專利名稱：用于治療氧化應(yīng)激相關(guān)障礙的肽類的制作方法
用于治療氧化應(yīng)激相關(guān)障礙的肽類
技術(shù)領(lǐng)域和背景技術(shù)
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于治療氧化應(yīng)激相關(guān)障礙的肽試劑。
自由基是極具反應(yīng)性的化學(xué)物質(zhì)，它們引起生物系統(tǒng)的顯著破壞。自由基與生物分子的不加區(qū)別的反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和細(xì)胞組分(例如線粒體)的破壞，由此通過使細(xì)胞失去它們的結(jié)構(gòu)和/或功能來影響這些生理過程。
在生物系統(tǒng)中，自由基總體上稱為活性氧(R0Q。ROS是從內(nèi)源性來源通過含氧物種的代謝，以及來自外源性來源例如毒素和大氣污染物。
ROS對生物分子的攻擊被稱為“氧化應(yīng)激”。氧化應(yīng)激已經(jīng)暗示是多種退行性疾病中的誘發(fā)因素。
帕金森氏病(PD)是由遺傳和環(huán)境因素引起的一種多因素疾病。雖然患有PD的大多數(shù)患者具有散發(fā)性疾病，近年來已經(jīng)鑒別出數(shù)個(gè)遺傳原因。引起PD的遺傳形式的日漸增加數(shù)量的基因提供了對該疾病的根本性機(jī)理進(jìn)行全新認(rèn)知的可能性。這些基因包括α-突觸核蛋白、parkin、PINKl、dardarin (LRRK2)、以及 DJ-I。
目前的PD發(fā)病機(jī)理的觀念集中在ROS的形成以及導(dǎo)致對黑質(zhì)致密部造成氧化損害的氧化應(yīng)激的啟動(dòng)。廣泛的事后剖析研究已經(jīng)提供了支持氧化應(yīng)激涉及PD發(fā)病機(jī)理的證據(jù)；具體地說，這些包括腦中鐵含量的改變、線粒體功能的損害、抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的改變 (最值得注意的是超氧化物歧化酶[SOD]和還原型谷胱甘肽[GSH])，以及對脂質(zhì)、蛋白、和 DNA氧化性損害的證據(jù)。鐵可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，并且已經(jīng)顯示黑質(zhì)內(nèi)注射誘導(dǎo)了進(jìn)行性帕金森綜合征的模型。
多發(fā)性硬化癥(MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的炎性、脫髓鞘疾病，其特征在于神經(jīng)機(jī)能障礙的多種征狀。MS及其動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)，被認(rèn)為是起因于自身免疫介導(dǎo)的活化了的免疫系統(tǒng)，例如T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。在病理學(xué)上，MS被表征為淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞靜脈周浸潤進(jìn)入CNS薄壁組織， 導(dǎo)致了稱為斑塊的脫髓鞘性損傷。這些斑塊(它們是MS的標(biāo)志)與少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡、軸突損傷以及神經(jīng)元缺失相關(guān)聯(lián)?？梢詫S視為一種炎性神經(jīng)退行性疾病的觀點(diǎn)得到了證明區(qū)域中神經(jīng)元和軸突損傷遠(yuǎn)離極性斑塊的研究，以及證明正常出現(xiàn)的白質(zhì)和灰質(zhì)改變的成像研究的支持。
MS的病因?qū)W還未被完全闡明，已經(jīng)將它歸因于遺傳和環(huán)境原因兩者。累積的數(shù)據(jù)顯示在MS的發(fā)病機(jī)理中氧化應(yīng)激起主要作用。主要由活化了的小膠質(zhì)細(xì)胞過量產(chǎn)生的導(dǎo)致氧化應(yīng)激的活性氧(ROS)已經(jīng)隱含作為MS和EAE中脫髓鞘和軸突損傷的介質(zhì)。
神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸酯是MS中氧化應(yīng)激來源之一，主要是通過活化它的親離子受體。 少突膠質(zhì)細(xì)胞，CNS的髓鞘生產(chǎn)細(xì)胞，對于谷氨酸酯興奮性毒性也是高度脆弱的(主要是通過AMPA/紅藻氨酸鹽受體)。ROS引起對主要細(xì)胞部件例如脂類、蛋白類以及核酸類的損傷， 導(dǎo)致了細(xì)胞死亡。導(dǎo)致對ROS作用脆弱性增加的MS病人的CNS中削弱的細(xì)胞抗氧化劑防御系統(tǒng)可以增加CNS損害。
肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，也稱為葛雷克氏癥，是一種進(jìn)行性致命的神經(jīng)疾病，它影響多達(dá)30，000名美國人，其中每年美國新增5，000個(gè)病例。該障礙屬于稱為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的一類障礙。當(dāng)大腦和脊髓中控制隨意運(yùn)動(dòng)的特定的神經(jīng)細(xì)胞逐漸退化時(shí)，就會(huì)發(fā)生 ALS。家族性肌萎縮性側(cè)索硬化(FALQ是與更常見的散發(fā)性變異體的區(qū)別僅在于它的家族性背景的ALS的一種形式。
有實(shí)質(zhì)性證據(jù)來支持氧化應(yīng)激造成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡的假說。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是抗氧化酶的突變，超氧化物歧化酶I(SODl)，在顯著少量的病例中引起疾病。
DJ-I是一種小的189個(gè)氨基酸的蛋白，它在不同的種類中是普遍地表達(dá)的并且是高度保守的。累積的數(shù)據(jù)顯示它涉及多種細(xì)胞過程，尤其是在氧化應(yīng)激中。已知DJ-I具有數(shù)種亞型，其中等電點(diǎn)在5. 5至7之間，在正常情況下主要是堿性亞型。當(dāng)ROS暴露時(shí)， 存在DJ-I的更多酸性亞型的累積(通過半胱氨酸殘基的氧化來介導(dǎo))[Bandopadhyay R， et al.，Brain 127 :420-430,2004 ；Canet-AviIes et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 101 9103-9108，2004]。
DJ-I分布廣泛并且在大腦中高度表達(dá)，并且不限于一個(gè)單功能系統(tǒng)或解剖學(xué)位置。DJ-I表達(dá)于不同神經(jīng)遞質(zhì)表型的神經(jīng)元中以及所有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型，例如星形細(xì)胞、 小膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞中。近來，多種DJ-I突變被發(fā)現(xiàn)并且與家族性帕金森氏病相關(guān)聯(lián)(PD) [Bonifati et al. ,2003, Science 299 :256-9,2003] 來自散發(fā)性 PD 大腦對比對照物的腦樣品死后研究發(fā)現(xiàn)在PD大腦中DJ-I的酸性亞型更豐富[Bandopadhyay R， et al. , Brain 127 =420-430, 2004] 0在其他神經(jīng)退行性疾病中檢測出DJ-I免疫反應(yīng)性， 包括多系統(tǒng)萎縮、阿爾茨海默病、進(jìn)行性核上麻痹、具有與染色體17相關(guān)帕金森綜合征的額顳癡呆、以及皮克氏病[Bandopadhyay R, et al. , Brain 127 :420-430,2004 ；Neumann N.et al. ,Acta Neuropathol(Berl) 107 :489-496,2004 ；Rizzu P.et al. ,Ann Neurol 55 113-118,2004]。
W02007/119237對DJ-I水平的分析以及用于診斷氧化應(yīng)激相關(guān)障礙的活性進(jìn)行了討論。
美國專利申請?zhí)?0060153807和美國專利申請?zhí)?0060171935討論了例如DJ-I 相關(guān)試劑用于治療神經(jīng)退行性疾病例如帕金森病的載體介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)。
W02008/111063討論了能夠上調(diào)DJ-I-依賴性VMAT2轉(zhuǎn)錄用于治療神經(jīng)退行性疾病的肽試劑。發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了一種包括如SEQ ID NO :3中列出的序列的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，其中在氧化應(yīng)激條件下該分離肽使細(xì)胞活力增加。
根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了一種包括包含來自如SEQ ID NO 1 中列出氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，或其肽模擬物的藥物組合物，以及藥學(xué)上可接受的載體，其中在氧化應(yīng)激條件下該分離肽使細(xì)胞活力增加。
根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了一種包括包含來自如SEQ ID NO 2 中列出氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，或其肽模擬物的藥物組合物，其中在氧化應(yīng)激條件下該分離肽使細(xì)胞活力增加。
根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了一種治療對其有需要的受試者體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)障礙的方法，該方法包括將向受試者給予治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物，由此治療該氧化應(yīng)激相關(guān)障礙。
根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了一種包括來自如SEQ ID NO=I中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，或其肽模擬物，以及藥學(xué)上可接受的載體，其中在氧化應(yīng)激條件下該分離肽使細(xì)胞活力增加。
根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了一種包括來自如SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，或其肽模擬物，其中在氧化應(yīng)激條件下該分離肽使細(xì)胞活力增加。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQ ID NO 3中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQ ID NO 14中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該分離肽是如SEQ ID NO 24中列出的。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該分離肽包括來自如SEQ ID NO 1中列出的氨基酸序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該分離肽包括來自如SEQ ID NO 2中列出的氨基酸序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該分離肽包括來自如SEQ ID NO 1中列出的氨基酸序列的不多于15個(gè)連續(xù)氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該分離肽包括包含來自如SEQ ID NO 2中列出的氨基酸序列的不多于15個(gè)連續(xù)氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽不長于20個(gè)氨基菌！。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQIDNO38中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQIDNO39中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQIDNO10中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQIDNO11中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQIDNO:1或3中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQIDNO40中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQIDNO13中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQIDNO41中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQIDNO42中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，該分離肽包括如SEQIDNO2中列出的序列。
根據(jù)本發(fā)明的--些實(shí)施方式，這些氨基酸中至:少一個(gè)是天然存在的氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，這些氨基酸中至少一個(gè)是合成的氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該分離肽附連到細(xì)胞滲透劑上。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該附連是共價(jià)附連。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該細(xì)胞滲透劑是一種肽試劑。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該肽細(xì)胞滲透劑包括選自由SEQ ID NO :21-23組成的組中的一種氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該分離肽是如SEQ ID NO :24-36中列出的。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該細(xì)胞包括神經(jīng)元細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，這些ROS條件選自由6-羥基多巴胺毒性、過氧化氫毒性、UV輻射以及多巴胺毒性組成的組。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該氧化應(yīng)激相關(guān)障礙是神經(jīng)退行性疾病。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該神經(jīng)退行性疾病是選自由帕金森病、多發(fā)性硬化癥、ALS、多系統(tǒng)萎縮、阿爾茨海默病、中風(fēng)、進(jìn)行性核上麻痹、具有與染色體17相關(guān)帕金森綜合征的額顳癡呆以及皮克氏病組成的組。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，該分離的肽用于治療氧化應(yīng)激相關(guān)障礙。
除非另外定義，在本文中使用的所有技術(shù)的和/或科學(xué)的術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。雖然與在本文中所述的那些類似或等效的方法和材料可以用于實(shí)踐或測試本發(fā)明的實(shí)施方式，示例性的方法和/或材料說明如下。 在沖突的情形下，本專利申請(包括定義)將具有支配力。此外，這些材料、方法、以及實(shí)例僅是說明性的而并非意在進(jìn)行必要地限制。


在此參考附圖僅通過舉例對本發(fā)明的一些實(shí)施方式進(jìn)行說明。現(xiàn)在特別詳細(xì)地參考這些附圖，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是所顯示的這些細(xì)節(jié)是通過舉例方式并且用于說明性地討論本發(fā)明實(shí)施方式的目的。在此方面，用圖進(jìn)行的說明使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員清楚本發(fā)明的實(shí)施方式可以如何實(shí)踐。
在這些附圖中
圖IA-圖IF是柱狀圖，它們示出了針對氧化損傷和毒性損傷DJ-I相關(guān)肽TAT 2a(SEQ ID NO :24)在體外是保護(hù)性的。在暴露于氧化應(yīng)激之后通過暴露于H202進(jìn)行誘導(dǎo)， 與僅用鹽水相比較，發(fā)現(xiàn)使用DJ-I相關(guān)肽治療增加了細(xì)胞活力(A)，減少了線粒體損害(B) 并且增加了代謝活性(C)。通過定量[3H]胸腺嘧啶核苷結(jié)合對細(xì)胞增殖進(jìn)行測量。在暴露于這些肽(D)下，不存在增加的細(xì)胞增殖。對抗6-羥基多巴胺和多巴胺毒性的保護(hù)作用對應(yīng)地示于圖IE和F中。所提呈的實(shí)驗(yàn)是在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞上完成的，并且重復(fù)至少3次。與用運(yùn)載體治療并且暴露于相同毒性損傷的對照細(xì)胞相比較，*p < 0. 05。
圖2A-圖2B是柱狀圖，它們示出了針對6-羥基多巴胺毒性DJ-I相關(guān)肽在體外是保護(hù)性的。在暴露于6-羥基多巴胺之前，與鹽水相比較，當(dāng)用DJ-I相關(guān)肽預(yù)處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y時(shí)發(fā)現(xiàn)增加了代謝活性，DJ-I相關(guān)肽#2的衍生物對抗6-羥基多巴胺毒性的保護(hù)作用示于圖2A中并且DJ-I相關(guān)肽#5的衍生物對抗6-羥基多巴胺毒性的保護(hù)作用示于圖2B中。突變的肽不能保護(hù)對抗6-羥基多巴胺毒性(如圖2A-圖2B中所示)。 所提呈的實(shí)驗(yàn)是在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞上完成的，并且重復(fù)至少3次。與暴露于相同毒性損傷的對照細(xì)胞相比較，*P < 0. 05。
圖3示出了針對6-羥基多巴胺毒性DJ-I相關(guān)肽在體外是保護(hù)性的。在暴露于6-羥基多巴胺之前，與鹽水相比較，當(dāng)用DJ-I相關(guān)肽II (SEQ ID NO :8)預(yù)處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y時(shí)發(fā)現(xiàn)增加了活力，與暴露于相同毒性損傷的對照細(xì)胞相比較，*p < 0. 05。
圖4A是柱狀圖，示出了針對血清剝奪(或不含血清，serum deprivation) DJ-I相關(guān)肽是保護(hù)性的。在血清剝奪期間與鹽水相比較，當(dāng)用DJ-I相關(guān)肽(SEQ ID NO :10),11 (SEQID NO 8)以及短ID NO 9)預(yù)處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y時(shí)發(fā)現(xiàn)增加了活力，*P < 0. 05。
圖4B是柱狀圖，示出了針對氧化毒性和毒素誘導(dǎo)的毒性對照DJ-I相關(guān)肽不是保護(hù)性的。在使用或不使用對照肽X和Y(不期望誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)的序列)進(jìn)行預(yù)處理下將細(xì)胞暴露于不斷增加劑量的6-羥基多巴胺(0-25UM)或暴露于過氧化氫(H2O2，0-50UM)。所提呈的實(shí)驗(yàn)是在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞上完成的，并且重復(fù)3次。與用運(yùn)載體治療并且暴露于相同毒性劑量的對照細(xì)胞相比較，未觀察到顯著差異。
圖5A-B是柱狀圖，示出了在原代培養(yǎng)中通過TAT 2a (SEQ ID NO :24)肽對抗H2A 和6-羥基多巴胺毒性的保護(hù)作用。在從出生后野生型C57/bl小鼠的皮質(zhì)中得到的原代混合的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物中證明了對抗逐漸增加濃度的過氧化氫和6-羥基多巴胺的類似的保護(hù)作用。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。與用運(yùn)載體治療并且暴露于相同毒性損傷的對照細(xì)胞相比較，*P <0.05。
圖6是柱狀圖，示出了在神經(jīng)元分化的鼠類神經(jīng)干細(xì)胞中針對氧化損傷DJ-I相關(guān)肽I (SEQ ID NO 23)和II (SEQ ID NO 8)是保護(hù)性的。在暴露于過氧化氫(H2O2)之前，與鹽水相比較，當(dāng)用DJ-I相關(guān)肽I或II預(yù)處理這些細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)增加了活力，與暴露于相同毒性損傷的對照細(xì)胞相比較，*P < 0. 05。
圖7A-圖7B是照片，示出了在幼稚型成神經(jīng)瘤細(xì)胞(圖7A)和用A53T突變體 α-突觸核蛋白穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中(圖7Β) α-突觸核蛋白的免疫組織化學(xué)染色。Aa-突觸核蛋白被Alexa-568連接的二抗染成紅色。細(xì)胞核被DAPI復(fù)染色(藍(lán)色)。該實(shí)驗(yàn)一式三份重復(fù)3次。
圖8是示出了 α-突觸核蛋白的圖形定量的柱狀圖，以及在假轉(zhuǎn)染的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞以及用野生型(WT) α-突觸核蛋白或Α53Τ突變型α -突觸核蛋白穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中代表針對α-突觸核蛋白蛋白質(zhì)印跡的照片。該實(shí)驗(yàn)一式三份重復(fù)3次。
圖9是柱狀圖，示出了在過表達(dá)突變型α-突觸核蛋白的細(xì)胞中肽#2衍生物對抗6-羥基多巴胺毒性的保護(hù)作用。當(dāng)用DJ-I相關(guān)肽#2的衍生物進(jìn)行處理時(shí)，在暴露于 6-羥基多巴胺過表達(dá)Α53Τ α-突觸核蛋白的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中證明了顯著增加的代謝活性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。與用運(yùn)載體治療并且暴露于相同毒性損傷的對照細(xì)胞相比較， *ρ < 0. 05。
圖10是柱狀圖，示出了在過表達(dá)突變型α-突觸核蛋白的細(xì)胞中通過肽TAT 2a (SEQ ID NO :24)對抗過氧化氫毒性的保護(hù)作用。當(dāng)用DJ-I相關(guān)肽TAT 2a (SEQ ID NO 24)進(jìn)行處理時(shí)，在暴露于過氧化氫過表達(dá)A53T α -突觸核蛋白的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中證明了顯著增加的活力。與用運(yùn)載體治療并且暴露于相同毒性損傷的對照細(xì)胞相比較，*Ρ < 0. 05。
圖11是柱狀圖，示出了針對多巴胺毒性DJ-I相關(guān)肽在體內(nèi)是保護(hù)性的。在使用或不使用DJ-I相關(guān)肽#2的衍生物進(jìn)行預(yù)處理下，將細(xì)胞暴露于逐漸增加劑量的多巴胺 (0-50uM)。所提呈的實(shí)驗(yàn)是在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞上完成的，并且重復(fù)3次。與用運(yùn)載體治療并且暴露于相同多巴胺劑量的對照細(xì)胞相比較，*Ρ < 0. 05。
圖12Α-圖12Β是柱狀圖，示出了在NSC-34細(xì)胞中針對過氧化氫和SIN-I毒性DJ-I 相關(guān)肽是保護(hù)性的。在暴露于過氧化氫(圖12Α)或SIN-I (圖12Β)毒性之前，與鹽水相比較，當(dāng)用 DJ-I 相關(guān)肽 TAT 2a (SEQ ID NO :24)或 TAT 2b (SEQ ID NO :25)預(yù)處理 NSC-IM 細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)增加了活力，與暴露于相同毒性損傷的對照細(xì)胞相比較，*P < 0. 05，**p < 0. 01。
圖13是柱狀圖，示出了在ALS的細(xì)胞模型中DJ-I相關(guān)肽#2的衍生物是保護(hù)性的。 在暴露于SIN-I毒性之前，與鹽水相比較，當(dāng)用DJ-I相關(guān)肽#2的衍生物預(yù)處理NSC-34細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)增加了代謝活性，突變的肽#2不能保護(hù)對抗SIN-I毒性(如所示)。所提呈的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。與暴露于相同毒性損傷的對照細(xì)胞相比較，*p < 0. 05。
圖14是柱狀圖，示出了在對抗紫外線輻射的細(xì)胞模型中DJ-I相關(guān)肽是保護(hù)性的。在暴露于紫外線輻射之前，與鹽水相比較，當(dāng)用DJ-I相關(guān)肽II (SEQ ID N0J)或TAT 2a (SEQ ID NO :24)預(yù)處理HaCaT細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)增加了代謝活性。所提呈的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。與對照物相比較，*P < 0. 05。
圖15A-圖15B是柱狀圖，示出了紋狀體內(nèi)的TAT加肽注射保護(hù)對抗體內(nèi)6_羥基多巴胺半帕金森病的小鼠模型。6-羥基多巴胺損害之前一小時(shí)，將溶于鹽水的2μ1 100 μ M肽TAT 2a (SEQ ID NO :24)或單獨(dú)的鹽水立體定位地注入右側(cè)紋狀體中。與對照相比較，在該肽治療的小鼠體內(nèi)在損害之后2周和4周發(fā)現(xiàn)了顯著減少的苯丙胺誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)， Y < 0.01(圖15A)。此外，響應(yīng)于苯丙胺注射，較小部分的受損害小鼠旋轉(zhuǎn)(圖15B)。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。
圖16A-圖16B是柱狀圖，示出了靜脈內(nèi)肽()TAT 2a(SEQ ID NO :24)注射保護(hù)對抗體內(nèi)6羥基多巴胺半帕金森病的小鼠模型。在6-羥基多巴胺損害之前4小時(shí)，將50 μ g 肽TAT 2a (SEQ ID NO :24)或單獨(dú)的鹽水靜脈內(nèi)注入。與對照相比較，在IV肽治療的小鼠體內(nèi)證明了顯著地減少的苯丙胺誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)， < 0.01(圖16A)。響應(yīng)于苯丙胺注射，較小部分的受損害小鼠旋轉(zhuǎn)(圖16B)。
圖17是柱狀圖，示出了皮下注射肽(SEQ ID NO 25)保護(hù)對抗MPTP帕金森病的模型。
具體實(shí)施方式
許多神經(jīng)退行性障礙被認(rèn)為與氧化應(yīng)激相關(guān)聯(lián)，例如帕金森病和中風(fēng)。逐漸累積的數(shù)據(jù)顯示DJ-1，一種小的189個(gè)氨基酸蛋白，涉及多種細(xì)胞過程，尤其是在氧化應(yīng)激中， 并且提出了它用于治療神經(jīng)退行性疾病的用途。
在其一些實(shí)施方式中，本文披露內(nèi)容涉及用于治療氧化應(yīng)激相關(guān)障礙的DJ-I相關(guān)肽。與本披露相聯(lián)系已經(jīng)鑒別出DJ-I蛋白上的兩個(gè)最小核心序列，它們包括治療活性。 已經(jīng)制備出多種肽，它們包括一個(gè)或多個(gè)這樣的核心序列，并且已經(jīng)證明了神經(jīng)保護(hù)特性。
具體地說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是在體外細(xì)胞系統(tǒng)中包括這兩個(gè)核心序列中至少一項(xiàng)的 DJ-I相關(guān)肽能夠保護(hù)對抗毒性損傷，包括6-羥基多巴胺、多巴胺以及H2O2 (圖IA-圖1F、圖 2A-圖2B、圖3、圖11、圖12A)，以及血清剝奪(圖4A)，同時(shí)不包括該鑒別的核心序列之一的其他DJ-I相關(guān)肽不包括這類神經(jīng)保護(hù)特性(圖4B)。這些實(shí)驗(yàn)在原代培養(yǎng)物(圖5A-圖 5B)以及具有相同結(jié)果的分化神經(jīng)干細(xì)胞(圖6)中重復(fù)。
本文披露內(nèi)容的另一個(gè)方面涉及在成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中過表達(dá)突變型 A53T α-突觸核蛋白的帕金森障礙的一種體外細(xì)胞模型。本披露實(shí)施方式的DJ-I相關(guān)肽被證明在體外細(xì)胞模型中針對6-羥基多巴胺毒性(圖9)和H2O2毒性(圖10)具有保護(hù)性。
本文披露內(nèi)容的又另一個(gè)方面涉及用于ALS和紫外線照射的一種細(xì)胞模型，其中本披露實(shí)施方式的DJ-I相關(guān)肽被證明在這些測定中也具有保護(hù)性(圖13和圖14)。
最后，在帕金森病的體內(nèi)模型中對本披露實(shí)施方式的DJ-I相關(guān)肽進(jìn)行測試。在局部(圖15A-圖15B)和全身(圖16A-圖16B)給藥兩者之后某些DJ-I相關(guān)肽顯示治療活性。
總之，根據(jù)本文披露內(nèi)容，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的是從DJ-I衍生的肽(DJ-1相關(guān)肽)可以用于治療氧化應(yīng)激相關(guān)障礙。如在此使用的短語“氧化應(yīng)激條件”是指這些使活性氧(ROS)的水平升高超過正常水平的條件。如提及的，這可能起因于缺乏抗氧化劑或起因于過多的自由基。示例性的ROS條件包括但不限于6-羥基多巴胺毒性、過氧化氫毒性、紫外線輻射以及多巴胺毒性。
在某些實(shí)施方式中，本文披露內(nèi)容的某些方面，如在此更全面詳細(xì)說明的，涉及長度不長于20個(gè)氨基酸的短DJ-I相關(guān)肽。更具體地，根據(jù)本披露的一個(gè)方面，提供了包括來自如SEQ ID NO 1中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸不長于25個(gè)氨基酸的一種分離的DJ-I相關(guān)肽，或其肽模擬物，其中在氧化應(yīng)激條件下該分離肽增加了細(xì)胞活力。
KGAEEMETVIPVDVMRRAGI- (SEQ ID NO 1 ；在此也稱為 # 肽 2)
根據(jù)本文披露內(nèi)容這個(gè)方面的實(shí)施方式，該肽包括來自如SEQ ID NO=I中列出的氨基酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)連續(xù)氨基酸。
KGAEEMETVIPVDVMRRAGI-(SEQ ID NO :1)
根據(jù)本文披露內(nèi)容這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方式，該肽包括SEQ ID NO=I的不多于10個(gè)連續(xù)氨基酸。
根據(jù)本文披露內(nèi)容這個(gè)方面的其他實(shí)施方式，該肽包括SEQ ID NO=I的不多于15個(gè)連續(xù)氨基酸。
包含在本文披露內(nèi)容這個(gè)方面的肽中的示例性序列包括SEQ ID NO :1-12,SEQ ID NO 38 或 SEQ ID NO :39。
根據(jù)本文披露內(nèi)容的另一個(gè)方面，提供了一種包括來自SEQ ID NO 2中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，或其肽模擬物，其中在氧化應(yīng)激條件下該分離肽使細(xì)胞活力增加。
KEGPYDVVVLPGGNLGAQNLS- (SEQ ID NO 2 ；在此也稱為肽 #5)。
根據(jù)本文披露內(nèi)容這個(gè)方面的實(shí)施方式，該肽包括來自如SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)連續(xù)氨基酸。
根據(jù)本文披露內(nèi)容這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方式，該肽包括SEQ ID NO 2的不多于10個(gè)連續(xù)氨基酸。
根據(jù)本文披露內(nèi)容這個(gè)方面的其他實(shí)施方式，該肽包括SEQ ID NO 2的不多于15個(gè)連續(xù)氨基酸。
包含在本文披露內(nèi)容這個(gè)方面的肽中的示例性序列包括SEQ ID NO :2,13-20, 40-42。
如在此使用的術(shù)語“肽”是指一種天然的或合成的氨基酸的聚合物，包括天然肽 (降解產(chǎn)物，合成方式合成的多肽或重組體多肽)和假肽(典型地，合成方式合成的肽)，以及作為肽類似物的類肽類和半類肽類，它們可以具有例如使這些肽在體內(nèi)時(shí)甚至更穩(wěn)定或更能夠穿透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的修飾。
這類修飾包括但不限于N端修飾、C端修飾、多肽鍵修飾(包括但不限于CH2-NH、 CH2-S、CH2-S = 0、0 = C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S = C-NH、CH = CH 或 CF = CH)、主鏈修飾、 以及殘基修飾。用于制備模擬肽化合物的方法是本領(lǐng)域熟知的并且例如在Quantitative Drug Design，C. A. Ramsden Gd.，第 17· 2 章，F(xiàn). Choplin Pergamon Press (1992)中進(jìn)行詳細(xì)說明，通過引用將其結(jié)合于本文就像在此完全列出一樣。下面提供這個(gè)方面進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。
多肽內(nèi)的多肽鍵(-C0-NH-)可以被下面各項(xiàng)取代例如N-甲基化的鍵 (-N (OK)-CO-)、酯鍵(-C (R) H-C-O-O-C (R)-N-)、酮亞甲基鍵(-C0-CH2-)、α -氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基，例如甲基，卡巴鍵(-CH2-NH-)、羥基亞乙基鍵 (-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺鍵(-CS-NH-)、烯屬雙鍵(-CH = CH-)、反酰胺鍵(-NH-C0-)、多肽衍生物(_N(R)-CH2-C0-)，其中R是天然存在于碳原子上的“正常的”側(cè)鏈。
這些修飾可以發(fā)生在沿著該多肽鏈這些鍵的任何一個(gè)上，并且甚至同時(shí)在數(shù)個(gè)個(gè))上。
天然芳香族氨基酸，Trp, Tyr以及Wie，可以取代合成的非天然酸例如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的環(huán)甲基化的衍生物、Phe的鹵化的衍生物或鄰甲基-Tyr。
除了上述之外，本發(fā)明的多肽還可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾的氨基酸或一個(gè)或多個(gè)非氨基酸單體(例如，脂肪酸、復(fù)雜的碳水化合物等)。
如在本文中使用的在說明書中以及在下面的權(quán)利要求部分中術(shù)語“氨基酸”或 “氨基酸類”被理解為包括20個(gè)天然存在的氨基酸；通常體內(nèi)翻譯后修飾的那些氨基酸， 包括例如羥基脯氨酸、磷酸絲氨酸以及磷酸蘇氨酸；以及其他非常見氨基酸，包括但不限于 2-氨基己二酸、羥基賴氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正亮氨酸以及鳥氨酸。此外，術(shù)語“氨基酸”包括D-和L-氨基酸兩者(立體異構(gòu)體)。
下面的表1和表2列出天然存在的氨基酸(表1)和非常規(guī)的或修飾的氨基酸(表 2)，它們可以與本發(fā)明一起使用。
表 權(quán)利要求
1.一種具有包括如SEQ ID NO :3中列出序列的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，其中在氧化應(yīng)激條件下所述分離肽使細(xì)胞活力增加。
2.一種治療對其有需要的受試者體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)障礙的方法，所述方法包括向所述受試者給予治療有效量的包括來自如SEQ ID NO :1中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，或其肽模擬物，以及藥學(xué)上可接受的載體，其中，在氧化應(yīng)激條件下，所述分離肽使細(xì)胞活力增加，由此治療所述氧化應(yīng)激相關(guān)障礙。
3.一種治療對其有需要的受試者體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)障礙的方法，所述方法包括向所述受試者給予治療有效量的包括來自如SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，或其肽模擬物，以及藥學(xué)上可接受的載體，其中，在氧化應(yīng)激條件下，所述分離肽使細(xì)胞活力增加，由此治療所述氧化應(yīng)激相關(guān)障礙。
4.一種包括來自如SEQ ID NO :1中列出的氨基酸序列至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于 25個(gè)氨基酸的分離肽，或其肽模擬物，其中，在氧化應(yīng)激條件下該分離肽增加了細(xì)胞活力用于治療氧化應(yīng)激相關(guān)障礙。
5.一種包括來自如SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，或其肽模擬物，其中，在氧化應(yīng)激條件下，所述分離肽使細(xì)胞活力增加以用于治療氧化應(yīng)激相關(guān)障礙。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的方法或分離肽，其中，所述氧化應(yīng)激相關(guān)障礙是神經(jīng)退行性疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法或分離肽，其中，所述神經(jīng)退行性疾病是選自由帕金森病、多發(fā)性硬化癥、ALS、多系統(tǒng)萎縮、阿爾茨海默病、中風(fēng)、進(jìn)行性核上麻痹、具有與染色體 17相關(guān)帕金森綜合征的額顳癡呆以及皮克氏病組成的組。
8.一種藥物組合物，包括包含來自如SEQ ID NO :1中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽、或其肽模擬物，以及藥學(xué)上可接受的載體，其中， 在氧化應(yīng)激條件下，所述分離的肽使細(xì)胞活力增加。
9.一種藥物組合物，包括包含來自如SEQ ID NO 2中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽、或其肽模擬物，以及藥學(xué)上可接受的載體，其中， 在氧化應(yīng)激條件下，所述分離的肽使細(xì)胞活力增加。
10.根據(jù)權(quán)利要求2、4或8中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽包含如SEQ ID NO 3中列出的序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求3、5或9所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽包含如SEQ ID NO 14中列出的序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、10所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽是如SEQID NO 24中列出的。
13.根據(jù)權(quán)利要求2、4或8中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽包含來自如SEQ ID NO 1中列出的所述氨基酸序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求3、5或9所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽包含來自如 SEQ ID NO 2中列出的所述氨基酸序列的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求2、4或8中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽包含來自如SEQ ID NO :1中列出的所述氨基酸序列的不多于15個(gè)連續(xù)氨基酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求3、5或9所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽包含來自如 SEQ ID NO :2中列出的所述氨基酸序列的不多于15個(gè)連續(xù)氨基酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽不長于20個(gè)氨基酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求2、4或8中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽包含如SEQ ID NO 38中列出的序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求2、4或8中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中所述分離肽包含如SEQ ID NO 39中列出的序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求2、4或8中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中所述分離肽包含如SEQ ID NO 10中列出的序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求2、4或8中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中所述分離肽包含如SEQ ID NO 11中列出的序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求2、4或8中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中所述分離肽包含如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3中列出的序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求3、5或9所述的方法、肽或藥物組合物，其中所述分離肽包含如SEQ ID NO 40中列出的序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法、肽或藥物組合物，其中所述分離肽包括如SEQID NO 13中列出的序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求3、5或9所述的方法、肽或藥物組合物，其中所述分離肽包含如SEQ ID NO 41中列出的序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽包含如SEQID NO 42中列出的序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求3、5或9所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽包含如SEQ ID NO 2中列出的序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述氨基酸中的至少一個(gè)是天然存在的氨基酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述氨基酸中的至少一個(gè)是合成的氨基酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求1- 中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽附連至細(xì)胞滲透劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽是共價(jià)附連的。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述細(xì)胞滲透劑是一種肽試劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述肽細(xì)胞滲透劑包含選自 SEQ ID NOs :21-23組成的組中的一種氨基酸序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述分離肽是如SEQID NOs 24-36中列出的。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述細(xì)胞包含神經(jīng)元細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法、肽或藥物組合物，其中，所述ROS條件選自由6-羥基多巴胺毒性、過氧化氫毒性、UV輻射以及多巴胺毒性組成的組。
37.一種包含來自如SEQ ID NO :1中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離肽，或其肽模擬物，以及藥學(xué)上可接受的載體，其中，在氧化應(yīng)激條件下，所述分離肽使細(xì)胞活力增加。
38.一種包含來自如SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸的不長于25個(gè)氨基酸的分離的肽，或其肽模擬物，其中，在氧化應(yīng)激條件下，所述分離肽使細(xì)胞活力增加。
全文摘要
披露了分離的DJ-1相關(guān)肽以及包括它的藥物組合物用于治療氧化應(yīng)激相關(guān)障礙。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102498127SQ201080041696
公開日2012年6月13日 申請日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者丹尼爾·奧芬, 埃爾戴德·梅拉梅德, 尼里特·勒夫 申請人:雷蒙特亞特特拉維夫大學(xué)有限公司