專利名稱：一種從霞水母刺絲囊毒素內(nèi)分離致死毒素蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體的說是一種從霞水母(Cyanea nozakii)刺絲囊細(xì)胞毒素中分離純化致死毒素蛋白的方法。
背景技術(shù)：
水母(jellyfish)是一種膠質(zhì)狀的浮游動(dòng)物，主要包括四大類群刺胞動(dòng)物門的水螅水母類、管水母類、缽水母類以及櫛水母門的櫛水母類。水母種類繁多，分布廣泛，世界上已記錄的水母種類大約有1000種左右，其中我國海域已知的約有400種。我國是海岸線非常長的國家之一，從北到南地跨寒溫帶、溫帶、亞熱帶和熱帶，而在我國的沿海地區(qū)幾乎均有大量水母分布，其中以霞水母數(shù)量尤為豐富。近年來，水母經(jīng)常暴發(fā)，造成眾多游泳者被蜇傷，輕者皮膚出現(xiàn)皮疹、紅腫、瘙癢，令被蜇傷者痛苦不堪，重者昏厥、休克甚至死亡。而水母之所以能夠給人們帶來如此大的危害，最主要的原因是存在于水母觸手上的刺絲囊細(xì)胞內(nèi)含有大量的水母毒素。水母毒素主要是蛋白類物質(zhì)，其中包含多種具有不同生物活性的毒素蛋白，如溶血活性、酶活性、抗氧化活性、致死毒性、心臟血管毒性、肝臟毒性等，而水母毒素作為一類結(jié)構(gòu)新穎的蛋白，為開發(fā)新型的海洋藥物提供了重要的先導(dǎo)化合物。但是，到目前為止對水母毒素的研究主要集中在水母粗毒方面，其主要原因有以下幾方面第一，水母粗毒素中含有許多種蛋白組分，其中某些組分之間的性質(zhì)(如分子量、帶電荷數(shù)、疏水性等)非常相近，這就給水母毒素的分離純化帶來了很大的麻煩；第二， 水母毒素是蛋白類物質(zhì)，具有熱敏感性，容易受到溫度等環(huán)境因素的影響而致使其活性降低甚至喪失，這就造成在分離純化過程中很難保持其活性。第三，水母種類的不同，其生理結(jié)構(gòu)以及體內(nèi)所含的毒素成分和活性也存在較大的差異，這就致使不同種類水母毒素的分離純化工作難以直接效仿，只能通過繁雜的實(shí)驗(yàn)摸索才能獲得。所以，水母毒素的分離純化工作具有很大的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從霞水母刺絲囊毒素內(nèi)分離致死毒素蛋白的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種從霞水母刺絲囊毒素中分離致死毒素蛋白的方法1)將霞水母刺絲囊細(xì)胞加入預(yù)冷緩沖液中破碎，破碎后2 6°C離心，收集上清液，待用；2)將上述步驟1)上清液于2 6°C下用緩沖液透析過夜，然后低溫離心，收集上清液，待用；3)將步驟2)所得上清液過濾，而后用含Con A Sepharose 4B親和柱進(jìn)行分離，分離時(shí)采用含有0. 1 0. 3M α -甲基-D-甘露糖苷和0. 1 0. 3MNaCl的pH7. 4，濃度10 30mM的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，低溫離心，收集上清液，待用；4)將步驟3)得到的上清液用強(qiáng)陰離子交換樹脂Mono Q預(yù)裝柱純化分離，依次采
3用pH7. 8，濃度為10 30mM的Tris-HCl緩沖液和含IM NaCl的pH7. 8，濃度為10 30mM 的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為0. 2 0. SmLmin"1,收集約25 40min洗脫液，
即為從霞水母刺絲囊毒素中分離致死毒素蛋白。所述步驟1)霞水母刺絲囊細(xì)胞為將置于-80 -20°c低溫的霞水母觸手于2 6°C自溶12 48h，自溶后利用20 60目的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去觸手殘片，而后在2 6°C下 10000 15000g離心5 20min，收集下部沉淀，2 6°C冷凍干燥，待用。所述步驟1)向霞水母刺絲囊細(xì)胞加入pH7. 8，濃度10 30mM的2 6°C下預(yù)冷 Tris-HCl緩沖液中，而后將其置于冰浴下用超聲波功率為200 400kw下破碎20 60min 中，工作/間隙為5s/30s。所述步驟2)離心條件為在2 6°C下，10000 15000g離心5 20min。所述步驟2)中緩沖液為含有1 3mM MnCl2U 3mM CaCl2禾Π 0. 1 0. 3Μ NaCl 的 ρΗ7. 4，濃度 10 30mM 的 Tris-HCl。所述步驟3)中的過濾時(shí)將步驟2)收集的上清液用孔徑為0. 22 μ m的微孔濾膜過
濾ο所述步驟3)中將步驟2)所得上清液過濾，而后用含Con A Sepharose4B親和柱進(jìn)行分離，首先采用含1 3mM MnCl2,1 3mM CaCl2禾Π 0. 1 0. 3MNaCl的pH7. 4，濃度 10 30mM的Tris-HCl緩沖液洗掉未結(jié)合的蛋白，然后采用含0. 1 0. 3M α -甲基-D-甘露糖苷和0. 1 0. 3Μ NaCl的ρΗ7. 4，濃度10 30mM的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，而后將收集的洗脫組分于2 6°C采用pH7. 8，10 30mM Tris-HCl緩沖液透析，低溫離心，收集上清液，待用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明從霞水母中分離純化霞水母致死毒素蛋白的方法，為水母毒素蛋白的純化提供了方法指導(dǎo)。2.本發(fā)明采用陰離子交換劑Con A Sepharose 4B親和柱和強(qiáng)陰離子Mono Q預(yù)裝柱分離致死毒素蛋白，具有流速快、分辨率高、產(chǎn)率高的特點(diǎn)，而且分離步驟少，只經(jīng)過兩步柱層析分離就能夠得到較純的致死毒素蛋白，有效地縮短了分離時(shí)間，減少了致死毒素蛋白的活性損失。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的Mono Q分離Con A Sepharose 4B洗脫液的層析圖。圖2本發(fā)明實(shí)施例提供的分子篩Mono Q致死毒素蛋白峰的SDS-PAGE電泳圖。圖3本發(fā)明實(shí)施例提供的采用Bradford法測定蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11)霞水母毒素刺絲囊細(xì)胞的制備將Ikg冰凍的霞水母觸手于2°C下自溶過夜后，利用20目的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去觸手殘片，然后取上清液并在10000g、4°C下冷凍高速離心 20mi η并收集下層沉淀，用0. 154mol ·L^lNaCl溶液的生理鹽水于2V反復(fù)洗洚3次至上層液澄清，并將刺絲囊細(xì)胞沉淀冷凍干燥后，"20 0C下冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 2)霞水母毒素的提取取步驟1)霞水母刺絲囊細(xì)胞0. 5g和在2°C下預(yù)冷的20mL pH7. 810mM Tris-HCl緩沖液置于燒杯中，在冰浴下用超聲波功率為200kw下破碎30min中， 工作/間隙為5s/30s。破碎完畢后在4°C下，IOOOOg離心20min，上清液即為霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素，并用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測定上清液中霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素的蛋白濃度。3)親和層析Con A Sepharose 4B分離霞水母毒素①上樣前樣品的預(yù)處理將提取到的霞水母刺絲囊毒素于2°C下采用含ImM MnCl2, ImM CaCl2 和 0. 15M NaCl 的 pH7. 4，IOmM Tris-HCl 緩沖液透析過夜，然后 IOOOOg 冷凍離心20min，棄沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上Con A Sepharose 4B柱(1. 0x5cm)，流速為 0. ZmLmirT1，然后以含 0. IM α -甲基-D-甘露糖苷和 0. IMNaCl 的 pH7. 4，IOmM Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集洗脫液。4)強(qiáng)陰離子Mono Q分離①上樣前樣品的預(yù)處理將上述收集組分于2°C采用pH7. SlOmMTris-HCl緩沖液透析過夜，然后IOOOOg冷凍離心20min，棄沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫取上述處理好的樣品上Mono Q預(yù)裝柱(0. 5/5cm)純化分離，依次采用pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液和含IM NaCl的pH7. 8IOmMTris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為0. ZmLmirT1，收集各洗脫峰并且利用截流分子量為3kDa的超濾管對pH7. 8 20mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行濃縮脫鹽(參見圖1)。5) SDS-PAGE純度檢測將步驟4) Mono Q預(yù)裝柱分離到的各個(gè)洗脫峰進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測其純度(參見圖2)。6)致死活性的檢測實(shí)驗(yàn)組是用微量注射器向斑馬魚尾部分別注射3、5、8、12、 15、20yL的上述檢測后含單一蛋白的pH7.820mM Tris-HCl緩沖液，然后觀察斑馬魚的行為及24小時(shí)內(nèi)生存狀況，同時(shí)分別向斑馬魚尾部注射3、5、8、12、15、20μ L pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液作為空白對照。其中實(shí)驗(yàn)組和對照組每個(gè)梯度均用10條斑馬魚平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)顯示，分離純化到的霞水母毒素蛋白對斑馬魚具有致死活性，其半致死量LD5tl為約 0. 56 μ g毒素蛋白/g.魚，其中蛋白濃度的測定方法采用Bradford法，利用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線 (參見圖3)。實(shí)施例21)霞水母毒素刺絲囊細(xì)胞的制備將2kg冰凍的霞水母觸手于4°C下自溶過夜后，利用40目的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去觸手殘片，然后取上清液并在12000g、4°C下冷凍高速離心 IOmin并收集下層沉淀，用0. 154mol · L^lNaCl溶液的生理鹽水于4°C反復(fù)洗滌3次至上層液澄清，并將刺絲囊細(xì)胞沉淀冷凍干燥后，"20。C下冷凍保存?zhèn)溆谩?)霞水母毒素的提取取步驟1)霞水母刺絲囊細(xì)胞1. Og和在4°C下預(yù)冷的30mL pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液置于燒杯中，在冰浴下用超聲波功率為300kw下破碎30min中， 工作/間隙為5s/30s。破碎完畢后在4°C下，12000g離心lOmin，上清液即為霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素，并用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測定上清液中霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素的蛋白濃度。3)親和層析Con A Sepharose 4B分離霞水母毒素
①上樣前樣品的預(yù)處理將提取到的霞水母刺絲囊毒素于4°C下采用含有2mM MnCl2, 2mM CaCl2 核 0. 2M NaCl 的 pH7. 4,20mM Tris-HCl 緩沖液透析過夜，然后 12000g7令凍離心lOmin，棄沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上Con A Sepharose 4B柱(1. 6x10cm)， 流速為OJmLmirT1,然后以含有0.2M α -甲基-D-甘露糖苷和0. 2Μ NaCl的pH7. 4，20mM Tris-HCl緩沖液洗脫，收集洗脫液。4)強(qiáng)陰離子Mono Q分離①上樣前樣品的預(yù)處理將上述組分4°C采用pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后12000g冷凍離心lOmin，棄沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫取上述處理好的樣品上Mono Q預(yù)裝柱(0. 5/5cm)純化分離，依次采用pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液和含IM NaCl的pH7. 8IOmMTris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為0. 2mLmin-1,收集各洗脫峰并且利用截流分子量為3kDa的超濾管對pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行濃縮脫鹽。5) SDS-PAGE純度檢測將步驟4) Mono Q預(yù)裝柱分離到的各個(gè)洗脫峰進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測其純度。6)致死活性的檢測實(shí)驗(yàn)組是用微量注射器向斑馬魚尾部分別注射3、5、8、12、 15、20μ L的上述含單一蛋白的pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液，然后觀察斑馬魚的行為及24 小時(shí)內(nèi)生存狀況，同時(shí)分別向斑馬魚尾部注射3、5、8、12、15、20μ L ρΗ7· 820mM Tris-HCl緩沖液作為空白對照。其中實(shí)驗(yàn)組和對照組每個(gè)梯度均用10條斑馬魚平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)顯示， 分離純化到的霞水母毒素蛋白對斑馬魚具有致死活性，其半致死量LD5tl為約0. 58 μ g毒素蛋白/g.魚，其中蛋白濃度的測定方法采用Bradford法，利用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)施例31)霞水母毒素刺絲囊細(xì)胞的制備將3kg冰凍的霞水母觸手于6°C下自溶過夜后，利用60目的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去觸手殘片，然后取上清液并在15000g、6°C下冷凍高速離心 5min并收集下層沉淀，用0. 154mol ·L^lNaCl溶液的生理鹽水于6°C反復(fù)洗滌3次至上層液澄清，并將刺絲囊細(xì)胞沉淀冷凍干燥后，"20。C下冷凍保存?zhèn)溆谩?)霞水母毒素的提取取步驟1)霞水母刺絲囊細(xì)胞2. Og和在6°C下預(yù)冷的50mL pH7. 830mM Tris-HCl緩沖液置于燒杯中，在冰浴下用超聲波功率為400kw下破碎60min中， 工作/間隙為5s/30s。破碎完畢后在6°C下，15000g離心5min，上清液即為霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素，并用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測定上清液中霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素的蛋白濃度。3)親和層析Con A Sepharose 4B分離霞水母毒素①上樣前樣品的預(yù)處理將提取到的霞水母刺絲囊毒素于6°C下采用含有3mM MnCl2, 3mM CaCl2 和 0. 3M NaCl 的 pH7. 4,30mM Tris-HCl 緩沖液透析過夜，然后 15000g7令凍離心5min，棄沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上Con A Sepharose 4B柱，流速為 0. 5mLmin_1,然后采用含有0. 3M α -甲基-D-甘露糖苷核0. 3M NaCl的ρΗ7. 4，30mM Tris-HCl緩沖液洗脫，收集洗脫液。4)強(qiáng)陰離子Mono Q分離
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①上樣前樣品的預(yù)處理將上述組分6°C對pH7. 830mM Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后15000g冷凍離心5min，棄沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫取上述處理好的樣品上Mono Q預(yù)裝柱(0. 5/5cm)純化分離，依次采用pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液和含IM NaCl的pH7. 8IOmMTris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為0. 2mLmin-1,收集各洗脫峰并且利用截流分子量為3kDa的超濾管對pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行濃縮脫鹽。5) SDS-PAGE純度檢測將步驟4) Mono Q預(yù)裝柱分離到的各個(gè)洗脫峰進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測其純度。6)致死活性的檢測實(shí)驗(yàn)組是用微量注射器向斑馬魚尾部分別注射3、5、8、12、 15、20μ L的上述含單一蛋白的pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液，然后觀察斑馬魚的行為及24 小時(shí)內(nèi)生存狀況，同時(shí)分別向斑馬魚尾部注射3、5、8、12、15、20μ L ρΗ7· 820mM Tris-HCl緩沖液作為空白對照。其中實(shí)驗(yàn)組和對照組每個(gè)梯度均用10條斑馬魚平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)顯示， 分離純化到的霞水母毒素蛋白對斑馬魚具有致死活性，其半致死量LD5tl為約0. 54 μ g毒素蛋白/g.魚，其中蛋白濃度的測定方法采用Bradford法，利用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從霞水母刺絲囊毒素中分離致死毒素蛋白的方法，其特征在于1)將霞水母刺絲囊細(xì)胞加入預(yù)冷緩沖液中破碎，破碎后2 6°C離心，收集上清液，待用；2)將上述步驟1)上清液于2 6°C下用緩沖液透析過夜，然后低溫離心，收集上清液， 待用；3)將步驟2)所得上清液過濾，而后用含ConA Sepharose 4B親和柱進(jìn)行分離，分離時(shí)采用含有0. 1 0. 3M α -甲基-D-甘露糖苷和0. 1 0. 3MNaCl的pH7. 4，濃度10 30mM 的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，低溫離心，收集上清液，待用；4)將步驟3)得到的上清液用強(qiáng)陰離子交換樹脂MonoQ預(yù)裝柱純化分離，依次采用 pH7. 8，濃度為10 30mM的Tris-HCl緩沖液和含IM NaCl的pH7. 8，濃度為10 30mM的 Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為0. 2 0. SmLmirT1，收集約25 40min洗脫液，即為從霞水母刺絲囊毒素中分離致死毒素蛋白。
2.按權(quán)利要求1所述的從霞水母刺絲囊毒素中分離致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步驟1)霞水母刺絲囊細(xì)胞為將置于-80 -20°C低溫的霞水母觸手于2 6°C自溶12 48h，自溶后利用20 60目的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去觸手殘片，而后在2 6°C下10000 15000g離心5 20min，收集下部沉淀，2 6°C冷凍干燥，待用。
3.按權(quán)利要求1或2所述的從霞水母刺絲囊毒素中分離致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步驟1)向霞水母刺絲囊細(xì)胞加入PH7. 8，濃度10 30mM的2 6°C下預(yù)冷 Tris-HCl緩沖液中，而后將其置于冰浴下用超聲波功率為200 400kw下破碎20 60min 中，工作/間隙為5s/30s。
4.按權(quán)利要求1所述的從霞水母刺絲囊毒素中分離致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步驟2)離心條件為在2 6°C下，10000 15000g離心5 20min。
5.按權(quán)利要求1所述的從霞水母刺絲囊毒素中分離致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步驟2)中緩沖液為含有1 3mM MnCl2U 3mM CaCl2禾Π 0. 1 0. 3Μ NaCl的 ρΗ7. 4，濃度 10 30mM 的 Tris-HCl。
6.按權(quán)利要求1所述的從霞水母刺絲囊毒素中分離致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步驟3)中的過濾時(shí)將步驟2)收集的上清液用孔徑為0. 22 μ m的微孔濾膜過濾。
7.按權(quán)利要求1所述的從霞水母刺絲囊毒素中分離致死毒素蛋白的方法，其特征在于所述步驟3)中將步驟2)所得上清液過濾，而后用含ConA Sepharose 4B親和柱進(jìn)行分離，首先采用含1 3mM MnCl2,1 3mM CaCl2禾Π 0. 1 0. 3Μ NaCl的ρΗ7. 4，濃度10 30mM的Tris-HCl緩沖液洗掉未結(jié)合的蛋白，然后采用含0. 1 0. 3M α -甲基-D-甘露糖苷和0. 1 0. 3Μ NaCl的ρΗ7. 4，濃度10 30mM的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，而后將收集的洗脫組分于2 6°C采用pH7. 8，10 30mM Tris-HCl緩沖液透析，低溫離心，收集上清液，待用。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種分離純化霞水母致死毒素蛋白的方法。其分離方法如下霞水母刺絲囊細(xì)胞經(jīng)超聲破碎提取得到水母粗毒素，透析除鹽后先后依次經(jīng)過親和色譜層析分離和陰離子交換色譜技術(shù)分離純化，最終得到一種具有致死活性水母毒素蛋白，測得其分子量為30kDa，并且測定其對斑馬魚的半致死量LD50為0.56μg毒素蛋白/g.魚。本發(fā)明具快速、簡便的特點(diǎn)，為獲得霞水母致死毒素蛋白提供了重要的方法指導(dǎo)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK102174098SQ20111002766
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者于華華, 馮金華, 劉松, 孟祥濤, 崔金會(huì), 李克成, 李榮鋒, 李鵬程, 秦玉坤, 邢榮娥 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所