植物暴露于輻射或誘變化合物)誘導(dǎo)的突變，不包括使用重組DNA技術(shù)獲得的突變。無效表型本文使用的無效表型是指給定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平無法檢測到。對于Gy 亞基，表達(dá)水平通過SDS-PAGE和考馬斯染色來確定。表型細(xì)胞或生物體的可檢測的特征，該特征是基因表達(dá)的表現(xiàn)。多態(tài)性在一種或多種個(gè)體的群體中，在一個(gè)或多個(gè)基因座處存在核酸序列的一種或多種變異。該變異可以包括但不限于一種或多種堿基的變化、一種或多種核苷酸的插入或一種或多種核苷酸的缺失。多態(tài)性包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、簡單序列重復(fù)(SSR)及插入和缺失indels。多態(tài)性的產(chǎn)生可能是由于核酸復(fù)制中的隨機(jī)過程，通過誘變，由于移動(dòng)的基因組元件，拷貝數(shù)變異，和在減數(shù)分裂過程中，諸如不等交換、基因組復(fù)制和染色體斷裂和融合。在群體中，變異可能常被發(fā)現(xiàn)或可能以低頻率存在，前者在普通植物育種中具有更大的應(yīng)用，而后者則可能與罕見但重要的表型變異有關(guān)。數(shù)量性狀基因座(QTL)數(shù)量性狀基因座(QTL)是指以一定程度控制通常連續(xù)分布的可用數(shù)字表示的性狀的遺傳基因座。SNP 是指當(dāng)比較兩個(gè)同源序列時(shí)的單核苷酸多態(tài)性或單核苷酸突變。大豆是指大豆(Glycine max)，且包括可用于大豆培育的所有植物品種，包括野生大豆種。嚴(yán)格條件是指5X SSC、50%甲酰胺和42°C的核酸雜交條件。基本等同一種特征，當(dāng)進(jìn)行比較時(shí)，與平均值不顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(例如，P =0. 05)。組織培養(yǎng)物包含相同或不同類型的分離細(xì)胞的組合物或組成植物部分的這些細(xì)胞的集合。轉(zhuǎn)基因包含已通過轉(zhuǎn)化引入大豆植物基因組中的序列的遺傳基因座。分型是指確定給定的大豆基因組多態(tài)性的特定等位基因形式的任何方法。例如， 通過確定存在哪種核苷酸(即，A、G、T或C)，對單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行分型。通過確定是否存在hdel來確定插入/缺失andel)。通過包括但不僅限于標(biāo)記分析的多種分析方法可以對hdel進(jìn)行分型。營養(yǎng)品對人類健康具有醫(yī)療效果的食品。IX.實(shí)施例包括以下實(shí)施例是為了證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 下面的實(shí)施例中公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)施中作用良好的技術(shù)，因此可以認(rèn)為構(gòu)成實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選模式。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對公開的特定實(shí)施方式進(jìn)行許多改變，而仍然獲得同樣的或相似的結(jié)果。實(shí)施例1與提高的α，-亞基表型相關(guān)的基因組區(qū)域β-伴大豆球蛋白三聚體中a，、α和β亞基的相對百分比分別為約35 %、45 % 和20% (Maruyama等人，1999)。在大多數(shù)種子中a α，比大約為1.觀。針對提高的 α ’-亞基含量選擇品種。蛋白質(zhì)分析如下進(jìn)行集中來自一個(gè)品種的大豆種子，并使用CAT Mega-研磨器(SOP Asci-01-0002)研磨。將磨碎的樣品貯存在4°C下。為了分析，每種稱取 30mg粉置入96孔2ml微孔板的一個(gè)孔中。在振搖下，在含有作為還原劑的0. IM 二硫蘇糖醇(DTT)的l.Oml IX Laemmli SDS緩沖液pH 6. 8中提取蛋白質(zhì)1小時(shí)。離心后，每個(gè)提取物的一部分在SDS緩沖液中進(jìn)一步稀釋，以產(chǎn)生0. 2-0. 5 μ g/μ L總蛋白質(zhì)，加熱至 90-100°C持續(xù)10分鐘，并冷卻。對于每個(gè)樣品，使用12通道移液器將1-2 μ g總蛋白質(zhì)加至沈泳道15% T梯度Tris/HCl Criterion凝膠上。分子量標(biāo)準(zhǔn)和親本對照包括在每個(gè)凝膠的兩個(gè)泳道中。對凝膠進(jìn)行電泳，直到示蹤染料到達(dá)凝膠底部大約1. 2小時(shí)，然后在膠態(tài)考馬斯藍(lán)G-250中染色過夜，在去離子水中脫色，并且使用GS800校準(zhǔn)的光密度計(jì)成像。 使用Bio-Rad Quantity One 軟件進(jìn)行定量。利用該軟件確定樣品泳道中每條帶的相對量。酸性大豆球蛋白的百分比和伴大豆球蛋白亞基帶的百分比報(bào)告為泳道中總蛋白質(zhì)的相對百分比。樣品身份和重量使用Master LIMS 示蹤。大部分品種的α ’并沒有提高(見表1)。此外，大多數(shù)品種中α α ’比的平均值大約為1.觀。鑒別出具有獨(dú)特種子組成，即其中α α’比小于1的品種，并且選出用于分析。此外，選擇具有正常α，水平的品種用于比較評估。表1 大豆球蛋白、β -伴大豆球蛋白和β -伴大豆球蛋白亞基的表型水平的蛋白質(zhì)分析
權(quán)利要求
1.一種包含α α，亞基比例為大約0. 1至大約1的β -伴大豆球蛋白三聚體組成的大豆種子，其中所述種子是由包括以下步驟的方法產(chǎn)生Α)根據(jù)LGI上的遺傳基因座，對多種大豆植物進(jìn)行基因分型；B)選擇在所述遺傳基因座中具有理想的基因型的大豆植物，所述基因型調(diào)節(jié)種子蛋白質(zhì)表型，該表型中β-伴大豆球蛋白三聚體中的α α ’亞基比例為大約0.1至大約1;和C)種植所述選擇的植物以產(chǎn)生種子，其中，至少一種產(chǎn)生的種子具有伴大豆球蛋白三聚體中的α α，亞基比例為大約0. 1至大約1的種子蛋白質(zhì)表型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆種子，其中，所述理想的基因型選自大豆品種！^對討切、 Ina,PI88788和具有理想的基因型的這些品種的后代的基因型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆種子，其中，當(dāng)使用一種或多種表2列出的標(biāo)記來確定所述理想的基因型時(shí)，所述理想的基因型選自表2提供的大豆品種MV0061、MV0064和MVOlll 的基因型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆種子，其中，使用SDS-PAGE確定所述α α ’亞基比例。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆種子，其中，所述α α ’亞基比例為大約0. 2至大約0. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆種子，其中，所述α α ’亞基比例為大約0. 4至大約0. 6。
7.—種產(chǎn)生大豆植物的方法，所述大豆植物能夠產(chǎn)生包含α α’亞基比例為大約 0. 1至大約1的β-伴大豆球蛋白三聚體組成的種子，該方法包括以下步驟Α)雜交至少一種在伴大豆球蛋白三聚體中具有降低的α-亞基所導(dǎo)致的提高的 α，亞基水平的植物與至少一種具有正常的α ’ -亞基水平的植物，以形成分離群體；B)根據(jù)LGI上的遺傳基因座，對至少一種來自所述分離群體的植物進(jìn)行基因分型；和C)選擇在所述遺傳基因座中具有理想的基因型的大豆植物，所述基因型調(diào)節(jié)種子蛋白質(zhì)表型，該表型中β-伴大豆球蛋白三聚體中的α α’亞基比例為大約0.1至大約1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述理想的基因型選自大豆品種i^yette、Ina, PI88788和具有理想的基因型的這些品種的后代的基因型。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，當(dāng)使用一種或多種表2列出的標(biāo)記來確定所述理想的基因型時(shí)，所述理想的基因型選自表2提供的大豆品種MV0061、MV0064和MVOlll的基因型。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，使用SDS-PAGE確定所述α α ’亞基比例。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述α α ’亞基比例為大約0.2至大約0.8。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述α α ’亞基比例為大約0.4至大約0.6。
13.—種選擇大豆植物的方法，所述大豆植物能夠產(chǎn)生包含α α’亞基比例為大約 0. 1至大約1的β -伴大豆球蛋白三聚體組成的種子，該方法包括以下步驟Α)根據(jù)LGI上的遺傳基因座，對多種大豆植物進(jìn)行基因分型；和 B)選擇在所述遺傳基因座中具有理想的基因型的大豆植物，所述基因型調(diào)節(jié)種子蛋白質(zhì)表型，該表型中β-伴大豆球蛋白三聚體中的α α’亞基比例為大約0.1至大約1。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟使選擇的大豆植物產(chǎn)生種子和對所產(chǎn)生的種子篩選β-伴大豆球蛋白三聚體亞基組成。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟從所述產(chǎn)生的種子選擇具有 α α，亞基比例為大約0. 1至大約1的β -伴大豆球蛋白三聚體組成的種子。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述α α ’亞基比例為大約0.2至大約0. 8。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述α α ’亞基比例為大約0.4至大約0. 6。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述理想的基因型選自大豆品種i^yette、 Ina,PI88788和具有理想的基因型的這些品種的后代的基因型。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，當(dāng)使用一種或多種表2列出的標(biāo)記來確定所述理想的基因型時(shí)，所述理想的基因型選自表2提供的大豆品種MV0061、MV0064和MVOlll 的基因型。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于培育包含與種子中提高的β-伴大豆球蛋白α’-亞基含量有關(guān)的基因組區(qū)域的大豆植物的方法。另外，本發(fā)明提供了包含賦予提高的β-伴大豆球蛋白α’-亞基含量的基因組區(qū)域的種質(zhì)和該種質(zhì)在育種計(jì)劃中基因滲入優(yōu)良種質(zhì)的用途。本發(fā)明還提供了這些植物的衍生物和植物部分及其用途。
文檔編號(hào)C07K14/00GK102165066SQ200980137594
公開日2011年8月24日 申請日期2009年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月4日
發(fā)明者J·詹金森 申請人:孟山都技術(shù)公司