專利名稱：甲型副傷寒沙門氏菌NmpC亞單位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及甲型副傷寒沙門氏菌亞單位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
傷寒是一種急性傳染病，包括傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhi)引起的傷寒和甲、乙、丙型副傷寒沙門氏菌(Salmonellaparatyphi A, Band C)引起的副傷寒(C 2005)。 患者常見的癥狀有頭痛、厭食、腹痛、便秘或腹瀉、干咳、表情淡漠、嗜酸性粒細(xì)胞減少或消失，還可能出現(xiàn)咽喉痛、鼻出血、有舌苔等癥狀。沒有獲得及時治療的患者會出現(xiàn)中毒現(xiàn)象， 還可能發(fā)展到回腸穿孔、腸胃出血、昏迷、昏厥、肺炎、腎炎等。由于甲型副傷寒沙門氏菌臨床耐藥株以及多重耐藥株廣泛存在，致使甲型副傷寒暴發(fā)流行。因此，甲型副傷寒越來越成為包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家危害人民群眾健康的嚴(yán)重傳染病之一。近年來傷寒Vi多糖疫苗取代了傳統(tǒng)的傷寒三聯(lián)疫苗。但是因為甲型副傷寒沙門氏菌是無莢膜的革蘭氏陰性菌，所以不能預(yù)防該菌引起的副傷寒。甲型副傷寒滅活疫苗由于副反應(yīng)太大已停止使用，而尚無新的有效疫苗預(yù)防副傷寒。人群缺乏免疫力，普遍易感， 防治形勢十分嚴(yán)峻。為了快速、有效、經(jīng)濟(jì)地預(yù)防和控制副傷寒的大面積流行，研究有效的甲型副傷寒疫苗已成為控制疫情的當(dāng)務(wù)之急。甲型副傷寒沙門氏菌，其外膜蛋白在致病和刺激機(jī)體免疫應(yīng)答方面起著非常重要的作用。因此，在研究和開發(fā)疫苗中，病原體的表面蛋白成為熱點，其中NmpC蛋白引起了人們的關(guān)注。NmpC是細(xì)菌的孔道蛋白的一種，屬于GBP(General Bacterial Porin)家族的一員。nmpC基因在大腸桿菌K-12中是一個沉默基因。當(dāng)使用突變技術(shù)激活nmpC基因后，發(fā)現(xiàn)該孔道蛋白是與肽聚糖緊密相連的，表達(dá)NmpC蛋白能夠引起細(xì)菌對一些噬菌體和大腸菌素的敏感度增加。同時，傷寒沙門氏菌孔道蛋白也具有良好的免疫原性，它能夠刺激小鼠產(chǎn)生具有殺菌活性的抗孔道蛋白抗體。然而已知的NmpC種類較少，到目前為止，還沒有將 NmpC蛋白用于制備甲型副傷寒沙門氏菌疫苗的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種新的甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白NmpC ；本發(fā)明的第二個目的在于提供該蛋白在制備甲型副傷寒沙門氏菌亞單位疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種甲型副傷寒沙門氏菌亞單位疫苗及其制備方法。本發(fā)明甲型副傷寒沙門菌外膜蛋白NmpC的氨基酸序列如SEQID No. 2所示，實驗表明，該蛋白具有良好的免疫保護(hù)性，可以用于制備預(yù)防或治療甲型副傷寒的藥物，尤其是疫苗。此外，由于NmpC具有免疫中和活性，還可以通過制備NmpC的特異性抗體來制備抗體藥物。本發(fā)明還提供用于編碼NmpC的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示?？紤]到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響蛋白表達(dá)的條件下，對編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行修改。因此，本發(fā)明還包含對編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個或多個核苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發(fā)明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供制備達(dá)甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白NmpC的方法，包括將編碼 NmpC的基因克隆至表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得重組的目的蛋白。所述的表達(dá)載體選自質(zhì)粒pET30a及其適用于大腸桿菌系統(tǒng)的所有pET系列表達(dá)載體。所述的大腸桿菌表達(dá)菌株選自E. coli BL21(DE3)、E. coli BL21 (DE3)pLys、 Origami 或 Rosetta。述的轉(zhuǎn)化用熱休克轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。將所述的NmpC基因克隆至質(zhì)粒pET30a，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，然后熱休克法轉(zhuǎn)化 E. coli BL21 (DE3)，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、破菌、離心、柱層析純化得到重組的NmpC重組蛋白。在分發(fā)明的一個實施方案中，采用如下方法制備得到外膜蛋白NmpC (I)NmpC目的基因的獲得以甲型副傷寒沙門氏菌50973菌株的基因組作為模板， 委托DNA合成公司合成引物NmpC-f和NmpC_r，用于擴(kuò)增NmpC蛋白基因，并引入Nde I和 Xho I酶切位點和6XHis標(biāo)簽；(2)重組表達(dá)菌NmpC-pET30a/BL21的構(gòu)建PCR得到的NmpC基因片段經(jīng)雙酶切后，與同樣經(jīng)過雙酶切的pET30a連接，連接產(chǎn)物通過熱休克法轉(zhuǎn)化用CaCl2制備的E. coli DH5a。鑒定重組正確后，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21(DE3)以用于誘導(dǎo)表達(dá)NmpC蛋白；(3) NmpC蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)挑取重組工程菌NmpC-pET30a/BL21單菌落接種到 Kan+-LB培養(yǎng)液中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后取適量樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，并用 anti-his作為一抗Western blot進(jìn)行鑒定；(4)重組工程菌NmpC-pET30a/BL21的大量培養(yǎng)在IL三角瓶中對重組工程菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。確定目的蛋白的表達(dá)形式，并計算目標(biāo)蛋白的表達(dá)率；(5) NmpC包涵體的制備采用超聲的方式破菌，經(jīng)離心的方法制得包涵體；(6) NmpC蛋白的純化和復(fù)性選擇GE公司的Ni親和預(yù)裝柱進(jìn)行純化。4°C下，采用梯度透析復(fù)性的方法對已純化好變性蛋白復(fù)性。此外，還進(jìn)一步進(jìn)行NmpC蛋白的動物免疫來確定NmpC的免疫效果，包括步驟 用NmpC蛋白聯(lián)合鋁佐劑免疫BALB/c小鼠，并采用野生型甲型副傷寒沙門氏菌攻毒小鼠， ELISA方法測血清總IgG抗體及統(tǒng)計候選疫苗的保護(hù)率，評價該疫苗的免疫效果。本發(fā)明還提供一種甲型副傷寒沙門氏菌亞單位疫苗，其包括甲型副傷寒沙門菌外膜蛋白NmpC以及疫苗佐劑，所述疫苗佐劑可以是鋁佐劑或弗氏佐劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果(1)針對甲型副傷寒沙門氏菌疫苗的臨床試驗中，國內(nèi)外基本上沒有單獨使用 NmpC蛋白的相關(guān)報道。本發(fā)明使用NmpC作為亞單位疫苗的主要組分，利用大腸桿菌系統(tǒng)獲得了高效表達(dá)。
(2)基因工程手段構(gòu)建的重組NmpC蛋白不含較大的融合標(biāo)簽，只含有一個6XHis 標(biāo)簽便于后期純化操作。此標(biāo)簽基本上不會影響NmpC蛋白本身的免疫原性。(3)在大腸桿菌中表達(dá)甲型副傷寒沙門氏菌的NmpC蛋白，可以提高蛋白疫苗的表達(dá)水平。由于大腸桿菌結(jié)構(gòu)簡單、生長快速、易于培養(yǎng)和發(fā)酵、生產(chǎn)成本低、目的蛋白產(chǎn)量高，這對于規(guī)?；a(chǎn)及其臨床應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義。


圖1是PCR獲得目的片段(M =DNA Marker DL2000 ； 1 陰性對照；2 =NmpC基因片段)圖 2 是重組質(zhì)粒 NmpC-pET30a 雙酶切鑒定(Μ :DNA Marker DL2000 ；1 NmpC-pET30a 的 Nde I 和 Xho I 雙酶切)；圖3是SDS-PAGE檢測重組NmpC的表達(dá)(M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 誘導(dǎo)后的pET30a/ BL21 ；2 誘導(dǎo)后的 NmpC-pET30a/BL21)；圖4是狗8{6111 blot檢測重組NmpC(M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 重組NmpC蛋白)；圖5是SDS-PAGE檢測NmpC蛋白的純化結(jié)果(M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 IOOmM咪唑洗脫峰)；圖6是鋁佐劑免疫后不同時間小鼠血清中NmpC蛋白特異性IgG變化曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合具體附圖，用本發(fā)明的實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但不以此來限制本發(fā)明。本發(fā)明中的實施例以E. coli BL21(DE!3)及其表達(dá)載體pET30a進(jìn)行表達(dá)甲型副傷寒沙門氏菌膜蛋白NmpC來說明。大腸桿菌表達(dá)菌株E. coli BL21 (DE3)、E. coli BL21 (DE3) pLys、Origami或Rosetta以及其他大腸桿菌系統(tǒng)的pET系列表達(dá)載體也同樣適用。在本實施例中，僅以鋁佐劑為例，來說明本發(fā)明重組蛋白的免疫過程，但并不局限于該佐劑，弗氏佐劑也在實施例的范圍之內(nèi)。實施例1 :甲型副傷寒沙門氏菌膜蛋白NmpC的制備1、甲型副傷寒沙門氏菌膜蛋白NmpC基因的獲得以甲型副傷寒沙門氏菌50973菌株(來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心)的基因組作為模板，委托DNA合成公司合成上下游引物NmpC-f :5’ -GGGAATTCCATATGGCCGAGGTATATAACAAAGACG-3’ ；NmpC-r :5’ -CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAACTGGTAGTTCAGACCA-3，。其中，NmpC-f、NmpC-r用于擴(kuò)增NmpC蛋白基因，并引入NdeI和Xho I酶切位點和 6 XHis標(biāo)簽。使用Taq plus酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增94°C IOmin預(yù)變性；30個循環(huán)(94°C 30s， 52°C 30s, 72°C lmin) ；72°C 7min。用1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。2、重組表達(dá)載體NmpC_pET30a的構(gòu)建NmpC基因純化后分別用Nde I和Bio I于37°C酶切3小時，回收純化片段，與純化的表達(dá)載體pET30a雙酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物通過熱休克法轉(zhuǎn)化用CaCl2制備的E. coli DH5ci，涂布Kan+-LB平板，37°C培養(yǎng)16小時，挑取數(shù)個單菌落接種Kan+-LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)12小時，堿裂解法抽提質(zhì)粒，Nde I和)(h0 I雙酶切質(zhì)粒鑒定含有預(yù)期大小的NmpC基因，并且通過專業(yè)DNA測序公司測序結(jié)果序列正確。構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒采用上述方法再次轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)用于誘導(dǎo)表達(dá)NmpC蛋白。3、NmpC蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分別挑取重組工程菌NmpC-pET30a/BL21單菌落接種到Kan+-LB培養(yǎng)液中，37 °C 震蕩培養(yǎng)過夜，第二天按分別接種到新鮮Kan+-LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D_約為0.8時，分別加入0.5mmol IPTG在37°C誘導(dǎo)表達(dá)4小時。誘導(dǎo)結(jié)束后取適量樣品進(jìn)行 SDS-PAGE檢測，并用anti-his作為一抗Wfestern blot鑒定。結(jié)果表明NmpC蛋白的表觀分子量是39. 3KDa,與理論計算值基本一致。4、重組工程菌NmpC_pET30a/BL21大量培養(yǎng)控制菌液0D600值約為0. 8時，加入lmmol/L IPTG，溫度37°C，培養(yǎng)4小時。目標(biāo)蛋白的表達(dá)率超過全菌蛋白的40 %，以包涵體表達(dá)形式。5、NmpC包涵體的制備誘導(dǎo)后的菌液6000rpm離心lOmin，菌沉淀以iTris緩沖液(0. 02mol/L Tris-Cl) 重懸，冰水浴超聲破菌(破菌功率100W，工作5s，暫停10s，100次)。超聲后液體經(jīng)12000g 離心后，所得12000g離心沉淀即為NmpC包涵體。6、NmpC蛋白的純化和復(fù)性選擇GE公司的Ni親和預(yù)裝柱對包涵體進(jìn)行純化。包涵體用變性液(0. 02mol/L Tris-C1，8M 尿素，0. 02mol/L 咪唑，pH8. 0)變性，然后用洗滌緩沖液(0. 02mol/L Tris-Cl, 8M尿素，0. 02mol/L咪唑，pH8. 0)洗滌雜蛋白，最后再使用洗脫緩沖液(0. 02mol/L Tris-Cl，8M尿素，0. lmol/L咪唑，ρΗ8· 0)洗脫目的蛋白，SDS-PAGE檢測，純化蛋白純度超過90% ；純化后的蛋白采用梯度透析的方法進(jìn)行復(fù)性，4°C下，分別在不同濃度的尿素透析液(0. 02mol/L Tris-C1，8M-6M-4M-2M-0M尿素，pH8. 0)中靜置透析，每個梯度保持12h，最后再透到緩沖液(0. 02mol/L Tris-Cl, pH8. 0)中。實施例2 =NmpC蛋白的動物免疫實驗1、動物免疫BALB/c小鼠分成3組，每組20只，其中10只采血，10只攻毒。采用肌肉注射的方式，分別在0，2，4周進(jìn)行免疫。A組為健康小鼠；B組使用鋁佐劑；C組使用NmpC蛋白+鋁佐劑。免疫劑量為每只小鼠O.aiil，含有抗原IOyg鋁佐劑O.aiig。在每次免疫后10天，進(jìn)行血清采集。第一，二次采用眼角靜脈叢采血，第三次采用摘眼球采血。使用ELISA方法測血清總IgG抗體，并用SPSS軟件分析各組數(shù)據(jù)的組間差異性。結(jié)果表明小鼠抗NmpC蛋白的IgG抗體效價很高。2、攻毒保護(hù)實驗將同批次飼養(yǎng)注射了鋁佐劑的BALB/c小鼠40只分為4組，每組10只。用生理鹽水將培養(yǎng)好的甲型副傷寒沙門氏菌50973洗下，混勻后，比濁確定菌濃度。而后用濃度分別為60，30，15，7. 5億/ml四個濃度的菌液攻毒，每只小鼠0. 5ml，腹腔注射。三天后記錄小鼠的死亡情況，確定最小絕對致死量。表1病原菌在Balb/C小鼠感染模型中最小絕對致死量的確定組別菌濃度(億/ml) 觀察天數(shù)總數(shù)死亡數(shù)死亡率
權(quán)利要求
1.一種甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白NmpC，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述外膜蛋白NmpC的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.權(quán)利要求1所述外膜蛋白NmpC在制備預(yù)防或治療甲型副傷寒疫苗中的應(yīng)用。
5.甲型副傷寒沙門氏菌NmpC亞單位疫苗，其包括有效劑量的權(quán)利要求1所述的外膜蛋白NmpC以及疫苗佐劑。
6.如權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗佐劑為鋁佐劑或費氏佐劑。
7.一種制備權(quán)利要求1所述外膜蛋白NmpC的方法，其包括步驟將權(quán)利要求2所述的基因克隆至表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得重組的目的蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)、 E. coli BL21 (DE3)pLys、Origami或Rosetta，所述表達(dá)載體為適用于在所述宿主菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)載體。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于包括如下步驟將所述的NmpC基因克隆至質(zhì)粒pET30a，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，然后熱休克法轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、破菌、離心、柱層析純化得到重組的NmpC重組蛋白。
10.一種制備權(quán)利要求5所述疫苗的方法，其包括將采用權(quán)利要求7 9所述的方法制備外膜蛋白NmpC，并將其與適量免疫佐劑混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲型副傷寒沙門氏菌亞單位疫苗NmpC及其制備方法。該疫苗包括有效劑量的甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白NmpC以及疫苗佐劑。所述外膜蛋白NmpC的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述制備方法是通過體外表達(dá)獲得外膜蛋白NmpC，再與疫苗佐劑混合獲得。本發(fā)明生產(chǎn)成本低、目的蛋白產(chǎn)量高，這對于規(guī)?；a(chǎn)NmpC亞單位疫苗及其預(yù)防甲型副傷寒沙門氏菌感染具有重要意義。
文檔編號C07K14/255GK102206258SQ20111007888
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者曾明, 梁昊宇, 王恒樑, 王斌, 計國欣 申請人:中國食品藥品檢定研究院