專(zhuān)利名稱(chēng)：用于生產(chǎn)絲紡絲液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)包含具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的絲蛋白如蜜蜂絲蛋白的絲紡絲液的方法。所述絲紡絲液能夠用于多種目的如個(gè)人護(hù)理用品、塑料、紡織物和生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
絲是由種類(lèi)繁多的昆蟲(chóng)和蜘蛛物種生產(chǎn)的蛋白纖維。家蠶(Bombyx mori)的絲作為縫合生物材料已被使用數(shù)百年。為了在轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中克隆和表達(dá)蠶或蜘蛛的絲的許多努力已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這是非常艱巨的任務(wù)(海格力斯任務(wù)，Herculean task)。這些絲基因的大尺寸和高度重復(fù)性序列使得它們頑抗在專(zhuān)門(mén)的絲腺以外表達(dá)，并且導(dǎo)致低蛋白質(zhì)產(chǎn)率。盡管蠶繭和蛛網(wǎng)是最為人所熟知的絲，但是其他物種可以生產(chǎn)更適于轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的絲。意大利蜜蜂(Apis mellifera)幼蟲(chóng)紡出絲苗,它們?cè)谄渲蟹趸捎?。蜜蜂絲由四個(gè)小的(每一個(gè) 30 kDa)和非重復(fù)性的纖維基因編碼(Sutherland等人，2006)。四個(gè)基因的同源組也已經(jīng)在大黃蜂、斗牛犬蟻、黃猄蟻、川軍蜂和亞細(xì)亞蜜蜂中被發(fā)現(xiàn)(Sutherland等人，2007 ；Sezutsu 等人，2007 ；Shi 等人，2008 ；W0 2007/038837)。老式的X射線纖維衍射研究證明蜜蜂絲含有排列成卷曲螺旋構(gòu)象的α -螺旋蛋白，最可能為四聚卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(Atkins, 1967),具有可能對(duì)應(yīng)于四種不同的絲蛋白的四條鏈。生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)所述蜜蜂絲蛋白序列的每一種均含有60-68%的卷曲螺旋(Sutherland 等人，2006)。絲線能夠從蜜蜂幼蟲(chóng)的所述絲腺中被拉伸出來(lái)。這些線與蠶絲纖維相比強(qiáng)度較弱但是延展性和韌性較好(Hepburn等人，1979)。Shi等人(2008)最近報(bào)道了亞細(xì)亞蜜蜂(Apis cerana)絲的重組生產(chǎn)。四種亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白在大腸桿菌中被表達(dá)成可溶的形式，具有每升酵素10-60 mg的產(chǎn)率。使用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)描述低濃度下(O. 03至0.2重量％)所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和相互作用的特征。這些確鑿地證明既非單獨(dú)的蛋白質(zhì)亦非四種蛋白質(zhì)的混合在溶液中具有緊密的三級(jí)包裝。所述蛋白質(zhì)作為單體或疏松的關(guān)聯(lián)二聚體存在并且具有幾乎不含α-螺旋結(jié)構(gòu)的高度隨機(jī)的螺旋構(gòu)象。需要有更深入的方法用于由能夠用于制造種類(lèi)繁多的產(chǎn)品的重組表達(dá)的卷曲螺旋絲蛋白來(lái)生產(chǎn)絲紡絲液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)表面活性劑和離子液體能夠用在生產(chǎn)包含卷曲螺旋絲蛋白的絲紡絲液的方法中。在第一方面中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)絲紡絲液的方法，所述方法包含i)裂解生產(chǎn)一種或多種絲蛋白的細(xì)胞，ii)通過(guò)采用表面活性劑或離子液體接觸它們使所述絲蛋白溶解，和
iii)濃縮所述絲蛋白來(lái)生產(chǎn)絲紡絲液，其中所述一種或多種絲蛋白能夠形成包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述絲蛋白被濃縮，通過(guò)a)通過(guò)加入沉淀所述表面活性劑的化合物來(lái)減少溶液中所述表面活性劑的量，和b)從在步驟a)中形成的所述沉淀中分離包含所述絲蛋白的溶液以生產(chǎn)所述絲紡絲液。能夠用于沉淀表面活性劑的化合物是本領(lǐng)域已知的并且包括鹽或碳水化合物；或其兩種或多種的組合。優(yōu)選地，所述鹽是鉀鹽或鈉鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述碳水化合物是α-環(huán)糊精。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述絲蛋白通過(guò)過(guò)濾被濃縮，更優(yōu)選膜過(guò)濾，并且甚至更優(yōu)選正切流動(dòng)過(guò)濾。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包含增加所述絲紡絲液中絲蛋白的濃度。這通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法能夠被實(shí)現(xiàn)。例如，所述絲紡絲液對(duì)抗脫水溶液被濾膜分析，如包含吸濕性聚合物的溶液。吸濕性聚合物的實(shí)例包括，但不限于，聚乙二醇、淀粉酶和絲膠，或其兩種或多種的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲紡絲液包含至少大約O. 5%w/v的絲蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述絲紡絲液包含大約O. 5%至大約15%的絲蛋白。所述細(xì)胞能夠是任何細(xì)胞類(lèi)型，典型地是包含編碼所述絲蛋白的外源性多聚核苷酸，并且能夠生產(chǎn)所述絲蛋白的重組細(xì)胞。實(shí)例包括，但不限于，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，或其兩種或多種的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟i)進(jìn)一步包含從已裂解的細(xì)胞中分離包涵體。所述方法還可以包含在步驟i)之前培養(yǎng)所述細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲蛋白能夠形成包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的部分包含七肽序列abcdefg的至少10個(gè)拷貝，并且其中處于位置a和d上的至少25%的氨基酸是丙氨酸殘基。更優(yōu)選地，處于位置a、d和e上的至少25%的氨基酸是丙氨酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述絲蛋白包含如下序列，更優(yōu)選基本上由如下序列組成，甚至更優(yōu)選由如下序列組成，所述序列選自a)如 SEQ ID NO I 至 8、17 至 24、33 至 40、49 至 56、65 至 72、81 至 88、97 至 98 中
任一個(gè)所提供的氨基酸系列，b)與 SEQ ID NO I 至 8、17 至 24、33 至 40、49 至 56、65 至 72、81 至 88、97 至 98 中任一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸系列，和c) a)或b)的生物學(xué)活性片段。在以上方面，優(yōu)選絲蛋白盡可能少地從細(xì)胞分泌。相應(yīng)地，優(yōu)選絲蛋白不包含N末端信號(hào)系列。對(duì)于以上方面特別有用的絲蛋白的例子包括但不局限于，包含如下序列、更優(yōu)選基本上由如下序列組成、甚至更優(yōu)選由如下序列組成的絲蛋白，所述序列選自a)如 SEQ ID NO 1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、53、55、65、67、69、
71、81、83、85、87或97中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列，b)與 SEQ ID NO 1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、53、55、65、67、69、71、81、83、85、87或97中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列，和c) a)或b)的生物學(xué)活性片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述絲蛋白能夠是許多相同的絲蛋白或是兩種或多種不同的絲蛋白的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果使用不同的絲蛋白，那么就是四種不同的絲蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述絲蛋白包含第一絲蛋白，所述第一絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其 組成，a)如 SEQ ID NO 1、2、17、18、33、34、49、50、65、66、81 或 82 中任何一個(gè)所提供的氨
基酸序列；b)與 SEQ ID NO 1、2、17、18、33、34、49、50、65、66、81 或 82 中任何一個(gè)或多個(gè)至少
30%相同的氨基酸序列；和c) a)或b)的生物學(xué)活性片段，第二絲蛋白，所述第二絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其組成，d)如 SEQ ID NO 3、4、19、20、35、36、51、52、67、68、83 或 84 中任何一個(gè)所提供的氨
基酸序列；e)與 SEQ ID NO 3、4、19、20、35、36、51、52、67、68、83 或 84 中任何一個(gè)或多個(gè)至少
30%相同的氨基酸序列；和f) c)或d)的生物學(xué)活性片段，第三絲蛋白，所述第三絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其組成，g^BSEQ ID NO 5、6、21、22、37、38、53、54、69、70、85 或 86 中任何一個(gè)所提供的氨
基酸序列；h)與 SEQ ID NO 5、6、21、22、37、38、53、54、69、70、85 或 86 中任何一個(gè)或多個(gè)至少
30%相同的氨基酸序列；和i) g)或h)的生物學(xué)活性片段，和/或第四絲蛋白，所述第四絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其組成，j ^BSEQ ID NO 7、8、23、24、39、40、55、56、71、72、87 或 88 中任何一個(gè)所提供的氨
基酸序列；k)與 SEQ ID NO 7、8、23、24、39、40、55、56、71、72、87 或 88 中任何一個(gè)或多個(gè)至少
30%相同的氨基酸序列；和I) j)或k)的生物學(xué)活性片段。更優(yōu)選地，關(guān)于以上方面，所述絲蛋白包含第一絲蛋白、第二絲蛋白、第三絲蛋白和第四絲蛋白，或基本上由其組成，所述第一絲蛋白包含，更優(yōu)選地基本上由其組成，甚至更優(yōu)選地由其組成，a)如SEQ ID NO I、17、33、49、65或81中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列；b)與SEQ ID NO I、17、33、49、65或81中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和c) a)或b)的生物學(xué)活性片段，
第二絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其組成，d)如SEQ ID NO 3、19、35、51、67或83中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列；e)與SEQ ID NO 3、19、35、51、67或83中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和f ) d)或e)的生物學(xué)活性片段，第三絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其組成，g)如SEQ ID NO 5、21、37、53、69或85中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列； h)與SEQ ID NO 5、21、37、53、69或85中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和i) g)或h)的生物學(xué)活性片段，和/或 第四絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其組成，j)如SEQ ID NO 7、23、39、55、71或87中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列；k)與SEQ ID NO 7、23、39、55、71或87中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和I) j )或k)的生物學(xué)活性片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一絲蛋白、第二絲蛋白、第三絲蛋白和/或第四絲蛋白由相同的細(xì)胞生產(chǎn)。在一個(gè)可供選擇的實(shí)施方案中，所述第一絲蛋白、第二絲蛋白、第三絲蛋白和/或第四絲蛋白由不同的細(xì)胞生產(chǎn)。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選步驟ii)包含大約等摩爾量的所述第一絲蛋白、所述第二絲蛋白、所述第三絲蛋白和所述第四絲蛋白。在直至步驟iii)為止并且不包括步驟iii)的任何時(shí)候，根據(jù)本發(fā)明加工的所述絲蛋白可以被獨(dú)立地制備和組合。所述單獨(dú)制備的絲蛋白能夠是相同的或不同的。例如，如文中所定義的第一絲蛋白在第一細(xì)胞中被表達(dá)并且如步驟i)和ii)中所定義的被加工，如文中所定義的第二絲蛋白在第二細(xì)胞中被表達(dá)并且如步驟i)和ii)中所定義的被加工，然后在進(jìn)行步驟iii)之前將所述兩種溶液組合。所述表面活性劑和離子液體溶解已沉淀的蛋白質(zhì)并且能夠使所述絲蛋白保持在溶液中同時(shí)允許后續(xù)步驟中卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的形成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表面活性劑是陰離子表面活性劑。用于本發(fā)明的陰離子表面活性劑的實(shí)例包括，但不限于，十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂基硫酸銨和其他烷基硫酸鹽、I-辛基磺酸鈉一水合物、月桂?；“彼徕c、月桂基乙醚硫酸鈉(SLES)、牛去氧膽酸鈉水合物和烷基苯磺酸鹽；以及其兩種或多種的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述陰離子表面活性劑是SDS。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子液體包含i)選自氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸鹽、乙酸鹽、C1-C4-烷基硫酸鹽、甲基磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、C1-C4-二烷基磷酸鹽、硫酸氫鹽和四氯鋁酸鹽的陰離子，和ii)選自IJ-C1-C4-二烷基咪唑鎗、3-氯吡啶鎗、4-二甲氨基吡啶鎗、2-乙基-4-氨基吡啶鎗、2-甲基吡啶鎗、2-乙基吡啶鎗、2-乙基-6-甲基吡啶鎗、喹啉鎗、異喹啉鎗、吡啶鎗、I-C1-C4-烷基咪唑鎗、I-甲基咪唑鎗、I, 2- 二甲基咪唑鎗、I-正丁基咪唑鎗、I, 4，5-三甲基咪唑鎗、1，4- 二甲基咪唑鎗、咪唑鎗、2-甲基咪唑鎗、I- 丁基-2-甲基咪唑鎗、4甲基咪唑鎗、1_(2’ -氨基乙基)咪唑鎗、I-乙烯基咪唑鎗、2-乙基咪唑鎗和苯并三唑鎗的陽(yáng)離子。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法生產(chǎn)每升培養(yǎng)細(xì)胞至少大約O. lg，更優(yōu)選至少大約lg，更優(yōu)選至少大約I. 5g,更優(yōu)選至少大約2g,甚至更優(yōu)選至少大約2. 5g的絲蛋白。在另一個(gè)方面中，本發(fā) 明提供了用于生產(chǎn)絲紡絲液的方法，所述方法包含i)從細(xì)胞培養(yǎng)物中，或從無(wú)細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中獲得上清液，生產(chǎn)一種或多種絲蛋白，ii)通過(guò)采用表面活性劑或離子液體接觸它們使所述絲蛋白溶解，和iii)濃縮所述絲蛋白來(lái)生產(chǎn)所述絲紡絲液，其中所述一種或多種絲蛋白能夠形成包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在該方面中，使用的是由所述細(xì)胞分泌的絲蛋白而不是用于生產(chǎn)所述絲紡絲液的所述細(xì)胞中的絲蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，可以同時(shí)地或相繼地進(jìn)行第一方面的步驟i )和以上方面的步驟i )。此外，在任何相應(yīng)步驟中，源自所述細(xì)胞和所述上清液的絲蛋白能夠被組合并且在此基礎(chǔ)上一起被加工。例如，能夠單獨(dú)進(jìn)行第一方面的步驟ii)和以上方面的步驟ii)并組合所述絲蛋白用于包括步驟iii)和iv)的進(jìn)一步加工。在以上方面的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟i)進(jìn)一步包含增加所述上清液中絲蛋白的濃度。這通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法能夠被實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)采用沉淀所述絲蛋白的試劑接觸所述上清液，所述試劑如，但不限于，硫酸銨、三氯乙酸、高氯酸和丙酮。關(guān)于以上方面，優(yōu)選所述絲蛋白盡可能多地由所述細(xì)胞分泌。因此，優(yōu)選所述絲蛋白包含N-末端信號(hào)序列。特別用于以上方面的絲蛋白的實(shí)例包括，但不限于，包含以下序列的，更優(yōu)選基本上由以下序列組成的，甚至更優(yōu)選由以下序列組成的絲蛋白，所述序列選自a)如 SEQ ID NO 2、4、6、8、18、20、22、24、34、36、38、40、50、52、54、56、66、68、70、
72、82、84、86、88或98中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列，b)與 SEQ ID NO 2、4、6、8、18、20、22、24、34、36、38、40、50、52、54、56、66、68、70、
72、82、84、86、88或98中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列，和c) a)或b)的生物學(xué)活性片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述絲蛋白包含第一絲蛋白，所述第一絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其組成，a)如SEQ ID NO 2、18、34、50、66或82中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列；b)與SEQ ID NO 2、18、34、50、66或82中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和c) a)或b)的生物學(xué)活性片段，第二絲蛋白，所述第二絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其組成，d)如SEQ ID NO 4、20、36、52、68或84中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列；e)與SEQ ID NO 4、20、36、52、68或84中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和
f ) c)或d)的生物學(xué)活性片段，第三絲蛋白，所述第三絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其組成，g)如SEQ ID NO 6、22、38、54、70或86中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列；h)與SEQ ID NO 6、22、38、54、70或86中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和i) g)或h)的生物學(xué)活性片段，和/或第四絲蛋白，所述第四絲蛋白包含，更優(yōu)選基本上由其組成，甚至更優(yōu)選由其組成，j)如SEQ ID NO 8、24、40、56、72或88中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列；k)與SEQ ID NO 8、24、40、56、72或88中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和I) j)或k)的生物學(xué)活性片段。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)絲纖維的方法，所述方法包含擠壓和/或拉伸通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的絲紡絲液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述擠壓包含使所述絲紡絲液通過(guò)大約5 μ m至大約500 μ m的毛細(xì)管。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包含i)裂解生產(chǎn)一種或多種絲蛋白的細(xì)胞并且從所述細(xì)胞中分離包涵體，ii)通過(guò)采用表面活性劑或離子液體接觸它們使所述包涵體中的所述絲蛋白溶解，iii)濃縮所述絲蛋白來(lái)生產(chǎn)絲紡絲液，iv)增加所述絲紡絲液中絲蛋白的濃度至大約2%至大約10%重量(％)的絲蛋白，更優(yōu)選大約3%至大約6%重量(％)的絲蛋白，和Vi)在脫水溶液中擠壓所述絲紡絲液。關(guān)于以上實(shí)施方案，所述脫水溶液優(yōu)選包含醇類(lèi)如甲醇或乙醇，或高濃度的鹽如MgCl2或似(1。在這些條件下擠壓的絲纖維作為濕法紡絲通常為本領(lǐng)域所知。優(yōu)選地，所述醇類(lèi)是甲醇并且所述溶液中甲醇的濃度為大約40%至大約80%v/v，更優(yōu)選大約50%至大約70%v/v。在該實(shí)施方案中，所述絲紡絲液可以包含如文中所定義的單一類(lèi)型的絲多肽，或者兩種或多種不同的類(lèi)型如四種不同的類(lèi)型。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)絲薄膜的方法，其中所述方法包含澆鑄通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的絲紡絲液。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的絲紡絲液。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的絲纖維。被提供的還有通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的絲薄膜。在其他另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的絲纖維和/或絲薄膜的產(chǎn)品。顯而易見(jiàn)地，本發(fā)明的一個(gè)方面的優(yōu)選特征和特性可應(yīng)用于本發(fā)明的許多其他方面。貫穿本說(shuō)明書(shū)的術(shù)語(yǔ)“包含(comprise)”,或變體如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”將被理解為意味著包含已陳述的元素、整體或步驟,或者元素、整體或步驟的群組，但是不排除任何其他元素、整體或步驟，或者元素、整體或步驟的群組。以下通過(guò)非限制的例子和參考附加的附圖的方式描述本發(fā)明。


圖I.溶解于SDS中的已純化包涵體的SDS-PAGE。泳道對(duì)應(yīng)于重組蛋白AmelFl_4 ；標(biāo)度為以kDa計(jì)的蛋白質(zhì)重量。圖2.天然的蜜蜂絲(A)和重組的蜜蜂絲(B)的紅外光譜中酰胺I和II區(qū)域的傅 里葉自去卷積。對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)的波段歸屬見(jiàn)表2。圖3.在空氣中被拉伸(A)和在空氣中被拉伸之后在甲醇中被第二次拉伸(B)的重組蜜蜂絲纖維的正交偏振顯微術(shù)。圖4.被擠壓至甲醇浴中(A)和空氣干燥之后在甲醇浴中被第二次拉伸至2倍長(zhǎng)度(B)或空氣干燥之后在甲醇浴中被第二次拉伸至4倍長(zhǎng)度(C)的重組蜜蜂絲纖維的正交偏振顯微術(shù)。
具體實(shí)施方案序列表要素SEQ ID NO: I -在文中被稱(chēng)為Xenospiral的蜜蜂絲蛋白(在文中也被稱(chēng)為AmelFl)(減去彳目號(hào)妝)。SEQ ID N0:2 -在文中被稱(chēng)為Xenospiral的蜜蜂絲蛋白。SEQ ID N0:3 -在文中被稱(chēng)為Xenospira2的蜜蜂絲蛋白(在文中也被稱(chēng)為Ame 1F2)(減去彳目號(hào)妝)。SEQ ID N0:4 -在文中被稱(chēng)為Xenospira2的蜜蜂絲蛋白。SEQ ID NO: 5_在文中被稱(chēng)為Xenospira3的蜜蜂絲蛋白(在文中也被稱(chēng)為AmelF3)(減去信號(hào)妝)。SEQ ID N0:6 -在文中被稱(chēng)為Xenospira3的蜜蜂絲蛋白。SEQ ID N0:7 -在文中被稱(chēng)為Xenospira4的蜜蜂絲蛋白(在文中也被稱(chēng)為AmelF4)(減去彳目號(hào)妝)。SEQ ID N0:8-在文中被稱(chēng)為Xenospira4的蜜蜂絲蛋白。SEQ ID NO:9 -編碼蜜蜂絲蛋白Xenospiral的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQ ID NO: 10-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospiral的核苷酸序列。SEQ ID NO: 11 -編碼蜜蜂絲蛋白XenoSpira2的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQ ID NO: 12-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospira2的核苷酸序列。SEQ ID NO: 13-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospira3的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQ ID NO: 14-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospira3的核苷酸序列。SEQ ID NO: 15-編碼蜜蜂絲蛋白Xenospira4的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO: 16 -編碼蜜蜂絲蛋白Xenospira4的核苷酸序列。SEQID NO: 17 -在文中被稱(chēng)為BBFl的大黃蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO: 18 -在文中被稱(chēng)為BBFl的大黃蜂絲蛋白。SEQID NO: 19 -在文中被稱(chēng)為BBF2的大黃蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO:20 -在文中被稱(chēng)為BBF2的大黃蜂絲蛋白。SEQID NO:21 -在文中被稱(chēng)為BBF3的大黃蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO:22 -在文中被稱(chēng)為BBF3的大黃蜂絲蛋白。 SEQID NO:23 -在文中被稱(chēng)為BBF4的大黃蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO:24 -在文中被稱(chēng)為BBF4的大黃蜂絲蛋白。SEQID NO: 25 -編碼大黃蜂絲蛋白BBFl的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:26 -編碼大黃蜂絲蛋白BBFl的核苷酸序列。SEQID NO: 27 -編碼大黃蜂絲蛋白BBF2的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:28 -編碼大黃蜂絲蛋白BBF2的核苷酸序列。SEQID NO: 29 -編碼大黃蜂絲蛋白BBF3的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:30 -編碼大黃蜂絲蛋白BBF3的核苷酸序列。SEQID NO: 31 -編碼大黃蜂絲蛋白BBF4的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:32 -編碼大黃蜂絲蛋白BBF4的核苷酸序列。SEQID NO: 33-在文中被稱(chēng)為BAFl的斗牛犬蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO:34-在文中被稱(chēng)為BAFl的斗牛犬蟻絲蛋白。SEQID NO:35 -在文中被稱(chēng)為BAF2的斗牛犬蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO: 36-在文中被稱(chēng)為BAF2的斗牛犬蟻絲蛋白。SEQID NO: 37-在文中被稱(chēng)為BAF3的斗牛犬蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO:38 -在文中被稱(chēng)為BAF3的斗牛犬蟻絲蛋白。SEQID NO: 39-在文中被稱(chēng)為BAF4的斗牛犬蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID N0:40_在文中被稱(chēng)為BAF4的斗牛犬蟻絲蛋白。SEQID NO:41-編碼斗牛犬蟻絲蛋白BAFl的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID N0:42_編碼斗牛犬蟻絲蛋白BAFl的核苷酸序列。SEQID NO:43-編碼斗牛犬蟻絲蛋白BAF2的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID N0:44_編碼斗牛犬蟻絲蛋白BAF2的核苷酸序列。SEQID NO:45-編碼斗牛犬蟻絲蛋白BAF3的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:46 -編碼斗牛犬蟻絲蛋白BAF3的核苷酸序列。SEQID N0:47-編碼斗牛犬蟻絲蛋白BAF4的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:48 -編碼斗牛犬蟻絲蛋白BAF4的核苷酸序列。SEQID NO:49 -在文中被稱(chēng)為GAFl的黃猄蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。
SEQID NO:50 -在文中被稱(chēng)為GAFl的黃猄蟻絲蛋白。SEQID N0:51 -在文中被稱(chēng)為GAF2的黃猄蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO:52 -在文中被稱(chēng)為GAF2的黃猄蟻絲蛋白。SEQID NO:53 -在文中被稱(chēng)為GAF3的黃猄蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO:54 -在文中被稱(chēng)為GAF3的黃猄蟻絲蛋白。SEQID NO:55 -在文中被稱(chēng)為GAF4的黃猄蟻絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO:56 -在文中被稱(chēng)為GAF4的黃猄蟻絲蛋白。SEQID NO: 57 -編碼黃猄蟻絲蛋白GAFl的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:58 -編碼黃猄蟻絲蛋白GAFl的核苷酸序列。SEQID NO: 59-編碼黃猄蟻絲蛋白GAF2的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:60 -編碼黃猄蟻絲蛋白GAF2的核苷酸序列。SEQID N0:61 -編碼黃猄蟻絲蛋白GAF3的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:62-編碼黃猄蟻絲蛋白GAF3的核苷酸序列。SEQID NO:63 -編碼黃猄蟻絲蛋白GAF4的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:64-編碼黃猄蟻絲蛋白GAF4的核苷酸序列。SEQID N0:65_在文中被稱(chēng)為Vssilk3的川軍蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID N0:66 -在文中被稱(chēng)為Vssilk3的川軍蜂絲蛋白。 SEQID N0:67-在文中被稱(chēng)為Vssilk4的川軍蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID N0:68-在文中被稱(chēng)為Vssilk4的川軍蜂絲蛋白。SEQID N0:69_在文中被稱(chēng)為Vssilk2的川軍蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO: 70-在文中被稱(chēng)為Vssilk2的川軍蜂絲蛋白。SEQID NO: 71-在文中被稱(chēng)為Vssilkl的川軍蜂絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQID NO: 72-在文中被稱(chēng)為Vssilkl的川軍蜂絲蛋白。SEQID NO: 73-編碼川軍蜂絲蛋白Vssilk3的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID N0:74_編碼川軍蜂絲蛋白Vssilk3的核苷酸序列。SEQID NO: 75 -編碼川軍蜂絲蛋白Vssilk4的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:76 -編碼川軍蜂絲蛋白Vssilk4的核苷酸序列。SEQID NO: 77 -編碼川軍蜂絲蛋白Vssilk2的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:78 -編碼川軍蜂絲蛋白Vssilk2的核苷酸序列。SEQID NO: 79 -編碼川軍蜂絲蛋白Vssilkl的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQID NO:80 -編碼川軍蜂絲蛋白Vssilkl的核苷酸序列。SEQID N0:81 -在文中被稱(chēng)為絲蛋白I的亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白(也被稱(chēng)為ABS1)(減去號(hào)肽)。SEQID N0:82 -在文中被稱(chēng)為絲蛋白I的亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白(也被稱(chēng)為ABS1)。SEQID NO:83 -在文中被稱(chēng)為絲蛋白2的亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白(也被稱(chēng)為ABS2)(減去號(hào)肽)。SEQ ID N0:84 -在文中被稱(chēng)為絲蛋白2的亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白(也被稱(chēng)為ABS2)。SEQ ID NO:85 -在文中被稱(chēng)為絲蛋白3的亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白(也被稱(chēng)為ABS3)(減去號(hào)肽)。SEQ ID NO:86 -在文中被稱(chēng)為絲蛋白3的亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白(也被稱(chēng)為ABS3)。SEQ ID N0:87_在文中被稱(chēng)為絲蛋白4的亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白(也被稱(chēng)為ABS4)(減去號(hào)肽)。 SEQ ID N0:88 -在文中被稱(chēng)為絲蛋白4的亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白(也被稱(chēng)為ABS4)。SEQ ID N0:89_編碼亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白ABSl的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQ ID NO:90-編碼亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白ABSl的核苷酸序列。SEQ ID N0:91-編碼亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白ABS2的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQ ID NO:92-編碼亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白ABS2的核苷酸序列。SEQ ID NO:93-編碼亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白ABS3的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQ ID NO:94-編碼亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白ABS3的核苷酸序列。SEQ ID NO:95-編碼亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白ABS4的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQ ID NO:96 -編碼亞細(xì)亞蜜蜂絲蛋白ABS4的核苷酸序列。SEQ ID NO:97 -在文中被稱(chēng)為MalFl的草蛉絲蛋白(減去信號(hào)肽)。SEQ ID N0:98 -在文中被稱(chēng)為MalFl的草蛉絲蛋白。SEQ ID NO:99 -編碼草蛉絲蛋白MalFl的核苷酸序列(減去編碼信號(hào)肽的區(qū)域)。SEQ ID NO: 100 -編碼草蛉絲蛋白MalFl的核苷酸序列。SEQ ID NO: 101至108 -寡聚核苷酸引物。發(fā)明詳述通用技術(shù)和定義除非另有特殊定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均應(yīng)被認(rèn)為具有如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的相同的含義(例如，細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、制絲加工、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域中)。除非另外指出，本發(fā)明所使用的所述重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)程序，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。所述技術(shù)在通篇文獻(xiàn)中被描述和解釋如，J. Perbal1APractical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour LaboratoryPress (1989), T. A. Brown (編輯)，Essential Molecular Biology :A Practical Approach,第 I 和 2卷，IRL Press (1991)，D. M. Glover 和B. D. Hames(編輯)，DNA Cloning: A PracticalApproach,第 1-4 卷,IRL Press (1995 和 1996),和 F. M. Ausubel 等人(編輯),CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988,包括迄今為止的所有更新)，Ed Harlow和David Lane (編輯)Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),和 J. E. Coligan 等人(編輯)Current Protocols in Immunology, John ffiley&Sons (包括迄今為止的所有更新)。術(shù)語(yǔ)“和/或”，例如，“X和/或Y”將被理解為意味著或者“X和Y”或者“X或Y”并且將用于提供對(duì)于二者兼有的含義或?qū)τ诙邠褚坏暮x的明確支持。如文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“絲蛋白”和“絲多肽”是指能夠用于生產(chǎn)絲纖維的纖維蛋白/多肽，和/或纖維蛋白復(fù)合物。如文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“一種或多種絲蛋白”是指可能使用兩種或多種不同類(lèi)型的絲蛋白如本文中所定義的第一絲蛋白、第二絲蛋白等的方法。因此，在上下文，一種絲蛋白意味著足以生產(chǎn)絲紡絲液的一群相同的絲蛋白分子。如文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“能夠形成包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)”是指在適合的條件下蛋白質(zhì)用于形成所述結(jié)構(gòu)的能力。例如，當(dāng)被加工用于生產(chǎn)絲纖維時(shí)，所述蛋白質(zhì)形成 所述結(jié)構(gòu)。此外，該術(shù)語(yǔ)并不意味著所述整體蛋白質(zhì)能夠形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，僅僅是其一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，大約45%至大約90%，更優(yōu)選大約55%至大約70%，甚至更優(yōu)選大約60%至大約66%的所述絲蛋白能夠形成包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。如文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“絲紡絲液”是指包含絲蛋白的水溶液。優(yōu)選地，所述絲紡絲液包含至少0. 05%w/v,更優(yōu)選至少0. l%w/v,甚至更優(yōu)選至少0. 5%w/v的如文中所定義的絲蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的絲紡絲液包含大約0. 5%至大約15%(重量％)的絲蛋白。然而，如果沒(méi)有進(jìn)行增加所述絲紡絲液中絲蛋白濃度的進(jìn)一步的步驟，那么更典型的產(chǎn)率為大約0.5%至大約4% (重量％)的絲蛋白。使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的絲紡絲液經(jīng)得起用于纖維形成和/或薄膜澆鑄的擠壓的檢驗(yàn)。如本文所使用的，“絲纖維”是指包含絲蛋白的細(xì)絲，所述細(xì)絲能夠被編織成多種物品如紡織品。如文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“減少表面活性劑溶液的量”，或其變體包括減少離子液體的量，意味著表面活性劑或離子液體的總量被減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述減少之后，在涉及所述溶液進(jìn)一步濃縮的任何步驟之前，表面活性劑或離子液體的濃度小于大約IOmM,更優(yōu)選小于5mM,甚至更優(yōu)選小于ImM。如文中所使用的，“脫水溶液”是任何溶液，優(yōu)選地是水溶液，與待濃縮的所述絲紡絲液相比，所述溶液具有更低的溶液中的水濃度。如文中所使用的，當(dāng)術(shù)語(yǔ)“溶解”是指所述絲蛋白與表面活性劑或離子液體接觸時(shí)，意味著所述表面活性劑或離子液體與所述絲蛋白結(jié)合并且通過(guò)防止它們的聚集將它們保持在溶液中。這與在所述細(xì)胞中，特別是在包涵體中看到的絲蛋白形成對(duì)比。術(shù)語(yǔ)“信號(hào)肽”、“N-末端信號(hào)序列”及其變體是指在分泌的成熟蛋白質(zhì)之前的氨基末端蛋白質(zhì)/多肽。所述信號(hào)肽被從所述成熟蛋白質(zhì)切斷并因此不存在于所述成熟蛋白質(zhì)中。信號(hào)肽具有引導(dǎo)和移位分泌的蛋白質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞膜的功能。所述信號(hào)肽也是指信號(hào)序列，并且為本領(lǐng)域所熟知。卷曲螺旋絲蛋白術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”通常可交換使用并且是指可以通過(guò)非氨基酸基團(tuán)的添加被修飾的或不被修飾的單一多肽鏈。如文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”還包括文中所描述的絲蛋白的變體、突變、修飾物、類(lèi)似物和/或衍生物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用的絲蛋白僅由天然存在的氨基酸組成。蛋白質(zhì)的同一'注％由具有空位創(chuàng)造罰分(gap creation penalty) =5和空位擴(kuò)展罰分(gap extension penalty) =0. 3 的 GAP (Needleman 和 Wunsch, 1970)分析(GCG 程序)來(lái)確定。查詢序列以長(zhǎng)度計(jì)至少為15個(gè)氨基酸，并且所述GAP分析在跨越至少15個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)了所述兩條序列。更優(yōu)選地，所述查詢序列以長(zhǎng)度計(jì)至少為50個(gè)氨基酸，并且所述GAP分析在跨越至少50個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)了所述兩條序列。更優(yōu)選地，所述查詢序列以長(zhǎng)度計(jì)至少為100個(gè)氨基酸，并且所述GAP分析在跨越至少100個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)了所述兩條序列。甚至更優(yōu)選地，所述查詢序列以長(zhǎng)度計(jì)至少為250個(gè)氨基酸，并且所述GAP分析在跨越至少250個(gè)氨基酸的區(qū)域比對(duì)了所述兩條序列。甚至更優(yōu)選地，所述GAP分析比對(duì)了所述兩條序列的整體長(zhǎng)度。如文中所使用的，“生物學(xué)活性”片段是保持全長(zhǎng)蛋白質(zhì)已定義的活性的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的一部分，所述已定義的活性即用于生產(chǎn)絲的能力。只要其能保持已定義的活性，生物學(xué)活性片段可以是任何長(zhǎng)度。 術(shù)語(yǔ)“基本上由…組成”，或其變體，意味著被定義的氨基酸序列可以具有相對(duì)于被定義的而言的一些，如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)，額外的氨基酸。例如，當(dāng)不存在于被定義的序列中時(shí)，N-末端蛋氨酸可以被添加。術(shù)語(yǔ)“由…組成”，或其變體，意味著當(dāng)與被定義的序列相比時(shí)，被定義的序列不具有額外的或較少的氨基酸，特別是在N-和C-末端。關(guān)于被定義的蛋白質(zhì)，可以理解的是高于如上所提供的那些的同一性％數(shù)字將涵蓋優(yōu)選的實(shí)施方案。因此，在可應(yīng)用的情況下，鑒于最小的同一性％數(shù)字，優(yōu)選所述蛋白質(zhì)包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與相關(guān)的被提名的SEQ ID NO至少40%，更優(yōu)選至少45%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，更優(yōu)選至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，更優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少99. 1%，更優(yōu)選至少99. 2%，更優(yōu)選至少99. 3%，更優(yōu)選至少99. 4%，更優(yōu)選至少99. 5%，更優(yōu)選至少99. 6%，更優(yōu)選至少99. 7%，更優(yōu)選至少99. 8，甚至更優(yōu)選至少99. 9%相同。通過(guò)將適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓氲骄幋a所述絲蛋白的核酸中，或通過(guò)所需的蛋白質(zhì)的體外合成能夠制備文中所描述的天然存在的絲蛋白的氨基酸序列突變。所述突變包括，例如，所述氨基酸序列中殘基的缺失、插入或取代。缺失、插入和取代的組合能夠用于達(dá)成最終構(gòu)建體，只要最終蛋白質(zhì)產(chǎn)品擁有所需的特性。使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)都能夠制備突變的(改變的)蛋白質(zhì)。例如，本發(fā)明的多聚核苷酸能夠被體外誘變。所述體外誘變技術(shù)包括將所述多聚核苷酸亞克隆至適合的載體中，將所述載體轉(zhuǎn)化成“增變株”如大腸桿菌XL-Ired (Stratagene)并且將所述已轉(zhuǎn)化的細(xì)菌繁殖至適合的世代數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的所述多聚核苷酸被施加如Harayama所廣泛描述的DNA改組技術(shù)(1998)。這些DNA改組技術(shù)可以包括可能除了與本發(fā)明的那些相關(guān)的基因以外的本發(fā)明的基因，如來(lái)自不同于文中特征化的特異性物種的膜翅目或脈翅目物種的絲基因。使用文中所描述的用于確定它們是否能夠用作絲蛋白的技術(shù)能夠輕易地篩選源自突變的/改變的DNA的產(chǎn)品。在設(shè)計(jì)氨基酸序列突變時(shí)，突變位點(diǎn)的位置和突變的性質(zhì)將取決于待修飾的特性。用于突變的所述位點(diǎn)能夠被單獨(dú)地或連續(xù)地修飾，例如，通過(guò)(I)取決于所獲得的結(jié)果，首先用保守氨基酸選擇、然后用更激進(jìn)的選擇取代，(2)刪除靶標(biāo)殘基，或(3)向已定位位點(diǎn)的毗鄰插入其他殘基。氨基酸序列的缺失或插入通常在大約I至15個(gè)殘基的范圍內(nèi)變化，更優(yōu)選大約I至10個(gè)殘基并且典型地大約I至5個(gè)相鄰的殘基。取代突變至少有一個(gè)氨基酸殘基從所述蛋白質(zhì)分子中被除去并且在它的位置插入不同的殘基。對(duì)于取代誘變而言最感興趣的位點(diǎn)包括被鑒定為對(duì)于功能很重要的位點(diǎn)。其他感興趣的位點(diǎn)是那些從不同菌株或物種中獲得的相同的特定殘基的位點(diǎn)。這些位置對(duì)于生物活性可能是重要的。這些位點(diǎn)，尤其是屬于至少三個(gè)其他同一性保守位點(diǎn)的序列的那些，優(yōu)選以相對(duì)保守的方式被取代。所述保守取代如名為“示范性取代”的表I所示。表I.示范性取代 IwftiI 4范件 殘坫取代
Ala (A) val; leu; ilc; gly; cys; scr; lhr
Arg (R) Iys_
Asn (N) gin; his_
Asp (D) glu_
Cys (C) scr; thr; ala; gly; val_
Gln (Q) asn; his_
Glu (E) asp_Gly (G) pro; ala; scr; val; thr; eye_
His (H) asn; gin_
He (I) leu val; ala; met
Lcu (L) ile; val; met; ala; phe_
,LiiSi(K)__ES_
Met (M) leu; phe_
Phe (F) leu; val; ala Pro (P) gly
Scr (S) lhr; ala; gly; val; glii; cys_
Thr (I) scr; gin; ala; cys
Trp (W) Iyr_
,.IilCII—M..b!i_
Val (V) 丨 ile; leu; met; phc; ala; scr; thr通過(guò)由共有序列(abcdefg)n代表的七肽重復(fù)來(lái)描述絲蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的特征。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的部分包含所述七肽序列abcdefg的至少10個(gè)拷貝，并且處于位置a和d上的至少25%的氨基酸是丙氨酸殘基。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)包含至少12個(gè)連續(xù)的所述七肽拷貝，更優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)的所述七肽拷貝，甚至更優(yōu)選至少18個(gè)連續(xù)的所述七肽拷貝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)能夠具有多達(dá)至少28個(gè)所述七肽拷貝。典型地，所述七肽拷貝將被重復(fù)地銜接著。然而，它們未必一定是完全的重復(fù)銜接，例如，如WO 2007/038837的圖5和6所示，在兩個(gè)七肽之間可以發(fā)現(xiàn)一些氨基酸，或者可以發(fā)現(xiàn)一些被截?cái)嗟钠唠?參看，例如，WO 2007/038837的圖5中的Xenospiral)。關(guān)于能夠用于具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的所述絲蛋白的氨基酸取代的指導(dǎo)在W02007/038837的圖5和6以及表6至10中提供。當(dāng)基于文中所提供的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)而預(yù)測(cè)的有用氨基酸取代與WO 2007/038837的表I中提供的示范性取代發(fā)生沖突時(shí)，優(yōu)選使用所述基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的取代。所述絲蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)具有高含量的丙氨酸殘基，特別是處于所述七肽的氨基酸位置a、d和e。然而，位置b、C、f和g也具有高頻率的丙氨酸殘基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)
施方案中，處于所述七肽的位置a、d和/或e的至少15%的氨基酸是丙氨酸殘基，更優(yōu)選至少25%，更優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40%，甚至更優(yōu)選至少50%。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，處于所述七肽的位置a和d兩處的至少25%的氨基酸是丙氨酸殘基，更優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40%，甚至更優(yōu)選至少50%。此外，優(yōu)選處于所述七肽的位置b、c、f和g的至少15%的氨基酸是丙氨酸殘基，更優(yōu)選至少20%，甚至更優(yōu)選至少25%。典型地，所述七肽將不包含任何脯氨酸或組氨酸殘基。此外，所述七肽將很少包含(I個(gè)或2個(gè))，若有的話，苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甘氨酸或色氨酸殘基。除了丙氨酸以外，所述七肽中的常見(jiàn)(例如大于5%，更優(yōu)選大于10%)氨基酸包括亮氨酸(特別是處于位置b和d)，絲氨酸(特別是處于位置b、e和f)、谷氨酸(特別是處于位置C、e和f)、賴氨酸(特別是處于位置b、c、d、f和g)以及處于位置g的精氨酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)使用模式識(shí)別程序MARC0IL來(lái)確定所述七肽(Delorenzi and Speed, 2002)。對(duì)于本發(fā)明的所述方法有用的蛋白質(zhì)(和多聚核苷酸)能夠從種類(lèi)繁多的膜翅目和脈翅目物種中被純化(分離)。膜翅目的實(shí)例包括，但不限于，細(xì)腰亞目中的任何物種(蜜蜂、螞蟻和黃蜂)，其包括下列昆蟲(chóng)科；青蜂科(青蜂)、蟻科(螞蟻)、蟻蜂科(絨蟻)、蛛蜂科(蛛蜂)、土蜂科、胡蜂科(胡蜂、蜾贏蜂、川軍蜂)、榕小蜂科(榕小蜂)、小蜂科(小蜂)、蟻小蜂科(蟻小蜂)、旋小蜂科(旋小蜂)、金小蜂科(金小蜂)、旗腹姬蜂科(旗腹姬蜂)、繭蜂科、姬蜂科(姬蜂)、切葉蜂科、蜜蜂科、分舌蜂科、集蜂科和準(zhǔn)蜂科(集油蜂)。脈翅目的實(shí)例包括來(lái)自下列昆蟲(chóng)科的物種螳蛉科、草蛉科(草蛉)、蟻蛉科(蟻蛉)和蝶角蛉科(蝶角蛉)。使用文中所描述的用于來(lái)自大黃蜂(Bombus terrestris)、斗牛犬蟻(Myrmecia forficata)、黃猿蟻(Oecophylla smaragdina)和草蛉(Mallada signata)的絲的相同過(guò)程來(lái)描述所述另外的蛋白質(zhì)(和多聚核苷酸)的特征。在合成中或合成之后被有區(qū)別地修飾的蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如，通過(guò)生物素化、芐基化、糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、通過(guò)已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)的衍生化、蛋白水解裂解、連接至抗體分子或其他分子配體等。這些修飾可用于增加所述蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和/或生物活性。多聚核苷酸
術(shù)語(yǔ)“多聚核苷酸”與術(shù)語(yǔ)“核酸”在文中可交換使用。在多聚核苷酸背景下的術(shù)語(yǔ)“外源性”是指當(dāng)存在于細(xì)胞中，或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中時(shí)，相對(duì)于它的天然態(tài)發(fā)生量的改變的多聚核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是天然地不包含所述多聚核苷酸的細(xì)胞。然而，所述細(xì)胞可以是包含非內(nèi)源性多聚核苷酸的細(xì)胞，所述非內(nèi)源性多聚核苷酸導(dǎo)致其編碼蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量的改變，優(yōu)選增加。本發(fā)明的外源性多聚核苷酸包括未從其所存在的轉(zhuǎn)基因(重組)細(xì)胞，或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的其他成分中分離出的多聚核苷酸，以及在所述細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中生產(chǎn)隨后從至少一些其他成分中純化出的多聚核苷酸。 多聚核苷酸的同一性％由具有空位創(chuàng)造罰分=5和空位擴(kuò)展罰分=0.3的GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)來(lái)確定。除非另有陳述，查詢序列以長(zhǎng)度計(jì)至少為45個(gè)核苷酸，并且所述GAP分析在跨越至少45個(gè)核苷酸的區(qū)域比對(duì)了所述兩條序列。優(yōu)選地，查詢序列以長(zhǎng)度計(jì)至少為150個(gè)核苷酸，并且所述GAP分析在跨越至少150個(gè)核苷酸的區(qū)域比對(duì)了所述兩條序列。更優(yōu)選地，查詢序列以長(zhǎng)度計(jì)至少為300個(gè)核苷酸，并且所述GAP分析在跨越至少300個(gè)核苷酸的區(qū)域比對(duì)了所述兩條序列。甚至更優(yōu)選地，所述GAP分析比對(duì)了所述兩條序列的整體長(zhǎng)度。關(guān)于被定義的多聚核苷酸，可以理解的是高于如上所提供的那些的同一性％數(shù)字將涵蓋優(yōu)選的實(shí)施方案。因此，在可應(yīng)用的情況下，鑒于最小的同一性％數(shù)字，優(yōu)選本發(fā)明的多聚核苷酸包含序列，所述序列與相關(guān)的被提名的SEQ ID NO至少40%，更優(yōu)選至少45%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，更優(yōu)選至少93%，更優(yōu)選至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，更優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少99. 1%，更優(yōu)選至少99. 2%，更優(yōu)選至少99. 3%，更優(yōu)選至少99. 4%，更優(yōu)選至少99. 5%，更優(yōu)選至少99. 6%，更優(yōu)選至少99. 7%，更優(yōu)選至少99. 8%，甚至更優(yōu)選至少99. 9%相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼用于本發(fā)明的絲蛋白的多聚核苷酸包含序列，更優(yōu)選基本上由序列組成，甚至更優(yōu)選由序列組成，所述序列選自a)如 SEQ ID NO 9 至 16、25 至 32、41 至 48、57 至 64、73 至 80、89 至 96、99 或 100
中任何一個(gè)所提供的核苷酸序列，b)與 SEQ ID NO 9 至 16、25 至 32、41 至 48、57 至 64、73 至 80、89 至 96、99 或 100
中任何一個(gè)或更多至少30%相同的核苷酸序列，和c) a)或b)的編碼部分的生物學(xué)活性片段。當(dāng)優(yōu)選所述絲蛋白盡可能少的從所述細(xì)胞分泌時(shí)，所述被編碼的絲蛋白不包含N-末端信號(hào)序列。編碼所述絲蛋白的多聚核苷酸的實(shí)例包括那些序列，其包含以下序列，更優(yōu)選基本上由以下序列組成的，甚至更優(yōu)選由以下序列組成，所述序列選自a)如 SEQ ID NO 9、11、13、15、25、27、29、31、41、43、45、47、57、59、61、63、73、75、77、79、89、91、93、95或97中任何一個(gè)所提供的核苷酸序列，b)與 SEQ ID NO 9、11、13、15、25、27、29、31、41、43、45、47、57、59、61、63、73、75、77、79、89、91、93、95或97中任何一個(gè)或更多至少30%相同的核苷酸序列，和c) a)或b)的生物學(xué)活性片段。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案依賴于具有N-末端信號(hào)序列的絲蛋白的表達(dá)，和/或如文中所定義的第一絲蛋白、第二絲蛋白、第三絲蛋白和/或第四絲蛋白的共同生產(chǎn)(co-production)(在相同的或不同的細(xì)胞中)?；谛蛄斜碇兴峁┑男蛄行畔?，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易地鑒定用于針對(duì)本發(fā)明的每一個(gè)實(shí)施方案的表達(dá)的代表性多聚核苷酸。當(dāng)與天然存在的分子相比時(shí)，用于本發(fā)明的所述方法的多聚核苷酸可以擁有一種或多種突變，所述突變是核苷酸殘基的缺失、插入或取代。突變能夠是天然存在的(也就是說(shuō)，從天然來(lái)源中分離)或合成的(例如，通過(guò)在所述核酸上進(jìn)行定點(diǎn)誘變)。在嚴(yán)格的條件下，用于本發(fā)明的多 聚核苷酸還能夠與如文中所提供的編碼絲蛋白的核苷酸序列雜交，所述核苷酸序列如SEQ ID NO 9至16、25至32、41至48、57至64、73至80、89至96、99和100中的一種或多種。如文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格的雜交條件”等是指本領(lǐng)域熟悉的參數(shù)，包括隨著寡聚核苷酸的長(zhǎng)度而變化的雜交溫度。在編輯的所述方法的參考文獻(xiàn)中(SambiOok等人(如前所述)和Ausubel等人(如前所述))，可以發(fā)現(xiàn)核酸雜交參數(shù)。例如，如文中所使用的，嚴(yán)格的雜交條件能夠是指在雜交緩沖液(3. 5x SSC、0. 02%菲可、O. 02% 聚乙烯吡咯烷酮、O. 02% 牛血清白蛋白(BSA)、2. 5mM NaH2PO4 (ρΗ7)、0· 5%SDS、2mMEDTA)中于65°C的雜交，隨后是于50°C的O. 2x SSC、0. 01%BSA中一次或多次的洗滌。核酸構(gòu)建體用于本發(fā)明的所述方法的細(xì)胞將典型地包含編碼所述絲蛋白的核酸構(gòu)建體。所述構(gòu)建體可以被整合到所述細(xì)胞的基因組中，或者是染色體外如重組載體。所述載體含有異源性多聚核苷酸序列，其是天然條件下未發(fā)現(xiàn)與編碼所述絲蛋白的所述多聚核苷酸分子毗鄰的多聚核苷酸序列，并且優(yōu)選其源自與衍生出所述多聚核苷酸分子的物種不同的物種。所述載體能夠是RNA或DNA，可以為原核的或真核的，并且典型地是轉(zhuǎn)座子(如US5，792，294中所描述)、病毒或質(zhì)粒。重組載體的一種類(lèi)型包含可操縱地連接至表達(dá)載體的編碼所述絲蛋白的多聚核苷酸分子。詞組可操縱地連接是指多聚核苷酸分子向表達(dá)載體中的插入，所述插入以所述分子在被轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中時(shí)能夠被表達(dá)的方式進(jìn)行。如文中所使用的，表達(dá)載體是能夠轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并且影響特異性多聚核苷酸分子表達(dá)的DNA或RNA載體。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體還能夠在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制。表達(dá)載體能夠是原核的或真核的，并且典型地是病毒或質(zhì)粒。本發(fā)明的表達(dá)載體包括在本發(fā)明的重組細(xì)胞中發(fā)揮功能(即，指導(dǎo)基因表達(dá))的任何載體，所述載體包括在細(xì)菌、真菌、體內(nèi)寄生蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物、昆蟲(chóng)、動(dòng)物和植物細(xì)胞中的載體。本發(fā)明特別優(yōu)選的表達(dá)載體能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)基因表達(dá)。本發(fā)明的載體還能夠用于在無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)，所述系統(tǒng)為本領(lǐng)域所熟知。特別地，所述核酸構(gòu)建體含有調(diào)控序列如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制源(origins of replication)以及與所述重組細(xì)胞相配的和控制所述多聚核苷酸分子表達(dá)的其他調(diào)控序列。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)、延伸和終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是那些控制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操作子和抑制子序列。適合的轉(zhuǎn)錄控制序列包括能夠在本發(fā)明的至少一種所述重組細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何轉(zhuǎn)錄控制序列。多種所述轉(zhuǎn)錄控制序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄控制序列包括那些在細(xì)菌、酵母、節(jié)肢動(dòng)物、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能的，如，但不限于，tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、卩遼菌體λ、卩遼菌體T7、T71ac、卩遼菌體Τ3、卩遼菌體SP6、卩遼菌體SP01、金屬硫因、α -交配因子、畢赤酵母醇氧化酶、甲病毒屬亞基因組啟動(dòng)子(如辛德畢斯病毒亞基因組啟動(dòng)子)、抗生素耐受性基因、桿狀病毒、玉米夜蛾(Heliothis Zea)昆蟲(chóng)病毒、牛痘病毒、皰疹病毒、浣熊痘病毒、其他痘病毒、腺病毒、巨細(xì)胞病毒(如即刻早期啟動(dòng)子)、猿猴病毒40、逆轉(zhuǎn)錄病毒、肌動(dòng)蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)、勞斯肉瘤病毒、熱休克、磷酸鹽和硝酸鹽轉(zhuǎn)錄控制序列以及能夠控制原核或真核細(xì)胞中基因表達(dá)的其他序列。如上所概述的，本發(fā)明的一個(gè)方面依賴于從所述細(xì)胞中分泌出的所述絲蛋白，典型地歸因于N-末端信號(hào)序列的存在。適合的信號(hào)序列的實(shí)例包括，但不限于，組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、干擾素、白介素、生長(zhǎng)激素、病毒包膜糖蛋白信號(hào)段、尼克煙草(Nicotiana nectarin)信號(hào)肽(US 5，939，288)、煙草伸展蛋白信號(hào)、大豆油質(zhì)蛋白油體結(jié)合蛋白信號(hào)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)液泡基本的幾丁質(zhì)酶信號(hào)肽，以及文中所定義的所述絲多肽的天然信號(hào)序列。細(xì)朐本發(fā)明的大多數(shù)方法依賴于生產(chǎn)如文中所定義的一種或多種絲蛋白的細(xì)胞的使 用。通過(guò)能夠?qū)⒍嗑酆塑账岱肿硬迦胨黾?xì)胞的任何方法能夠?qū)崿F(xiàn)多聚核苷酸分子向細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化技術(shù)包括，但不限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、吸附和原生質(zhì)體融合。重組細(xì)胞可以保持為單細(xì)胞或者可以生長(zhǎng)為組織、器官或多細(xì)胞生物。已轉(zhuǎn)化的多聚核苷酸分子能夠保持在染色體外或者能夠整合到已轉(zhuǎn)化的(即，重組的)細(xì)胞的染色體中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)中，所述整合以保留它們的待表達(dá)的能力的方式進(jìn)行。用于轉(zhuǎn)化的適合的宿主細(xì)胞包括能夠被編碼如文中所定義的絲多肽的多聚核苷酸轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞。宿主細(xì)胞可能是內(nèi)在地(即，天然地)能夠生產(chǎn)所述絲多肽的或者可能是在被如文中所定義的至少一種多聚核苷酸分子轉(zhuǎn)化之后能夠生產(chǎn)所述絲多肽的。宿主細(xì)胞能夠是能夠生產(chǎn)如文中所定義的至少一種絲蛋白的任何細(xì)胞，并且包括細(xì)菌、真菌(包括酵母)、寄生蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物、動(dòng)物和植物細(xì)胞。宿主細(xì)胞的實(shí)例包括沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、埃希氏菌屬(Escherichia)、桿菌(Bacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、酵母菌屬(Saccharomyces)、粘蟲(chóng)屬(Spodoptera)、分支桿菌屬(Mycobacteria)、尺蠖屬(Trichoplusia)、BHK (幼倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞、MDCK 細(xì)胞、CRFK 細(xì)胞、CV-1 細(xì)胞、COS (例如，C0S-7)細(xì)胞和Vero細(xì)胞。宿主細(xì)胞的其他實(shí)例是大腸桿菌，包括大腸桿菌K-12衍生物；傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhi);鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium),包括減毒株；秋粘蟲(chóng)(Spodoptera frugiperda);擬尺蠖(Trichoplusia ni );和非致癌的小鼠成肌G8細(xì)胞(例如，ATCC CRL 1246)。額外的適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物細(xì)胞宿主包括其他腎細(xì)胞系、其他成纖維細(xì)胞系(例如，人、鼠或雞胚胎成纖維細(xì)胞系)、骨髓瘤細(xì)胞系、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、小鼠NIH/3T3細(xì)胞、LMTK細(xì)胞和/或HeLa細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易地確定適合的培養(yǎng)條件如針對(duì)特殊細(xì)胞類(lèi)型的介質(zhì)、溫度和時(shí)間。例如,在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是于大約30°C至大約37°C培養(yǎng)了大約24小時(shí)至大約48小時(shí)周期的大腸桿菌。重組DNA技術(shù)能夠用于通過(guò)操縱，例如，宿主細(xì)胞中所述多聚核苷酸分子的拷貝數(shù)、那些多聚核苷酸分子被轉(zhuǎn)錄的效率、所得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被翻譯的效率和翻譯后修飾的效率來(lái)改善已轉(zhuǎn)化的多聚核苷酸分子的表達(dá)。用于增加多聚核苷酸分子表達(dá)的重組技術(shù)包括，但不限于，將多聚核苷酸分子可操縱地連接至高拷貝數(shù)質(zhì)粒上、將所述多聚核苷酸分子整合到一種或多種宿主細(xì)胞染色體中、將載體穩(wěn)定性序列添加到質(zhì)粒上、轉(zhuǎn)錄控制信號(hào)(例如，啟動(dòng)子、操作子、增強(qiáng)子)的取代或修飾、翻譯控制信號(hào)(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Shine-Dalgarno序列)的取代或修飾、修飾多聚核苷酸分子以適應(yīng)宿主細(xì)胞密碼子的使用和刪除去穩(wěn)定化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列。絲紡絲液的牛產(chǎn)本發(fā)明涉及生產(chǎn)絲紡絲液的方法，所述絲紡絲液隨后能夠用于種類(lèi)繁多的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)方面的一個(gè)步驟涉及裂解細(xì)胞來(lái)釋放生產(chǎn)于和包含于所述細(xì)胞中的絲蛋白。通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何手段能夠進(jìn)行該步驟。例如，典型地離心所述細(xì)胞懸浮液將所述細(xì)胞制成丸狀并且重新懸浮所述細(xì)胞制成更加濃縮的溶液以用于裂解。細(xì)胞能夠，例如，通過(guò)弗氏壓碎器(French Press)的通路被裂解、使用Polytron (BrinkmanInstruments)被均質(zhì)化或者在冰上被超聲處理。裂解細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)的替代方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參看，例如，Sambrook等人,如前所述)。多種試劑盒可用于細(xì)胞裂 解并且為本領(lǐng)域所熟知，例如Bugbuster試劑盒(Novagen)和ProteaPrep試劑盒(ProteaBiosciences, Inc.)。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了如文中所定義的在細(xì)菌中表達(dá)的絲蛋白形成不溶性聚集體(“包涵體”)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括這些包涵體的分離。幾個(gè)方案可適用于蛋白質(zhì)包涵體的純化。例如，包涵體的純化典型地包括采用如上所討論的方法通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞的包涵體的提取、分離和/或純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞被裂解，所述細(xì)胞膜被溶解，并且包含所述包涵體的不溶性部分被分離用于進(jìn)一步加工。本發(fā)明的一個(gè)方面依賴于增加來(lái)自所述上清液的絲蛋白的濃度。此外，這能夠通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這通過(guò)采用沉淀所述絲蛋白的試劑接觸所述上清液來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述試劑如，但不限于，硫酸銨、三氯乙酸、高氯酸和丙酮，或者商用沉淀劑混合物如 PlusOne (Amersham Biosciences)或 Perfect-Focus (Geno TechnologyInc. )0但是，優(yōu)選在絲蛋白產(chǎn)率不足夠高的情況下，用于生產(chǎn)絲紡絲液的本發(fā)明的可選步驟包含增加所述絲紡絲液中絲蛋白的濃度。此外，這能夠通過(guò)用于增加水溶液中蛋白質(zhì)濃度的本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)特別有用的實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)抗脫水溶液如包含吸濕性聚合物的溶液的濾膜分析來(lái)濃縮所述絲紡絲液。適合的吸濕性聚合物的實(shí)例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、淀粉酶和絲膠，或其兩種或多種的組合。有一系列分子大小的PEG分子可被利用，通過(guò)選用于濾膜分析的膜和所需的濃縮速率確定所述PEG的選擇。優(yōu)選地，所述PEG具有大約8，000至大約10，000g/mol的分子量和大約25%至大約50%的濃度。表面活性劑在一個(gè)實(shí)施方案中，如文中所定義的生產(chǎn)絲紡絲液的步驟包括表面活性劑的使用。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)表面活性劑(如SDS)能夠使如文中所定義的絲蛋白保持在溶液中同時(shí)允許在所述表面活性劑的濃度被降低時(shí)形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表面活性劑是陰離子表面活性劑。用于本發(fā)明的陰離子表面活性劑的實(shí)例包括，但不限于，十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂基硫酸銨和其他烷基硫酸鹽、I-辛基磺酸鈉一水合物、月桂酰基肌氨酸鈉、月桂基乙醚硫酸鈉(SLES)、牛去氧膽酸鈉水合物和烷基苯磺酸鹽；或其兩種或多種的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述陰離子表面活性劑是SDS。能夠使用增加所述絲蛋白溶解度的任何濃度的所述表面活性劑。例如，使用至少大約O. 1%ν/ν的所述表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用大約O. 1%至大約10%v/v，更優(yōu)選地，大約O. 5%至大約2%v/v或大約O. 5%至大約5%v/v的所述表面活性劑。用于生產(chǎn)絲紡絲液的本發(fā)明的所述方法的進(jìn)一步的步驟包含通過(guò)添加沉淀所述表面活性劑的化合物來(lái)降低表面活性劑的量用于輔助所述絲蛋白的正確折疊?？梢允褂门c所述表面活性劑結(jié)合并且降低所述表面活性劑溶解度的任何化合物。實(shí)例包括，但不限于，鹽或碳水化合物如α-環(huán)糊精；或其兩種或多種的組合。優(yōu)選地，所述鹽是鉀鹽或鈉鹽。優(yōu)選地，所述鉀鹽是氯化鉀并且所述鈉鹽是乙酸鈉。能夠使用導(dǎo)致溶液中表面活性劑的量降低的任何濃度的所述化合物。例如，添加所述化合物至最終濃度為大約ImM至大約1Μ，更優(yōu)選大約40mM至大約IOOmM或大約40mM至400mM。
用于生產(chǎn)絲紡絲液的本發(fā)明的所述方法的進(jìn)一步的步驟包含從隨著所述化合物的添加而形成的所述沉淀中分離所述溶液。這能夠通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述方法如使用離心(例如在16000g離心5分鐘)，并且除去包含(其為)所述絲紡絲液的所述上清液(溶液)。優(yōu)選地，在該步驟之后，所述絲蛋白構(gòu)成至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少99%，甚至更優(yōu)選100%的溶液中的蛋白質(zhì)。離子液體通常，離子液體能夠被定義為化合物，所述化合物完全由離子組成并且在低于大約100°c，優(yōu)選低于大約85°C的溫度下是液體。如在本發(fā)明中所使用的，離子液體通常包含一種或多種陰離子和一種或多種陽(yáng)離子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述離子液體包含有機(jī)陽(yáng)離子，所述有機(jī)陽(yáng)離子通過(guò)衍生一種或多種化合物以包括取代基來(lái)創(chuàng)造，所述取代基如烷基、稀基、塊基、燒氧基、稀氧基、塊氧基、多種芳香基團(tuán)，如(取代的或無(wú)取代的)苯基、(取代的或無(wú)取代的)芐基、(取代的或無(wú)取代的)苯氧基和(取代的或無(wú)取代的)芐氧基以及在其環(huán)的部分具有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)雜原子多種雜環(huán)芳香基團(tuán)，所述雜環(huán)是取代的或無(wú)取代的。所述衍生的化合物包括，但不限于，咪唑、吡唑、噻唑、異噻唑、氮代噻唑、氧代噻唑、噁嗪、噁唑啉、環(huán)氧氮硼燒、dithiozole (未找到中譯文)、三唑、delenozole (未找到中譯文)、環(huán)氧磷烷、吡咯、環(huán)硼烷、呋喃、噻吩、環(huán)磷烷、五唑、Π引哚、Π引哚林、噁唑、異噁唑、異四唑、四唑、苯并呋喃、二苯并呋喃、苯并噻吩、二苯并噻吩、噻二唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、噠嗪、哌嗪、哌啶、嗎啉酮、批喃、anno line (未找到中譯文)、酞嗪、喹唑啉、胍鐵、喹喔啉、基于膽堿的類(lèi)似物,及其組合。所述基本的陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)能夠是單一或多重取代的或無(wú)取代的。所述離子液體的陰離子部分能夠包含無(wú)機(jī)部分、有機(jī)部分，或其組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述陰離子部分包含一種或多種部分，所述部分選自鹵素、磷酸鹽、烷基磷酸鹽、烯基磷酸鹽、雙(三氟甲基磺?；?亞胺(NTf2)、BF4'PF6'AsF6'NO3'N(CN)2'N(SO3CF3)2'氨基酸、取代的或無(wú)取代的碳硼烷、高氯酸鹽、擬鹵素如硫氰酸鹽和氰酸鹽、基于金屬氯化物的路易斯酸(例如，氯化鋅和氯化鋁)或Cu羧酸鹽。擬鹵化物是一價(jià)的并且具有那些類(lèi)似于鹵化物的性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的有用的擬鹵化物實(shí)例包括氰化物、硫氰酸鹽、氰酸鹽、雷酸鹽和疊氮化物。含有1-6個(gè)碳原子的示范性羧酸鹽是甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、己酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、丙酮酸鹽等等。根據(jù)本發(fā)明能夠制備和使用多種離子液體。特別地，能夠使用如上所提到的所述陽(yáng)離子和陰離子的任何組合。僅需要將一種或多種陽(yáng)離子(如以上所描述的那些)與一種或多種陰離子(如以上所描述的那些)組合來(lái)形成在如文中所描述的條件下為液體的材料。例如，陽(yáng)離子性咪唑鎗部分能夠與陰離子性鹵素部分組合來(lái)形成在所需的條件下為液體的材料(例如，I-丁基-3-甲基-咪唑鎗氯化物)并且其基本上完全由離子部分形成。因此，本發(fā)明涵蓋了多種多樣的離子液體的使用是顯而易見(jiàn)的。根據(jù)本發(fā)明所使用的離子液體的具體的、非限制性的實(shí)例包括I- 丁基-3-甲基-咪唑鎗氯化物烯丙基-3-甲基-咪唑鎗氯化物(“AmimCl，，) ； I-乙基-3-甲基-咪唑鎗氯化物；1_氫_3_甲基-咪唑鎗氣化物；1_節(jié)基_3_甲基-味卩坐鐵氣化物(“BenzylmimCl ”)；1_異丙基_3_甲基-味卩坐鐵氯化物；1-間甲氧基節(jié)基-3-甲基-咪唑鐵氯化物(“MethoxyBenzylmimCl”)；1_間甲基節(jié)基-3-甲基-咪唑鎗氯化物(“MethylBenzylmimCl”); I-芐基-3-甲基-咪唑鎗氯化物和I-甲基-3-節(jié)基-咪唑鐵二氰胺("BenzylmimDca")。
本發(fā)明還涵蓋了多種離子液體混合物的使用。事實(shí)上，離子液體混合物能夠用于 提供具有定制的性質(zhì)(如粘度)的離子液體。例如，BenzylmimCl是相對(duì)粘滯的離子液體；然而，通過(guò)與AminCl混合能夠顯著降低它的粘度。因此，通過(guò)改變粘性較大成分和粘性較小成分之間的比例能夠調(diào)節(jié)所述離子液體混合物的粘度。根據(jù)本發(fā)明所使用的離子液體能夠根據(jù)文獻(xiàn)被合成。優(yōu)選地，在使用之前，所述離子液體在真空干燥箱中被烘干(例如，于IO(TC) —段時(shí)間，如大約48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子液體由材料形成，所述材料在環(huán)境條件下為固體的(例如，結(jié)晶的)但是在增加的溫度下為液體的(如大于大約30°C、大于大約50°C、大于大約75°C或大于大約100°C)。通常，所述結(jié)晶的材料能夠被置于適當(dāng)?shù)娜萜髦胁⑶冶患訜嶂寥芙?參看，例如，IonicLiquids in Synthesis, ffasserscheid, P.和 Weldon, T.(編輯)，Wiley Pub·)。當(dāng)然，所述離子液體還能夠包含在環(huán)境條件下(例如，在20-25°C左右的溫度下)為液體的材料。過(guò)濾和/或色譜法溶解的絲蛋白可以被濃縮并從雜質(zhì)中分離出來(lái)，所述雜質(zhì)如所述表面活性劑、離子液體和基于電荷、親水性、親和力、溶解度或穩(wěn)定性，或者尺寸的其他細(xì)胞成分。分離技術(shù)的非限制性實(shí)例包括硫酸銨沉淀、色譜法和膜過(guò)濾(包括切向流膜過(guò)濾)。在利用用于分離的色譜法的實(shí)施方案中，示范性的方法包括離子交換(陽(yáng)離子的或陰離子的)、親和色譜法、親水性相互作用、疏水性相互作用、尺寸排除和凝膠滲透(參看US 6，248，570)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)膜過(guò)濾能夠進(jìn)行所述分離，所述膜過(guò)濾包括，但不限于，如單通道、無(wú)出路的直流過(guò)濾(DFF)以及橫向流或正切流動(dòng)過(guò)濾(TFF)的方法。根據(jù)本發(fā)明，過(guò)濾依據(jù)使用具有已定義孔徑范圍的半滲透膜，根據(jù)尺寸分離分子的原則。過(guò)濾方法和可以在分離中使用的膜類(lèi)型的組合是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。根據(jù)本發(fā)明，膜過(guò)濾是受到聚合的或無(wú)機(jī)的膜影響的細(xì)胞成分的分離。在本領(lǐng)域中，根據(jù)其從載體液體中除去的物質(zhì)尺寸定義的膜有四種常見(jiàn)的可接受的類(lèi)別。連續(xù)的透膜過(guò)濾的方法從最小的孔到最大的孔依次為逆向滲透(R0)、納米過(guò)濾(NF)、超濾(UF)和微米過(guò)濾(MF)。采用上述膜的過(guò)濾通過(guò)使用具有特定孔徑的膜根據(jù)分子的分子量來(lái)分離分子。例如，采用具有小于O. OOl微米的孔徑的RO膜的分離旨在分離具有小于200道爾頓的分子量的分子。采用具有從O. 001至O. 008微米以內(nèi)的孔徑的NF膜的過(guò)濾旨在分離具有從200道爾頓至15千道爾頓(kDa)以內(nèi)的的分子量的分子。采用具有從O. 005至O. I微米以內(nèi)的孔徑的UF膜的過(guò)濾旨在分離具有從5kDa至300kDa以內(nèi)的的分子量的分子。采用具有從O. 05至3. O微米以內(nèi)的孔徑的微米過(guò)濾膜的過(guò)濾旨在分離具有從IOOkDa至3000kDa及更大的分子量的分子。根據(jù)本發(fā)明，膜過(guò)濾能夠?qū)⑷芙獾慕z蛋白從其他成分中分離出來(lái)，所述膜過(guò)濾基于利用膜的尺寸排除，所述膜具有由所述膜的孔徑所確定的特定的截留分子量(MQWC0)。MWC0，也稱(chēng)作名義分子量限制(NMWL)或名義截留分子量(NMWC0)，是千道爾頓規(guī)格的用于膜過(guò)濾的名稱(chēng)。所述MWCO被定義為所述分子90%被所述膜保留的分子量。因?yàn)?，例如，相同分子量的分子能夠具有顯著不同的形狀，所以盡管所述MWCO不是精確的度量標(biāo)準(zhǔn)，但仍舊是有用的度量標(biāo)準(zhǔn)并且通常為膜生產(chǎn)商所使用。在本發(fā)明中不但可以使用疏水性膜而且可以使用親水性膜。所述膜可以作為平板狀薄片使用或者在螺旋狀纏繞結(jié)構(gòu)中使用。還可以使用中空纖維。關(guān)于UF膜的組成，可以使用許多潛在的膜材料包括，但不限于，再生纖維素、聚醚砜(其可以或可以不被修飾來(lái)改變它固有的疏水性)、聚偏二氟乙烯，以及陶瓷和金屬氧化物的聚集體。許多聚醚砜UF膜能夠經(jīng)受O. 5-1.3的pH范圍和高達(dá)85°C的溫度范圍。用于MF膜的材料包括用于UF膜的每一種，以及聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和PTFE(TEFLON )。在一些實(shí)施方案中，所述溶解的絲蛋白能夠被過(guò)濾用于從較小的細(xì)胞成分中分離大細(xì)胞碎片來(lái)避免所述細(xì)胞碎片干擾涉及使用膜或色譜法的分離和純化步驟的進(jìn)行。在這些實(shí)施方案中，所述滲過(guò)物包含所述絲蛋白并且被回收。在一些實(shí)施方案中，膜能夠用于具有適合的MWCO的分離步驟。例如，在本發(fā)明的所述方法中使用的典型的絲蛋白具有大約30kDa的分子量(MW)。在這些實(shí)施方案中，所述滲余物包含所述絲蛋白并且能夠被回收。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，正切流動(dòng)過(guò)濾對(duì)于所述絲蛋白既發(fā)揮滲濾作用又發(fā)揮濃縮作用。在TFF中，典型地，所述溶液平行于所述過(guò)濾膜流動(dòng)?？缒毫Σ顚?dǎo)致流動(dòng)的和可濾過(guò)的溶質(zhì)(它的分子量小于所述膜的分子量或者類(lèi)似于此，如球蛋白)流經(jīng)所述濾器。在HPTFF (高效正切流動(dòng)過(guò)濾)中，所述膜是帶電荷的，因此既使用尺寸又使用電荷來(lái)分離污染物(參看US 20030229212)。根據(jù)本發(fā)明，滲濾能夠是不連續(xù)的或連續(xù)的滲濾。在不連續(xù)的滲濾中，所述溶液被濃縮，并且失去的體積由新緩沖液代替。在連續(xù)的滲濾中，所述溶液的體積通過(guò)在舊緩沖液被除去時(shí)新緩沖液的流入被保持。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使用超濾膜的正切流動(dòng)過(guò)濾能夠進(jìn)行所述絲蛋白的分離和純化。思途 使用本發(fā)明的所述方法生產(chǎn)的絲紡絲液能夠用于一系列廣泛和多樣的醫(yī)學(xué)、軍事、工業(yè)和商業(yè)應(yīng)用。例如，所述絲紡絲液用于生產(chǎn)絲纖維，所述絲纖維進(jìn)而能夠用于醫(yī)用裝置(如縫合線、皮膚移植片、細(xì)胞生長(zhǎng)基質(zhì)、替換韌帶和外科用網(wǎng)狀織物)以及廣泛的工業(yè)和商業(yè)產(chǎn)品(如，例如，電纜、繩索、網(wǎng)、釣魚(yú)線、服裝織物、防彈背心內(nèi)襯、容器織物、背包、背囊、書(shū)包或錢(qián)包皮帶、粘附性裝訂材料、非粘附性裝訂材料、束縛材料、帳篷織物、防水油布、水池覆蓋物、車(chē)輛覆蓋物、圍欄材料、密封劑、建筑材料、防風(fēng)雨材料、彈性分隔材料、運(yùn)動(dòng)設(shè)備)的制造；并且，事實(shí)上，幾乎用于纖維或織物的任何用途，所述纖維或織物的高抗張強(qiáng)度和彈性是所需的特性。所述絲紡絲液還應(yīng)用于個(gè)人護(hù)理用品組合物(如化妝品、皮膚護(hù)理品、毛發(fā)護(hù)理品和染發(fā)劑)的生產(chǎn)；和微粒涂覆(如色素)。所述絲可以以它們的天然形式來(lái)使用或者可以將它們修飾來(lái)形成衍生物，所述衍生物提供更有益的效果。例如，通過(guò)結(jié)合至聚合物以降低如US 5，981，718和US 5，856，451中所描述的變應(yīng)原性可以將所述絲修飾。適合的修飾聚合物包括，但不限于，聚亞烷基氧化物、聚乙烯醇、聚羧酸酯、聚(乙烯吡咯烷酮)和右旋糖酐。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)其他蛋白質(zhì)修飾劑的選擇性消化和拼接可以將所述絲修飾。例如，通過(guò)在大約60°C的高溫下采用酸的處理可以將所述絲蛋白裂解成較小的肽單元。有用的酸包括，但不限于，稀鹽酸、硫酸或磷酸。可選地，通過(guò)采用堿(如氫氧化鈉)的處理或使用可以被使用的適合的蛋白酶的酶消化可以完成所述絲蛋白的消化?？梢詫⑺龅鞍踪|(zhì)進(jìn)一步修飾來(lái)提供性能特性，所述性能特性有益于個(gè)人護(hù)理用品的特異性應(yīng)用。用于個(gè)人護(hù)理用品的蛋白質(zhì)的修飾為本領(lǐng)域所熟知。例如，通常所使用的方法如US 6，303，752,US 6，284，246和US 6，358，501中所描述。修飾的實(shí)例包括，但不 限于，用于促進(jìn)水-油乳液增強(qiáng)的乙氧基化作用、用于提供親脂兼容性的硅氧基化作用和有助于與肥皂和去污劑組合物的兼容性的酯化作用。此外，采用官能團(tuán)可以將所述絲蛋白衍生化，所述官能團(tuán)包括，但不限于，胺、環(huán)氧乙烷、氰酸酯、羧酸酯、硅酮共聚醇、硅氧烷酯、脂肪族季胺、烏拉坦、聚丙烯酰胺、二羧酸酯和鹵代酯。通過(guò)與二亞胺的反應(yīng)和通過(guò)金屬鹽的形成也可以將所述絲蛋白衍生化。符合上述定義的“多肽”(和“蛋白質(zhì)”)，所述衍生的和/或修飾的分子在文中也廣泛地被認(rèn)為是“多肽”和“蛋白質(zhì)”。所述絲紡絲液能夠連同其他纖維類(lèi)型一起紡織和/或用其他纖維類(lèi)型捆綁或編織。實(shí)例包括，但不限于，聚合物纖維(例如，聚丙烯、尼龍、聚酯)、其他植物和動(dòng)物來(lái)源的纖維和絲(例如，棉花、羊毛、家蠶(Bombyx mori)或蜘蛛絲)和玻璃纖維。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是用10%聚丙烯纖維編織的絲纖維。本發(fā)明涵蓋了所述纖維組合的生產(chǎn)能夠輕易地實(shí)踐用于增強(qiáng)任何所需的特性，例如，外觀、柔軟度、重量、耐用度、防水性質(zhì)、改善的制造成本，所述特性通常可以在用于醫(yī)學(xué)、工業(yè)或商業(yè)應(yīng)用的纖維的制造和生產(chǎn)中尋求。個(gè)人護(hù)理用品化妝品和皮膚護(hù)理組合物可以是包含在化妝品上可接受的介質(zhì)中的有效量的絲的無(wú)水組合物。這些組合物的用途包括，但不限于，皮膚護(hù)理、皮膚清潔、化妝品和抗皺產(chǎn)品。用于化妝品和皮膚護(hù)理組合物的有效量的絲在文中被定義為相對(duì)于所述組合物總重量的比例以重量計(jì)介于大約10_4至大約30%，但是優(yōu)選以重量計(jì)介于大約10_3至15%。這個(gè)比例可以隨著化妝品或皮膚護(hù)理組合物的類(lèi)型而變化。對(duì)于化妝品上可接受的介質(zhì)而言，適合的組合物如US 6，280, 747中所描述。例如，所述化妝品上可接受的介質(zhì)可以含有脂肪物質(zhì)，所述脂肪物質(zhì)相對(duì)于所述組合物總重量的比例以重量計(jì)介于大約10至大約90%，其中所述脂肪相含有至少一種液體的、固體的或半固體的脂肪物質(zhì)。所述脂肪物質(zhì)包括，但不限于，油、蠟、樹(shù)膠和所謂的糊狀脂肪物質(zhì)?？蛇x地，所述組合物可以采用穩(wěn)定的分散系的形式如油包水或水包油乳劑。此外，所述組合物可以含有一種或多種常規(guī)的化妝品或皮膚病學(xué)添加劑或佐劑，包括，但不限于，抗氧化劑、防腐劑、填充物、表面活性劑、UVA和/或UVB防曬劑、芳香劑、增稠劑、潤(rùn)濕劑和陰離子型、非離子型或兩性聚合物，以及染料或色素。采用包含通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的絲的被乳化的材料可生產(chǎn)的被乳化的化妝品和準(zhǔn)藥物，例如，清潔化妝品(美容皂、潔面乳、香波、洗發(fā)水等等)、毛發(fā)護(hù)理用品(染發(fā)劑、毛發(fā)化妝品等等)、基礎(chǔ)化妝品(普通霜、乳液、剃須膏、調(diào)節(jié)劑、古龍水、剃須水、化妝油、面膜等等)、上妝化妝品(粉底、眉筆、眼霜、眼影、睫毛膏等等)、芳香化妝品(香水等等)、美黑和防曬化妝品(美黑和防曬霜、美黑和防曬水、美黑和防曬油等等)、指甲化妝品(指甲霜等等)、眼線化妝品(眼線筆等等)、唇部化妝品(唇膏、 唇霜等等)、口腔護(hù)理用品(牙膏等等)、沐浴化妝品(沐浴用品等等)等等。所述化妝品組合物還可以是指甲護(hù)理用品的形式，如指甲油。指甲油在文中被定義為用于指甲處理和著色的組合物，所述組合物包含在化妝品上可接受的介質(zhì)中的有效量的絲。用于指甲油組合物的有效量的絲在文中被定義為相對(duì)于所述指甲油總重量的比例以重量計(jì)介于大約10_4至大約30%。用于指甲油的化妝品上可接受的介質(zhì)成分如US6，280，747中所描述。所述指甲油典型地含有溶劑和成膜物質(zhì)，如纖維素衍生物、聚乙烯基衍生物、丙烯酸聚合物或共聚物、乙烯基共聚物和聚酯聚合物。所述組合物還可以含有有機(jī)的或無(wú)機(jī)的色素。毛發(fā)護(hù)理組合物在文中被定義為用于毛發(fā)處理的組合物，包括但不限于香波、調(diào)節(jié)劑、洗液(lotion)、氣霧劑、凝膠和摩絲,所述組合物包含在化妝品上可接受的介質(zhì)中的有效量的絲。用于毛發(fā)護(hù)理組合物的有效量的絲在文中被定義為相對(duì)于所述組合物總重量的比例以重量計(jì)介于大約10_2至大約90%。用于毛發(fā)護(hù)理組合物的化妝品上可接受的介質(zhì)成分如 US 2004/0170590、US 6，280，747、US6, 139，851 和 US 6，013，250 中所描述。例如，這些毛發(fā)護(hù)理組合物能夠是水性的、醇性的或水-醇溶液，所述醇優(yōu)選為乙醇或異丙醇，對(duì)于水-醇溶液而言，相對(duì)于總重量的比例以重量計(jì)介于大約I至大約75%。此外，所述毛發(fā)護(hù)理組合物可以含有如上所給定的一種或多種常規(guī)的化妝品或皮膚病學(xué)添加劑或佐劑。毛發(fā)著色組合物在文中被定義為用于毛發(fā)著色、染色或漂洗的組合物，包含在化妝品上可接受的介質(zhì)中的有效量的絲。用于毛發(fā)著色組合物的有效量的絲在文中被定義為相對(duì)于所述組合物總重量的比例以重量計(jì)介于大約10_4至大約60%。用于毛發(fā)著色組合物的化妝品上可接受的介質(zhì)成分如US 2004/0170590、US6, 398，821和US 6，129，770中所描述。例如，毛發(fā)著色組合物通常含有無(wú)機(jī)的基于過(guò)氧化的染色氧化劑和可氧化的著色劑的混合物。最常見(jiàn)的所述基于過(guò)氧化的染色氧化劑是過(guò)氧化氫。通過(guò)主要中間體(例如對(duì)苯二胺、對(duì)氨基苯酚、對(duì)二氨基吡啶、羥基吲哚、氨基吲哚、氨基胸腺嘧啶或氰基苯酚)與次要中間體(例如苯酚、間苯二酚、間氨基苯酚、間苯二胺、萘酚、吡唑酮、羥基吲哚、兒茶酚或吡唑)的氧化偶聯(lián)形成所述氧化的毛發(fā)著色劑。此外，毛發(fā)著色組合物可以含有氧化劑、掩蔽劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、緩沖載體、表面活性劑、溶劑、抗氧化劑、聚合物、非氧化的染料和調(diào)節(jié)劑。所述絲還能夠用于涂覆色素和化妝品微粒以便改善用于化妝品和涂覆組合物的所述微粒的分散性?；瘖y品微粒在文中被定義為微?；牟牧先缭诨瘖y品組合物中使用的色素或惰性微粒。適合的色素和化妝品微粒，包括，但不限于，無(wú)機(jī)顏色色素、有機(jī)色素和惰性微粒。所述無(wú)機(jī)顏色色素包括，但不限于，二氧化鈦、氧化鋅以及鐵、鎂、鈷和鋁的氧化物。有機(jī)色素包括，但不限于，D&C Red No. 36、D&C Orange No. 17、D&C Red No. 7、11、31 和 34鈣色淀、D&C Red No. 12鋇色淀、D&C Red No. 13鍶色淀、FD&C Yellow No. 5鋁色淀和碳黑微粒。惰性微粒包括，但不限于，碳酸鈣、硅酸鋁、硅酸鈣、硅酸鎂、云母、滑石、硫酸鋇、硫酸鈣、粉末狀Nylon 、全氟代烷烴和其他惰性塑料。所述絲還可以在牙線中使用(參看，例如，US 2005/0161058)。所述牙線可以是單絲紗線或多絲紗線，并且纖維可以或可以不是扭曲的。所述牙線可以被包裝成單件或者是具有用于將其切成任何所需長(zhǎng)度的切口的卷狀物。所述牙線可以被提供為不同于細(xì)絲的一系列形狀，如但不限于，條和片等等。所述牙線可以采用不同材料進(jìn)行涂覆，如但不限于，用于牙線的蠟、聚四氟乙烯單絲紗線。所述絲還可以在肥皂中使用(參看，例如，US 2005/0130857)。色素和化妝品微粒的涂覆用于色素和化妝品微粒涂覆的絲的有效量在文中被定義為相對(duì)于微粒干重的比
例以重量計(jì)介于大約IO4至大約50%之間，但優(yōu)選介于大約O. 25至大約15%之間。所使用的所述絲的最適宜量取決于被涂覆的色素或化妝品微粒的類(lèi)型。例如，與無(wú)機(jī)顏色色素一起使用的絲的量?jī)?yōu)選以重量計(jì)介于大約O. 01%至20%之間。在有機(jī)色素的情況下，優(yōu)選的絲的量以重量計(jì)介于大約1%至大約15%之間，而對(duì)于惰性微粒而言，優(yōu)選的絲的量以重量計(jì)介于大約O. 25%至大約3%之間。用于制備被涂覆的色素和微粒的方法如US 5，643，672中所描述。這些方法包括在振搖或混合的同時(shí)，將所述絲的水溶液添加到所述微粒中，形成所述絲和所述微粒的漿體并干燥，將所述絲的溶液噴灑在所述微粒上干燥或者將所述絲和所述微粒的漿體凍干。這些被涂覆的色素和化妝品微粒可以用于化妝品配方、油漆、墨水
坐坐寸寸ο生物醫(yī)學(xué)所述絲可以被用作繃帶上的涂料來(lái)促進(jìn)傷口愈合。對(duì)于這個(gè)應(yīng)用而言，所述繃帶材料采用有效量的所述絲進(jìn)行涂覆。出于傷口愈合繃帶的目的，有效量的絲在文中被定義為相對(duì)于所述繃帶材料重量的比例以重量計(jì)介于大約10_4至大約30%之間。待涂覆的所述材料可以是任何柔軟的，生物學(xué)上惰性的，有孔的布料或纖維。實(shí)例包括，但不限于，棉花、絲、人造絲、醋酸纖維、丙烯酸纖維、聚乙烯纖維、聚酯纖維及其組合。通過(guò)本領(lǐng)域已知的一些方法可以完成所述布料或纖維的涂覆。例如，可以將待涂覆的所述材料浸入到含有所述絲的水溶液中?？蛇x地，可以使用噴槍將含有所述絲的所述溶液噴灑到待涂覆的所述材料的表面上。此外，使用輥涂印刷工藝可以將含有所述絲的所述溶液涂覆到表面上。所述傷口繃帶可以包括其他添加劑，包括但不限于，消毒劑如碘、碘化鉀、聚維酮碘、利凡諾、過(guò)氧化氫、苯扎氯銨和氯己定；治療促進(jìn)劑如尿囊素、鹽酸地布卡因和蘋(píng)果酸氯苯胺；血管收縮劑如鹽酸萘唑啉；收斂劑如氧化鋅；和結(jié)痂劑如硼酸。所述絲紡絲液還可以采用作為傷口敷料材料的薄膜的形式被使用。采用無(wú)定形薄膜的形式作為傷口敷料材料的絲的用途如US 6，175，053中所描述。所述無(wú)定形薄膜包含稠密且無(wú)孔的結(jié)晶度低于10%的含有有效量的絲的薄膜。對(duì)于用于傷口護(hù)理的薄膜而言，絲的有效量在文中被定義為以重量計(jì)介于大約I至99%之間。所述膜還可以含有其它成分包括但不限于其他蛋白質(zhì)如絲膠和如上所述的消毒劑、治療促進(jìn)劑、血管收縮劑、收斂劑以及結(jié)痂劑。其他蛋白質(zhì)如絲膠可以以重量計(jì)可占所述組合物的I至99%。所列舉的其他成分的量?jī)?yōu)選總計(jì)低于所述組合物的大約30%(以重量計(jì))，更優(yōu)選介于所述組合物的大約O. 5至20% (以重量計(jì))。通過(guò)在水溶液中溶解上述材料，過(guò)濾或離心除去不溶物以及將所述溶液澆鑄在光滑的固體表面(如丙烯酸板)上，然后干燥可以制備所述傷口敷料薄膜。所述絲紡絲液還可以用于生產(chǎn)縫合線(參看，例如，US 2005/0055051)。所述縫合線能夠以由超高分子量纖維和絲纖維構(gòu)成的編織套為特征。聚乙烯提供強(qiáng)度。聚酯纖維可以與高分子量聚乙烯一起編織來(lái)提供改善的束縛性質(zhì)。所述絲可以采用對(duì)比色被提供來(lái)提供用于改善的縫合線識(shí)別和鑒定的蹤跡。與其他纖維相比，絲具有更好的組織順從性，允許待切割的末端接近于結(jié)點(diǎn)而不用擔(dān)心縫合線的末端與周?chē)M織之間的有害相互作用。使用用于涂覆所述縫合線的多種材料也能夠增強(qiáng)所述高強(qiáng)度縫合線的操作特性。所述縫合線有利地具有Ethibond No. 5縫合線般的強(qiáng)度，但是具有No. 2縫合線般的直徑、感覺(jué)和打結(jié)能力。因此，對(duì)于大多數(shù)整形外科程序(如肩袖修復(fù)、跟腱修復(fù)、髕腱修復(fù)、ACL/PCL再造、髖部和肩部再造程序，以及在縫合錨中使用的或與縫合錨一起使用的縫合線的替換)而言，所述縫合線是理想的。例如，所述縫合線能夠是無(wú)涂覆的，或者是采用蠟(蜂蠟、石蠟、聚乙烯蠟或其他)、娃酮(Dow Corning娃酮流體202A或其他)、娃酮橡膠、PBA (聚丁酸)、乙基纖維素(FiIodel)或其他涂料涂覆的,來(lái)改善織帶的潤(rùn)滑性、結(jié)點(diǎn)的安全性或耐磨性。所述絲紡絲液還可以用于生產(chǎn)支架(參看，例如，US 2004/0199241)。例如，所提 供的支架移植體包括腔內(nèi)支架和移植體，其中所述支架移植體包括絲。所述絲誘導(dǎo)接受所述支架移植體的宿主的應(yīng)答，其中所述應(yīng)答能夠?qū)е滤鼋z支架移植體和與所述絲支架移植體的絲毗鄰的所述宿主的組織之間的增強(qiáng)的粘附力。通過(guò)多種手段的任何一種可以將所述絲附屬于所述移植體，例如，通過(guò)將所述絲交織到所述移植體中或者通過(guò)將所述絲粘附到所述移植體上(例如，借助粘附劑或借助縫合線)。所述絲可以采用線、織帶、片、粉末等形式。關(guān)于所述絲在所述支架移植體上的位置，可以僅僅將所述絲附屬于所述支架的外表面，和/或可以將所述絲附屬于所述支架移植體的末端區(qū)域，以便輔助在宿主中那些末端區(qū)域固定于鄰近組織。種類(lèi)繁多的支架移植體可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用，取決于所需的處理的位點(diǎn)和本質(zhì)。例如，支架移植體可以是分為兩部分的或管狀的移植體，圓柱形的或錐形的，自身可膨脹的或氣球-可膨脹的，一體式的或模塊化的等。除了絲以外，所述支架移植體可以含有在一些或所有的所述絲上面的涂覆，其中所述涂覆隨著所述支架移植體插入宿主而降解，所述涂覆從而延遲了所述絲與所述宿主之間的接觸。適合的涂覆包括，但不限于，明膠、可降解的聚酯(例如，PLGA、PLA、MePEG-PLGA、PLGA-PEG-PLGA及其共聚物和混雜物)、纖維素和纖維素衍生物(例如,羥丙基纖維素)、多糖(例如，透明質(zhì)酸、右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、殼聚糖)、脂類(lèi)、脂肪酸、糖酯、核酸酯、聚酸酐、聚原酸酯和聚乙烯醇(PVA)。所述含絲支架移植體可以含有生物學(xué)活性試劑(藥物)，其中所述試劑從所述支架移植體中被釋放出來(lái)，然后在所述支架移植體被插入其中的宿主中誘導(dǎo)了增強(qiáng)的細(xì)胞應(yīng)答(例如，細(xì)胞的或細(xì)胞外的基質(zhì)沉積)和/或纖維化應(yīng)答。所述絲紡絲液還可以用于生產(chǎn)用于在體外生產(chǎn)韌帶和肌腱的基質(zhì)(參看，例如，US 2005/0089552)?；诮z-纖維的基質(zhì)能夠被播種在多能干細(xì)胞上，如骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)0所述通過(guò)生物工程制成的韌帶或肌腱有利地以細(xì)胞定向和/或在所施加的機(jī)械力方向的基質(zhì)卷曲模式作為特性，并且如果施加所述力的話，其還以沿著所述機(jī)械力或刺激來(lái)產(chǎn)生的機(jī)械負(fù)載的軸向產(chǎn)生包括I型膠原、III型膠原和纖維連接蛋白的韌帶和肌腱特異性標(biāo)記作為特性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述韌帶或肌腱以纖維束的存在作為特性，所述纖維束被排列成螺旋狀結(jié)構(gòu)。能夠被生產(chǎn)的韌帶或肌腱的一些實(shí)例包括前交叉韌帶、后交叉韌帶、肩袖肌腱、肘部和膝部的中間側(cè)副韌帶、手部的屈肌韌帶、踝部的側(cè)韌帶以及頜骨或顳下頜關(guān)節(jié)的肌腱和韌帶。通過(guò)本發(fā)明的方法可以生產(chǎn)的其他組織包括軟骨(既有關(guān)節(jié)的又有半月板的)、骨、肌肉、皮膚和血管。所述絲紡絲液還可以用于生產(chǎn)水凝膠(參看，例如，US 2005/0266992)。合成絲膠水凝膠能夠以開(kāi)孔結(jié)構(gòu)作為特性，所述開(kāi)孔結(jié)構(gòu)允許它們作為組織工程學(xué)支架、細(xì)胞培養(yǎng)底物、傷口和燒傷敷料、軟組織替代物、骨填充物，以及用于藥學(xué)或生物學(xué)活性化合物的載體來(lái)使用。所述絲紡絲液還可以用于生產(chǎn)皮膚病學(xué)組合物(參看，例如，US2005/0019297)。此夕卜，所述紡絲液還可以用于生產(chǎn)緩釋組合物(參看，例如，US2004/0005363)。紡織品所述絲紡絲液還可以用于生產(chǎn)用于隨后用于紡織品的纖維表面的涂覆。這為所述纖維上提供了單層的蛋白質(zhì)薄膜，導(dǎo)致了光滑的拋光。US 6，416，558和US5，232，611描述 了對(duì)于纖維的拋光涂覆的添加。在這些公開(kāi)中描述的方法提供了拋光所述纖維以提供好感覺(jué)和光滑表面的多種用途的實(shí)例。對(duì)于這個(gè)應(yīng)用而言，采用有效量的所述絲涂覆所述纖維。對(duì)于用于紡織品的纖維涂料的目的，絲的有效量在文中被定義為相對(duì)于所述纖維材料重量的比例以重量計(jì)介于大約I至大約99%之間。所述纖維材料包括，但不限于，棉花、聚酯(如人造絲和Lycra )、尼龍、羊毛的紡織纖維和包括天然絲的其他天然纖維。適合于將所述絲應(yīng)用于所述纖維上的組合物可以包括共溶劑(如乙醇、異丙醇、六氟烷醇(hexafluoranol)、異硫氰酸基鈾酸酯(isothiocyanouranate))和能夠與水混合以形成溶液或微乳的其他極性溶劑?？梢詫⑺龊z溶液噴灑到所述纖維上或者將所述纖維浸入到所述溶液中。然而不必要的是，優(yōu)選閃式干燥所述被涂覆的材料。一個(gè)可選擇的方案是將所述絲組合物應(yīng)用到編織纖維上。本發(fā)明的一個(gè)理想的實(shí)施方案是使用絲來(lái)涂覆如用于絲襪的可伸縮織物。復(fù)合材料絲纖維能夠被添加到聚氨酯、其他樹(shù)脂或熱塑性填充物中來(lái)制備控制盤(pán)和其他建筑材料或作為代替木頭和刨花板的模塑家具和臺(tái)式(benchtop)。所述組合物還能夠用于建筑物和自動(dòng)的建筑特別是屋頂和門(mén)板。所述絲纖維再次強(qiáng)化了使所述材料更加堅(jiān)固并且允許重量更輕的建筑具有等于或大于其他刨花板和復(fù)合材料的強(qiáng)度的所述樹(shù)脂。絲纖維可以被分離并且被添加到合成的復(fù)合成形樹(shù)脂中或者與源自植物的蛋白質(zhì)、淀粉和油組合使用來(lái)生產(chǎn)基于生物學(xué)的復(fù)合材料。用于生產(chǎn)所述材料的工藝如JP 2004284246、US2005175825、US 4，515，737、JP 47020312 和 WO 2005/017004 中所描述。紙張?zhí)砑觿┧鼋z的纖維性質(zhì)對(duì)于造紙而言能夠增加強(qiáng)度和質(zhì)量質(zhì)地。通過(guò)將絲線在棉漿中呈斑點(diǎn)狀分散制備超光滑的手工紙張，而制造的絲紙張被用做禮品包裝紙、筆記本封面、手提袋。用于從絲紡絲液中生產(chǎn)紙張產(chǎn)品的工藝一般如JP2000139755中所描述。高級(jí)材料從本發(fā)明的絲紡絲液中生產(chǎn)的絲具有相當(dāng)?shù)捻g性并且當(dāng)其被弄濕時(shí)在保持這些性質(zhì)的方面可以從其他絲中脫穎而出(Hepburn等人，1979)。服裝紡織工業(yè)中的實(shí)質(zhì)性增長(zhǎng)領(lǐng)域是技術(shù)的和智能的紡織品。對(duì)于健康的、高性能的、有利環(huán)境的和個(gè)性化的紡織品產(chǎn)品的需求有所增長(zhǎng)。當(dāng)被弄濕時(shí)不改變性質(zhì)并且特別地保持它們的強(qiáng)度和延展性的纖維，如本發(fā)明的那些，對(duì)于用于運(yùn)動(dòng)和休閑穿著以及工作穿著的功能服裝和防護(hù)服裝而言是有用的。在武器和監(jiān)控技術(shù)中的發(fā)展促進(jìn)了在個(gè)人防護(hù)設(shè)備以及與戰(zhàn)場(chǎng)相關(guān)的系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)中的創(chuàng)新。除了常規(guī)的要求如對(duì)于延長(zhǎng)的暴露的材料耐用度、過(guò)度磨損和對(duì)抗外界環(huán)境的防護(hù)以外，從本發(fā)明的絲紡絲液中生產(chǎn)的絲紡織品能夠被加工來(lái)抵抗彈道投射(ballistic projectiles)、火災(zāi)和化學(xué)品。用于生產(chǎn)所述材料的工藝如W02005/045122和US 2005268443 中所描述。
實(shí)施例實(shí)施例I-蜜蜂絲蛋白的重組生產(chǎn)和純化為了創(chuàng)造重組表達(dá)構(gòu)建體,使用下列寡核苷酸引物組,通過(guò)來(lái)自如Sutherland等人(2006)所述的cDNA克隆的PCR對(duì)不含信號(hào)肽的四種蜜蜂絲基因序列(基因庫(kù)登記號(hào) FJ235088、FJ235089、FJ235090、FJ235091)進(jìn)行擴(kuò)增。AmelFl =GGAATT CTC ATG A67'77Y； GAG GGG (TC, GGCAAC TCGID NO 101)和 CGGC GGATCC TTA TTA AAA TAC GTTGCTCTTCAA GT (SEQ ID N0102)；Ame IF2 GGAATT C K AT(; A CC ('(；(' (；T(； ATT ΑΛΤ (Λ( (}Λ(； TC'C (7'{；(SEQID NO 103 )和 CGGC GGATCC TTA TTkJTC CAA CTTTGC TACATG TATTTT C (SEQ ID NO:
104)；Ame 1F3 =GGAATT C CC ATG GGC GTC GAG GAA TTCAAG TCC TCG (SEQ ID NO
105)和CGGC AGATCT TTA TTA AAA TTTTTTATC CTCAATA(SEQ ID NO :106);AmelF4 =GGAATT C CC ATG GCA AGG GAA GAG GTG GAGACA ('(;(>' (SEQ IDNO 107 )和(TH GGATCC TTA ΤΤΑ(’Π. Γ/ΙΓ (—7Γ ΓΟ! TTC TTC ATT C(SEQ ID NO :108)(克隆限制酶位點(diǎn)采用下劃線和粗體表示并且與所述cDNA序列匹配的序列采用斜體表示)。將PCR擴(kuò)增子克隆至pET14b表達(dá)載體(Novagen)的限制酶位點(diǎn)(AmelFl和Ame 1F2 BspHl 和 Bam HI ；AmelF3 Ncol 和 Bgl II ；AmelF4 Ncol 和 Bam HI)并且在表達(dá)之前通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證所述序列。將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化成Rosetta 2 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Novagen)并且將所述絲蛋白在搖瓶?jī)?nèi)的 50ml 過(guò)夜表達(dá)瞬時(shí)TB介質(zhì)(overnight express instant TB medium, Novagen)中初始表達(dá)。所述四種蜜蜂絲蛋白(AmelF 1-4)于20°C以可溶性形式以及于30°C和37°C以不溶性形式在大腸桿菌細(xì)胞中合成。如根據(jù)在SDS-PAGE (圖I)之后可比較的蛋白質(zhì)條帶強(qiáng)度來(lái)判斷，當(dāng)對(duì)從所述包涵體中回收的蛋白質(zhì)在溫度> 30°C進(jìn)行延長(zhǎng)期(24-36h)的表達(dá)時(shí)，獲得最高的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。使用通過(guò)質(zhì)譜確定的蛋白質(zhì)鑒別，定量的凝膠條帶強(qiáng)度分析表明從所述包涵體中回收的蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上是純凈的(> 95%)絲蛋白。隨后的分析發(fā)現(xiàn)從包涵體中溶解的蛋白質(zhì)自身組裝成天然樣的結(jié)構(gòu)。因此，所有隨后的表達(dá)在如此的條件下進(jìn)行以致從所述包涵體中回收重組蛋白質(zhì)。為了增加蛋白質(zhì)產(chǎn)率，發(fā)展和優(yōu)化了用于AmelF3的大規(guī)模的補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝(batch fed fermentation process)。使用最小培養(yǎng)基(起始體積 I. 6 升)在 2 升 BiostatB培養(yǎng)瓶(Sartorius Stedim, Melsungen, Germany)中進(jìn)行發(fā)酵。使用葡萄糖作為初始的碳來(lái)源，在采用IPTG的絲蛋白表達(dá)誘導(dǎo)之后切換到甘油補(bǔ)料。初始的介質(zhì)含有(每升)KH2PO4,13. 3g ； (NH4) 2HP04,4g和檸檬酸I. 7g。使用2M NaOH將所述介質(zhì)的pH調(diào)節(jié)至最終值
7.O。將下列成分分別滅菌,然后添加(每升最終介質(zhì)):40ml的50%(w/v)葡萄糖；5ml的IMMgSO4 ；130 μ I的O. IM鹽酸硫胺素；lml的100mg/ml氨節(jié)西林和5ml的維生素/微量金屬溶液，所述溶液含有(每升溶液):生物素，O. 2g ；CuSO4 · 5Η20，2· Og ；NaI,0. 08g ；MnSO4 · H2O,
3.Og ;Na2Mo04 ·2Η20，0· 2g ;硼酸，0. 02g ；CoCl2 ·6Η20，0· 5g ；ZnCl2,7. Og ；FeS04 ·7Η20，22· Og ；CaSO4 · 2H20,0. 5g 和 H2SO4, Iml。用于所述四種株的發(fā)酵接種(inocula)在與用于發(fā)酵液的相同介質(zhì)中于37°C被培養(yǎng)20h。一旦將所述接種轉(zhuǎn)移到發(fā)酵瓶，就通過(guò)10% (w/v) NH4OH或10% (w/v) H3PO4的添加將所述介質(zhì)的pH調(diào)節(jié)和控制至7. O。將溫度控制在37°C，并且通過(guò)操縱攪拌速度高達(dá)IlOOrpm并且當(dāng)必需時(shí)采用純氧使空氣供給豐富將溶解氧(DO)的濃度維持在40%的空氣飽和度以上。當(dāng)培養(yǎng)物已經(jīng)增長(zhǎng)至在600nm下的光密度(OD6tltlnm)值大約為20(在接種之后 IOh) 時(shí)，將IPTG添加至最終濃度為ImM。所述發(fā)酵液以批次模式被操作直至所有的葡萄糖被消費(fèi)，如通過(guò)DO中的驟升所表明的(在接種之后 12h)。在甘油補(bǔ)料分批階段，將400ml的62%(v/v)甘油溶液以50ml/h的速率投入到所述發(fā)酵液中。培養(yǎng)物增長(zhǎng)24h，之后通過(guò)離心收集細(xì)胞并于_80°C保存。在這些條件下，所述發(fā)酵液的OD6tltlnm值為34并且溶解后被純化的重組AmelF3的產(chǎn)率大約為每升發(fā)酵液2. 5克。使用相同的發(fā)酵條件來(lái)表達(dá)其他的蜜蜂絲蛋白。表達(dá)絲蛋白AmelFl、2和4的株增長(zhǎng)至OD6tltol值分別為30、67和57。溶解后被純化的重組蛋白質(zhì)AmelFl、2和4的產(chǎn)率大約分別為每升發(fā)酵液O. 2、I. 5和I. 9克。來(lái)自優(yōu)化的補(bǔ)料分批發(fā)酵系統(tǒng)的被純化的蛋白質(zhì)的2. 5g/L的產(chǎn)率是目前對(duì)于任何重組絲蛋白而言最高的已報(bào)道的表達(dá)水平。對(duì)于這種高產(chǎn)率有貢獻(xiàn)的因素包括所述蜜蜂絲蛋白基因的尺寸和本質(zhì)以及所述絲蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。相對(duì)于編碼被廣泛研究的蜘蛛的蛛絲和家蠶的蠶絲的基因的大尺寸OlOkbp)和高度重復(fù)性本質(zhì)，所述蜜蜂絲基因是小的(大約Ikbp)以及在它們的DNA序列中的遠(yuǎn)遠(yuǎn)較少的重復(fù)(Sutherland等人,2006)。所述較小的尺寸和降低的重復(fù)水平意味著所述蜜蜂基因不具有遺傳不穩(wěn)定性的傾向，所述遺傳不穩(wěn)定性包括早發(fā)性翻譯終止和截?cái)?，其由高度重?fù)性核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因表達(dá)所致。根據(jù)用于可溶的或包涵體制備的生產(chǎn)商方案，在采用BugBuster Master Mix(Novagen)反復(fù)處理之后，包涵體中的所述絲蛋白從大腸桿菌細(xì)胞中被純化。通過(guò)采用4-12%梯度的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) (Invitrogen)分析蛋白質(zhì)溶液。通過(guò)如前所述的銜接的質(zhì)譜驗(yàn)證重組絲蛋白的鑒別(Sutherland等人,2006)。包涵體中的絲蛋白被溶解在3%十二烷基硫酸鈉(SDS)中，于60°C的2h孵育。使用QuantiPro BCA分析試劑盒(Sigma)測(cè)量溶液中的蛋白質(zhì)濃度。當(dāng)必需時(shí),所述四種重組蜜蜂絲蛋白的每一種的溶液以等摩爾的比例被混合。通過(guò)對(duì)抗導(dǎo)致KDS沉淀的5g/L KCl溶液的濾膜分析從蛋白質(zhì)溶液中除去過(guò)量的SDS。通過(guò)在16000g下離心5分鐘除去所述沉淀。實(shí)施例2-傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)使用傅里葉變換紅外光譜法來(lái)比較天然的和重組的蜜蜂絲的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。天然的蜜蜂絲片從市售的蜂房中獲得，在氯仿中被充分地洗滌來(lái)除去蠟并且在水中被充分地洗滌來(lái)除去水溶性污染物。所述四種重組蜜蜂絲蛋白的每一種的溶液以等摩爾的比例被混合、燒鑄并干燥成薄膜。使用適宜搭配i系列成像紅外顯微配件的Perkin-Elmer System 2000傅里葉變換光譜儀以傳輸模式獲得來(lái)自這些樣品的紅外光譜。使用Spectrum軟件(5. 3. I版本)收集光譜并且顯示為在4CHT1的分辨率下收集的256次掃描的平均值。使用Grams/Al軟件v5. 05進(jìn)行收集后的數(shù)據(jù)處理和分析。每一種絲光譜的酰胺I區(qū)域的去卷積如圖2所示。對(duì)于結(jié)果和組分二級(jí)結(jié)構(gòu)歸屬的總結(jié)如表2所示。表2. FTIR曲線擬合總結(jié)
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)絲紡絲液的方法，所述方法包含 i )裂解生產(chǎn)一種或多種絲蛋白的細(xì)胞， ii)通過(guò)采用表面活性劑或離子液體接觸它們使所述絲蛋白溶解，和 iii)濃縮所述絲蛋白來(lái)生產(chǎn)絲紡絲液， 其中所述一種或多種絲蛋白能夠形成包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述絲蛋白被濃縮，通過(guò) a)通過(guò)加入沉淀所述表面活性劑的化合物來(lái)減少溶液中所述表面活性劑的量，和 b)從在步驟a)中形成的所述沉淀中分離包含所述絲蛋白的溶液以生產(chǎn)所述絲紡絲液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述沉淀表面活性劑的化合物是鹽或碳水化合物；或其兩種或多種的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述鹽是鉀鹽或鈉鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述絲蛋白通過(guò)過(guò)濾被濃縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述絲蛋白通過(guò)膜過(guò)濾被濃縮。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述膜過(guò)濾是正切流動(dòng)過(guò)濾。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包含增加所述絲紡絲液中絲蛋白的濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其包含所述絲紡絲液對(duì)抗脫水溶液的濾膜分析。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述脫水溶液包含吸濕性聚合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述吸濕性聚合物選自聚乙二醇、淀粉酶和絲膠，或其兩種或多種的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述絲紡絲液包含至少大約O.5%w/V的絲蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述絲紡絲液包含大約O.5%至大約15%w/v的絲蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求I至13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，或其兩種或多種的組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求I至15任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟i)進(jìn)一步包含從已裂解的細(xì)胞中分離包涵體。
17.根據(jù)權(quán)利要求I至16任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包含在步驟i)之前培養(yǎng)所述細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求I至17任一項(xiàng)所述的方法，其中所述絲蛋白能夠形成包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的部分包含至少10個(gè)七肽序列abcdefg的拷貝，并且其中處于位置a和d上的至少25%的氨基酸是丙氨酸殘基。
19.根據(jù)權(quán)利要求I至18任一項(xiàng)所述的方法，其中所述絲蛋白包含序列，所述序列選自a)如SEQ ID NO 1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、53、55、65、67、69、71、81、83、85、87或97中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列，b)與SEQ ID NO 1、3、5、7、17、19、21、23、33、35、37、39、49、51、53、55、65、67、69、71、81、.83、85、87或97中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列，和 c)a)或b)的生物學(xué)活性片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求I至19任一項(xiàng)所述的方法，其中所述絲蛋白包含第一絲蛋白，其包含 a)如SEQID NO I、17、33、49、65或81中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列； b)與SEQID NO 1、17、33、49、65或81中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和 c)a)或b)的生物學(xué)活性片段， 第二絲蛋白，其包含 d)如SEQID NO 3、19、35、51、67或83中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列； e)與SEQIDNO 3、19、35、51、67或83中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和 f)d)或e)的生物學(xué)活性片段， 第三絲蛋白，其包含 g)如SEQID NO 5、21、37、53、69或85中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列； h)與SEQIDNO 5、21、37、53、69或85中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和 i)g)或h)的生物學(xué)活性片段，和/或 第四絲蛋白，其包含 j)如SEQ ID NO 7、23、39、55、71或87中任何一個(gè)所提供的氨基酸序列； k)與SEQ ID NO 7、23、39、55、71或87中任何一個(gè)或多個(gè)至少30%相同的氨基酸序列；和 I) j)或k)的生物學(xué)活性片段。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一絲蛋白、第二絲蛋白、第三絲蛋白和/或第四絲蛋白由相同的細(xì)胞生產(chǎn)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一絲蛋白、第二絲蛋白、第三絲蛋白和/或第四絲蛋白由不同的細(xì)胞生產(chǎn)。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟ii)包含大約等摩爾量的所述第一絲蛋白、所述第二絲蛋白、所述第三絲蛋白和所述第四絲蛋白。
24.根據(jù)權(quán)利要求I至23任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面活性劑是陰離子表面活性劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述陰離子表面活性劑是十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂基硫酸銨或其他烷基硫酸鹽、I-辛基磺酸鈉一水合物、月桂?；“彼徕c、月桂基乙醚硫酸鈉(SLES)、牛去氧膽酸鈉水合物、烷基苯磺酸鹽；或其兩種或多種的組合。
26.根據(jù)權(quán)利要求I至23任一項(xiàng)所述的方法，其中所述離子液體包含 i)選自氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸鹽、乙酸鹽、C1-C4-烷基硫酸鹽、甲基磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、C1-C4- 二烷基磷酸鹽、硫酸氫鹽和四氯鋁酸鹽的陰離子，和 ii)選自1，3-CrC4-二烷基咪唑鎗、3-氯吡啶鎗、4- 二甲氨基吡啶鎗、2-乙基-4-氨基吡啶鎗、2-甲基吡啶鎗、2-乙基吡啶鎗、2-乙基-6-甲基吡啶鎗、喹啉鎗、異喹啉鎗、吡啶鎗、I-C1-C4-烷基咪唑鎗、I-甲基咪唑鎗、I, 2- 二甲基咪唑鎗、I-正丁基咪唑鎗、1，4，5-三甲基咪唑鎗、1，4-二甲基咪唑鎗、咪唑鎗、2-甲基咪唑鎗、I-丁基-2-甲基咪唑鎗、4甲基咪唑鎗、1-(2’_氨基乙基)咪唑鎗、I-乙烯基咪唑鎗、2-乙基咪唑鎗和苯并三唑鎗的陽(yáng)離子。
27.一種用于生產(chǎn)絲紡絲液的方法，所述方法包含 i )從細(xì)胞培養(yǎng)物中，或從無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中獲得上清液，生產(chǎn)一種或多種絲蛋白， ii)通過(guò)采用表面活性劑或離子液體接觸它們使所述絲蛋白溶解，和 iii)濃縮所述絲蛋白來(lái)生產(chǎn)所述絲紡絲液， 其中所述一種或多種絲蛋白能夠形成包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中步驟i)進(jìn)一步包含增加所述上清液中絲蛋白的濃度。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中絲蛋白的濃度通過(guò)采用沉淀所述絲蛋白的試劑接觸所述上清液被增加。
30.一種用于生產(chǎn)絲纖維的方法，所述方法包含擠壓和/或拉伸根據(jù)權(quán)利要求I至29任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的絲紡絲液。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中擠壓包含使所述絲紡絲液通過(guò)大約5μ m至大約500 μ m的毛細(xì)管。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或權(quán)利要求31所述的方法，其中所述絲紡絲液被擠壓至包含醇類(lèi)的溶液中。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述醇類(lèi)是甲醇并且所述溶液中甲醇的濃度為大約40%至大約80%v/v。
34.一種用于生產(chǎn)絲薄膜的方法，所述方法包含澆鑄根據(jù)權(quán)利要求I至29任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的絲紡絲液。
35.根據(jù)權(quán)利要求I至29任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的絲紡絲液。
36.根據(jù)權(quán)利要求30至33任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的絲纖維。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法生產(chǎn)的絲薄膜。
38.包含根據(jù)權(quán)利要求36所述的絲纖維和/或根據(jù)權(quán)利要求37所述的絲薄膜的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)包含具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的絲蛋白如蜜蜂絲蛋白的絲紡絲液的方法。所述絲蛋白從生產(chǎn)它們的細(xì)胞中獲得，通過(guò)采用表面活性劑或離子液體接觸它們使所述蛋白溶解并且濃縮所述蛋白來(lái)生產(chǎn)絲紡絲液。所述蛋白質(zhì)能夠用于多種用途如個(gè)人護(hù)理用品、塑料、紡織物和生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/30GK102812036SQ201080042791
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者T·D·薩瑟林, V·S·阿里托, A·西斯卡塔, S·韋斯曼, M·G·胡森, J·S·丘奇 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)工業(yè)研究組織