專利名稱：：一種霞水母來源的具有抗疲勞活性的糖蛋白及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種霞水母來源的具有抗疲勞活性的糖蛋白及其制備工藝，屬天然生物活性物質(zhì)及其制備
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：'霞水母(C少o"e""oz。te)，俗稱麻蜇，是一種人型海洋浮游生物，屬刺胞動物門(PhylumCnidaria),缽水母綱(ClassScyphomedusae)，旗口水母目(OrderPhylumcnidaria),霞水母科(FamilyCyanea)。我國沿海已發(fā)現(xiàn)的有白色霞水母(Qwiea"o加ih'/^/j/"ow_ye)、發(fā)形霞水母(Cy朋eacap7toa)、棕色霞水母(Cy朋ea/em^力ea&cfac/wte)，和紫色霞水母(Owjeapw/ra,eflA^/n'"o"ye)4個種，其中以白色霞水母數(shù)量最多、分布范圍最廣。霞水母通常以小型浮游動物為餌，其生殖腺發(fā)達(dá)，繁殖能力強，生長速度極快，目前我國霞水母的年產(chǎn)量已經(jīng)高達(dá)千萬噸，構(gòu)成了一種新的大然海洋生物資源。海洋來源的多糖、蛋白聚糖和糖蛋白是十分重要的天然海洋食品資源，常常具有顯著的生物活性，如海參多糖、海藻多糖等均有許多的研究報道，證實其具有顯著的生物活性。以霞水母為原料，從中分離提取制備糖蛋白的研究國內(nèi)外尚未見任何報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明發(fā)明了一種霞水母來源的具有抗疲勞活性的糖蛋白及其制備工藝。較為獨特的是，它以一種新型的天然海洋生物資源-霞水母(Q^"ra"o^始')-作為糖蛋白的制備原料進(jìn)行加工，實現(xiàn)了對霞水母進(jìn)行開發(fā)利用的目的。按照本發(fā)明進(jìn)行操作，能夠以極高的產(chǎn)率獲得高純度糖蛋白產(chǎn)品。這對于霞水母這一大然海洋生物資源的綜合利用而言是至關(guān)重要的。本發(fā)明發(fā)明的霞水母活性糖蛋白經(jīng)初步的研究確認(rèn).基本無毒，具有顯著的抗疲勞活性，將作為新荊的生物活性材料和保健食品原料被)''泛應(yīng)用亍食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)。具體來說，首先，我們發(fā)現(xiàn)新鮮的或經(jīng)過三礬腌制處理的市售麻蜇可以在經(jīng)過脫鹽處理之后用作糖蛋白的制備原料。其中所含的糖蛋白對水浸泡處理是穩(wěn)定的，在我們所采取的浸泡工藝條件下，既不會因受到浸泡而被釋解、被提取到水中流失，也不會因受過浸泡而影響其在后續(xù)的水解處理中的分散性，即經(jīng)過三礬腌制處理的市售麻蜇與剛捕撈上岸的新鮮的霞水母具有同等的可加工性，均可用作制備高純度高生物活性糖蛋白的原料。由此奠定了以霞水母為原料加工制備高純度高生物活性糖蛋白的基礎(chǔ)。其次，在對pH、溫度、壓力等溶融和酵解條件以及氫氧化鈉、鹽酸、膠原蛋白酶等各種常用的溶融劑進(jìn)行了系統(tǒng)的考察和對比后，我們發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)?shù)娜苋跅l件下，霞水母中所含有的糖蛋白以及膠原蛋白不經(jīng)過變性處理，便可直接被溶融，分散到水中，得到澄清透明，所含雜質(zhì)很少的高純度分散液。這種分散液經(jīng)過職瞎處理可有效的使其中所含的糖蛋白與膠原蛋白相分離。我們發(fā)現(xiàn)，在浸泡pH、浸泡壓力、浸泡時間、溶融(酶解)劑等水解工藝參數(shù)中，溶融(酶解)劑的種類和溶融(酶解)時所采用的溫度對于得率而言是最為重要的。其中，有效的溶融劑為常見的酸(如鹽酸、磷酸、硫酸等無機黢或甲酸、醋酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸等有機酸)。當(dāng)選用鹽酸為溶融劑時，pH值應(yīng)當(dāng)在0.5-6.8范圍之內(nèi)；有效的酶解劑為各種蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶等)中的一種或若干種。酶解時，pH值應(yīng)當(dāng)在所J4H的最適pH范圍之內(nèi)。當(dāng)選用鹽酸為溶融劑時，溶融溫度應(yīng)當(dāng)在-30-200。C范圍內(nèi)，最好是在0-60。C的范圍內(nèi)，當(dāng)選用胰蛋白酶為酶解劑時，應(yīng)當(dāng)在胰蛋白酶的最適溫度下進(jìn)行溶融。其他各項參數(shù)，浸泡脫鹽需進(jìn)行6-15次，每次浸泡所需的用水量為所投放的霞水母原料的1-5倍,浸泡溫度在-50-98°C范圍內(nèi)，浸泡時間為0.5-12hr次"。液體的干燥方式，可以是冷凍干燥，也可以是噴霧干燥。具體實施方式下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。實例一取10恥g三礬腌制處理的市售麻蜇，瀝水后，室溫下浸沒于2-5倍量的去離子水中浸泡，并每2-3小時換一次水，直至浸泡水中氯化鈉的含量低于1.5ppm為.lh(氯離子檢測呈陰性)。浸泡后的脫鹽霞水母用醋酸將其pH調(diào)節(jié)至3.5-5.5，在30-60。CK保溫融溶20-48小時，得到一澄清透明的粘性液體。然后將粘性液體的pH調(diào)節(jié)至胰蛋白酶的最適pH,在該酶的最適溫度下保溫處理8-16小時，然后離心，棄去不溶性殘渣，得到上清液，即為糖蛋白液；糖蛋A液經(jīng)濃縮后噴霧干燥，得到20g純度達(dá)到90n/o以上的具有顯著的抗疲勞活性的糖蛋白粉固體。實例一取1000g新鮮霞水母，室溫下浸沒于2-5倍量的去離子水中浸泡，并每2-3小時換一次水，直至浸泡水中氯化鈉的含量低于1.5ppm為止(氯離子檢測呈陰性)。浸泡后的脫鹽霞水母用醋酸將其pH調(diào)節(jié)至3.5-5.5，在30"60。C下保溫融溶20-48小時，得到一澄清透明的粘性液體。然后將粘性液體的pH調(diào)節(jié)至胰蛋白酶的最適pH,在該酶的最適溫度K保溫處理8-16小時，然后離心，棄去不溶性殘渣，得到上清液，即為糖蛋白液；糖蛋白液經(jīng)濃縮后噴霧千燥，得到10g純度達(dá)到90V。以上的具有顯著的抗疲勞活性的糖蛋白粉固體。實例二對一份糖蛋白粉樣品進(jìn)行了蛋白含量的測定，總糖含量的測定，氨基酸組成的測定以及單糖組成的測定。測定結(jié)果表明，該樣品中含75%的蛋白質(zhì)，25%的糖，平均分于量為56,000。所含單糖以葡萄糖為主，所含氨基酸的組成見表l。表l供試樣品的氨基酸組成氨基酸含量(mg/g)%天冬氨酸4.14188.97谷氨酸6.7677314.66絲氨酸2.303974.99組氨酸0.230820.50甘氨酸9.6034220.80蘇氨酸1.8蘭3.93精氨酸4.02958.73丙氨酸3.49037.56酪氨酸0.54779.19胱氨酸0.430210.93綴氨酸1.780333.86蛋氨酸0.588821.28苯丙氨酸0.824561.79異亮氨酸1.242362.69亮氨酸1.867064.04賴氨酸2.193384.75脯氨酸1.970244.27色氨酸-0.00羥脯氨酸2.341715.07總氨基酸46.17007實例四以健康昆明種小白鼠(雌雄各半，4周齡，體重18-22g，由無錫市惠山江南實驗動物場提供批準(zhǔn)號:SCXK(蘇)2002-0006)為實驗動物，對所得到的糖蛋白粉進(jìn)行急性毒性試驗，所得結(jié)果如下表2供試樣品對小鼠體重的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表3急性毒性實驗結(jié)果組別小鼠數(shù)量給藥劑量一周體重增長增長率死亡數(shù)空白對領(lǐng)組100.5mL/只3.374g14.79%0試驗組107500mg/kg1.579g6.63%0通過觀察，給藥后lh內(nèi)小鼠活動均減少，4h后逐漸恢復(fù)正?；顒?。試驗組2d內(nèi)進(jìn)食量有所減少，以后的5d內(nèi)小鼠食欲、精神、毛色均正常；7d后，脫頸處死，肉眼尸檢未見心、肝、脾、肺、腎等主要臟器病變和中毒現(xiàn)象。觀察期7d內(nèi)每天稱重，試驗組小鼠的體重在給藥后2d內(nèi)下降，說明這2d小鼠的進(jìn)食量減少，以后的5d內(nèi)，體重逐漸恢復(fù)并不斷增加。研究結(jié)果表明，在供試樣品大劑量灌胃的情況下，未出現(xiàn)小鼠死亡，也未有明顯毒性反應(yīng)。說明其無毒性或毒性很小，其最大安全劑量在7500mg/Kg以上。實例五以健康昆明種小白鼠(雌雄各半，4周齡，體重18-22g，由無錫市惠山江南實驗動物場提供批準(zhǔn)號SCXK(蘇)2002-0006)為實驗動物，對所得到的糖蛋A粉進(jìn)行抗疲勞保健功能測試，所得結(jié)果如K:1負(fù)重游泳實驗表4供試樣品對小鼠負(fù)重游泳時間的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表4可知，試驗組小鼠的負(fù)重(5%)游泳時間均比對照組的延長，且低劑量組、中劑量組、高劑量組與對照組tti咬，游泳時間的差異具有高度顯著性(P<0.01),表明供試樣品能延長小鼠的負(fù)重游泳時間，增強其耐力。并且低劑量組與中劑量組、高劑量組之間差異顯著(PO.05),中劑量組,高劑量組之間差異不顯著((P>0.05)。'2血清尿素氮測定_表5供試樣品對小鼠尿素氮的影響_<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>方差分析，PO.05;與對照組比較*<0.05;**P<oi~~由表5可知，試驗組的小鼠血清尿素氮含量均低于對照組，且與對照組比較有顯著性差異(P<0.05),表明供試樣品能減少或抑制疲勞小鼠血清尿素氮產(chǎn)生。各劑量組之間差異不顯著(P>0.05)。3肝糖元含量測定表6供試樣品對小鼠肝糖原含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>方差分析，P<0.05;與對照組比較"PO.Ol由表6可知，試驗組小鼠肝糖原含量均高于對照組，且中劑量組、高劑量組與對照組比較，差異有高度顯著性(PO.Ol)，表明供試樣品具有促進(jìn)肝糖原儲備的作用。4血乳酸測定表7供試樣品對小鼠血乳酸的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>方差分析，PO.05;與對照組比較"PO.Ol，*P<0.05由表7可知，試驗組中低劑量組安靜時的血乳酸值與對照組無顯著差異(P>0.05)，中劑量組和高劑量組與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。而各劑量組游泳10min后及游泳10min后休息20min這2個時間點的血？激值均明顯低于對照組，差異均有顯著性(PO.05),但各劑量組之間差異無顯著性(P>0.05)。各劑量組的乳酸曲線下面積與對照組相比，差異具有高度顯著性(PO.Ol)。表明供試樣品能降低小鼠運動后血乳酸含量。抗疲勞實驗結(jié)果表明供試樣品能延長小鼠的負(fù)重游泳時間，減少或抑制疲勞小鼠血清尿素氮產(chǎn)生，降低小鼠運動后血乳酸含量，促進(jìn)肝糖原儲備的作W。根據(jù)功翁巨學(xué)評價檢驗方法，實驗小鼠負(fù)重游泳實驗結(jié)果陽性，血乳酸、血清尿素、肝糖元二項生化指標(biāo)中任二項指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用。本實驗在實驗小鼠負(fù)重游泳實驗結(jié)果陽性基礎(chǔ)上，其余二項生化指標(biāo)均陽性，因此可判定供試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用。權(quán)利要求1.一種霞水母來源的具有抗疲勞活性的糖蛋白。2.如權(quán)稠要求1所述的糖蛋白的制備工藝。該工藝由卜列歩驟組成(1)以水為溶劑對霞水母進(jìn)行浸泡，脫除原料霞水母中所含有的鹽分。(2)自除了鹽分的霞水母進(jìn)行溶融處理，使霞水母消融，得到一無色或淡黃色的粘稠液體。(3)對新得到的粘稠液體，進(jìn)行酶解處理，得到一有沉淀形成的懸浮液。(4)對懸浮液進(jìn)行(或不進(jìn)行)離心、分級、脫色、脫鹽等物理處理，得到一無色或淡黃色的溶液。(5)對溶液進(jìn)行干燥，得到一白色-淺黃色的粉末，即為糖蛋白。所宣稱的霞水母，俗稱麻蜇，系指霞水母科海洋生物白色霞水母(0;朋^"^^;'《/^!'0^^)、發(fā)形霞水母(Cy朋eaccrjw7toa)、棕色霞7^K母(Cya"e"/w"gi"e"Esc/wc/zo/te)或紫色霞水母(Cy。"eapM/pwrea《油力考e)的新鮮捕拂品或其經(jīng)過三礬腌制的腌制品。所宣稱的溶融處理，系指在-定的pH、溫度、壓力下，用特定的溶融劑進(jìn)行的將霞水母融化在水中，形成粘稠滿體的加工過程。所宣稱的酶解處理.系指在一定的pH、溫度、壓力下，用特定的酶對霞水母融化在水中形成的粘稠液體進(jìn)行降解的加工過程。所宣稱的物理處理，系指在一定的溫度、壓力卜，對懸浮液體進(jìn)行的運用離心、分級、脫色、脫鹽等加工過程。所宣稱釣千燥為使經(jīng)過溶液脫除水分，得到固體的加工過程。所宣,糖蛋白為自霞水母中分離提取得到的一種產(chǎn)物。它是一種白色或淡黃色粉末，無嗅，略帶苦味，其中含有70~90%的蛋白質(zhì)，10~30%的糖，平均分子量在1,000~100,000之間。該糖蛋白無毒，具有顯著的抗疲勞生物活性。3.權(quán)利要求2中宣稱的水系指pH調(diào)節(jié)為某一定值的tJ來水或去離子水，其pH值在2-12范圍之內(nèi)。4.權(quán)利要求2中宣稱的浸泡.進(jìn)行6-15次，每次浸泡所需的用水量為所投放的霞水母原料的1-5倍，浸泡溫度在-50-98°C范圍內(nèi)，浸泡時間為0.5—12hr次—1。5.權(quán)利要求2中宣稱的溶融處理，在pH-0.5-6.8的條件下進(jìn)行，其操作壓力為0.0001-0.5MPa,操作溫度為，30-200°C。6.權(quán)利要求2中宣稱的酶解處理，在pH-5.5-7.5的條件下進(jìn)行，其操作壓力為0.0001-0.5MPa，操作溫度為-30-200°C。7.權(quán)利要求2中宣稱的溶融處理，可供選用的溶融劑為0.110molL"的酸(如鹽酸、磷酸、硫酸等無機酸或甲酸、醋酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸等有機酸)。8.權(quán)利要求2中宣稱的酶解處理，可供選用的酶為各種蛋白酶(如胃蛋白K、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶等)中的一種或若千種。9.權(quán)利要求2中宣稱的干燥，可以是冷凍干燥，也可以是噴霧干燥。全文摘要本發(fā)明發(fā)明了一種霞水母來源的具有抗疲勞活性的糖蛋白及其制備工藝，屬天然生物活性物質(zhì)及其制備
技術(shù)領(lǐng)域：
。它提供了一種新型的天然海洋生物活性糖蛋白，該糖蛋白中含75％的蛋白質(zhì)，25％的糖，平均分子量為56,000。其所含單糖以葡萄糖為主，所含氨基酸中甘氨酸占20％以上，羥脯氨酸占5％以上。按照本發(fā)明進(jìn)行操作，能夠獲得2％的純度達(dá)到90％以上的糖蛋白。這種新型糖蛋白完全沒有毒副作用，具有顯著的抗疲勞活性。文檔編號A61K35/56GK101230375SQ200710171189公開日2008年7月30日申請日期2007年11月28日優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日發(fā)明者姜瑞霞,張本田,丹林,湯魯宏申請人:張麗麗;江南大學(xué)