專利名稱：霞水母來(lái)源有免疫增強(qiáng)活性的膠原蛋白肽及制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種霞水母來(lái)源有免疫增強(qiáng)活性的膠原蛋白肽及制備和應(yīng)用，屬天然生物活性物質(zhì)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
霞水母(Cyanea nozakii)，俗稱麻蜇，是一種大型海洋浮游生物，屬刺胞動(dòng)物門(Phylum Cnidaria)，缽水母綱(Class Scyphomedusae)，旗口水母目(Order Phylum cnidaria)，霞水母科(Family Cyanea)。我國(guó)沿海已發(fā)現(xiàn)的有白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyanea ferrugineaEschscholtz)，和紫色霞水母(Cyanea purpurea Kishinouye)4個(gè)種，其中以白色霞水母數(shù)量最多、分布范圍最廣。霞水母通常以小型浮游動(dòng)物為餌，其生殖腺發(fā)達(dá)，繁殖能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度極快，目前我國(guó)霞水母的年產(chǎn)量已經(jīng)高達(dá)千萬(wàn)噸，構(gòu)成了一種新的天然海洋生物資源。
海洋來(lái)源的多糖、蛋白聚糖和膠原蛋白肽是十分重要的天然海洋食品資源，常常具有顯著的生物活性，如海參多糖、海藻多糖等均有許多的研究報(bào)道，證實(shí)其具有顯著的生物活性。以霞水母為原料，從中分離提取制備膠原蛋白肽的研究報(bào)道國(guó)內(nèi)外尚很少見，迄今未見有從中分離提取具有免疫增強(qiáng)活性的膠原蛋白肽的報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明發(fā)明了一種霞水母來(lái)源的具有免疫增強(qiáng)活性的膠原蛋白肽及其制備工藝和應(yīng)用。較為獨(dú)特的是，它以一種新型的天然海洋生物資源-霞水母(Cyanea nozakii)-作為膠原蛋白肽的制備原料進(jìn)行加工，實(shí)現(xiàn)了對(duì)霞水母進(jìn)行開發(fā)利用的目的。按照本發(fā)明進(jìn)行操作，能夠以極高的產(chǎn)率獲得高純度膠原蛋白肽產(chǎn)品。這對(duì)于霞水母這一天然海洋生物資源的綜合利用而言是至關(guān)重要的。
本發(fā)明發(fā)明的霞水母活性膠原蛋白肽經(jīng)初步的研究確認(rèn)，基本無(wú)毒，具有顯著的免疫增強(qiáng)活性，將作為新型的生物活性材料和保健食品原料被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、護(hù)膚美容用品和醫(yī)藥用品等領(lǐng)域。
具體來(lái)說(shuō)，首先，我們發(fā)現(xiàn)新鮮的或經(jīng)過(guò)三礬腌制處理的市售麻蜇可以在經(jīng)過(guò)脫鹽處理之后用作膠原蛋白肽的制備原料。其中所含的膠原蛋白肽對(duì)水浸泡處理是穩(wěn)定的，在我們所采取的浸泡工藝條件下，既不會(huì)因受到浸泡而被降解、被提取到水中流失，也不會(huì)因受過(guò)浸泡而影響其在后續(xù)的水解處理中的分散性，即經(jīng)過(guò)三礬腌制處理的市售麻蜇與剛捕撈上岸的新鮮的霞水母具有同等的可加工性，均可用作制備高純度高生物活性膠原蛋白肽的原料。由此奠定了以霞水母為原料加工制備高純度高生物活性膠原蛋白肽的基礎(chǔ)。
其次，在對(duì)溫度、壓力等水解條件以及氫氧化鈉、鹽酸、膠原蛋白酶等各種常用的溶融劑進(jìn)行了系統(tǒng)的考察和對(duì)比后，我們發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)?shù)乃鈼l件下，霞水母中所含有的膠原蛋白不經(jīng)過(guò)變性處理，便可直接被水解，分散到水中，得到澄清透明，所含雜質(zhì)很少的水解分散液。
我們發(fā)現(xiàn)，在浸泡溶劑、浸泡時(shí)間、水解劑等水解工藝參數(shù)中，水解劑的種類和水解時(shí)所采用的溫度對(duì)于水解得率而言是最為重要的。其中，有效的溶融劑為常見的堿(如鈉、鉀、鈣、鋇的氫氧化物或碳酸鹽、氨水等)、常見的酸(如鹽酸、磷酸、硫酸等無(wú)機(jī)酸或甲酸、醋酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸等有機(jī)酸)或各種蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶等)中的一種或若干種。當(dāng)選用氫氧化鈉為溶融劑時(shí)，pH值應(yīng)當(dāng)在7.0-14.0范圍之內(nèi)，當(dāng)選用鹽酸為溶融劑時(shí)，pH值應(yīng)當(dāng)在0.5-6.8范圍之內(nèi)，當(dāng)選用蛋白酶類為溶融劑時(shí)，pH值應(yīng)當(dāng)在所選酶的最適pH范圍之內(nèi)；當(dāng)選用酸堿為溶融劑時(shí)，融溶溫度應(yīng)當(dāng)在10-120℃范圍內(nèi)，最好是在0-60℃的范圍內(nèi)，當(dāng)選用蛋白酶類為溶融劑時(shí)，應(yīng)當(dāng)在蛋白酶類的最適溫度下進(jìn)行水解。其他各項(xiàng)參數(shù)，浸泡應(yīng)在pH調(diào)節(jié)為2-12范圍內(nèi)某一定值，最好是在6.5～6.8，的水中進(jìn)行，浸泡溫度在0～98℃范圍內(nèi)，最好是在0～15℃的范圍內(nèi)，浸泡操作進(jìn)行至浸泡水的電導(dǎo)率低于30μScm-1停止。離心分離在0～120℃，最好是在0～10℃條件下進(jìn)行，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速在4000～12000rpm之間，最好是在6000～8000rpm之間，離心時(shí)間為10～60min。液體的干燥方式，可以是冷凍干燥，也可以是噴霧干燥。

具體實(shí)施例方式 下面的實(shí)例將具體說(shuō)明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)例一 取1000g三礬腌制處理的市售麻蜇，瀝水后，室溫下浸沒于2-5倍量的去離子水中浸泡，并每2-3小時(shí)換一次水，直至浸泡水中氯化鈉的含量低于1.5ppm(氯離子檢測(cè)呈陰性)，浸泡水的電導(dǎo)率低于30μScm-1為止。浸泡后的脫鹽霞水母添加活力為4000Units的胰蛋白酶10g，在30-60℃下保溫溶融4-24小時(shí)，得到一懸浮液。然后離心(4℃，8000rpm，30min)，棄去不溶性殘?jiān)?，得到澄清透明的液體，即為膠原蛋白肽液；膠原蛋白肽液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，40℃，0.001MPa下濃縮至原體積的1/5后噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度185℃，出風(fēng)溫度85℃)，得到20g純度達(dá)到90％以上的具有顯著的免疫增強(qiáng)活性的膠原蛋白肽粉固體。
實(shí)例二 取100kg新鮮霞水母，3～10℃下浸沒于2-5倍量的去離子水中浸泡，并每2-3小時(shí)換一次水，直至浸泡水的電導(dǎo)率低于30μScm-1為止。浸泡后的脫鹽霞水母添加500g復(fù)合酶制劑(由市售胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶和中性蛋白酶按照1∶1∶1∶1的配比組成)，在35～50℃下保溫處理8-16小時(shí)，然后在4℃，8000rpm下離心30min。棄去不溶性殘?jiān)?，得到澄清透明的液體，即為膠原蛋白肽液；膠原蛋白肽液在40℃，0.001MPa下濃縮至原體積的1/2后冷凍干燥，得到1000g純度達(dá)到95％以上的具有顯著的免疫增強(qiáng)活性的膠原蛋白肽粉固體。
實(shí)例三 對(duì)一份膠原蛋白肽粉樣品進(jìn)行了蛋白含量的測(cè)定，總糖含量的測(cè)定，氨基酸組成的測(cè)定以及單糖組成的測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，該樣品中含88％的蛋白質(zhì)，10.5％的糖，平均分子量為1274。所含單糖以葡萄糖為主，所含氨基酸的組成見表1。
表1供試樣品的氨基酸組成
實(shí)例四 以健康昆明種小白鼠(雌雄各半，4周齡，體重18-22g，由無(wú)錫市惠山江南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供批準(zhǔn)號(hào)SCXK(蘇)2002-0006)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)所得到的膠原蛋白肽粉進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，所得結(jié)果見表2和表3。
表2供試樣品對(duì)小鼠體重的影響
表3急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
通過(guò)觀察，給藥后1h內(nèi)小鼠活動(dòng)均減少，4h后逐漸恢復(fù)正常活動(dòng)。試驗(yàn)組7d內(nèi)進(jìn)食量逐漸增加，且小鼠食欲、精神、毛色均正常；7d后，脫頸處死，肉眼尸檢未見心、肝、脾、肺、腎等主要臟器病變和中毒現(xiàn)象。觀察期7d內(nèi)每天稱重，試驗(yàn)組小鼠的體重不斷增加。研究結(jié)果表明，在供試樣品大劑量灌胃的情況下，未出現(xiàn)小鼠死亡，也未有明顯毒性反應(yīng)。說(shuō)明其無(wú)毒性或毒性很小，其最大安全劑量在7500mg/Kg以上。
實(shí)例五 以健康昆明種小白鼠(雌雄各半，4周齡，體重18-22g，由無(wú)錫市惠山江南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供批準(zhǔn)號(hào)SCXK(蘇)2002-0006)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)所得到的膠原蛋白肽進(jìn)行免疫增強(qiáng)測(cè)試，所得結(jié)果見表4～6。
1小鼠血清溶血素測(cè)定 表4供試樣品對(duì)小鼠血清溶血素的影響
方差分析，P＜0.05；與對(duì)照組比較*P＜0.05 溶血素(IgM)是反映體液免疫功能狀況的一種方法，如果用藥后溶血素生成增多，則出現(xiàn)紅細(xì)胞溶血時(shí)的吸光度值增高，表明用藥后機(jī)體的體液免疫作用增強(qiáng)。由表4結(jié)果可知，高劑量組與空白對(duì)照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，低劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較無(wú)差異性(P＞0.05)，這說(shuō)明，高劑量供試樣品對(duì)血清溶血素(IgM)的生成有十分明顯的影響，表現(xiàn)出較好的體液免疫增強(qiáng)作用。
2小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)測(cè)定 表5供試樣品對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

方差分析，P＜0.01；與對(duì)照組比較**P＜0.01 遲發(fā)型超敏反應(yīng)是反映細(xì)胞免疫功能狀況的一種方法，由表5可知，試驗(yàn)組的小鼠左右耳廓片重量之差與對(duì)照組比較均有增加，中劑量組與空白對(duì)照組比較差異有高度顯著性(P＜0.01)，其中低劑量組和高劑量組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。表明供試樣品在一定濃度范圍內(nèi)能顯著提高小鼠細(xì)胞免疫功能。
3小鼠吞噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定 表6供試樣品對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響
方差分析，P＜0.01；與對(duì)照組比較*P＜0.05；**P＜0.01 吞噬細(xì)胞吞噬功能是反映非特異性免疫功能狀況的一種方法，由表6可知，中劑量組與高劑量組與對(duì)照組比較吞噬百分率有顯著性差異(P＜0.05)，中劑量組與高劑量組與對(duì)照組比較吞噬指數(shù)有高度顯著性差異(P＜0.01)，低劑量組與對(duì)照組比較無(wú)差異(P＞0.05)，說(shuō)明一定劑量的供試樣品能激活吞噬活性，提高單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能。
免疫增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定劑量的供試樣品對(duì)小鼠體液免疫功能，細(xì)胞免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞功能都有一定的增強(qiáng)作用。
根據(jù)功能學(xué)評(píng)價(jià)檢驗(yàn)方法，在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性四個(gè)方面任兩個(gè)方面結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力功能作用。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)小鼠細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能三個(gè)方面結(jié)果陽(yáng)性，因此可判定供試樣品具有免疫增強(qiáng)作用。
權(quán)利要求
1.一種霞水母來(lái)源的具有免疫增強(qiáng)活性的膠原蛋白肽，其特征在于外觀為白色或淡黃色，無(wú)嗅，略帶苦味的粉末，自霞水母科海洋生物白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyanea ferruginea Eschscholtz)或紫色霞水母(Cyanea purpurea Kishinouye)的新鮮捕撈品或其經(jīng)過(guò)三礬腌制的腌制品中分離提取得到，無(wú)毒，具有顯著的免疫增強(qiáng)活性，其中含有80～90％的蛋白質(zhì)，10～20％的糖，平均分子量在1,000～3,000之間。所含單糖以葡萄糖為主，所含氨基酸中甘氨酸占16％以上，脯氨酸與羥脯氨酸之和占18％以上。
2.權(quán)利要求1所述的膠原蛋白肽的制備工藝。該工藝由下列步驟組成
(1)將霞水母用水浸泡；
(2)對(duì)浸泡后的霞水母進(jìn)行溶融處理，然后離心分離，得到無(wú)色或淡黃色的上清液；
(3)將上清液直接干燥或經(jīng)過(guò)均質(zhì)、脫色、脫鹽處理后干燥，得到白色或淺黃色的粉末，即為膠原蛋白肽。
3.如權(quán)利要求2所述的膠原蛋白肽的制備工藝，其特征在于將霞水母在pH調(diào)節(jié)為2-12范圍內(nèi)某一定值的水中浸泡至浸泡水的電導(dǎo)率低于30μScm-1為止，浸泡溫度在0～98℃范圍內(nèi)。
4.如權(quán)利要求2所述的膠原蛋白肽的制備工藝，其特征在于所述的溶融處理指采用溶融劑將霞水母融化于水中形成液體。
5.如權(quán)利要求4所述的膠原蛋白肽的制備工藝，其特征在于所述的溶融劑為堿、酸或各種蛋白酶中的一種或幾種混合。
6.如權(quán)利要求5所述的膠原蛋白肽的制備工藝，其特征在于所述的堿為鈉、鉀、鈣、鋇的氫氧化物或碳酸鹽、氨水，濃度為0.1～10molL-1；所述的酸為鹽酸、磷酸、硫酸、甲酸、醋酸、蘋果酸、乳酸或檸檬酸，濃度為0.1～10molL-1；所述的蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、膠原蛋白酶或彈性蛋白酶。
7.如權(quán)利要求4所述的膠原蛋白肽的制備工藝，其特征在于所述的溶融處理在pH 0.5～14.0，溫度10～120℃，操作壓力0.0001～0.5MPa條件下進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求2所述的膠原蛋白肽的制備工藝，其特征在于所述的干燥為冷凍干燥或噴霧干燥。
9.權(quán)利要求1所述的膠原蛋白肽在具有免疫增強(qiáng)功能的藥品、保健品、護(hù)膚美容用品的制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬天然生物活性物質(zhì)領(lǐng)域，具體涉及一種霞水母來(lái)源的具有免疫增強(qiáng)活性的膠原蛋白肽及其制備工藝和應(yīng)用。該霞水母來(lái)源的膠原蛋白肽含有80～90％的蛋白質(zhì)，10～20％的糖，該膠原蛋白肽的平均分子量在1,000～3,000之間。所含單糖以葡萄糖為主，所含氨基酸中甘氨酸占16％以上，脯氨酸與羥脯氨酸之和占18％以上。該膠原蛋白肽應(yīng)用于制備具有免疫增強(qiáng)功能的藥品、保健品或護(hù)膚美容用品，效果顯著，無(wú)明顯毒副作用。
文檔編號(hào)A61K8/65GK101353380SQ20081002491
公開日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者湯魯宏, 張本田, 超 鄧, 丹 林, 琪 王, 偉 陳 申請(qǐng)人:張麗麗, 江南大學(xué)