專利名稱：柱層析法從組分i中提取人纖維蛋白原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別是一種柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法。
背景技術(shù)：
人纖維蛋白原(Human Fibrinogen)即人凝血因子I，是血漿蛋白的主要成份之一，分子量約為34萬，等電點(diǎn)5. 5，加溫至57°C很快變性。它在血漿中的含量高，約為2-4g/ L，是血漿粘滯性的主要決定因素，肝臟是合成纖原的主要場(chǎng)所。人纖維蛋白原(Fg)能迅速提高血液中纖維蛋白原的含量，通過凝血酶的作用，使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶的纖維蛋白，網(wǎng)絡(luò)血液中血球等有形成分凝成血塊，達(dá)到止血的目的。用于治療產(chǎn)后大出血和因大手術(shù)、外傷或內(nèi)出血等引起的纖維蛋白原缺乏而造成的凝血障礙，以及胸廓、腹部和尿路等大型外科手術(shù)的出血等，對(duì)治療血友病的合并癥也有效。由于血漿中纖維蛋白原含量十分豐富，并且纖維蛋白原分子量很大，所以纖維蛋白原較易從血漿中分離提純，而且該產(chǎn)品臨床需求量也較大，因此分離純化人纖維蛋白原， 不僅提高寶貴血漿資源的綜合利用，同時(shí)在醫(yī)藥衛(wèi)生方面也有較大意義。人纖維蛋白原是已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的的血液制品，收錄在2010年版《中國(guó)藥典》三部中，該藥在國(guó)內(nèi)已經(jīng)臨床使用多年，其生產(chǎn)工藝已比較成熟，近年也有專利申請(qǐng)?zhí)枮?200810046747. 5和專利申請(qǐng)?zhí)枮?00910237204. 6的人纖維蛋白原的生產(chǎn)方法，但目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)血液制品廠家基本上都采用低溫乙醇法以血漿為原料，從Cohn6法的組分I中提取人纖維蛋白原，該法主要缺陷為制品的純度較低，一般70 80%，外觀較差，質(zhì)量穩(wěn)定性差。也有報(bào)導(dǎo)從冷沉淀中提取人纖維蛋白原，由于冷沉淀中的纖維蛋白原的含量較低，產(chǎn)品最終收率沒有從FI高，并且冷沉淀是作為人凝血因子VIII的起始原料，如果用于生產(chǎn)人纖維蛋白原，勢(shì)必降低人凝血因子VIII的生產(chǎn)量，收率低。因此，人纖維蛋白原的制備方法亟待改進(jìn)和創(chuàng)新。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，可有效解決人纖維蛋白原純度高，穩(wěn)定性好，收率高的問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，由以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)組分I沉淀的溶解及過濾沉淀用5 15倍體積的第一溶解液，20_26°C攪拌溶解1小時(shí)，溶解后的制品澄清過濾，計(jì)量制品體積；(2) S/D滅活將制品溫度控制在M ，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入質(zhì)量濃度的11% S/D溶液，保持制品溫度M 6小時(shí)；(3)第一次甘氨酸沉淀計(jì)量步驟2中滅活液體積，按1. 5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至2 8°C，以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，設(shè)定溫度0°C，收集沉淀； (4) 一次沉淀的溶解及過濾沉淀用5 10倍體積的第二溶解液，在20_26°C攪拌溶解1小時(shí)，溶解后過濾，收集濾液；(5)柱層析DEAE_650M凝膠先用枸櫞酸緩沖液平衡，再將步驟中的濾液上柱進(jìn)行層析，收集流出液，層析結(jié)束后用3倍柱床體積的枸櫞酸緩沖液洗滌凝膠，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀層析流出液按1. 5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至2 8°C，用離心機(jī)以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，_5°C收集沉淀；(7) 二次沉淀的溶解及過濾沉淀用3 5倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時(shí)， 溶解后，過濾；(8)配制檢測(cè)過濾后制品蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白質(zhì)含量用第三溶解液進(jìn)行配制， 使最終制品中蛋白含量為25g/L ；(9)分裝及凍干配制后制品除菌分裝于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝后凍干；(10)干熱滅活步驟9中凍干后制品置于水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。該方法是采用柱層析技術(shù)并結(jié)合甘氨酸沉淀法從組分I(FI)中提取人纖維蛋白原，該生產(chǎn)工藝中采用的甘氨酸沉淀法比傳統(tǒng)的低溫乙醇沉淀法條件溫和，能夠保證制品的活性和制品的穩(wěn)定性，加入了 DEAE-650M凝膠吸附過程，能夠吸附生產(chǎn)過程中夾帶的其它凝血因子，進(jìn)一步保障了制品的穩(wěn)定，以組分I作原料能夠提高每升血漿人纖維蛋白原收率。該法采用甘氨酸作為沉淀劑，使最終制品中夾帶有0. 5%左右的甘氨酸，甘氨酸與鹽酸精氨酸聯(lián)合作為制品穩(wěn)定劑，能夠增強(qiáng)制品凍干后的穩(wěn)定性。所以該生產(chǎn)工藝能夠提高制品的質(zhì)量，純度、穩(wěn)定性和最終產(chǎn)品的收率，是制備人纖維蛋白原的創(chuàng)新。
四

圖1為本發(fā)明的制備工藝流程圖。圖2為本發(fā)明所采用的S/D法對(duì)PRV的滅活動(dòng)力學(xué)曲線圖。圖3為本發(fā)明所采用的S/D法處理Sindbis的滅活動(dòng)力學(xué)曲線圖。圖4為本發(fā)明所采用的干熱法病毒滅活對(duì)EMC的滅活動(dòng)力學(xué)曲線圖。
五具體實(shí)施例方式以下結(jié)合工藝流程圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。由圖1所示，本發(fā)明在具體實(shí)施中是由以下步驟實(shí)現(xiàn)的(1)組分I沉淀的溶解及過濾沉淀用5 15倍體積的第一溶解液，20_26°C攪拌溶解1小時(shí)，溶解后的制品澄清過濾，計(jì)量制品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有10 14g檸檬酸三鈉，9gNaCl，8 12g蔗糖，2 4gTris(三羥甲基氨基甲烷)，3 5g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調(diào)整pH值6. 90-7. 10 ；(2) S/D滅活將制品溫度控制在M ，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入質(zhì)量濃度的11% S/D滅活劑，保持制品溫度M ^°C 6小時(shí)；所述的11% S/D溶液為，IOOOml注射用水溶液中含有IlOg吐溫-80，3 磷酸三丁酯；所述的S/D滅活劑，即用有機(jī)溶劑/去污劑混合物(S/D)破壞包膜病毒的脂膜，一旦破壞脂膜的病毒不可能再與感染細(xì)胞結(jié)合，該法能有效的滅活脂包膜病毒，但不能滅活非包膜病毒；(3)第一次甘氨酸沉淀計(jì)量步驟2中滅活液體積，按1. 5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至2 8°C，以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，設(shè)定溫度0°C，收集沉淀；(4) 一次沉淀的溶解及過濾沉淀用5 10倍體積的第二溶解液，在20_26°C攪拌溶解1小時(shí)，溶解后過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有 5 IOg檸檬酸三鈉，加HCl調(diào)整pH值6. 90-7. 10 ；(5)柱層析DEAE_650M凝膠先用枸櫞酸緩沖液平衡，再將步驟中的濾液上柱進(jìn)行層析，收集流出液，層析結(jié)束后用3倍柱床體積的枸櫞酸緩沖液洗滌凝膠，并入流出液中，硅膠柱層析流動(dòng)相為水相；(6)第二次甘氨酸沉淀層析流出液按1. 5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至2 8°C，用離心機(jī)以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，_5°C收集沉淀；(7) 二次沉淀的溶解及過濾沉淀用3 5倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時(shí)，溶解后，過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有14 16. 5g的枸櫞酸鈉，30 55g鹽酸精氨酸，7 9g的氯化鈉，用HCl或NaOH調(diào)整溶液pH6. 9 7. 1 ；(8)配制檢測(cè)過濾后制品蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白質(zhì)含量用第三溶解液進(jìn)行配制， 使最終制品中蛋白含量為25g/L ；(9)分裝及凍干配制后制品除菌分裝于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝后凍干；(10)干熱滅活步驟9中凍干后制品置于水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾采用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0. 7 μ m 1. 0 μ m ；所述的步驟(3)和步驟(6)中甘氨酸的濃度為1. 5 2. 2mol/L。本發(fā)明在具體實(shí)施中，還可由以下實(shí)施例給出實(shí)施例1 本發(fā)明在具體實(shí)施中由以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)組分I沉淀的溶解及過濾沉淀用5倍體積的第一溶解液，20°C攪拌溶解1小時(shí)，溶解后的制品澄清過濾，計(jì)量制品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有10g檸檬酸三鈉，9g NaCl，8g蔗糖，2g Tris，3g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調(diào)整pH值為 6. 90 ；滅活將制品溫度控制在M°C，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入質(zhì)量濃度的11% S/D滅活劑，保持制品溫度6小時(shí)；(3)第一次甘氨酸沉淀計(jì)量步驟2中滅活液體積，按1. 5mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至2°C，以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，0°C收集沉淀；(4) 一次沉淀的溶解及過濾沉淀用5倍體積的第二溶解液，在20°C攪拌溶解1小時(shí)，溶解后過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有5g檸檬酸三鈉，加HCl調(diào)整pH值為6. 90 ；(5)柱層析DEAE_650M凝膠先用枸櫞酸緩沖液平衡，再將步驟中的濾液上柱進(jìn)行層析，收集流出液，層析結(jié)束后用3倍柱床體積的枸櫞酸緩沖液洗滌凝膠，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀層析流出液按1. 5mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至2°C，用離心機(jī)以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，_5°C收集沉淀；(7) 二次沉淀的溶解及過濾沉淀用3倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時(shí)，溶解后，過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有14g的枸櫞酸鈉，30g鹽酸精氨酸，7g的氯化鈉，用HCl或NaOH調(diào)整溶液pH為6. 9 ；(8)配制檢測(cè)過濾后制品蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白質(zhì)含量用第三溶解液進(jìn)行配制， 使最終制品中蛋白含量為25g/L ；(9)分裝及凍干配制后制品除菌分裝于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝后凍干；(10)干熱滅活步驟9中凍干后制品置于水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾采用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0. 7 μ m。實(shí)施例2:(1)組分I沉淀的溶解及過濾沉淀用8倍體積的第一溶解液，23°C攪拌溶解1小時(shí)，溶解后的制品澄清過濾，計(jì)量制品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有12g檸檬酸三鈉，9gNaCl，IOg蔗糖，3g Tris, 4g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調(diào)整pH值為 7 ；(2) S/D滅活將制品溫度控制在25°C，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入質(zhì)量濃度的11% S/D滅活劑，保持制品溫度25°C 6小時(shí)；(3)第一次甘氨酸沉淀計(jì)量步驟2中滅活液體積，按1. 8mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至5°C，以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，0°C收集沉淀；(4) 一次沉淀的溶解及過濾沉淀用7倍體積的第二溶解液，在23°C攪拌溶解1小時(shí)，溶解后過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有7. 5g檸檬酸三鈉，加HCl調(diào)整pH值為7 ；(5)柱層析DEAE_650M凝膠先用枸櫞酸緩沖液平衡，再將步驟中的濾液上柱進(jìn)行層析，收集流出液，層析結(jié)束后用3倍柱床體積的枸櫞酸緩沖液洗滌凝膠，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀層析流出液按1. 8mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至5°C，用離心機(jī)以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，_5°C收集沉淀；(7) 二次沉淀的溶解及過濾沉淀用4倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時(shí)，溶解后，過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有15. 2g的枸櫞酸鈉，43g鹽酸精氨酸，Sg的氯化鈉，用HCl或NaOH調(diào)整溶液pH為7 ；(8)配制檢測(cè)過濾后制品蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白質(zhì)含量用第三溶解液進(jìn)行配制， 使最終制品中蛋白含量為25g/L ；(9)分裝及凍干配制后制品除菌分裝于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝后凍干；(10)干熱滅活步驟9中凍干后制品置于水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾采用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0.85 μ m。實(shí)施例3 (1)組分I沉淀的溶解及過濾沉淀用15倍體積的第一溶解液，攪拌溶解1小時(shí)，溶解后的制品澄清過濾，計(jì)量制品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有14g檸檬酸三鈉，9g NaCl，12g蔗糖，4g Tris，5g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調(diào)整pH值為 7. 10 ；(2) S/D滅活將制品溫度控制在，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入質(zhì)量濃度的11% S/D滅活劑，保持制品溫度6小時(shí)；(3)第一次甘氨酸沉淀計(jì)量步驟2中滅活液體積，按2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至8°C，以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，0°C收集沉淀；(4) 一次沉淀的溶解及過濾沉淀用10倍體積的第二溶解液，在攪拌溶解1 小時(shí)，溶解后過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有10g檸檬酸三鈉，加HCl調(diào)整pH值為7. 10 ；(5)柱層析DEAE_650M凝膠先用枸櫞酸緩沖液平衡，再將步驟中的濾液上柱進(jìn)行層析，收集流出液，層析結(jié)束后用3倍柱床體積的枸櫞酸緩沖液洗滌凝膠，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀層析流出液按2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至8°C，用離心機(jī)以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，_5°C收集沉淀；(7) 二次沉淀的溶解及過濾沉淀用5倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時(shí)，溶解后，過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有16. 5g的枸櫞酸鈉，55g鹽酸精氨酸，9g的氯化鈉，用HCl或NaOH調(diào)整溶液pH為7. 1 ；(8)配制檢測(cè)過濾后制品蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白質(zhì)含量用第三溶解液進(jìn)行配制， 使最終制品中蛋白含量為25g/L ；(9)分裝及凍干配制后制品除菌分裝于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝后凍干；(10)干熱滅活步驟9中凍干后制品置于水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘；所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾采用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為Ι.Ομπι。本發(fā)明產(chǎn)品經(jīng)測(cè)試完全達(dá)到或超過了《中國(guó)藥典》2010年版(三部)的相關(guān)要求和國(guó)內(nèi)已上市的同類產(chǎn)品，相關(guān)數(shù)據(jù)的對(duì)比分析見下表本發(fā)明產(chǎn)品與國(guó)內(nèi)上市銷售產(chǎn)品質(zhì)量比較資料(規(guī)格0. 5g/瓶)
權(quán)利要求
1.一種柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，其特征在于，是由以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)組分I沉淀的溶解及過濾沉淀用5 15倍體積的第一溶解液，2046°C攪拌溶解 1小時(shí)，溶解后的制品澄清過濾，計(jì)量制品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有10 14g檸檬酸三鈉，9g NaCl, 8 12g蔗糖，2 4gTris，3 5g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調(diào)整pH值6. 90-7. 10 ；(2)S/D滅活將制品溫度控制在M ^TC,按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入質(zhì)量濃度的11% S/D滅活劑，保持制品溫度M 6小時(shí)；所述的11% S/ D滅活劑為，IOOOml注射用水溶液中含有110g吐溫_80，33g磷酸三丁酯；(3)第一次甘氨酸沉淀計(jì)量步驟2中滅活液體積，按1.5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至2 8°C，以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，設(shè)定溫度0°C，收集沉淀；(4)一次沉淀的溶解及過濾沉淀用5 10倍體積的第二溶解液，在20-26°C攪拌溶解1小時(shí)，溶解后過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有5 IOg檸檬酸三鈉，加HCl調(diào)整pH值6. 90-7. 10 ；(5)柱層析DEAE-650M凝膠先用枸櫞酸緩沖液平衡，再將步驟中的濾液上柱進(jìn)行層析，收集流出液，層析結(jié)束后用3倍柱床體積的枸櫞酸緩沖液洗滌凝膠，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀層析流出液按1.5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至2 8°C，用離心機(jī)以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，_5°C收集沉淀；(7)二次沉淀的溶解及過濾沉淀用3 5倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時(shí)，溶解后，過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有14 16. 5g的枸櫞酸鈉， 30 55g鹽酸精氨酸，7 9g的氯化鈉，用HCl或NaOH調(diào)整溶液pH6. 9 7. 1 ；(8)配制檢測(cè)過濾后制品蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白質(zhì)含量用第三溶解液進(jìn)行配制，使最終制品中蛋白含量為25g/L;(9)分裝及凍干配制后制品除菌分裝于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝后凍干；(10)干熱滅活步驟9中凍干后制品置于水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。 所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾采用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0.7μπι 1. 0 μ m ；所述的步驟(3)和步驟(6)中甘氨酸的濃度為1. 5 2. 2mol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，其特征在于， 由所述的以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)組分I沉淀的溶解及過濾沉淀用5倍體積的第一溶解液，20°C攪拌溶解1小時(shí)， 溶解后的制品澄清過濾，計(jì)量制品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有10g檸檬酸三鈉，9g NaCl，8g蔗糖，2g Tris，3g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調(diào)整pH值為 6. 90 ；滅活將制品溫度控制在M°C，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入質(zhì)量濃度的11% S/D滅活劑，保持制品溫度6小時(shí)；(3)第一次甘氨酸沉淀計(jì)量步驟2中滅活液體積，按1. 5mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至2°C，以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，0°C收集沉淀；(4)一次沉淀的溶解及過濾沉淀用5倍體積的第二溶解液，在20°C攪拌溶解1小時(shí)， 溶解后過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有5g檸檬酸三鈉，加HCl調(diào)整pH值為6. 90 ；(5)柱層析DEAE-650M凝膠先用枸櫞酸緩沖液平衡，再將步驟(4)中的濾液上柱進(jìn)行層析，收集流出液，層析結(jié)束后用3倍柱床體積的枸櫞酸緩沖液洗滌凝膠，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀層析流出液按1.5mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至2°C，用離心機(jī)以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，_5°C收集沉淀；(7)二次沉淀的溶解及過濾沉淀用3倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時(shí)，溶解后， 過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有14g的枸櫞酸鈉，30g鹽酸精氨酸，7g的氯化鈉，用HCl或NaOH調(diào)整溶液pH為6. 9 ；(8)配制檢測(cè)過濾后制品蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白質(zhì)含量用第三溶解液進(jìn)行配制，使最終制品中蛋白含量為25g/L;(9)分裝及凍干配制后制品除菌分裝于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝后凍干；(10)干熱滅活步驟9中凍干后制品置于水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾采用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0.7 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，其特征在于， 由所述的以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)組分I沉淀的溶解及過濾沉淀用8倍體積的第一溶解液，23°C攪拌溶解1小時(shí)，溶解后的制品澄清過濾，計(jì)量制品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有12g檸檬酸三鈉，9g NaCl，10g蔗糖，3g Tris，4g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調(diào)整pH值為7 ； 滅活將制品溫度控制在25°C，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入質(zhì)量濃度的11% S/D滅活劑，保持制品溫度25°C 6小時(shí)；(3)第一次甘氨酸沉淀計(jì)量步驟2中滅活液體積，按1.8mol/L濃度加入甘氨酸粉末， 充分溶解后冷卻至5°C，以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，0°C收集沉淀；(4)一次沉淀的溶解及過濾沉淀用7倍體積的第二溶解液，在23°C攪拌溶解1小時(shí)， 溶解后過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有7. 5g檸檬酸三鈉，加HCl調(diào)整pH值為7 ；(5)柱層析DEAE-650M凝膠先用枸櫞酸緩沖液平衡，再將步驟中的濾液上柱進(jìn)行層析，收集流出液，層析結(jié)束后用3倍柱床體積的枸櫞酸緩沖液洗滌凝膠，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀層析流出液按1.8mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至5°C，用離心機(jī)以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，_5°C收集沉淀；(7)二次沉淀的溶解及過濾沉淀用4倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時(shí)，溶解后， 過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有15. 2g的枸櫞酸鈉，43g鹽酸精氨酸，Sg的氯化鈉，用HCl或NaOH調(diào)整溶液pH為7 ；(8)配制檢測(cè)過濾后制品蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白質(zhì)含量用第三溶解液進(jìn)行配制，使最終制品中蛋白含量為25g/L;(9)分裝及凍干配制后制品除菌分裝于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝后凍干；(10)干熱滅活步驟9中凍干后制品置于水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾采用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0.85 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，其特征在于， 由所述的以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)組分I沉淀的溶解及過濾沉淀用15倍體積的第一溶解液，26°C攪拌溶解1小時(shí)， 溶解后的制品澄清過濾，計(jì)量制品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有14g檸檬酸三鈉，9g NaCl，12g蔗糖，4g Tris，5g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調(diào)整pH值為 7. 10 ；滅活將制品溫度控制在^TC,按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態(tài)下緩慢加入質(zhì)量濃度的11% S/D滅活劑，保持制品溫度6小時(shí)；(3)第一次甘氨酸沉淀計(jì)量步驟2中滅活液體積，按2.2mol/L濃度加入甘氨酸粉末， 充分溶解后冷卻至8°C，以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，0°C收集沉淀；(4)一次沉淀的溶解及過濾沉淀用10倍體積的第二溶解液，在攪拌溶解1小時(shí)， 溶解后過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有10g檸檬酸三鈉，加HCl調(diào)整pH值為7. 10 ；(5)柱層析DEAE-650M凝膠先用枸櫞酸緩沖液平衡，再將步驟(4)中的濾液上柱進(jìn)行層析，收集流出液，層析結(jié)束后用3倍柱床體積的枸櫞酸緩沖液洗滌凝膠，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀層析流出液按2.2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷卻至8°C，用離心機(jī)以4200rpm的速度進(jìn)行連續(xù)離心分離40分鐘，_5°C收集沉淀；(7)二次沉淀的溶解及過濾沉淀用5倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時(shí)，溶解后， 過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有16. 5g的枸櫞酸鈉，55g鹽酸精氨酸，9g的氯化鈉，用HCl或NaOH調(diào)整溶液pH為7. 1 ；(8)配制檢測(cè)過濾后制品蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白質(zhì)含量用第三溶解液進(jìn)行配制，使最終制品中蛋白含量為25g/L;(9)分裝及凍干配制后制品除菌分裝于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝后凍干；(10)干熱滅活步驟9中凍干后制品置于水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘；所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾采用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為Ι.Ομπι。
全文摘要
本發(fā)明涉及柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，可有效解決人纖維蛋白原純度高，穩(wěn)定性好，收率高的問題，本發(fā)明由以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)FI沉淀的溶解及過濾；(2)S/D滅活；(3)第一次甘氨酸沉淀；(4)一次沉淀的溶解及過濾；(5)柱層析；(6)第二次甘氨酸沉淀；(7)二次沉淀的溶解及過濾；(8)配制；(9)分裝及凍干；(10)干熱滅活；該法采用甘氨酸作為沉淀劑，使最終制品中夾帶有0.5％左右的甘氨酸，甘氨酸與鹽酸精氨酸聯(lián)合作為制品穩(wěn)定劑，能夠增強(qiáng)制品凍干后的穩(wěn)定性，提高制品的質(zhì)量、純度和最終產(chǎn)品的收率，是制備人纖維蛋白原的創(chuàng)新。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102212129SQ20111007855
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月5日
發(fā)明者劉國(guó)榮, 時(shí)凱, 江景玉, 皮川真, 陳惠珍, 雷文成 申請(qǐng)人:邦和藥業(yè)股份有限公司