專(zhuān)利名稱(chēng)：一種水母毒素去溶血毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種水母毒素去溶血毒性的方法。
背景技術(shù)：
水母毒素是一類(lèi)結(jié)構(gòu)新穎、毒性極強(qiáng)的肽類(lèi)毒素，具有心血管、溶血、神經(jīng)、呼吸等多種生物活性。由于水母毒素具有溫度敏感、不穩(wěn)定、易粘附、易失活等特點(diǎn)，其毒性成分的 純化與鑒定工作進(jìn)展緩慢，總體上滯后于其他常見(jiàn)生物毒素。水母毒素心血管毒性和溶血毒性在水母蜇傷中毒中發(fā)揮重要作用，也是水母毒素 中研究報(bào)道最多的兩類(lèi)毒性組分。其中心血管毒性組分豐度較低，但造成的心血管功能 損傷是水母毒素致死的主要原因(Xiao L，Liu GS, Wang QQ, et al.，The lethality of tentacle-only extractfrom jellyfish Cyanea capillata is primarily attributed to cardiotoxicity inanaesthetized SD rats [J].Toxicon. 2010, 55(4) :838_845)。溶 血毒性組分豐度較高，溶血會(huì)造成血鉀升高，對(duì)損傷心血管功能可能起協(xié)同作用(Xiao L， Zhang J,Wang QQ,et al. ,In vitro and in vivo haemolyticstudies of tentacle-only extract from jellyfish Cyanea capillata[J]. Toxicol In Vitro. 2010,doi :10.1016/ j. tiv. 2010. 02. 009)。因此，要深入研究水母毒素心血管毒性機(jī)理，必須去除水母粗毒中高 豐度的溶血毒性組分，以利于心血管毒性蛋白的分離純化。研究表明，心血管毒性組分比溶血毒性組分更為耐堿(聶菲，肖良，張靜，等.發(fā) 形霞水母毒素分離產(chǎn)物溶血活性的比較及其影響因素分析[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).2008， 29(1) :83_86 ；Xiao L，He Q，GuoY, et al.，Cyanea capillata tentacle-only extract as a potential alternativeof nematocyst venom Its cardiovascular toxicity and tolerance toisolation and purification procedures[J]. Toxicon. 2009, 53(1) 146-152)。但至今未見(jiàn)用堿性條件去除水母粗毒中高豐度溶血毒性組分的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種水母毒素去溶血毒性的方法，步驟如下1.制備水母粗毒提取液1)采樣將采集到的水母迅速剪下觸手，立即將觸手干冰冷凍，運(yùn)回后置于_70°C 超低溫冰箱凍存?zhèn)溆茫?)制備水母粗毒提取液將凍存觸手用自配海水于4°C自溶4天，磁力攪拌器攪 拌，收集觸手自溶液體，IOOOOg離心15min，上清液即水母粗毒提取液；2.制備去溶血毒性的水母毒素溶液1)用堿性條件破壞溶血毒性蛋白將上述制備的水母粗毒提取液用0. lmol/L NaOH調(diào)pH至10. 5，靜置4h，IOOOOg離心15min去沉淀，取上清；2)純化選用合適的透析袋及透析緩沖液，采用透析方法可將被破壞的溶血毒性 蛋白或其他雜蛋白和雜質(zhì)去除，而保留水母毒素的心血管毒性組分。
本發(fā)明選用透過(guò)分子量為IOkDa的透析袋，將上述上清液先用0. 02mol/L、pH6. 0 醋酸緩沖液透析24h，再將緩沖液更換為0. 02mol/L、pH 9. 5Tris-醋酸緩沖液繼續(xù)透析 24h，IOOOOg離心15min，棄沉淀，上清液即為去溶血毒性的水母毒素溶液。本發(fā)明將水母毒素去溶血毒性前后的蛋白濃度、溶血毒性和心血管毒性進(jìn)行了對(duì) 比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，所制備的去溶血毒性的水母毒素的蛋白濃度大大低于水母粗毒，溶血毒 性基本喪失，而心血管毒性只略低于水母粗毒，說(shuō)明本發(fā)明方法能有效去除水母毒素的溶 血毒性，并能保存其心血管毒性，有利于深入研究水母毒素心血管毒性機(jī)理。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，為深入研究水母毒素心血管毒性機(jī)理提供了一種去溶血毒性的 簡(jiǎn)便而有效的方法。


圖1.水母粗毒與去溶血毒性水母毒素的溶血活性比較圖。圖2.水母粗毒與去溶血毒性水母毒素的心血管活性比較圖。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。實(shí)施例1.制備去溶血毒性水母毒素1.制備水母粗毒提取液發(fā)形霞水母采自浙江省三門(mén)灣海域，取觸手10g，加入自配海水(NaCl 28g， MgCl2 · 6H20 5g，KCl 0. 8g, CaCl2L 033g，加水至 1000ml) 10ml,自溶 4 天，磁力攪拌器每日 攪拌2次，每次lOmin。100目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾3次，濾液IOOOOg離心3次，每次15min，收集 上清即水母粗毒提取液(cTOE，crude tentacle-only extract)。制備去溶血毒性的水母
毒素將上述水母粗毒提取液采用0. lmol/L NaOH調(diào)pH至10. 5，靜置4h，IOOOOg離心 15min去沉淀，取上清；上清液用透過(guò)分子量為IOkDa的透析袋進(jìn)行透析，先用0. 02mol/ L、pH 6. 0醋酸緩沖液透析24h，再將緩沖液更換為0. 02mol/L、pH 9. 5Tris-醋酸緩沖液 繼續(xù)透析24h，IOOOOg離心15min，棄沉淀，上清液即為去溶血毒性的水母毒素溶液(tTOE， treated tentacle-only extract)0所有操作都在冰水或4°C條件下進(jìn)行。使用前采用0. 01mol/L、pH7. 4PBS透析8h。水母毒素去溶血毒性前后蛋白濃度、溶血毒性和心血管毒性對(duì)比實(shí)驗(yàn)1)蛋白濃度比較蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法進(jìn)行，測(cè)得cTOE蛋白濃度為1. 5mg/ml，而tTOE蛋 白濃度為0.5mg/ml，是cTOE蛋白濃度的1/3。說(shuō)明通過(guò)本方法可以大大降低cTOE中的雜 蛋白濃度。2)溶血毒性比較雄性SD大鼠1只(第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供，下同)，體重250g，用25%烏拉坦 腹腔注射麻醉，按體重麻醉劑量為1. 2g/kg。股動(dòng)脈插管取大鼠動(dòng)脈血，等體積50u肝素生 理鹽水抗凝，PBS漂洗數(shù)次，每次漂洗后3000g離心5min棄上清，直至上清清亮為止。紅細(xì) 胞與PBS按體積比1 50(2% )稀釋成紅細(xì)胞懸液。反應(yīng)總體積1.5ml，其中紅細(xì)胞懸液0. 5ml，實(shí)驗(yàn)組cTOE和tTOE各設(shè)5個(gè)劑量組，分別加入0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，再用PBS加 至反應(yīng)總體積1. 5ml ；陰性對(duì)照組不加毒素(即Oml)，陽(yáng)性對(duì)照組加0. 4ml 0. 2mg/ml皂素， 也用PBS加至反應(yīng)總體積1. 5ml。37°C水浴30min，3000g離心5min，用分光光度計(jì)分別檢 測(cè)A545，計(jì)算溶血分?jǐn)?shù)，溶血分?jǐn)?shù)=[(樣品管A545)-(陰性對(duì)照A545) ]/[(陽(yáng)性對(duì)照A545)-(陰 性對(duì)照A545)] X 100%，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，cTOE溶血毒性非常強(qiáng)烈，呈劑量依賴(lài)性，而 tTOE的溶血毒性幾乎完全喪失，說(shuō)明制備tTOE的過(guò)程中成功去除了 cTOE中的溶血毒性。3)心血管毒性比較雄性SD大鼠12只，體重200 250克，隨機(jī)分為cTOE與tTOE兩組，每組6只，25%烏拉坦腹腔注射麻醉，按體重麻醉劑量1. 2g/kg。左側(cè)股動(dòng)脈插管連接壓力感受器， MPA生物信號(hào)分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)并記錄SD大鼠股動(dòng)脈血壓的變化。右側(cè)頸外靜脈置管，按體重 給藥，劑量分別為cTOE 10mg/kg, tTOE 3. 3mg/kg(相當(dāng)于cTOE 10mg/kg)，觀察SD大鼠血 壓變化，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3的A、B、C中可以看出，通過(guò)本發(fā)明方法處理后的tTOE雖然與 cTOE相比心血管毒性稍弱，但仍具有很強(qiáng)的心血管毒性，說(shuō)明本方法在去除溶血毒性等非 心血管毒性成分的同時(shí)，能較好地保存心血管毒性成分。
權(quán)利要求
一種水母毒素去溶血毒性的方法，步驟如下1)制備水母粗毒提取液將采集到的水母迅速剪下觸手，立即將觸手干冰冷凍，再置于-70℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?；將凍存觸手用自配海水于4℃自溶4天，磁力攪拌器攪拌，收集觸手自溶液體，10000g離心15min，上清液即為水母粗毒提取液；所說(shuō)自配海水為NaCl 28g，MgCl2·6H2O 5g，KCl 0.8g，CaCl2 1.033g，加水至1000ml；2)制備去溶血毒性的水母毒素溶液將上述制備的水母粗毒提取液用0.1mol/L NaOH調(diào)pH至10.5，靜置4h，10000g離心15min去沉淀，取上清；上清液用透過(guò)分子量為10kDa的透析袋進(jìn)行透析，先用0.02mol/L、pH 6.0醋酸緩沖液透析24h，再將緩沖液更換為0.02mol/L、pH 9.5Tris-醋酸緩沖液繼續(xù)透析24h，10000g離心15min，棄沉淀，上清液即為去溶血毒性的水母毒素溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種水母毒素去溶血毒性的方法。步驟為1)將水母觸手用自配海水于4℃自溶4天，磁力攪拌器攪拌，收集觸手自溶液體，10000g離心15min，上清液即為水母粗毒提取液；2)將水母粗毒提取液用0.1mol/L NaOH調(diào)pH至10.5，靜置4h，10000g離心15min去沉淀，上清液用透過(guò)分子量為10kDa的透析袋進(jìn)行透析，先用0.02mol/L、pH 6.0醋酸緩沖液透析24h，再將緩沖液更換為0.02mol/L、pH 9.5Tris-醋酸緩沖液繼續(xù)透析24h，10000g離心15min，棄沉淀，上清液即為去溶血毒性的水母毒素溶液。本發(fā)明為水母毒素提供了一種去溶血毒性的簡(jiǎn)便而有效的方法。
文檔編號(hào)A61P7/00GK101822692SQ201010149779
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者劉四化, 張黎明, 王倩倩, 肖良 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)