專利名稱：一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水母屬刺胞動物門，是一類分布廣泛、生物總量非常龐大的海洋浮游生物。已有大量研究表明，水母體內(nèi)富含多種生物活性物質(zhì)，包括水母毒素蛋白和一些活性強烈、具有良好開發(fā)前景的新功能蛋白。水母類浮游于4-6米深的海水表層，長期生活在強烈的光輻射環(huán)境下。氧化損傷是紫外輻射造成機體損傷的重要機制之一，已有研究表明，浮游生物為避免或減少紫外輻射造成的損害，經(jīng)過長期適應(yīng)性選擇，在其機體內(nèi)產(chǎn)生了種類繁多、結(jié)構(gòu)特異、活性強烈的抗氧化活性物質(zhì)。發(fā)達的抗氧化體系在保護細胞和生物體免受光及感光色素等損傷中起重要作用，能保護強光紫外對生物體的輻射，清除輻射反應(yīng)中產(chǎn)生的自由基。已有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)形霞水母觸手提取物具有很強的體外抗氧化活性，對活性氧族的清除能力遠比常用的抗氧化劑維生素C強。通過硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析等方法也分別從水母Rhopilema esculentum、Stomolophus meleagris中分離出多種具有明顯清除自由基功能的蛋白。這些結(jié)果均表明，水母體內(nèi)含有活性強烈的抗氧化活性組分，是抗氧化、抗輻射活性物質(zhì)的重要來源。盡管如此，目前對水母體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的組成、重要抗氧化酶類(蛋白)的序列信息、表達情況、抗氧化活性水平等尚未有系統(tǒng)的了解。過氧化物還原酶(Peroxiredoxin, Prx)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要的抗氧化酶,廣泛存在于各種生物體內(nèi)。過氧化物還原酶在清除活性氧中發(fā)揮重要作用，也是近年來抗氧化活性方面的研究熱點之一。目前已被報導(dǎo)的過氧化物還原酶類主要有六種，根據(jù)含有半胱氨酸殘基數(shù)目，可將其分為1-Cys和2-Cys兩個亞類。除過氧化物酶6為1-Cys亞類外，其余五種均屬于2-Cys亞類。過氧化物還原酶的主要功能是清除機體新陳代謝產(chǎn)生的活性氧，故主要分布于細胞質(zhì)、線粒體等容易產(chǎn)生活性氧的結(jié)構(gòu)中。過氧化物還原酶能對機體內(nèi)各種生物反應(yīng)進行調(diào)節(jié)，參與細胞增殖、細胞凋亡、信號傳導(dǎo)等過程，從而保護機體應(yīng)對氧化損傷和保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。過氧化氫在細胞內(nèi)可以與信號通路中蛋白質(zhì)的疏基發(fā)生反應(yīng)，使蛋白活化或失活，從而對信號傳導(dǎo)過程進行調(diào)節(jié)，但過高的過氧化氫會對細胞造成損害，甚至引起細胞死亡，過氧化物酶可將大量多余的過氧化氫還原為水，從而保護機體減少或避免此類氧化性損傷。目前，國內(nèi)外尚未見對水母過氧化物還原酶的有關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶及其編碼基因，本發(fā)明的另一目的在于提供該發(fā)形霞水母過氧化物還原酶在制備抗氧化藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑、抗衰老藥物等中的應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建 發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫，并對該文庫重組克隆的序列進行測定和注釋分析，獲得了發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的編碼基因。該發(fā)形霞水母過氧化物還原酶是首次發(fā)現(xiàn)的具有明顯抗氧化活性的水母類過氧化物還原酶，是水母體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要活性組分，該還原酶在抗氧化、抗輻射藥物研究中具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的主要技術(shù)方案是，通過構(gòu)建發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫，對其進行測序和篩選，獲得發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的編碼基因，并對其抗氧化活性進行研究。本發(fā)明的第一方面，提供了一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶，所述的一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶，具有如下(i )或( )的蛋白質(zhì):( i )具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(ii)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且同等功能的由(i )衍生的蛋白質(zhì)。所述的一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶，具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，該蛋白含有信號肽，為分泌蛋白，定位于細胞外，分子量27.9kDa，等電點為6.3。本發(fā)明還提供了一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的編碼基因，為如下(i )或( )的DNA分子:( i )具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；(ii )與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列同源性在80%以上的核苷酸序列。所述的一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的編碼基因，該核苷酸序列全長884bp，包含一個744bp的開放閱讀框，如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明的第二方面，提供了一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的制備方法，該方法包括如下步驟:·(I)構(gòu)建發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫；(2)對上述發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫重組克隆的序列進行測定和分析，獲得一個編碼過氧化物還原酶的核苷酸序列；(3)構(gòu)建發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的表達質(zhì)粒，重組工程菌；(4)發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的表達；(5)重組發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的純化。所述步驟(I)中的發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫通過如下方法構(gòu)建:I)抽提發(fā)形霞水母觸手組織總RNA ；2 )分離mRNA，合成發(fā)形霞水母觸手組織cDNA ；3)將上述cDNA插入pUC19質(zhì)粒載體，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，涂布于LB培養(yǎng)基平板進行藍白斑篩選，即構(gòu)建成發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫。所述步驟(3)中的構(gòu)建發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的表達質(zhì)粒，重組工程菌，具體步驟為:I)根據(jù)發(fā)形霞水母過氧化物還原酶基因序列以及原核表達載體pET24a的酶切位點，設(shè)計一對帶有特異性酶切位點Nhe I和Xho I的PCR引物，如下所示:上游引物:5’ -CTAGCTAGCATGAAAGATGACGAGTC-3 ’下游引物:5，-CCGCTCGAGCATTTCTTCCTTC-3，PCR 反應(yīng)條件為:95°C保溫 5min ;95°C保溫 30sec，55.5°C保溫 30sec，68°C保溫lmin, 30 個循環(huán)；68°C保溫 5min ；
2)酶切回收后的PCR產(chǎn)物及pET24a原核表達質(zhì)粒；3)利用兩個酶切位點將編碼序列連接到pET24a載體上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta (DE3)獲得重組工程菌。所述步驟(4)中的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的表達條件為:12°C，0.5mM IPTG,150rpm/min下誘導(dǎo)10小時,在此誘導(dǎo)條件下重組蛋白主要以可溶形式表達,表達量占總蛋
白量的30%左右。所述步驟(5)中的純化為采用鎳離子親和層析柱一步純化即得，洗脫條件為分別占總體積50%的結(jié)合緩沖液與50%的洗脫緩沖液；其中，結(jié)合緩沖液為NaH2P0420mM;NaC1500mM;咪唑 30mM ；pH7.4，洗脫緩沖液為 NaH2P0420mM; NaC1500mM;咪唑500mM ；pH7.4。本發(fā)明的第三方面，提供了發(fā)形霞水母過氧化物還原酶及其編碼基因在制備抗氧化藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑、抗衰老藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫，采用BLASTx分析法，獲得了一個編碼過氧化物還原酶的序列，即包含序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。此核苷酸序列全長884bp,包含一個744bp的開放閱讀框,編碼一個含248個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，即序列表SEQ ID N0.2所不氨基酸序列。該蛋白含有信號肽,為分泌蛋白，定位于細胞外。分子量27.9kDa，等電點為6.3。本發(fā)明通過構(gòu)建發(fā)形霞水母過氧化物還原酶基因的原核重組表達載體，將重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞，篩選得到表達發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的重組菌，誘導(dǎo)表達后利用親和層析法純化獲得重組蛋白，方法簡單，價格低廉。本發(fā)明獲得的重組發(fā)形霞水母過氧化物還原酶具有顯著的抗氧化活性。通過ABTS+自由基清除法檢測到純化蛋白清除ABTS+自由基的能力為維生素C等價物Trolox的23倍。胰島素還原法實驗中，DTT存在的情況下，胰島素A、B鏈間的二硫鍵可以被重組發(fā)形霞水母過氧化物還原酶還原而斷裂，兩鏈解離，因B鏈的溶解度較低而使反應(yīng)液變渾濁，在655nm處吸光值升高。在進行純化蛋白對H2O2清除能力的檢測時，可觀察到隨著純化蛋白濃度的升高或作用時間的延長，反應(yīng)液在475nm處吸光值持續(xù)下降，說明剩余H2O2量隨之減少。此外，還通過超螺旋質(zhì)粒的保護實驗證實了純化蛋白對超螺旋DNA構(gòu)象具有明顯的保護作用。因此，本發(fā)明中涉及的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶在開發(fā)抗氧化藥物、抗衰老藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑方面將有很大的應(yīng)用價值。


圖1為發(fā)形霞水母過氧化物還原酶與其他物種過氧化物還原酶序列的多重比對；其中黑色代表完全同源的區(qū)域。圖2為本發(fā)明中擴增發(fā)形霞水母過氧化物還原酶開放閱讀框(不含編碼信號肽的區(qū)域)編碼序列的梯度PCR產(chǎn)物的核酸電泳結(jié)果；其中，M:2kb的核酸分子量Marker ;1_12:梯度PCR產(chǎn)物。圖3為本發(fā)明中重組發(fā)形 霞水母過氧化物還原酶誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE電泳結(jié)果；其中，M:蛋白分子量Marker ;1，4:誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌超聲裂解液；2，5:誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌超聲裂解上清；3:誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌超聲裂解沉淀。圖4為本發(fā)明中重組發(fā)形霞水母過氧化物還原酶分離純化的SDS-PAGE電泳結(jié)果；其中，1:未誘導(dǎo)的重組大腸桿菌；2:誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌超聲裂解上清；3:重組蛋白純化時穿透峰；4，5:重組蛋白純化時洗脫峰。圖5為檢測重組發(fā)形霞水母過氧化物還原酶抗氧化能力(ABTS+自由基清除法)時用維生素C等價物Trolox反應(yīng)而制作的標(biāo)準曲線(y=_0.0005x+0.2979，R2=0.9976)。圖6為檢測重組發(fā)形霞水母過氧化物還原酶對胰島素A、B鏈間二硫鍵還原作用能力的曲線圖。圖7為檢測重組發(fā)形霞水母過氧化物還原酶對H2O2清除能力的曲線圖。圖8為檢測純化蛋白對超螺旋構(gòu)象DNA保護作用的核酸電泳結(jié)果；其中，
酸分子量 Marker ；1:質(zhì)粒；2:質(zhì)粒、FeCl3 ；3:質(zhì)粒、DTT ；4:質(zhì)粒、FeCl3、DTT ；5-10:質(zhì)粒、FeCl3、DTT 及不同濃度(200，150，100，50，25，12.5 μ g/ml)重組蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細描述。但下列實施例不應(yīng)看作對本發(fā)明范圍的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。用實施例1制得的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶進行實施例2-5的實驗。

本發(fā)明選擇的發(fā)形霞水母(Cyanea Capillata)采集自浙江省三門灣海域,并經(jīng)集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院教授鑒定(L.Xiao et al, Toxicon, 2009，53:146 - 152)。實施例1:發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的篩選及制備。1.發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫的構(gòu)建和分析I)總RNA的抽提根據(jù)Invitrogen公司的Trizol試劑說明進行,氯仿去除蛋白質(zhì)，獲得約7 μ g總RNA ；2)mRNA 的分離按照 QIANGEN 公司的 Oligotex mRNA Spin-coIumn Kit 說明進行，cDNA 的合成則參照 Clontech 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 說明進行；3)將cDNA插入pUC19質(zhì)粒載體(購自Takara公司)，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α(購自博邁德公司)中，涂布于15CM培養(yǎng)皿進行藍白斑篩選，即構(gòu)建成發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫。該文庫共有菌落1923個，其中藍斑35個，重組率98.18%，庫容量1.92*106，插入長度彡400bp的有效序列1035條，采用100bp、90%的原則對這些序列進行unigene歸并，得到unigene數(shù)為528條。同時對序列進行全長分析，在20條序列中有12條序列有相關(guān)同源信息，結(jié)果為其中12條全長，完整性比率:12/12X100%= 100%，表明該cDNA文庫具有較好的質(zhì)量。對該cDNA文庫進行隨機測序，所得序列經(jīng)去載體后進行BLAST分析(http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov)。2.發(fā)形霞水母過氧化物還原酶基因序列的分析發(fā)形霞水母過氧化物還原酶基因來自上述cDNA文庫中編號為4D10的克隆。序列全長884bp，如SEQ ID NO:1所示，包含一個744bp的開放閱讀框；編碼含248個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，如SEQ ID NO: 2所示，分子量27.9kDa，等電點6.3。
Blastx搜索結(jié)果顯示該蛋白與多個物種的過氧化物還原酶具有高度同源性(如圖1 )，是水母來源的過氧化物還原酶家族的新分子。對其進一步的生物信息學(xué)分析顯示，該蛋白含有信號肽，為分泌蛋白，定位于細胞外。3.發(fā)形霞水母過氧化物還原酶重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及工程菌重組I)根據(jù)發(fā)形霞水母過氧化物還原酶基因序列以及原核表達載體pET24a (購自Novagen公司)的酶切位點，設(shè)計并合成一對引物，擴增范圍不包含開放閱讀框中編碼信號肽結(jié)構(gòu)的區(qū)域，其中上游引物包含酶切位點Nhe I (GCTAGC)，下游引物包含酶切位點Xho I (CTCGAG),兩引物的序列具體如下:上游引物:5’-CTAGCTAGCATGAAAGATGACGAGTC-3’(SEQ ID NO:3)下游引物:5’-CCGCTCGAGCATTTCTTCCTTC-3’ (SEQ ID N0:4)經(jīng)過梯度PCR實驗后，選定55.5°C為最佳退火溫度，對目的基因進行PCR大量擴增，PCR反應(yīng)條件為:
權(quán)利要求
1.一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶，其特征在于，所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶具有如下(i )或(ii)的蛋白質(zhì) (i )具有SEQ ID NO:2所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (ii )SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且同等功能的由(i )衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶，其特征在于所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，該蛋白含有信號肽，為分泌蛋白，定位于細胞外，分子量27. 9kDa，等電點為6. 3。
3.—種如權(quán)利要求I所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的編碼基因，其特征在于，該編碼基因為如下(i )或( )的DNA分子 (i )具有SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列； ( )與SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列同源性在80%以上的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的所述的一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的編碼基因，其特征在于所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的編碼基因，該核苷酸序列全長884bp，包含一個744bp的開放閱讀框。
5.一種如權(quán)利要求2所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 (A)構(gòu)建發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫； (B)對上述發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫重組克隆的序列進行測定和分析，獲得一個編碼過氧化物還原酶的核苷酸序列； (C)構(gòu)建發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的表達質(zhì)粒，重組工程菌； (D)發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的表達； (E)重組發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的制備方法，其特征在于所述步驟(A)中的發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫通過如下方法構(gòu)建 a)抽提發(fā)形霞水母觸手組織總RNA； b)分離mRNA，合成發(fā)形霞水母觸手組織cDNA； c)將上述cDNA插入pUC19質(zhì)粒載體，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，涂布于LB培養(yǎng)基平板進行藍白斑篩選，即構(gòu)建成發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的制備方法，其特征在于所述步驟(C)中的構(gòu)建發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的表達質(zhì)粒，重組工程菌，具體步驟為 a)設(shè)計并合成PCR引物如下 上游引物如SEQ ID NO:3所示， 下游引物如SEQ ID N0:4所示， PCR 反應(yīng)條件為95°C保溫 5min ;95°C保溫 30sec，55. 5°C保溫 30sec，68°C保溫 lmin，30個循環(huán)；68°C保溫5min ； b)酶切回收后的PCR產(chǎn)物及pET24a原核表達質(zhì)粒； c)利用兩個酶切位點將編碼序列連接到pET24a載體上，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta獲得重組工程菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的制備方法，其特征在于所述步驟(D)中的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的表達條件為12°C，0. 5mM IPTG，150rpm/min下誘導(dǎo)10小時。
9.一種如權(quán)利要求I或2所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶在制備抗氧化藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑或抗衰老藥物中的應(yīng)用。
10.一種如權(quán)利要求3所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的編碼基因在制備抗氧化藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑或抗衰老藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，目前尚未見對水母過氧化物還原酶的有關(guān)研究報道。本發(fā)明提供了一種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶，所述的發(fā)形霞水母過氧化物還原酶，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了發(fā)形霞水母過氧化物還原酶的編碼基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。同時，本發(fā)明還提供了發(fā)形霞水母過氧化物還原酶及其編碼基因在制備抗氧化藥物、抗輻射藥物、皮膚防護劑、食品防腐劑、抗衰老藥物等中的應(yīng)用。本發(fā)明具有較大的臨床應(yīng)用價值。
文檔編號A61K48/00GK103255113SQ20131018870
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月21日
發(fā)明者張黎明, 阮增良, 柳國艷, 周永紅, 張博, 常銀龍, 鄭杰民, 王倩倩 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)