專利名稱：作為補(bǔ)體激活的抑制劑的masp同種型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型ficolin-相關(guān)多肽，和衍生于這些ficolin-相關(guān)多肽的多肽，其用于治療與炎癥、凋亡、自體免疫性、凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病有關(guān)的病癥的治療，以及用作生物標(biāo)記。本發(fā)明還涉及識別所述新型ficolin-相關(guān)多肽和衍生于其的多肽的抗體、編碼所述多肽的核酸分子、用于生產(chǎn)所述多肽的載體和宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
補(bǔ)體系統(tǒng)(C)的激活通過三種不同的起始途徑完成旁路途徑(AP)，經(jīng)典途徑(CP)，或凝集素途徑(LCP)。AP激活發(fā)生在外源表面上，并且由C3的緩慢自發(fā)性水解和因子備解素、因子B和因子D形成功能性C3轉(zhuǎn)換酶C3bBb的活性引起。AP還作為另外兩種途徑的放大途徑(amplification pathway)(放大環(huán))起作用。最近，已經(jīng)表明，備用的轉(zhuǎn)換酶組裝還可以通過將備解素非共價連接到一些靶標(biāo)表面上而起始。另一方面，當(dāng)Clq結(jié)合與 抗原復(fù)合的免疫球蛋白時起始CP激活，Clq同與抗原復(fù)合的免疫球蛋白的結(jié)合引發(fā)Clq-締合的絲氨酸蛋白酶Clr和Cls的激活。Cls分裂并且激活C4和C2，從而形成CP C3轉(zhuǎn)換酶C4b2a。當(dāng)甘露糖-結(jié)合凝集素(MBL)或ficolins結(jié)合限制性模式的糖類(carbohydrate)或乙?；幕衔飼r，例如，在微生物體表面上，或當(dāng)暴露在瀕死宿主細(xì)胞上時，激活LCP。當(dāng)與配體結(jié)合時，締合的絲氨酸蛋白酶MASP-2激活并且分裂C4和C2，從而形成LCP C3轉(zhuǎn)換酶C4b2a。已經(jīng)提議MASP-I的功能涉及C2的MASP-2分裂的穩(wěn)定，并且還指導(dǎo)C3的低級分裂。然而，其它研究將MASP-I和MASP-2的功能和活性與涉及凝血酶原、纖維蛋白原和因子XIII的凝結(jié)系統(tǒng)交叉通訊(coagulation system cross-talk)相關(guān)。使用MASPI/3敲除小鼠，最近證明MASP-I事實(shí)上有助于補(bǔ)體活性。最近發(fā)現(xiàn)的MBL締合的絲氨酸蛋白酶MASP-3的準(zhǔn)確功能尚未得到闡明。已經(jīng)報道了一些研究，其表明MASP-3與有限范圍的MBL寡聚體締合，并且MASP-3和小的MBL-締合的蛋白(sMAP)參與MBL依賴性LCP補(bǔ)體激活的調(diào)節(jié)或抑制。MASP-I和-3通過不同的剪接來源于同一 MASP1/3基因(存在于染色體3q27_q28上)。它們包含相同的A鏈，不同的是15個C端殘基。A鏈包括由EGF(表皮生長因子)結(jié)構(gòu)域隔開的兩個CUB (Clr/Cls，Urchin-EGF,骨形態(tài)生成蛋白)結(jié)構(gòu)域，接著是兩個CCP結(jié)構(gòu)域(補(bǔ)體控制蛋白)。包括絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的B鏈不同于MASP-I和MASP-3。MASP-2和sMAP也來源于相同的基因(存在于染色體Ip36-p36. 2上)，其中sMAP是缺少絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和A鏈主要部分的截短形式。已經(jīng)表明MASP1/3基因是多態(tài)性的，但是其功能重要性仍然所知甚少。然而，存在一些證據(jù)表明MASP2/sMAP基因中的多態(tài)性與增加的感染風(fēng)險有關(guān)。MASPs的表達(dá)定位在肝臟的肝細(xì)胞，但是最近的研究記載人MASP-3 mRNA (唯一的MASP-mRNA)在寬泛范圍的組織中表達(dá)。發(fā)明目的本發(fā)明實(shí)施方案的目的是提供適于治療與炎癥、凋亡、自體免疫性、凝結(jié)、和/或血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病有關(guān)的病癥的多肽。本發(fā)明的多肽可以進(jìn)一步適于作為生物標(biāo)記，用于診斷和/或預(yù)測這些適應(yīng)證以及用于惡性病，如癌癥。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與凝集素補(bǔ)體途徑的識別分子相關(guān)的新型多肽以及諸如衍生于其的片段的多肽可以用于治療與炎癥、凋亡、自體免疫性、凝結(jié)、和/或血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病有關(guān)的特定醫(yī)學(xué)病癥的治療。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及分離的ficolin-相關(guān)多肽。在第二方面，本發(fā)明涉及包括氨基酸序列SEQ ID NO :4的多肽或其變體或免疫學(xué)片段。在第三方面，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體。在第四方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸分子。在另一個方面，本發(fā)明涉及包含與SEQ NO :2的序列至少70%相同的核苷酸序列的分尚的核酸分子。在另一個方面，本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸分子的載體。在另一個方面，本發(fā)明涉及包含含有編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸分子的載體的宿主細(xì)胞。在另一個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括在允許多核苷酸構(gòu)建體表達(dá)的條件下，在適合的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞，并且從培養(yǎng)基中回收得到的多肽。在另一個方面中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。在另一個方面中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多肽的藥物組合物。在另一個方面中，本發(fā)明涉及檢測生物樣品中的本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括a)獲得生物學(xué)樣品；b)使所述生物學(xué)樣品與本發(fā)明的抗體接觸；并且c)如果有的話，檢測所述抗體與多肽的復(fù)合物；作為所述樣品中存在所述多肽的指示。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽，其用作藥物。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽用于制備藥物的用途。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽，其用于治療與炎癥、凋亡和/或自體免疫性相關(guān)的任意適應(yīng)證。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽，其用于治療與凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病有關(guān)的任意適應(yīng)證。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽，其用于預(yù)防在鑒定的高?；颊咧邪l(fā)生血栓栓塞并發(fā)癥，所述鑒定的高?；颊呷缃?jīng)歷手術(shù)的那些或患有充血性心力衰竭(congestive heart failure)的那些。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽，其用于治療與心臟相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥。 在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽，其用于治療與ficolin-相關(guān)多肽缺乏有關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于治療與炎癥、凋亡和/或自體免疫性相關(guān)的任意適應(yīng)證的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的多肽。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于治療與凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病有關(guān)的任意適應(yīng)證的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的多肽。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防在鑒定的高?；颊咧邪l(fā)生血栓栓塞并發(fā)癥的方法，所述鑒定的高?；颊呷缃?jīng)歷手術(shù)的那些或患有充血性心力衰竭的那些，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的多肽。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于治療與心臟相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的多肽。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于治療與ficolin-相關(guān)多肽缺乏有關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的多肽。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及能夠在嚴(yán)格條件下與編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列雜交的核酸探針。在另一個方面中，本發(fā)明涉及檢測生物學(xué)樣品中存在編碼本發(fā)明的多肽的核酸的方法，所述方法包括a)獲得生物學(xué)樣品；b)使所述生物學(xué)樣品與本發(fā)明的核酸探針接觸；并且c)如果有的話，檢測所述核酸探針與編碼多肽的核酸的復(fù)合物；作為在所述樣品中存在所述編碼多肽的核酸的指示。在另一個方面中，本發(fā)明涉及診斷與ficolin-相關(guān)多肽異常表達(dá)有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括獲得來自患者的生物學(xué)樣品，并且測量所述生物學(xué)樣品中ficolin-相關(guān)多肽的表達(dá)，其中，與對照相比，ficolin-相關(guān)多肽增加或減少的表達(dá)表示患者患有與ficolin-相關(guān)多肽異常表達(dá)有關(guān)的病癥。在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種分離的組合物，其包括本發(fā)明的多肽以及選自Ficolin-l、2、3，甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D，和細(xì)胞內(nèi)膠原樣防御分子，諸如CLL-Il的一種或多種蛋白的組合。在另一個方面中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物，其是一種藥物組合物。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述的藥物組合物，其用作藥物。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的組合物用于制備藥物的用途。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的藥物組合物，其用于治療與炎癥、凋亡和/或自體免疫性相關(guān)的任意適應(yīng)證。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的藥物組合物，其用于治療本文定義的任意適應(yīng)證。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于治療本文定義的任意適應(yīng)證的方法，所述方法包括同時或先后施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的多肽和一種或多種選自Ficolin-l、2、3，和甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP_D，和細(xì)胞內(nèi)膠原樣防御分子，諸如CLL-Il的蛋白。在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽作為血液和組織中的生物標(biāo)記的用途，用于診斷和/或預(yù)測惡性疾病，諸如癌癥疾病，諸如腦瘤、肝腫瘤和生殖道腫瘤。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽作為血液和組織中的生物標(biāo)記的用途，用于診斷和/或預(yù)測本文定義的自體免疫、代謝和/或炎性病癥。附例圖I :MASP_1基因的可變轉(zhuǎn)錄。在肝臟cDNA中檢測到MASP-1基因的可變轉(zhuǎn)錄。使用位于外顯子6的通用正向引物和位于外顯子12 (MASPl)、外顯子11(MASP3)、和外顯子8a(FAP)的特異性反向引物擴(kuò)增MASP1，MASP3，和FAP轉(zhuǎn)錄物。MASPl產(chǎn)生500bp的片段，MASP3產(chǎn)生506bp的片段，F(xiàn)AP產(chǎn)生309bp的片段。圖2 :MASP1基因的可變剪接。MASPl通過剪截掉8a和外顯子11產(chǎn)生，二者均包含終止密碼子序列(用黑框標(biāo)記)。MASPl序列在外顯子17中包含終止密碼子。MASP3通過剪截掉外顯子8a而產(chǎn)生，如果沒有剪截掉外顯子8a，則產(chǎn)生FAP。FAP蛋白包含兩個CUB結(jié)構(gòu)域，EFG結(jié)構(gòu)域和第一 CCPl結(jié)構(gòu)域。
圖3 =FAP片段的組織表達(dá)。在來自Clontech的cDNA組中研究MASP_1、MASP3、和FAP基因的組織分布。使用通用正向引物和特異性反向弓I物擴(kuò)增MASP-I、MASP-3、和FAP轉(zhuǎn)錄物。GADPH用作參照基因。所有三種基因在肝臟中高度表達(dá)，另外，F(xiàn)AP在心臟組織中強(qiáng)表達(dá)(用黑色箭頭表示)。在腦、結(jié)腸、前列腺、骨骼肌、和小腸中檢測到FAP基因的較少表達(dá)(用白色箭頭表示)。圖4 :MASP-1，MASPUP FAP 的比對。利用 BioEdit 軟件比對 MASP-1，MASP-3，和FAP的蛋白序列。MASP-I和MASP-3包含不同的C端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，而FAP不包含任何絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。相反，該蛋白在C端區(qū)域包含17個新的氨基酸。圖5 =FAP的cDNA序列和相對應(yīng)的蛋白序列。cDNA序列顯示在上一行，相對應(yīng)的蛋白序列顯示在下。外顯子區(qū)域被黑色豎直線分開。認(rèn)為參與MBL/ficolins結(jié)合的氨基酸用淺黃色方框標(biāo)記。圖6 =MASP-I補(bǔ)體激活。將人MBL用增加量的MASP-1溫育。MASP-1能夠激活C3和C4兩種補(bǔ)體蛋白。圖7 MASP-2補(bǔ)體激活。將人MBL用增加量的MASP-2溫育。MASP-2能夠強(qiáng)烈激活C3和C4兩種補(bǔ)體蛋白。圖8 :補(bǔ)體的MASP-3抑制。將人MBL用增加量的MASP-3溫育。MASP-3能夠抑制C3和C4兩種補(bǔ)體蛋白的激活。圖9 :免疫沉淀。用 mAb 抗-MBL 131-11，抗-Ficolin-2 克隆 219，和抗-Ficolin-3克隆334免疫沉淀血清Ficolin/MBL。接著進(jìn)行Dynal磁珠分離，SDS-PAGE，蛋白質(zhì)印跡和生物素標(biāo)記的抗-MASP-1/MASP-3克隆8B3作為信號抗體。

圖10 =Ficolin與乙?；娜搜灏椎鞍?AcHSA)結(jié)合時，F(xiàn)AP與Ficolin相互作用。洗脫的與AcHSA結(jié)合的血清Ficolin。蛋白質(zhì)印跡使用生物素標(biāo)記的抗-MASP-I/MASP-3克隆8B3作為信號抗體進(jìn)行。圖11 =MASP-I和MASP-3與rFicolin-2之間相互作用的動力學(xué)和解離常數(shù)Hummelshaj T 等，Mol. Immunol.(分子免疫學(xué)),2007)。圖12 KULF和FAP的17個特有氨基酸的比對。圖13 :在甘露聚糖/MBL ELISA測定中，C4的補(bǔ)體激活。將甘露聚糖包被的孔用或不用重組人MBL溫育，然后用連續(xù)稀釋的MBL純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點(diǎn)雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。圖14 :在乙?；腂SA/Ficolin-3 ELISA測定中，C4的補(bǔ)體激活。將AcBSA包被的孔用或不用重組人Ficolin-3溫育，然后用連續(xù)稀釋的Ficolin-3純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點(diǎn)雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。圖15 :在甘露聚糖/MBL ELISA測定中，C4的補(bǔ)體激活。將甘露聚糖包被的孔用重組人MBL溫育，然后在一個維度用rMASP-Ι連續(xù)稀釋液作為不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清進(jìn)行溫育。隨后在第二維度用連續(xù)稀釋的MBL純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點(diǎn)雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。圖16 :在AcBSA/Ficolin-3 ELISA測定中，C4的補(bǔ)體激活。將AcBSA包被的孔用重組人Ficolin-3溫育，然后在一個維度用rMASP-Ι連續(xù)稀釋液作為不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清進(jìn)行溫育。隨后在第二維度用連續(xù)稀釋的Ficolin-3純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點(diǎn)雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。圖17 :在甘露聚糖/MBL ELISA中，C4的補(bǔ)體激活。將甘露聚糖包被的孔用重組人MBL溫育，然后在一個維度用rMASP-2連續(xù)稀釋液作為不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清進(jìn)行溫育。隨后在第二維度用連續(xù)稀釋的MBL純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點(diǎn)雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。圖18 :在AcBSA/Ficolin-3 ELISA測定中，C4的補(bǔ)體激活。將AcBSA包被的孔用重組人Ficolin-3溫育，然后在一個維度用rMASP-2連續(xù)稀釋液作為不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清進(jìn)行溫育。隨后在第二維度用連續(xù)稀釋的Ficolin-3純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點(diǎn)雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。圖19 :在甘露聚糖/MBL ELISA測定中，C4的補(bǔ)體激活。將甘露聚糖包被的孔用重組人MBL溫育，然后在一個維度用rMASP-3連續(xù)稀釋液作為不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清進(jìn)行溫育。隨后在第二維度用連續(xù)稀釋的MBL純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點(diǎn)雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。圖20 :在AcBSA/Ficolin-3 ELISA測定中，C4的補(bǔ)體激活。將AcBSA包被的孔用重組人Ficolin-3溫育，然后在一個維度用rMASP-3連續(xù)稀釋液作為不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清進(jìn)行溫育。隨后在第二維度用連續(xù)稀釋的Ficolin-3純合子缺陷型血清溫育。使用多克隆抗C4c抗體測量C4沉積。誤差條表示曲線上每個點(diǎn)雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。圖21 FAP,MASPl和MASP3的組織分布。在心臟組織中，F(xiàn)AP表達(dá)較MASPI和MASP3高得多。與在肝臟中的FAP表達(dá)相比，F(xiàn)AP在心臟組織中的表達(dá)高三倍。此外，與在肝臟中的MASPl和MASP3表達(dá)相比，在肝臟中觀察到更高的FAP表達(dá)。在腦、骨骼肌和前列腺組織中也檢測到相當(dāng)多的FAP表達(dá)。實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行三次。顯示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖22 :使用針對蛋白的17個FAP特異性C端殘基的多克隆小鼠抗血清進(jìn)行MAP-I的免疫組織化學(xué)肝臟定位。對照染色是陰性的。幾種不同的針對FAP的多克隆抗體(兔和小鼠)表現(xiàn)出相同模式的染色。圖23 =MAP-I組織定位的免疫組織化學(xué)分析(0M X10)。左圖顯示用針對MAP-I的 mAb(12Bll)染色。右圖顯示用不相關(guān)的IgGlk mAb的同種型對照染色。(A-B):心肌，(C-D)骨骼肌，(E-F):肝臟樣品，(G-H):主動脈組織。所有載玻片上右下角刻度條表示50 μ m。
圖24 =MAP-I和MASP-1/3血清復(fù)合物的免疫沉淀。(A)用mAb 20C4(抗MAP-1)和mAb 8B3 (抗MASP-1/3，具有在通用重鏈上的表位)從血清中免疫沉淀MAP-1和MASP-1/3。將還原的樣品電印跡并且用針對MAP-I的PAb或針對Ficolin-3 (FCN334)和MBL (Hyb131-1)的生物素?；?mAbs 顯色。(B)用針對 MBL(Hyb 131-11)，F(xiàn)icolin-2 (FCN219)和Ficolin-3 (FCN334)的mAbs分別從1ml，300 μ I和100 μ I血清進(jìn)行免疫沉淀(左側(cè))。對照為使用抗MAP-I mAb 20C4從血清沉淀的MAP-I (sMAP-Ι)和從培養(yǎng)物上清沉淀的rMAP-1 (rMAP-1)(右側(cè))。樣品通過使用針對MAP-I的pAb探測的蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。圖25 MASP-2和MAP-1對MBL和Ficolin-3介導(dǎo)的補(bǔ)體C4沉積的影響。C4沉積使用針對C4的多克隆抗體測量，并且作為0D490-650nm值給出。誤差條表示雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。在附圖標(biāo)記中給出rMBL，rFicolin-3，rMAP-1和rMASP-2的近似濃度。(A)使用MBL缺陷型血清，用400ng/ml的rMBL，重建在甘露聚糖包被的表面上的C4沉積。對照不加入rMBL。(B) rMASP-2對rMBL介導(dǎo)的C4沉積的劑量依賴性影響。(C) rMAP-Ι對rMBL介導(dǎo)的C4沉積的劑量依賴性影響。(D)使用Ficolin-3缺陷型血清，用400ng/ml的rFicolin-3,重建在AcBSA包被的表面上的C4沉積。(E)rMASP_2對rFicolin-3介導(dǎo)的C4
圖26 :MASP-2和MAP-I對純系統(tǒng)中補(bǔ)體C4沉積的影響。甘露聚糖表面上的rMBL在第一維度上用連續(xù)稀釋的rMASP-2預(yù)先溫育。然后在第二維度上應(yīng)用連續(xù)修飾的rMAP-1，然后應(yīng)用I μ g/ml的純化的C4。使用針對C4的pAb測量C4沉積，并且作為0D490_650nm值給出。誤差條表示雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。在附圖標(biāo)記中給出rMAP-Ι和rMASP-2的近似濃度。圖27 rMAP-Ι的SDS-PAGE分析。左手側(cè)表示免疫印跡分析+/-N-糖苷酶F處理(ENDO-F)。右側(cè)表示相對應(yīng)的考馬斯染色。Fig. 28A，B :校正曲線。A)通過mAb 20C4/mAb_8B3雙側(cè)ELISA產(chǎn)生的校正曲線，其使用應(yīng)用到MAP-I耗盡的正常人血清庫(PNHS)的兩倍連續(xù)稀釋的rMAP-Ι或稀釋在PBS/0. 05%吐溫/IOmM EDTA中的連續(xù)稀釋的rMAP-Ι進(jìn)行。誤差條表示8次確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。B)MAP-I耗盡的血清、正常人血清和摻加rMAP-Ι的MAP-I耗盡的血清的免疫印跡。圖29A-C =MAP-I血清濃度。A)在100名丹麥獻(xiàn)血者中的MAP-I血清濃度和分布。平均血清水平240ng/ml。范圍115_466ng/ml· ;B)MASP_3和MAP-1血清水平之間的相關(guān)性；C)對血清冷凍和解凍的影響。將血清冷凍和解凍8輪，測量每輪的MAP-I水平。誤差條表示雙重確定的標(biāo)準(zhǔn)誤差的兩倍。圖30 A)在100名丹麥獻(xiàn)血者中，MAP-I與MBL，F(xiàn)icolin-2和Ficolin-3之間各自的締合水平(以相對O. D. 490-650nm單位表示)。P值通過非參數(shù)雙尾t檢驗(yàn)獲得。B)在MAP-I血清水平和與MBL，F(xiàn)icolin-2和Ficolin-3的相對締合之間的相關(guān)性(左手側(cè))。MBL, Ficolin-2和Ficolin-3血清水平與同MAP-I的相對締合之間的相關(guān)性(右手側(cè))。相關(guān)性P-和r-值使用非參數(shù)斯皮爾曼等級相關(guān)性檢驗(yàn)計算。圖31A-C :蔗糖梯度超離心。A)由進(jìn)行10_30%蔗糖密度梯度的血清收集的級分(1-27)。級分通過針對MAP-1，MASP-3, MBL, Ficolin-2和-3的特異性ELISA進(jìn)行分析。血清IgM(19S)和IgG(7S)的峰值表示在圖的頂部。B)通過針對MAP-1，MASP-I, MASP-3,sMAP, MASP-2, MBL, Ficolin-2和Ficolin-3的免疫印跡分析編號8-23的級分。C)通過激活外源應(yīng)用在固定的乙?；疊SA(—種Ficolin-3配體)或甘露聚糖(一種MBL配體)上的人C4的能力而分析級分1-27。發(fā)明的詳細(xì)公開內(nèi)容本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種與凝集素補(bǔ)體途徑的識別分子相關(guān)的40kDa新型血漿蛋白，并且將其鑒定為MASP-1/MASP-3的新的可變轉(zhuǎn)錄變體，其又對應(yīng)于該新發(fā)現(xiàn)的血漿蛋白。本發(fā)明人已經(jīng)表明該新型蛋白(本發(fā)明人命名為FAP(Ficolin相關(guān)蛋白，F(xiàn)icolinAssociated Protein)或 MAP-1(MBL/Ficolin 相關(guān)蛋白-I, MBL/Ficolin associatedprotein-1))缺少酶結(jié)構(gòu)域但是包含ficolin/MBL結(jié)合結(jié)構(gòu)域,并且因此預(yù)測其通過MASPs的競爭和置換或備選地，但不相互排斥地，作為參與清除或信號傳導(dǎo)功能的蛋白而參與補(bǔ)體和凝結(jié)功能的調(diào)控和抑制。補(bǔ)體系統(tǒng)和/或凝結(jié)級聯(lián)的不可控激活強(qiáng)烈地與在系統(tǒng)性炎癥和膿毒癥、心肌梗 死和自體免疫性的范圍內(nèi)的各種疾病的致死性嚴(yán)重后果相關(guān)。已經(jīng)表明，凝結(jié)和補(bǔ)體激活的抑制是一種有希望的治療工具。本發(fā)明描述一種補(bǔ)體和凝結(jié)功能的可能的新型抑制劑。然而，本發(fā)明的多肽可以具有其它的功能，諸如清除和/或信號傳導(dǎo)功能。此外，其可以在一些疾病情形中用作新的生物標(biāo)記，所述疾病情形包括惡性疾病、自體免疫性、代謝和/或炎性病癥。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種稱為Ficolin相關(guān)蛋白(FAP)的體內(nèi)血存在的漿蛋白，并且表明，其主要與ficolins相締合(圖9)，但是其可能還與甘露糖結(jié)合凝集素相締合。通過搜索NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一種對應(yīng)于截短的MASP-I的可能的轉(zhuǎn)錄變體。基于這一序列，設(shè)計引物，從而擴(kuò)增推定的新基因轉(zhuǎn)錄物。隨后，使用人肝臟cDNA，鑒定了 MASP-I基因的新可變轉(zhuǎn)錄變體(圖I)。對這一 mRNA鏈進(jìn)行測序，并且確定氨基酸序列，其對應(yīng)于分子量為40kDa的在血漿/血清中觀察到的蛋白(圖5)。該新型蛋白部分與MASP-I和MASP-3相同，但是缺少絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，卻包含在終止密碼子前的編碼17個氨基酸的新外顯子。該外顯子在MASPl和MASP3轉(zhuǎn)錄物中被剪截掉(圖2)。通過使用一組mRNA表達(dá)文庫，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該蛋白在心臟和在肝臟中、其次在骨骼肌中強(qiáng)烈表達(dá)的證據(jù)(圖3)。在腦、消化道、前列腺和在脾中觀察到弱表達(dá)(圖3)。Taqman分析證實(shí)在心臟和肝臟細(xì)胞中的表達(dá)。FAP較MASPl和MASP3在心臟組織中的表達(dá)高得多。與在肝臟中的FAP表達(dá)相比，F(xiàn)AP在心臟組織中的表達(dá)高三倍。并且，與在肝臟中的MASPl和MASP3表達(dá)相比，在肝臟中觀察到更高的FAP表達(dá)。在腦、骨骼肌和前列腺組織中也檢測到相當(dāng)多的FAP表達(dá)。實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行三次。在心臟中的高表達(dá)非常顯著，并且使本發(fā)明人提議本發(fā)明的多肽作為自體免疫性、代謝和/或炎性病癥(諸如與心臟相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥)中抗組織損傷的非常有用的保護(hù)劑的應(yīng)用。本發(fā)明人已經(jīng)建立評估由ficolins和甘露糖結(jié)合凝集素引發(fā)的補(bǔ)體活性的測定法，并且發(fā)明人因此已經(jīng)能夠表明FAP可能的功能性補(bǔ)體抑制作用。本發(fā)明人已經(jīng)建立實(shí)時定量測定法來測量不同組織中準(zhǔn)確的相對表達(dá)水平。本發(fā)明的多肽可以通過重組技術(shù)產(chǎn)生。可以用特有的17個氨基酸長的肽免疫兔或小鼠，從而分別獲得FAP多克隆和單克隆特異性抗體。
特異性FAP抗體可以用于定量測量FAP和不同組織中的免疫組織化學(xué)檢測?？梢栽贓LISA中并且通過使用表面等離子體共振技術(shù)(Biacore)確定FAP和本文所述的不同結(jié)合配偶體之間的結(jié)合常數(shù)。FAP特異性接納體蛋白，如特異性細(xì)胞表面結(jié)合的受體，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)測定法鑒定，所述測定法諸如其中蛋白直接結(jié)合到細(xì)胞上的測定法。新型蛋白Ficolin相關(guān)蛋白(FAP)是MASPl的可變剪接變體。該蛋白缺少絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，但是仍然保留參與與補(bǔ)體系統(tǒng)的凝集素途徑的起始劑結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明人預(yù)測該蛋白通過MASPs的競爭和置換參與MASP-I和MASP-3 (補(bǔ)體，凝結(jié)功能和其它酶底物)功能的調(diào)節(jié)和抑制。備選地，但是不相互排斥地，F(xiàn)AP可以作用為清除分子，促進(jìn)去除與內(nèi)源性廢物物質(zhì)或病原體結(jié)合的FAP/MBL/ficolin復(fù)合物。補(bǔ)體系統(tǒng)和凝結(jié)級聯(lián)的不可控激活與不利的后果相關(guān)，并且功能性抑制劑，諸如本發(fā)明的多肽，可以非常有效地控制補(bǔ)體系統(tǒng)和凝結(jié)級聯(lián)。另外，本發(fā)明的多肽可以用在其它情形中。另一個角度是可以將該蛋白用作不同疾病情形中的生物標(biāo)記。所述蛋白是獨(dú)特的，并且可以提供用于新藥物和/或新診斷工具的基礎(chǔ)。包含氨基酸序列SEQ ID NO :4或其免疫學(xué)片段或變體的本發(fā)明的多肽可以具有與該氨基酸序列相關(guān)的特定功能。本發(fā)明人提議，所述多肽可以具有與選自下列的一種或多種蛋白的活性相對應(yīng)的功能或活性=DNMTl DNA (細(xì)胞因子_5_)-甲基轉(zhuǎn)移酶I (DNMTl)，高爾基蛋白亞家族B成員I (GOLGBl) ,A-激酶錨定蛋白9 (AKAP9)，B_和T-淋巴細(xì)胞-相關(guān)蛋白)(⑶272抗原)，包含PTB結(jié)構(gòu)域的吞沒銜接蛋白I (⑶LP)，和包含MACRO結(jié)構(gòu)域的蛋白2。在一些特別有意思的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有與包含PTB結(jié)構(gòu)域的吞沒銜接蛋白I(GULP)的活性相對應(yīng)的功能或活性。定義術(shù)語“ficolin相關(guān)多肽”用在本文中意指包含天然人ficolin相關(guān)多肽(FAP)(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列20-380或SEQ ID NO 9的氨基酸序列16-363的任意蛋白或多肽，其功能性變體、功能性截短版本以及功能性衍生物或綴合物，所述多肽不具有補(bǔ)體活性，但是具有與MASP-1，MASP-2，或MASP-3競爭與f icolin-3，MBL，Clq,肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D和/或CL-Ll (和其它膠原凝集素家族成員)結(jié)合的能力。這包括但不限于具有SEQ ID NO :I的人ficolin相關(guān)多肽(FAP)及其變體。術(shù)語“ficolin相關(guān)蛋白(FAP) ”用在本文中意指具有天然人FAP (SEQID NO I)的氨基酸序列1-380(有或無信號肽，諸如氨基酸序列20-380)的蛋白、其天然等位基因變體和同源物。其還包括具有略微修飾的氨基酸序列的蛋白，例如，包括N或C端氨基酸缺失或添加的修飾的N或C末端，只要這些蛋白基本上保留FAP活性。術(shù)語“ficolin相關(guān)蛋白(FAP) ”在本文中與術(shù)語“MAP-1”或“MBL/Ficolin相關(guān)蛋白-I”互換使用。在上述定義中的“FAP”還包括可能在一個個體到另一個個體之間存在并發(fā)生的天然等位基因變體。該術(shù)語還包括具有同源序列和相似功能的來源于除人外其它物種(諸如牛、豬、狗、馬、大鼠、和小鼠)的蛋白。此外，取決于所選的宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞環(huán)境的性質(zhì)，糖基化或其它翻譯后修飾的程度和位置可能不同。
術(shù)語“MBL-相關(guān)的絲氨酸蛋白酶-I”或“MASP-1”用在本文中意指具有天然人MASP-1 (SEQ ID NO :5)的氨基酸序列1-699 (有或無信號肽，諸如氨基酸序列20-699)的蛋白、其天然等位基因變體和同源物。應(yīng)該理解，所述序列可以存在于一條或多條肽鏈中，諸如存在于兩條鏈中，即，存在于天然人蛋白的重鏈和輕鏈中。術(shù)語“MBL-相關(guān)的絲氨酸蛋白酶-3”或“MASP-3”用在本文中意指具有天然人MASP-3 (SEQ ID NO 7)的氨基酸序列1-728 (有或無信號肽，諸如氨基酸序列20-728)的蛋白、其天然等位基因變體和同源物。應(yīng)該理解，所述序列可以存在于一條或多條肽鏈中，諸如存在于兩條鏈中，即，存在于天然人蛋白的重鏈和輕鏈中。術(shù)語“MBL-相關(guān)的絲氨酸蛋白酶-2”或“MASP-2”用在本文中意指具有天然人MASP-2 (SEQ ID NO 9)的氨基酸序列1-686 (有或無信號肽，諸如氨基酸序列16-686)的蛋白、其天然等位基因變體和同源物。應(yīng)該理解，所述序列可以存在于一條或多條肽鏈中，諸如存在于兩條鏈中，即，存在于天然人蛋白的重鏈和輕鏈中。術(shù)語“小的MBL相關(guān)蛋白”、“sMAP”、“19kD的MBL相關(guān)的血漿蛋白”或“MApl9”用 作本文中意指具有天然人sMAP (SEQ ID NO 11)的氨基酸序列1_185 (有或無信號肽，諸如氨基酸序列16-185)的蛋白、其天然等位基因變體和同源物。術(shù)語“變體”(“variant”或“variants”)用在本文中意欲指定具有序列SEQ IDNO :1的ficolin相關(guān)多肽或包含氨基酸序列SEQ ID NO 4的多肽，其中一個或多個氨基酸已被另一個氨基酸置換和/或其中一個或多個氨基酸已被刪除和/或其中已經(jīng)在多肽中插入一個或多個氨基酸和/或其中已向多肽添加一個或多個氨基酸。所述添加可以發(fā)生在N末端或在C末端或在兩端。在該定義中的“變體”仍然具有功能性活性。在一些實(shí)施方案中，變體與序列SEQ ID NO :1具有70%的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，變體與序列SEQ IDNO :1具有80%的序列同一性。在另一些實(shí)施方案中，變體與序列SEQ ID N0:1具有90%的序列同一性。在另一個實(shí)施方案中，變體與序列SEQ ID NO: I具有95%的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，變體與序列SEQ ID NO: 4具有70%的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，變體與序列SEQ ID NO :4具有80%的序列同一性。在另一些實(shí)施方案中，變體與序列SEQ ID NO :4具有90%的序列同一性。在另一個實(shí)施方案中，變體與序列SEQ ID NO:4具有95%的序列同一性。短語“功能性變體”、“功能性截短版本”和“功能性衍生物”用在本文中是指SEQ IDNO :1的變體、截短的版本以及衍生物，所述多肽包含SEQ ID NO: I的基本序列部分，并且至少具有與MASP-I或MASP-3競爭結(jié)合ficolins或MBL的能力而不具有補(bǔ)體活性和/或絲氨酸蛋白酶活性。應(yīng)該理解，ficolin相關(guān)多肽可以具有選自作為變體、和/或截短體和/或衍生物的兩個或三個特征。已經(jīng)在相同細(xì)胞類型中產(chǎn)生了 ficolin相關(guān)多肽的功能性變體，包括在本文所述的測定法中檢測時，表現(xiàn)出野生型FAP的至少約25%，諸如至少約50%，諸如至少約75%，諸如至少約90%的特異性活性的那些。術(shù)語“免疫學(xué)片段”用在本文中是指具有基本上相同的功能性活性和被抗體識別的相同空間方向的氨基酸序列的片段。相應(yīng)地，特異性抗體結(jié)合多肽和其免疫學(xué)片段二者。術(shù)語“另一個氨基酸”用作本文中意指不同于在該位置天然存在的氨基酸的一個氨基酸。這包括但不限于可以由多核苷酸編碼的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，不同的氨基酸采用天然L形式，并且可以由多核苷酸編碼。
術(shù)語“衍生物”用在本文中意欲指相對于野生型人FAP表現(xiàn)出基本上相同或提高的生物學(xué)活性的ficolin相關(guān)多肽，其中母本多肽的一個或多個氨基酸已被化學(xué)修飾，例如，通過烷基化、PEG化、?；?、酯形成或酰胺形成等進(jìn)行化學(xué)修飾。術(shù)語“補(bǔ)體活性”用在本文中意指激活補(bǔ)體系統(tǒng)的活性。補(bǔ)體活性可以用本文標(biāo)題為“測定法”部分中所述的測定法進(jìn)行測量。術(shù)語“甘露糖結(jié)合凝集素(MBL) ”用作本文中還意指甘露糖結(jié)合凝集素，甘露糖結(jié)合蛋白(MBPl)，和甘露糖結(jié)合蛋白，該術(shù)語可以互換使用。術(shù)語“能夠締合”用在本文中是指本發(fā)明的蛋白在溶液中特異性結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)的凝集素途徑的一個或多個起始劑或可能參與該多肽作用的其它蛋白的能力。術(shù)語“構(gòu)建體”意欲指可能基于編碼目的多肽的完整的或部分的天然存在的核苷酸序列的多核苷酸片段。構(gòu)建體可以任選地包含其它多核苷酸片段。以相似的方式，術(shù)語“可以由多核苷酸構(gòu)建體編碼的氨基酸”包括可以由上文定義的多核苷酸構(gòu)建體編碼的氨基酸，即，諸如 Ala, Val, Leu, He, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp 和 Gln 的氨基酸。術(shù)語“載體”用在本文中意指在宿主細(xì)胞中能夠擴(kuò)增的任意核酸實(shí)體。因此，載體可以是自發(fā)復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。備選地,載體可以是這樣一種載體,即，當(dāng)引入到宿主細(xì)胞中時,其整合到宿主細(xì)胞基因組中并且與其已經(jīng)整合到其中的染色體一起復(fù)制。載體的選擇通常取決于載體要被引入的宿主細(xì)胞。載體包括，但不限于，質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒或黏端質(zhì)粒載體。載體通常包含復(fù)制起點(diǎn)和至少一個可選擇基因，即，編碼易于檢測的產(chǎn)物的基因或該基因的存在對細(xì)胞生長是必需的基因。在另一個方面中，本發(fā)明提供包含所述多核苷酸構(gòu)建體或載體的重組宿主細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞是哺乳動物來源的。在另一個實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞選自由CHO細(xì)胞、HEK細(xì)胞和BHK細(xì)胞組成的組。術(shù)語“宿主細(xì)胞”用在本文中表示任意細(xì)胞，包括雜交細(xì)胞，其中可以表達(dá)異源DNA0典型的宿主細(xì)胞包括，但不限于昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞，包括人細(xì)胞，諸如BHK，CH0，HEKJP COS細(xì)胞。當(dāng)實(shí)施本發(fā)明時，培育的宿主細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選是建立的哺乳動物細(xì)胞系，包括但不限于，CH0(例如，ATCC CCL 61)，C0S-1(例如，ATCC CRL1650)，幼倉鼠腎(BHK)和 HEK293(例如，ATCC CRL1573 ;Graham 等，J. Gen. Virol.(基因病毒學(xué)雜志)36 :59-72,1977)細(xì)胞系。優(yōu)選的BHK細(xì)胞系是tk- tsl3 BHK細(xì)胞系(Waechter和 Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)79 :1106-1110,1982)，以下稱為BHK 570細(xì)胞。BHK 570細(xì)胞系可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection, 12301 Parklawn Dr. , Rockville, MD20852)獲得，ATCC 保藏號為 CRL 10314。 tk- tsl3 BHK細(xì)胞系也可從ATCC獲得，其保藏號為CRL 1632。其它適當(dāng)?shù)募?xì)胞系包括，但不限于，大鼠H印I (大鼠肝細(xì)胞瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠H印II (大鼠肝細(xì)胞瘤；ATCCCRL 1548)，TCMK (ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065)，NCTC1469 (ATCC CCL 9. I)和 DUKX細(xì)胞(Urlaub 和 Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)77 =4216-4220,
1980)。也可以使用3T3細(xì)胞、Namalwa細(xì)胞、骨髓瘤和骨髓瘤與其它細(xì)胞的融合。
在另一個方面中，本發(fā)明提供包含并且表達(dá)所述多核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動物。在另一個方面中，本發(fā)明提供包含并且表達(dá)所述多核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)本發(fā)明的ficolin相關(guān)多肽的方法，所述方法包括在允許多核苷酸構(gòu)建體表達(dá)的條件下在適合的生長培養(yǎng)基中培育包含所述多核苷酸構(gòu)建體的細(xì)胞，并且從培養(yǎng)基中回收得到的多肽。當(dāng)用于本文中時，術(shù)語“適合的生長培養(yǎng)基”意指包含細(xì)胞生長和編碼本發(fā)明的ficolin相關(guān)多肽的核酸序列表達(dá)所需要的營養(yǎng)物和其它成分的培養(yǎng)基。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)ficolin相關(guān)多肽的方法，所述方法包括從由轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生的奶中回收所述多肽。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)ficolin相關(guān)多肽的方法，所述方法包括培育包含多核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞，并且從得到的植物中回收所述多肽。 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“治療”意欲包括對預(yù)期涉及不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活的病癥(諸如炎癥和再灌注損傷)的預(yù)防和對已經(jīng)存在的病癥(諸如心肌梗死和中風(fēng))的調(diào)節(jié)，目的是抑制或?qū)⒔M織損傷減至最少。因此，術(shù)語“治療”包括預(yù)防性施用本發(fā)明的ficolin相關(guān)多肽。術(shù)語“受試者”用在本文中意欲指任何動物，特別是哺乳動物，諸如人，并且在適當(dāng)時候可以與術(shù)語“患者”互換使用。術(shù)語“序列同一性”，如本領(lǐng)域已知的，是指兩種或多種多肽分子或兩種或多種核酸分子之間通過比較序列確定的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”還意指核酸分子之間或多肽之間的序列相關(guān)性的程度，根據(jù)具體情況而定，通過兩個或多個核苷酸殘基或兩個或多個氨基酸殘基的鏈之間的匹配數(shù)目而確定?！巴恍浴睖y量在兩個或多個序列的較小者之間相同性匹配的百分?jǐn)?shù)，其中通過特定的數(shù)學(xué)模型或計算機(jī)程序(即，“算法”)闡釋缺口比對(如果存在的話)。術(shù)語“相似性”是相關(guān)的概念，但是與“同一性”相反，是指包括相同的匹配和保守置換匹配二者的序列關(guān)系。例如，如果兩種多肽序列具有(分?jǐn)?shù)(10/20))相同的氨基酸，并且其余的全部是非保守置換，則同一性和相似性百分?jǐn)?shù)均為50%。如果，在同一實(shí)例中，存在另外5個具有保守置換的位置，則同一性百分?jǐn)?shù)仍為50%，但是相似性百分?jǐn)?shù)為75%(分?jǐn)?shù)(15/20))。因此，在存在保守置換的情形中，兩種多肽之間的相似性程度高于這兩種多肽之間的同一性百分?jǐn)?shù)。氨基酸序列SEQ ID NO 1的保守修飾(和對編碼核苷酸的相對應(yīng)修飾)將產(chǎn)生具有與天然存在的FAP的那些相似的功能性和化學(xué)特征的ficolin相關(guān)多肽。相反，在ficolin相關(guān)多肽的功能性和/或化學(xué)特征中的實(shí)質(zhì)性修飾可以通過選擇氨基酸序列SEQID N01中的置換實(shí)現(xiàn)，所述置換在它們保持(a)置換區(qū)域中的分子主鏈的結(jié)構(gòu)，例如，作為折疊或螺旋構(gòu)象，(b)分子在靶位點(diǎn)的電荷或疏水性，或(C)側(cè)鏈的體積的作用方面顯著不同。例如，“保守氨基酸置換”可以包括用非天然殘基置換天然氨基酸殘基，以使對該位置氨基酸殘基的極性或電荷影響很小或沒有影響。此外，多肽中任何天然的殘基還可以用丙氨酸置換，如以前關(guān)于“丙氨酸掃描誘變”所述(參見，例如，MacLennan等，1998，ActaPhysiol. Scand. Suppl. 643 :55-67 ；Sasaki 等，1998, Adv. Biophys.(生物物理進(jìn)展)35 1-24，其討論了丙氨酸掃描誘變)。理想的氨基酸置換(不管是保守的還是不保守的)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在需要所述置換時確定。例如，氨基酸置換可以用來鑒定ficolin相關(guān)多肽的重要?dú)埢蛟黾踊蚪档捅疚乃龅膄icolin相關(guān)多肽的親和性。基于常見的側(cè)鏈特性，天然存在的殘基可以分成下述幾類I)疏水性正亮氨酸，Met, Ala, Val, Leu, He ；2)中性親水性Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ；3)酸性Asp，Glu ;4)堿性His, Lys, Arg ；5)影響鏈方向的殘基Gly, Pro ;和6)芳香的Trp, Tyr, Phe0例如，不保守置換可以包括這些種類中一類的一個成員與另一種類的一個成員交換。這樣置換的殘基可以引入到人ficolin相關(guān)多肽與非人ficolin相關(guān)多肽同源的區(qū)域 中，或引入到該分子的非同源區(qū)域中。在進(jìn)行這樣的變化時,可以考慮氨基酸的水性指數(shù)(hydropathic index)。基于氨基酸的疏水性和電荷特征，每個氨基酸已被指定一個水性指數(shù)，其為異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1. 9);丙氨酸(+1. 8);甘氨酸(-0. 4);蘇氨酸(-0. 7);絲氨酸(-0. 8);色氨酸(-0. 9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3. 5);天冬酰胺(-3. 5);賴氨酸(-3. 9);和精氨酸(-4. 5)。本領(lǐng)域中知曉水性氨基酸指數(shù)對賦予蛋白相互作用生物學(xué)功能的重要性。Kyte等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，157 =105-131 (1982)。已知某些氨基酸可以被具有相似水性指數(shù)或得分的另一些氨基酸置換并且仍然保留相似的生物學(xué)活性。在基于水性指數(shù)進(jìn)行變化時，優(yōu)選水性指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸置換，特別優(yōu)選在±1之內(nèi)的那些，并且甚至更特別優(yōu)選在±0. 5之內(nèi)的那些。本領(lǐng)域中還知曉可以基于親水性有效進(jìn)行相似氨基酸的置換，特別在意欲將由此產(chǎn)生的生物學(xué)功能等價蛋白或肽用于免疫學(xué)實(shí)施方案的情形中，如在本情形中一樣。蛋白的最大局部平均親水性，由其相鄰的氨基酸的親水性所控制，與其免疫原性和抗原性相關(guān)，即，與蛋白的生物學(xué)特性相關(guān)。下述親水性值已經(jīng)分配給氨基酸殘基精氨酸(+3. 0);賴氨酸('3. 0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2. 3);苯丙氨酸(-2. 5);色氨酸(-3. 4)。在其余相似的親水性值進(jìn)行變化時，優(yōu)選親水性值在±2之內(nèi)的氨基酸的置換，特別優(yōu)選在±1之內(nèi)的那些，甚至更特別優(yōu)選在±0.5之內(nèi)的那些。人們還可以基于親水性從一級氨基酸序列鑒定表位。這些表位還稱為“表位核心區(qū)”。專業(yè)技術(shù)人員將能夠利用公知的技術(shù)確定SEQ ID NO :I所示的多肽的適當(dāng)?shù)淖凅w。為了鑒定該分子在不破壞活性的前提下可以被改變的適當(dāng)區(qū)域，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以靶向認(rèn)為對活性不重要的區(qū)域。例如，當(dāng)已知來自相同物種或來自其它物種具有相似活性的相似多肽時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將ficolin相關(guān)多肽的氨基酸序列與所述相似多肽進(jìn)行比較。利用這樣的比較，人們可以鑒定在相似多肽之間保守的該分子的殘基和部分。應(yīng)該理解，在相對于所述相似多肽不保守的ficolin相關(guān)多肽的區(qū)域中的變化較不可能不利地影響ficolin相關(guān)多肽的生物學(xué)活性和/或結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將知曉，甚至在相對保守的區(qū)域中，人們也可以用化學(xué)相似的氨基酸置換天然存在的殘基，同時保留活性(保守氨基酸殘基置換)。因此，甚至可能對生物學(xué)活性或?qū)Y(jié)構(gòu)是重要的區(qū)域也可以進(jìn)行保守氨基酸置換而不破壞生物學(xué)活性或不會不利地影響多肽結(jié)構(gòu)。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參閱鑒定相似多肽中對活性或結(jié)構(gòu)重要的殘基的結(jié)構(gòu)-功能研究。關(guān)于這樣的比較，人們可以預(yù)測ficolin相關(guān)多肽中與相似多肽中對活性或結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基相對應(yīng)的氨基酸殘基的重要性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以為ficolin相關(guān)多肽和本發(fā)明的其它多肽所述預(yù)測的重要氨基酸殘基選擇化學(xué)相似的氨基酸置換。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以相對于相似多肽的結(jié)構(gòu)分析三維結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。參考所述信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以關(guān)于ficolin相關(guān)多肽的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測ficolin相關(guān)多肽 的氨基酸殘基的比對。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇不對預(yù)測在蛋白表面上的氨基酸殘基帶來根本變化，因?yàn)樗鰵埢梢詤⑴c與其它分子的重要的相互作用。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以產(chǎn)生在每個需要的氨基酸殘基包含單個氨基酸置換的檢測變體。然后，可以使用本文所述的活性測定法篩選所述變體。所述變體可以用來收集關(guān)于適當(dāng)?shù)淖凅w的信息。例如，如果人們發(fā)現(xiàn)對特定氨基酸殘基的改變導(dǎo)致破壞的、不理想地減少的、或不適當(dāng)?shù)幕钚?，將避免具有這樣的變化的變體。換言之，基于由這樣的常規(guī)實(shí)驗(yàn)收集的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定應(yīng)該避免單獨(dú)的或與其它突變組合的其它置換的氨基酸。許多科學(xué)出版物致力于二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。參見Moult J. , Curr. Op. in Biotech.(現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn)雜志)，7(4) :422-427 (1996)，Chou等，Biochemistry (生物化學(xué))，13(2) :222-245(1974) ;Chou 等，Biochemistry (生物化學(xué))，113 (2) :211-222(1974) ；Chou等，Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47 :45-148 (1978) ；Chou 等，Ann. Rev. Biochem.(生物化學(xué)年度綜述)，47 =251-276和Chou等，Biophys. J.(生物物理學(xué)雜志)，26 :367-384(1979)。此外，目前可以用計算機(jī)程序來輔助預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。一種預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的方法是基于同源性建模。例如，兩種具有大于30%的序列同一性或大于40%的相似性的多肽或蛋白通常具有相似的結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)。最近的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(TOB)的增長已經(jīng)提供了提高的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測性，包括在多肽或蛋白結(jié)構(gòu)中折疊的潛在數(shù)目。參見Holm等，Nucl.Acid. Res.(核酸研究)，27 (I) :244-247 (1999)。已經(jīng)提議(Brenner 等，Curr. Op. Struct.Biol.(現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)觀點(diǎn))，7(3) =369-376(1997))在給定的多肽或蛋白中存在有限數(shù)目的折疊，并且一旦已經(jīng)解析了關(guān)鍵數(shù)目的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)預(yù)測將獲得顯著的準(zhǔn)確性。預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的其它方法包括"threading"(Jones, D. , Curr. Opin. Struct.Biol.(現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)觀點(diǎn))，7(3) :377-87(1997) ;Sippl 等，Structure (結(jié)構(gòu))，4 (I)15-9(1996))，"模式分析"(Bowie 等，Science (科學(xué))，253 :164-170(1991) ；Gribskov等，Meth. Enzymol.(酶學(xué)方法)，183 146-159 (1990) ；Gribskov 等，Proc. Nat. Acad. Sci.(國家科學(xué)院學(xué)報)，84(13) :4355-4358(1987)),和"進(jìn)化聯(lián)系"(參見Home，同上，和Brenner,同上)。
相關(guān)多肽的同一性和相似性可以容易地通過已知的方法計算。所述方法包括，但不限于，Computational Molecular Biology (計算分子生物學(xué))，Lesk, A. M.編，OxfordUniversity Press (牛津大學(xué)出版社)，紐約，1988 ；Biocomputing Informatics andGenome Pro jects (生物計算信息學(xué)和基因組工程)，Smith, D. W.編，Academic Press(學(xué)院出版社)，紐約，1993 ；Computer Analysis of Sequence Data(序列數(shù)據(jù)的計算機(jī)分析)，第 I 部分，Griffin, A. Μ.，和 Griffin, H. G.編，Humana Press,新澤西，1994 ；SequenceAnalysis in Molecular Biology (分子生物學(xué)中的序列分析)，von Heinje, G. , AcademicPress (學(xué)院出版社)，1987 ；Sequence Analysis Primer (序列分析引物)，Gribskov,M.和Devereux, J.編，M. Stockton Press,紐約，1991 ;和 Carillo 等,SIAM J. Applied Math.，48 :1073(1988)中所述的那些。確定同一性和/或相似性的優(yōu)選方法設(shè)計為給出檢測序列之間的最大匹配。在公眾可用的計算機(jī)程序中記述了確定同一性和相似性的方法。確定兩種序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選的計算機(jī)程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP (Devereux等，Nucl. Acid. Res.(核酸研究)，12 :387 (1984) ；Genetics Computer Group(遺傳計算機(jī) 組)，University of Wisconsin (威斯康辛大學(xué))，Madison, ffis.), BLASTP, BLASTN,和FASTA (Altschul 等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，215 :403-410 (1990))。BLASTX 程序是從 National Center for Biotechnology Information (NCBI,國立生物技術(shù)信息中心)和其它來源(BLAST Manual, Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda,Md. 20894 ；Altschul 等，同上)公眾可用的。公知的Smith Waterman算法也可以用來確定同一'丨生。用于比對兩種氨基酸序列的特定的比對方案可能導(dǎo)致僅兩條序列的較短區(qū)域匹配，并且該小的比對區(qū)域可能具有非常高的序列同一性，盡管在這兩條全長序列之間沒有顯著的關(guān)系。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所選的比對方法(GAP程序)將導(dǎo)致跨越靶多肽至少50個連續(xù)的氨基酸的比對。例如,使用計算機(jī)算法GAP(Genetics Computer Group (遺傳計算組)，Universityof Wisconsin (威斯康辛大學(xué))，Madison, Wis.),比對要確定序列同一1丨生百分?jǐn)?shù)的兩種多肽，以最佳匹配它們各自的氨基酸(“匹配的跨度”，如由該算法確定的)。缺口開口罰分(其計算為平均對角線的3倍；“平均對角線(average diagonal) ”是使用的比較矩陣的對角線的平均數(shù)；“對角線”是通過特定的比較矩陣分配給每個最佳氨基酸匹配的得分或數(shù)字)和缺口延伸罰分(其通常是缺口開口罰分的{分?jǐn)?shù)(1/10)}倍)，以及比較矩陣，如PAM 250或BLOSUM 62與該算法聯(lián)合使用。該算法也使用標(biāo)準(zhǔn)的比較矩陣(關(guān)于PAM 250比較矩陣，參見 Dayhoff 等，Atlas of Protein Sequence and Structure,卷 5, supp. 3 (1978);關(guān)于BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等，Proc. NatI. Acad. Sci USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)，89 :10915-10919(1992)) ο用于多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括下述 算法Needleman等，J. Mol. Biol (分子生物學(xué)雜志)，48 :443-453 (1970)；比較矩陣來自Henikoff等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)，89 :10915-10919(1992)的BLOSUM 62 ;缺口罰分12，缺口長度罰分4，相似性閾值0。GAP程序使用上述參數(shù)。前述參數(shù)是使用GAP算法進(jìn)行多肽比較的默認(rèn)參數(shù)(與其一起對末端缺口沒有罰分)。
用于核酸分子序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括下述算法Needleman等，J. Mol Biol.(分子生物學(xué)雜志)，48 :443_453 (1970);比較矩陣匹配=+10，不匹配=0，缺口罰分50，缺口長度罰分3。GAP程序也使用上述參數(shù)。前述參數(shù)是用于核酸分子比較的默認(rèn)參數(shù)。可以使用其它示例性的算法，缺口開口罰分，缺口延伸罰分，比較矩陣，相似性閾值等，包括在Program Manual (程序手冊),WisconsinPackage,第9版，1997年9月中所述的那些。要進(jìn)行的特定選擇對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且將取決于要進(jìn)行的具體比較，諸如DNA與DNA比較，蛋白與蛋白比較，蛋白與DNA比較；另外，不管比較是在給定的序列對之間(在該情形中，通常優(yōu)選GAP或BestFit)還是在一個序列和大的序列數(shù)據(jù)庫之間(在該情形中，優(yōu)選FASTA或BLASTA)。制備本發(fā)明的Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽
本發(fā)明還涉及制備上述本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的方法。本文所述的本發(fā)明的Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽可以通過重組核酸技術(shù)產(chǎn)生。通常，修飾克隆的野生型FAP核酸序列來編碼需要的蛋白。然后，將該修飾的序列插入到表達(dá)載體中，其又轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。高等真核細(xì)胞，特別是培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選作為宿主細(xì)胞。關(guān)于人FAP的完整的氨基酸和核苷酸序列通過SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2給出。氨基酸序列變化可以通過多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)。核酸序列的修飾可以通過位點(diǎn)特異性誘變進(jìn)行。關(guān)于位點(diǎn)特異性誘變的技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的，并且例如，記述在Zoller和Smith (DNA 3:479-488,1984)或"Splicing by extension overlap (通過延長重疊剪接)"，Horton等，Gene (基因)77，1989，第61-68頁。因此，利用FAP的核苷酸和氨基酸序列，人們可以引入選擇的變化。同樣地，關(guān)于使用特異性引物利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備DNA構(gòu)建體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見PCR Protocols (PCR流程),1990, AcademicPress (學(xué)院出版社),San Diego, California,美國)。本發(fā)明的多肽還可以包括非天然存在的氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸包括，但不限于，丙氨酸，去氨基組氨酸，反式-3-甲基脯氨酸，2，4_甲醇基脯氨酸，順式-4-羥基脯氨酸，反式-4-羥基脯氨酸，N-甲基甘氨酸，別-蘇氨酸，甲基蘇氨酸，羥基乙基半胱氨酸，羥基乙基高半胱氨酸，硝基谷氨酰胺，高谷氨酰胺，哌可酸，噻唑烷羧酸，脫氫脯氨酸，3-和4-甲基脯氨酸，3，3- 二甲基脯氨酸，叔-亮氨酸，正-纈氨酸，2-氮雜苯丙氨酸，3-氮雜苯丙氨酸，4-氮雜苯丙氨酸，和4-氟苯丙氨酸。本領(lǐng)域已知一些用于將非天然存在的氨基酸殘基結(jié)合到多肽中的方法。例如，可以使用體外系統(tǒng)，其中使用化學(xué)氨基?；淖枰治飔RNAs抑制無義突變。用于合成氨基酸和氨基?；痶RNA的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在不含細(xì)胞的系統(tǒng)中進(jìn)行包含無義突變的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和翻譯，所述不含細(xì)胞的系統(tǒng)包括大腸桿菌(E. coli) S30提取物和商購的酶和其它試劑。通過層析純化多肽。參見，例如，Robertson 等，J. Am. Chem. Soc.(美國化學(xué)學(xué)會雜志)113 :2722,1991 ；Ellman 等，MethodsEnzymol.(酶學(xué)方法)202 301,1991 ;Chung 等，Science (科學(xué))259 :806-9,1993 JPChung等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)90 :10145-9，1993)。在第二種方法中，通過顯微注射突變的mRNA和化學(xué)氨基?；淖枰治飔RNAs在爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行翻譯(Turcatti等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)271 :19991-8，1996)。在第三種方法中，將大腸桿菌細(xì)胞在缺乏要被替代的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)和存在需要的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮雜苯丙氨酸，3-氮雜苯丙氨酸，4-氮雜苯丙氨酸，或4-氟苯丙氨酸)的條件下培養(yǎng)。所述非天然存在的氨基酸結(jié)合到多肽中替換其天然負(fù)體。參見，Koide等，Biochem.(生物化學(xué))33 :7470-6,1994。天然存在的氨基酸殘基可以通過體外化學(xué)修飾轉(zhuǎn)化為非天然存在的種類?；瘜W(xué)修飾可以與定點(diǎn)誘變組合，以進(jìn)一步擴(kuò)大置換的范圍(Wynn和 Richards，Protein Sci.(蛋白質(zhì)科學(xué))2 :395_403，1993)。編碼本發(fā)明的Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的核酸構(gòu)建體可以適當(dāng)?shù)厥腔蚪M或cDNA來源的，例如，通過制備基因組或cDNA文庫并且通過按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見Samtoook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)，第 2 版· ColdSpring Harbor Labora-tory (冷泉港實(shí)驗(yàn)室)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約，1989)使用合成的寡核苷酸探針雜交來篩選編碼該多肽的全部或部分的DNA序列而獲得。編碼Ficolin相關(guān)多肽的核酸構(gòu)建體還可以通過建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，所述建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，Beaucage和Caruthers, Tetrahedron Letters (四面體通信)22(1981) ,1859-1869 所述的磷酰亞胺法，或 Matthes 等，EMBO Journal (ΕΜΒ0 雜志)3 (1984)，801-805所述的方法。按照磷酰亞胺方法，合成寡核苷酸，例如，在自動化DNA合成儀中合成，純化，退火，連接并且克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中。編碼本發(fā)明的人Fi Co I in相關(guān)多肽和其它多肽的DNA序列還可以通過使用特定引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備，例如，如在下述中所述US 4,683,202，Saiki 等，Science (科學(xué))239 (1988)，487-491，或 Sambrook等，同上。此外，核酸構(gòu)建體可以是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過連接合成的、基因組或cDNA來源的片段(適當(dāng)?shù)?而制備的混合的合成的和基因組、混合的合成的和cDNA或混合的基因組和cDNA來源的，所述片段對應(yīng)于完整核酸構(gòu)建體的不同部分。核酸構(gòu)建體優(yōu)選地是DNA構(gòu)建體。用于產(chǎn)生本發(fā)明的Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的DNA序列典型地編碼在FAP氨基端的前-原多肽，從而獲得正確的翻譯后加工和從宿主細(xì)胞分泌。編碼本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的DNA序列通常插入到重組載體中，其可以是任何載體，其可以便利地進(jìn)行重組DNA步驟，并且載體的選擇通常取決于要引入載體的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自發(fā)復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。備選地，載體可以是這樣一種載體，即，當(dāng)引入到宿主細(xì)胞中時，其整合到宿主細(xì)胞基因組中并且與其已經(jīng)整合到其中的染色體一起復(fù)制。載體優(yōu)選是表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的DNA序列可操作地連接到該DNA轉(zhuǎn)錄所需要的另外的片段上。通常，表達(dá)載體來源于質(zhì)?；虿《綝NA，或可以包含二者的組件。術(shù)語“可操作地連接”表示所述片段這樣排列，以使它們按照它們需要的目的行使功能，例如，轉(zhuǎn)錄由啟動子起始并且沿著編碼多肽的DNA序列進(jìn)行。用于表達(dá)本發(fā)明的Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的表達(dá)載體包含能夠指導(dǎo)克隆的基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的啟動子。啟動子可以是任意DNA序列，其在選擇的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性，并且可以來源于對所述宿主細(xì)胞來說是同源或異源的編碼蛋白的基因。在哺乳動物細(xì)胞中指導(dǎo)編碼人Ficolin相關(guān)多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)?shù)膯幼拥?實(shí)例是 SV40 啟動子(Subramani 等，Mo I. Cell Biol.(分子細(xì)胞生物學(xué))I (1981)，854-864)，MT-I (金屬硫蛋白基因)啟動子(Palmiter 等，Science (科學(xué))222 (1983)，809-814)，CMV啟動子(Boshart等，Cell (細(xì)胞)41 =521-530,1985)或腺病毒2主要晚期啟動子(Kaufman和 Sharp, Mol. Cell. Biol (分子細(xì)胞生物學(xué))，2 :1304-1319，1982)。用于昆蟲細(xì)胞的適當(dāng)?shù)膯幼拥膶?shí)例是多角體蛋白啟動子(US4，745，051 ；Vasuvedan 等，F(xiàn)EBS Lett. 311, (1992) 7-11), PlO 啟動子(J. M. Vlak 等，J. Gen. Virology (基因病毒學(xué)雜志)69，1988，第765-776頁)，苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒基本蛋白啟動子(Autographa californica polyhedrosis virus basic protein promoter)(EP 397485)，桿狀病毒即時早期基因I啟動子(US 5, 155,037 ；US 5，162，222)，或桿狀病毒39K延遲早期基因啟動子(US 5，155，037 ；US 5，162，222)。用于酵母宿主細(xì)胞中的適當(dāng)?shù)膯幼拥膶?shí)例包括來自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)255 (1980)，12073-12080 ;Alber 和 Kawasaki, J. Mol.Appl. Gen.(分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志)I (1982)，419-434)或醇脫氫酶基因(Young等，在Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (關(guān)于化學(xué)的微生物遺傳學(xué)改造)(HoiIaender 等編)，Plenum Press,紐約，1982)的啟動子，或 TPIl (US 4, 599, 311)或ADH2-4c (Russell 等，Nature (自然)304 (1983)，652-654)啟動子。 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的適當(dāng)?shù)膯幼拥膶?shí)例為，例如，ADH3啟動子(McKnight等，The EMBO J. (ΕΜΒ0雜志)4(1985) ,2093-2099)或tpiA啟動子。其它有用的啟動子的實(shí)例是來源于編碼米曲霉(A. oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α -淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A. awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)乙酰胺酶的基因。優(yōu)選的是TAKA-淀粉酶和gluA啟動子。適當(dāng)?shù)膯幼永缭贓P 238023和EP 383 779中提及。如果需要，編碼本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的DNA序列還可以可操作地連接到適當(dāng)?shù)慕K止子上,諸如人生長激素終止子(Palmiter等，Science (科學(xué))222,1983，第 809-814 頁)或 TPIl (Alber 和 Kawasaki，J. Mol. Appl. Gen.(分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志)1，1982，第 419-434 頁)或 ADH3 (McKnight 等，The EMBO J. (ΕΜΒ0 雜志)4，1985，第2093-2099頁)終止子。表達(dá)載體還可以包含位于啟動子下游和FAP序列本身插入位點(diǎn)的上游的一組RNA剪接位點(diǎn)。優(yōu)選的RNA剪接位點(diǎn)可以從腺病毒和/或免疫球蛋白基因獲得。表達(dá)載體中還包含位于插入位點(diǎn)下游的多腺苷化信號。特別優(yōu)選的多腺苷化信號包括來自SV40的早期或晚期多腺苷化信號(Kaufman和Sharp，同前)，來自腺病毒5Elb區(qū)的多腺苷化信號，人生長激素基因終止子(DeNoto等Nucl. Acids Res.(核酸研究)9 :3719_3730，
1981)或來自人FAP基因或牛FAP基因的多腺苷化信號。表達(dá)載體還可以包括非編碼的病毒前導(dǎo)序列，諸如腺病毒2三聯(lián)前導(dǎo)序列，其位于啟動子和RNA剪接位點(diǎn)之間；和增強(qiáng)子序列，諸如SV40增強(qiáng)子。為了將本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽導(dǎo)向宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號序列(也已知為前導(dǎo)序列，前原序列或前序列)。將分泌信號序列與編碼本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的DNA序列在正確的閱讀框中連接。分泌信號序列通常位于編碼所述肽的DNA序列的5'。分泌信號序列可以通常與所述蛋白相關(guān)或可以來自于編碼另一種分泌的蛋白的基因。對于從酵母細(xì)胞中分泌，分泌信號序列可以編碼任意信號肽，其確保將所表達(dá)的本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽有效導(dǎo)向細(xì)胞的分泌途徑。信號肽可以是天然存在的信號肽，或其功能部分，或其可以是合成的肽。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)男盘栯臑棣烈蜃有盘栯?參見US 4，870，008)，小鼠唾液淀粉酶的信號肽(參見O. Hagenbuchle等，Nature (自然)289，1981，第643-646頁)，修飾的羧肽酶信號肽(參見L. A. Valls等，Cell (細(xì)胞)48，1987，第887-897頁)，酵母BARl信號肽(參見WO 87/02670)，或酵母天冬氨酸蛋白酶3 (YAP3)信號肽(參見 M. Egel-Mitani 等，Yeast 6，1990，第 127-137 頁)。對于在酵母中的有效分泌，還可以將編碼前導(dǎo)肽的序列插入在信號序列的下游且在編碼本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的DNA序列的上游。前導(dǎo)肽的功能是允許所表達(dá)的肽被從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)導(dǎo)向高爾基體并且進(jìn)一步至分泌小泡，從而分泌到培養(yǎng)基中(即，將本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽輸出到細(xì)胞壁外或至少通過細(xì)胞膜進(jìn)入到酵母細(xì)胞的周質(zhì)空間)。前導(dǎo)肽可以是酵母α因子前導(dǎo)(其應(yīng)用記述在例如US 4，546，082，US 4,870，008，EP 16 201，EP 123 294，EP 123 544 和 EP 163 529 中)。備選地，前導(dǎo)肽可以是合成的前導(dǎo)肽，認(rèn)為其不是天然存在的前導(dǎo)肽。合成的前導(dǎo)肽可以，例如，如WO89/02463 或 WO 92/11378 中所述構(gòu)建。 對于在絲狀真菌中的應(yīng)用，信號肽可以便利地來源于編碼曲霉屬淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因、編碼米赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶或柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶的基因。信號肽優(yōu)選地來源于編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。適當(dāng)?shù)男盘栯墓_在例如EP 238 023和EP215 594 中。對于在昆蟲細(xì)胞中的應(yīng)用，信號肽可以便利地來源于昆蟲基因(參見WO90/05783)，諸如鱗翅類煙草天蛾(Manduca sexta)脂肪動員激素前體信號肽(參見US5，023，328)。用于分別連接編碼本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的DNA序列、啟動子和任選的終止子和/或分泌信號序列，并將它們插入到包含復(fù)制所必需的信息的適當(dāng)?shù)妮d體中的步驟，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見，例如，Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)，Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約，1989)。轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞并且表達(dá)引入到細(xì)胞中的DNA序列的方法記述在，例如Kaufman 和 Sharp, J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)159 (1982)，601-621 ；Southern 和Berg, J. Mol. Appl. Genet.(分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志)I (1982)，327-341 ； Loyter 等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)79 (1982)，422-426 ；ffigler 等，Cell (細(xì)胞)14 (1978), 725 ;Corsaro和Pearson, Somatic Cell Genetics (體細(xì)胞遺傳學(xué))7 (1981),603, Graham和 van der Eb, Virology (病毒學(xué))52 (1973), 456 ;和 Neumann 等，EMB0J. (ΕΜΒ0 雜志)1(1982)，841-845 中?？寺〉腄NA序列通過例如，磷酸I丐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，Cell (細(xì)胞)14 :725-732，1978 ；Corsaro 和 Pearson, Somatic Cell Genetics (體細(xì)胞遺傳學(xué))7 :603-616,1981 ;Graham 和 Van der Eb, Virology (病毒學(xué))52d :456-467,1973)或電穿孔(Neumann等，EMBO J. (ΕΜΒ0雜志)1 =841-845,1982)引入到培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中。為了鑒定并且選擇表達(dá)外源DNA的細(xì)胞，通常將賦予可選擇表型的基因(可選擇的標(biāo)記)與目的基因或cDNA—起引入到細(xì)胞中。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記包括賦予藥物(諸如新霉素、潮霉素和甲氨蝶呤)抗性的基因?？蛇x擇的標(biāo)記可以是可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記。優(yōu)選的可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記是二氫葉酸還原酶(DHFR)序列。可選擇的標(biāo)記由Thilly綜述(Mammalian Cell Technology (哺乳動物細(xì)胞技術(shù))，Butterworth Publishers, Stoneham, MA,通過引用結(jié)合在本文中)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易的能夠選擇適當(dāng)?shù)目蛇x擇標(biāo)記?？蛇x擇的標(biāo)記可以在分離的質(zhì)粒上與目的基因同時引入到細(xì)胞中，或者它們可以在同一質(zhì)粒上引入到細(xì)胞中。如果在同一質(zhì)粒上，所述可選擇的標(biāo)記和目的基因可以處在不同啟動子或相同啟動子的控制之下，后一種排列產(chǎn)生雙順反子信使。這種類型的構(gòu)建體在本領(lǐng)域中是已知的(例如，，Levinson和Simonsen,U. S. 4, 713, 339)。也可以有利地將另外的DNA (已知為“載體DNA ” )添加到引入到細(xì)胞中的混合物中。在細(xì)胞已經(jīng)攝入該DNA后，它們在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長，典型地生長1-2天，開始表達(dá)目的基因。當(dāng)用在本文中時，術(shù)語“適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基”意指包含細(xì)胞生長和目的人Ficolin相關(guān)多肽表達(dá)所需要的營養(yǎng)物和其它成分的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖類、維生素、鹽、磷脂、蛋白和生長因子。然后，應(yīng)用藥物選擇來選擇以穩(wěn) 定方式表達(dá)所述可選擇標(biāo)記的細(xì)胞的生長。對于已經(jīng)轉(zhuǎn)染了可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記的細(xì)胞，可以增加藥物濃度，以選擇增加拷貝數(shù)目的克隆序列，由此增加表達(dá)水平。然后篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的克隆對目的人Ficolin相關(guān)多肽的表達(dá)。引入編碼本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的DNA序列的宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生翻譯后修飾的人多肽，并且包括酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。用于本發(fā)明的哺乳動物細(xì)胞系的實(shí)例為COS-UATCC CRL 1650)，幼倉鼠腎(BHK)和 293 (ATCC CRL 1573 ；Graham 等，J. Gen. Virol.(遺傳病毒學(xué)雜志)36 :59-72,1977)細(xì)胞系。優(yōu)選的 BHK 細(xì)胞系是 tk_tsl3 BHK 細(xì)胞系(Waechter 和 Baserga,Proc. Natl. Acad.Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)79 :1106-1110，1982，其通過弓I用結(jié)合于此)，以下稱為BHK570細(xì)胞。BHK 570細(xì)胞系已經(jīng)保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection, 12301 Parklawn Dr.，Rockville，Md. 20852)，ATCC 保藏號為 CRL 10314。。tk-tsl3 BHK細(xì)胞系也可從ATCC獲得，其保藏號為CRL 1632。另外，多種其他細(xì)胞系可以用在本發(fā)明中，包括大鼠H印I (大鼠肝細(xì)胞瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠H印11(大鼠肝細(xì)胞瘤；ATCCCRL 1548)，TCMK (ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1)，CHO (ATCC CCL 61)和 DUKX 細(xì)胞(Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)77 =4216-4220,1980)。適當(dāng)?shù)慕湍讣?xì)胞的實(shí)例包括酵母屬(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母屬(Schizosac-charomyces spp.)的細(xì)胞，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或Saccharomyces kluyveri的菌株。用異源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞并且由其生產(chǎn)異源多肽的方法記述在，例如，US 4, 599, 311,US 4, 931, 373,US 4，870，008，5，037，743，和 US 4, 845, 075中，所有這些通過引用結(jié)合于此。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通過可選擇的標(biāo)記確定的表型進(jìn)行選擇，所述表型通常是藥物抗性或在缺乏特定營養(yǎng)物(例如亮氨酸)的條件下生長的能力。用在酵母中的優(yōu)選載體是US 4，931，373中公開的POTl載體。編碼本發(fā)明的人Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽的DNA序列可以在信號序列之后，并且任選在前導(dǎo)序列之后，例如，如上述。適當(dāng)?shù)慕湍讣?xì)胞的其他實(shí)例為克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的菌株,諸如乳酸克魯維酵母(K. lactis),漢遜酵母屬(Hansenula),例如多形漢遜酵母(H. poIymorpha),或畢赤酵母屬(Pichia),例如巴斯德畢赤酵母(P. pastor is)(參見 Gleeson 等,J. Gen. Microbiol.(遺傳微生物學(xué)雜志)132，1986，第 3459-3465 頁；US 4，882，279)。其他真菌細(xì)胞的實(shí)例是絲狀真菌的細(xì)胞,例如，曲霉屬(Aspergillus spp.),鏈孢霉屬(Neurospora spp·),鍵刀菌屬(Fusarium spp.)或木霉屬(Trichoderma spp·),特別是米曲霉、構(gòu)巢曲霉或黑曲霉的菌株。應(yīng)用曲霉屬進(jìn)行蛋白表達(dá)記述在，例如EP 272 277，EP 238 023, EP 184 438 中。尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)的轉(zhuǎn)化,例如，如 Malardier 等，1989，Gene (基因)78 :147-156所述進(jìn)行。例如，木霉屬的轉(zhuǎn)化可以如EP 244 234所述進(jìn)行。當(dāng)使用絲狀真菌作為宿主細(xì)胞時，其可以轉(zhuǎn)化本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，便利地通過將DNA構(gòu)建體整合到宿主染色體中而獲得重組宿主細(xì)胞。該整合通常認(rèn)為是有利的，因?yàn)镈NA序列更可能穩(wěn)定地保持在細(xì)胞中。將DNA構(gòu)建體整合到宿主染色體中可以按照常規(guī)方法進(jìn)行，例如，通過同源或異源重組進(jìn)行。昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和其中異源多肽的產(chǎn)生可以如US 4，745，051 ；US4, 879，236 ；US
5,155,037 ；5, 162, 222 ；EP 397，485所述進(jìn)行，所有這些通過引用結(jié)合于此。用作宿主的昆蟲細(xì)胞系可以適當(dāng)?shù)貫轺[翅目(Lepidoptera)細(xì)胞系，諸如草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細(xì)胞(參見US 5,077,214)。培養(yǎng)條件可以適當(dāng)?shù)厝缋鏦O 89/01029或WO 89/01028中所述，或前文提及的任意參考文獻(xiàn)中所述。然后，在允許人Ficolin相關(guān)多肽表達(dá)的條件下，在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，之后可以從培養(yǎng)物中回收全部或部分得到的肽。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于宿主細(xì)胞生長的任意常規(guī)培養(yǎng)基，諸如最小培養(yǎng)基或包含適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充物的復(fù)雜培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得，或可以按照公布的配方制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的目錄中)。然后，可以通過常規(guī)步驟從培養(yǎng)基中回收由所述細(xì)胞產(chǎn)生的人Ficolin相關(guān)多肽，包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞，通過鹽(例如硫酸銨)沉淀上清或?yàn)V過物的蛋白質(zhì)樣成分，通過各種層析方法純化，例如離子交換層析，凝膠過濾層析，親和層析等，這取決于所討論的多肽的類型?？梢岳棉D(zhuǎn)基因動物技術(shù)來生產(chǎn)本發(fā)明的Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽。優(yōu)選地在雌性哺乳動物宿主的乳腺中產(chǎn)生所述蛋白。在乳腺中表達(dá)隨后將目的蛋白分泌到乳中克服了從其它來源分離蛋白所遇到的許多困難。乳容易收集，可以大量獲得，并且生物化學(xué)充分表征。此外，主要的乳蛋白以高濃度存在于乳中(典型地約I至15g/l)。從商業(yè)觀點(diǎn)來看，清楚地，優(yōu)選使用具有高的乳產(chǎn)率的物種作為宿主。盡管可以使用較小的動物，如小鼠和大鼠(并且在驗(yàn)證證據(jù)階段是優(yōu)選的)，但是優(yōu)選使用家畜哺乳動物，包括但不限于，豬、山羊、綿羊和牛。特別優(yōu)選綿羊，原因在于諸如這一物種先前的轉(zhuǎn)基因史、乳產(chǎn)率、成本和用于收集綿羊奶的設(shè)備的容易獲得性的因素(參見，例如，W088/00239，關(guān)于影響宿主物種選擇的因素的比較)。通常理想地選擇已經(jīng)關(guān)于乳業(yè)用途育種的宿主動物品種，諸如東弗里斯蘭綿羊(East Friesland sheep),或近來通過轉(zhuǎn)基因品 系育種引入奶場中的牛羊。在任一種事件中，應(yīng)該使用已知的、健康狀況良好的動物。
為了獲得在乳腺中的表達(dá)，使用來自乳蛋白基因的轉(zhuǎn)錄啟動子。乳蛋白基因包括編碼酪蛋白(參見U. S. 5，304，489)、β乳球蛋白、a乳清蛋白、和乳清酸性蛋白的那些基因。β乳球蛋白(BLG)啟動子是優(yōu)選的，在綿羊β乳球蛋白基因的情形中，通常使用該基因5'側(cè)連序列至少最近的406bp的區(qū)域，盡管優(yōu)選較大的5'側(cè)連序列部分，至多約5kbp，如包含5'側(cè)連啟動子和β乳球蛋白基因的非編碼部分的 4. 25kbp DNA片段(參見Whitelaw等，Biochem. J.(生物化學(xué)雜志)286 :31 39(1992))。來自其他物種的相似的啟動子DNA片段也是合適的。β乳球蛋白基因的其他區(qū)域也可以結(jié)合到構(gòu)建體中，待表達(dá)的基因的基因組區(qū)域也可以結(jié)合到構(gòu)建體中。在本領(lǐng)域中通常接受的是，缺少內(nèi)含子的構(gòu)建體，例如，與包含所述DNA序列的那些相比,表達(dá)很差(參見，Brinster等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)85 :836 840(1988) ;Palmiter 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)88:478 482(1991) ;Whitelaw 等，Transgenic Res.(轉(zhuǎn)基因研究)1:3 13(1991)；WO 89/01343 ;和冊91/02318，它們分別通過引用結(jié)合于此)。在這一點(diǎn)上，通常優(yōu)選的是，在可能時，使用包含編碼目的蛋白或多肽的基因的全部或一些天然內(nèi)含子，因此優(yōu)選進(jìn)一步包含至少一些來自例如β乳球蛋白基因的內(nèi)含子。一個這樣的區(qū)域是來自綿羊β乳球 蛋白基因的3'非編碼區(qū)的提供內(nèi)含子剪接和RNA多腺苷化的DNA序列。當(dāng)置換基因的天然3'非編碼序列時，該綿羊β乳球蛋白片段可以提高并且穩(wěn)定目的蛋白或多肽的表達(dá)水平。在其他實(shí)施方案中，在FAP序列的起始ATG周圍的區(qū)域用來自乳特異性蛋白基因的相對應(yīng)序列替換。這樣的替換提供推定的組織特異性起始環(huán)境，從而增強(qiáng)表達(dá)。盡管可以替換較小的區(qū)域，但是便利地用例如BLG基因替換完整的FAP前原和5'非編碼序列。對于在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)本發(fā)明的Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽，將編碼FAP的DNA片段可操作地連接到其表達(dá)所需要的另外的DNA片段上，從而產(chǎn)生表達(dá)單位。所述另外的片段包括上文提及的啟動子，以及為轉(zhuǎn)錄終止和mRNA多腺苷化提供的序列。表達(dá)單位另外包括編碼分泌信號序列的DNA片段，其可操作地與編碼修飾的FAP的片段連接。分泌信號序列可以是天然FAP分泌信號序列或可以是另一種蛋白(如乳蛋白)的分泌信號序列(參見，例如，von Heijne, Nucl. Acids Res.(核酸研究)14 :4683 4690 (1986);和 Meade等，U. S. 4，873，316，其通過引用結(jié)合于此)。盡管表達(dá)單位可以基本上通過任意序列連接而構(gòu)建，但是用于轉(zhuǎn)基因單位的表達(dá)單位的構(gòu)建便利地通過將FAP序列插入到包含另外的DNA片段的質(zhì)粒或噬菌體載體中進(jìn)行。特別便利地提供包含編碼乳蛋白的DNA片段的載體，并且用FAP變體的編碼區(qū)替換乳蛋白的編碼區(qū)；由此產(chǎn)生包括乳蛋白基因的表達(dá)控制序列的基因融合體。在任意情形中，表達(dá)單位克隆到質(zhì)?；蚱渌d體中促進(jìn)FAP序列的擴(kuò)增。擴(kuò)增便利地在細(xì)菌(例如大腸桿菌)宿主細(xì)胞中進(jìn)行，由此該載體典型地包括在細(xì)菌宿主細(xì)胞中起作用的復(fù)制起點(diǎn)和可選擇的標(biāo)記。然后，將表達(dá)單位引入到所選宿主物種的受精卵(包括早期階段的胚胎)中。異源DNA的引入可以通過數(shù)種途徑中的一種完成，所述途徑包括顯微注射(例如美國專利號 4，873，191)，反轉(zhuǎn)錄病毒感染(Jaenisch, Science (科學(xué))240 1468 1474 (1988))或使用胚胎干(ES)細(xì)胞的位點(diǎn)定向整合(由Bradley等，Bio/Technology (生物技術(shù))10 534 539(1992)綜述)。然后，將卵植入到假孕雌性中的輸卵管或子宮中，并且允許發(fā)育成至足月。在其種系中攜帶引入的DNA的后代可以將該DNA以正常的、孟德爾方式傳遞給它們的后代，允許轉(zhuǎn)基因群體的發(fā)育。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的通用方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見，例如，General procedures for producing transgenic animals are known inthe art(see, for example, Hogan Manipulating the Mouse Embryo A LaboratoryManual (操作小鼠胚胎實(shí)驗(yàn)室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實(shí)驗(yàn)室),1986 ；Simons 等，Bio/Technology(生物技術(shù))6 :179 183(1988) ；ffall 等，Biol.Reprod.(生物學(xué)繁殖)32 :645 651 (1985) ；BuhIer 等，Bio/Technology (生物技術(shù))8 140143 (1990) ;Ebert 等,Bio/Technology (生物技術(shù))9 :835 838(1991) ;Krimpenfort 等，Bio/Technology (生物技術(shù))9 :844 847(1991) ;Wall 等，J. Cell. Biochem.(細(xì)胞生物化學(xué)雜志)49:113 120(1992) ；U. S. 4, 873, 191 ；U. S. 4, 873, 316 ；W0 88/00239,WO 90/05188,WO92/11757 ;和GB87/00458)。用于將外源DNA序列引入到哺乳動物和它們的種系細(xì)胞中的技術(shù)最初在小鼠中開展(參見，例如，Gordon等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)77:7380 7384(1980) ;Gordon 和 Ruddle，Science (科學(xué))214 :1244 1246(1981)；Palmiter 和 Brinster, Cell (細(xì)胞)41 :343345 (1985) ；Brinster 等,Proc. Natl. Acad. Sci.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)82 :4438 4442(1985);和Hogan等(同前))。這些技術(shù)隨后適用于更大的動物，包括家畜物種(參見，例如，WO 88/00239，WO 90/05188，和W092/11757 ； 和Simons等,Bio/Technology (生物技術(shù))6 :179 183(1988))?？偨Y(jié)來說，目前用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠或家畜的最有效的途徑中，按照建立的技術(shù)，將數(shù)百個線性目的DNA分子注射到受精卵的一個前核中。也可以使用將DNA注射到合子的細(xì)胞質(zhì)中。還可以利用在轉(zhuǎn)基因植物中的生產(chǎn)。表達(dá)可以是普遍的或?qū)蛱囟ǖ钠鞴?，諸如塊莖(參見，Hiatt, Nature (自然)344 :469 479(1990) ;Edelbaum 等，J. Interferon Res.(干擾素研究雜志)12 :449 453(1992) ;Si jmons 等，Bio/Technology (生物技術(shù))8 :217221(1990) JPEP O 255 378)FAP 純化本發(fā)明的Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽可以從細(xì)胞培養(yǎng)基或乳中回收。本發(fā)明的Ficolin相關(guān)多肽和其它多肽可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法純化，包括但不限于，層析(例如，離子交換，親和性，疏水，層析聚焦，和大小排阻)，電泳方法(例如，制備級等電聚焦(IEF),差別性溶解性(例如,硫酸銨沉淀)，或提取(參見,例如,Protein Purification (蛋白純化)，J.-C. Janson 和 Lars Ryden 編，VCH Publishers,紐約，1989)。優(yōu)選地，它們可以通過在抗-FAP抗體柱上的親和層析進(jìn)行純化。另外的純化可以通過常規(guī)化學(xué)純化手段實(shí)現(xiàn)，諸如高效液相色譜。其他純化方法，包括檸檬酸鋇沉淀，是本領(lǐng)域中已知的，并且可以應(yīng)用于純化本文所述的新型Ficolin相關(guān)多肽和其他多肽(參見,例如，Scopes, R. , ProteinPurification (蛋白純化)，Springer-Verlag, N. Y.，1982)。為了治療目的，優(yōu)選本發(fā)明的Ficolin相關(guān)多肽和其他多肽是基本上純的。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的(Ficolin相關(guān)多肽)和其他多肽純化至至少約90-95 %的均質(zhì)性，優(yōu)選至至少約98 %的均質(zhì)性。純度可以通過例如凝膠電泳和氨基端氨基酸測序評估。術(shù)語“分離的多肽”是指本發(fā)明的多肽⑴已經(jīng)與其天然相關(guān)的至少約50%的多核苷酸、脂質(zhì)、糖類或其他物質(zhì)(即污染物)分離。優(yōu)選地，所述分離的多肽基本上不含任意其他污染多肽或其他在其天然環(huán)境中存在的污染物，其將干擾其治療、診斷、預(yù)防或研究應(yīng)用。術(shù)語“微生物”用在本文中是指細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌、原生生物；微型植物和動物(諸如綠藻或浮游生物)，渦蟲和變形蟲。該定義包括病原體微生物。測定法關(guān)于SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡的通用步驟如供應(yīng)商推薦，使用NuPAGE 系統(tǒng)(Invitrogen)，用不連續(xù)的緩沖液，在10%或4-12% (w/v)Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。蛋白質(zhì)印跡使用聚偏氟乙烯膜(PVDF-HyBond, GE-healthcare，Hilleroed，丹麥，貨號 RPN303F)，2 μ g/ml 生物素標(biāo)記的一級單克隆抗體和通過在PBS，0. 05%吐溫20中I : 1500稀釋的HRP綴合的鏈霉抗生物素蛋白(P0397，Dako, Glostrup，丹麥)進(jìn)行二級顯現(xiàn)而進(jìn)行。將膜用在丙酮和在50mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5中的O. 015% H2O2中的O. 04% 3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma-aldrich,fcoenby，丹麥，貨號 A5754-100G)顯影。共免疫沉淀甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)血清復(fù)合物的免疫沉淀將Iml正常人血清I : I稀釋在TBS (IOmM Tris,140mM NaCl，pH 7.5)中，并且在4°C用5yg MBL特異性小鼠單克隆抗體 Hyb 131-11 (Bioporto, Gentoffe,丹麥)顛倒溫育 I 小時。Ficolin-2血清復(fù)合物的免疫沉淀將O. 5ml正常人血清I : I稀釋在TBS(IOmMTris,140mM NaCl，pH 7.5)中，并且在4°C用5yg Ficolin-2特異性小鼠單克隆抗體Hyb219 (Munthe-Fog L,等)顛倒溫育I小時。
Ficolin-3血清復(fù)合物的免疫沉淀將O. 2ml正常人血清I : I稀釋在TBS(IOmMTris,140mM NaCl，pH 7.5)中，并且在4°C用5yg Ficolin-3特異性小鼠單克隆抗體Hyb334 (Munthe-Fog L,等)顛倒溫育I小時。免疫復(fù)合物沉淀用綿羊抗小鼠IgG綴合的磁dynal珠(Dynal-Invitrogen,貨號112. 02D)進(jìn)行在用血清和一級抗體(如上文)溫育后，添加5xl07個綿羊抗小鼠綴合的磁dynal珠，并且在4°C溫育30分鐘。將珠子磁力分離并且用TBS-吐溫-Ca2+(10mM Tris,140mM NaCl，0. 05%吐溫，5mM CaCl2, pH 7.5)洗滌3次，最后在SDS-上樣緩沖液中煮沸，并且通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)印跡使用生物素標(biāo)記的單克隆抗體mAb-8B3 (與MASP-I和-3共有的重鏈/A鏈上的表位反應(yīng))進(jìn)行。FAP的免疫親和純化按供應(yīng)商推薦，將IOmg mAb_8B3 (與FAP、MASP-I和-3共有的重鏈/A鏈上的表位反應(yīng))或IOmg兔多克隆抗FAP抗體綴合到CNBr活化的瓊脂糖(GE-healthcare，Hilleroed，丹麥，貨號17-0430-01)上并且填充到柱子上。從血清純化將150ml正常人血清的匯聚液用TBS+0. 5M NaCl+10mM EDTA(IOmMTris,640mM NaCl,10mM EDTA，pH 7.5)1 I稀釋，并且上樣到上述柱上。將該柱用11TBS+0. 5M NaCl+10mM EDTA洗滌，并且用IM甘氨酸-HCl，pH 2. 5洗脫Iml級分，并且通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析,蛋白質(zhì)印跡使用生物素標(biāo)記的單克隆抗體mAb-8B3進(jìn)行。重組FAP的純化將來自表達(dá)重組FAP (rFAP)的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)的
2-3 I培養(yǎng)物上清(來自CHO無血清培養(yǎng)基/Gibco-Invitrogen，貨號12651-014)上樣到上述抗體柱上。將該柱用I. 5 1TBS+0. 5M NaCl+10mM EDTA洗滌，并且用IM甘氨酸-HCl，pH 2. 5洗脫Iml級分。洗脫的級分通過SDS-PAGE和考馬斯染色進(jìn)行分析。
FAP 的重組表達(dá)從Genscript (Genscript,New Jersey,美國)定購插入全長cDNA的 pcDNA5/FRT 載體(Invitrogen,貨號 V6010-20),并且與 pOG44 載體(Invitrogen,貨號V6005-20)共轉(zhuǎn)染到CHO Flp-In細(xì)胞系(Invitrogen，貨號R758-07)中，并且按供應(yīng)商推薦(Invitrogen)進(jìn)行選擇和克隆。將細(xì)胞生長在Freestyle CHO無血清培養(yǎng)基(Invitrogen,貨號12651-014)中，收集培養(yǎng)物上清并且進(jìn)行分析。單克隆和多克隆抗體的產(chǎn)生按供應(yīng)商推薦(Thermo Fisher Scientific/Pierce, Illinois,美國),使用半胱氨酸偶聯(lián)方法,用間-馬來酰亞胺苯甲酰基_N_輕基琥拍酰亞胺酯，將FAP特異性17個C-端殘基的肽構(gòu)建體(定購自Genscript, New Jersey,美國)偶聯(lián)到破傷風(fēng)和白喉的類毒素形式上。6只小鼠和2只兔每只用吸附到Al (OH) 3和弗氏不完全佐劑上的25 μ g抗原免疫3次(間隔14天)。利用ELISA，使用偶聯(lián)到蛋白載體上的不同F(xiàn)AP肽，評估多克隆抗體滴度。
在第一次、第二次和第三次免疫后14天收集多克隆兔抗血清( IOml)。兩只小鼠用于生產(chǎn)單克隆抗體。在融合前4天，小鼠接受靜脈內(nèi)注射25 μ g抗原。融合按他處所述進(jìn)行(Kohler, G.和 C. Milstein. 1975. Continuous cultures of fusedcells secreting antibody of predefined specificity(分泌預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng))· Nature (自然)256 =495-497)。克隆通過針對偶聯(lián)到不同蛋白載體上的肽的差別性ELISA篩選進(jìn)行選擇。功能性補(bǔ)體測定法使用Ficolin-3和MBL純合子缺陷型血清來研究FAP功能。Ficolin-3 測定法將 Maxisorp 平板(NUNC，Roskilde，丹麥，貨號 439454)在 4°C在包被緩沖液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.5)中用5 μ g/ml乙?；呐Ｑ灏椎鞍装?2小時。在巴比妥/吐溫緩沖液(4mM巴比妥，145mM NaCl, 2mM CaCl2, ImM MgCl2, pH
7.4+0. 05%吐溫)中封閉/洗滌4次后，加入在巴比妥/吐溫緩沖液中500ng/ml的重組人Ficolin-3，并且在20°C搖動溫育I. 5小時。在巴比妥/吐溫緩沖液中洗滌平板兩次后，在分離的平板的第一維度上，加入連續(xù)稀釋的作為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清的重組FAP，人MASP-1,-2或-3，并且在20°C搖動溫育I小時。在巴比妥/吐溫緩沖液中洗滌平板兩次后，在平板的第二維度上，加入連續(xù)稀釋的Ficolin-3或MASP-2缺陷型血清，并且在37°C溫育30分鐘。在巴比妥/吐溫緩沖液中洗滌平板四次后，通過在20°C用I : 2000稀釋的針對人C4c的多克隆兔抗體(Dako，Glostrup，丹麥貨號Q0369)溫育I小時，然后4次洗滌步驟，并且在20°C用辣根過氧化物酶綴合的豬抗兔抗體(Dako，Glostrup，丹麥貨號P0399)溫育45分鐘而測量補(bǔ)體因子C4的沉積。通過將平板用100 μ I/孔溶解在具有0. 12%。(ν/V) H2O2的檸檬酸緩沖液(35mM檸檬酸，65mM Na2PO4, pH 5)中的鄰-苯二胺(OPD) (O. 4mg/ml)顯色而獲得信號。用IM H2SO4終止酶反應(yīng)，并且使用V-max動力學(xué)-讀數(shù)儀(分子裝置(Molecular Devices))在 490nm-650nm 測量光學(xué)密度(OD)水平。甘露糖結(jié)合凝集素測定法將Maxisorp平板(NUNC，Roskilde,丹麥，貨號439454)在 4°C在包被緩沖液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.5)中用 10 μ g/ml 甘露聚糖(Sigma-aldrich,Broenby,丹麥,貨號M7504-1G)包被12小時。在巴比妥/吐溫緩沖液(4mM 巴比妥，145mMNaCl，2mM CaCl2, ImM MgCl2,pH 7.4+0. 05%吐溫)中封閉 /洗滌4次后，加入在巴比妥/吐溫緩沖液中0. 5 μ g/ml的重組人甘露糖結(jié)合凝集素，并且在20°C搖動溫育I. 5小時。在巴比妥/吐溫緩沖液中洗滌平板兩次后，在分離的平板的第一維度上，加入連續(xù)稀釋的作為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清的重組FAP，人MASP-I，-2或-3，并且在20°C搖動培養(yǎng)I小時。在巴比妥/吐溫緩沖液中洗滌平板兩次后，在平板的第二維度上，加入連續(xù)稀釋的MBL或MASP-2缺陷型血清，并且在37°C溫育45分鐘。在巴比妥/吐溫緩沖液中洗滌平板四次后，通過在20°C用I : 2000稀釋的針對人C4c的多克隆兔抗體(Dako，Glostrup，丹麥貨號Q0369)溫育I小時，然后4次洗滌步驟，并且在20°C用辣根過氧化物酶綴合的豬抗兔抗體(Dako，Glostrup，丹麥貨號P0399)溫育45分鐘而測量補(bǔ)體因子C4的沉積。通過將平板用100 μ I/孔溶解在具有O. 12%。(ν/ν)Η202的檸檬酸緩沖液(35mM檸檬酸，65mMNa2PO4,pH 5)中的鄰-苯二胺(OPD) (O. 4mg/ml)顯色而獲得信號。用IM H2SO4終止酶反應(yīng)，并且使用V-max動力學(xué)-讀數(shù)儀(分子裝置(Molecular Devices))在490nm-650nm測量光學(xué)密度(OD)水平。基因分型測定法可以進(jìn)行不同的基因分型測定法，其中使用生物學(xué)測定法確定個體中的基因型?？梢允褂貌煌N類的測定法，諸如 基于雜交的方法O動態(tài)等位基因特異性雜交O分子指示標(biāo)ο SNP 微陣列·基于酶的方法ο限制性片段長度多態(tài)性ο基于PCR的方法ο Flap內(nèi)切核酸酶ο引物延伸。5’_ 核酸酶ο寡核苷酸連接酶測定法·基于DNA物理特性的其它擴(kuò)增后方法ο單鏈驗(yàn)證多態(tài)性ο溫度梯度凝膠電泳ο變性高效液相色譜O完整擴(kuò)增子的高分辨率解鏈ο SNPlex·測序施用和藥物組合物組合治療 本說明書中定義的ficolin相關(guān)多肽可以與選自Ficolin_l、2、3,和甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)的一種或多種蛋白同時或先后施用。因子可以提供在單一劑型中，其中所述單一劑型包含兩種化合物，或以部件試劑盒的形式提供，所述部件試劑盒包括作為第一單位劑型的ficolin相關(guān)多肽制劑和作為第二單位劑型的所述一種或多種其它化合物的制齊U。不管在整個說明書中何時提及第一或第二或第三單位劑量等，這不表示施用的優(yōu)選次序，而是僅為了便利的目的這樣提及。
ficolin相關(guān)多肽制劑和一種或多種其它化合物的制劑“同時”給藥意指施用處在單一劑型中的化合物，或施用第一藥劑，然后施用第二藥劑，時間間隔不超過15分鐘，優(yōu)選10分鐘，更優(yōu)選5分鐘，更優(yōu)選2分鐘。任何一種因子可以最先施用?！跋群蟆苯o藥意指施用第一藥劑，然后施用第二藥劑，時間間隔超過15分鐘。兩種單位劑型中的任一種可以最先施用。優(yōu)選地，兩種產(chǎn)物通過相同的靜脈內(nèi)途徑注射。本發(fā)明的另一個目的是提供一種藥物制劑，其包含以O(shè)mg/ml至lmg/ml的血清/血漿濃度存在的ficolin相關(guān)多肽，并且其中所述制劑具有2. 0-10. O的pH。所述制劑可以進(jìn)一步包含緩沖劑系統(tǒng)、防腐劑、等滲劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述藥物制劑是水性制劑，即包含水的制劑。所述制劑典型地是溶液或混懸液。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述藥物制劑是水溶液。術(shù)語“水性制劑”定義為包含至少50% w/w的水的制劑。同樣地，術(shù)語“水溶液”定義為包含至少50% w/w的水的溶液，術(shù)語“水性混懸液”定義為包含至少50% w/w的水的混懸液。在其它實(shí)施方案中，所述藥物制劑是冷凍干燥的制劑，在使用前醫(yī)師或患者向其 中加入溶劑和/或稀釋劑。在其它實(shí)施方案中，所述藥物制劑是不需要預(yù)先溶解即時使用的干燥的制劑(例如冷凍干燥或噴霧干燥)。在另一個方面中，本發(fā)明涉及包含ficolin相關(guān)多肽的水溶液、和緩沖劑的藥物制劑，其中ficolin相關(guān)多肽以Ο-lmg/ml或以上的血清/血漿濃度存在，并且其中所述制劑具有約2. O-約10. O的pH。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，制劑的pH選自由下列組成的列表2. 0，2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5,3. 6,3. 7,3. 8,3. 9,4. 0,4. I,4. 2，4. 3，4. 4，4. 5，4. 6，4. 7，4. 8，4. 9，5. 0，5. I，5. 2，5. 3，5. 4，5. 5，5. 6，5. 7，5. 8，5. 9，6. 0，
6.I，6. 2，6. 3，6. 4，6. 5，6. 6，6. 7，6. 8，6. 9，7. 0，7. I，7. 2，7. 3，7. 4，7. 5，7. 6，7. 7，7. 8，7. 9，
8.O，8. I，8. 2，8. 3，8. 4，8. 5，8. 6，8. 7，8. 8，8. 9，9. O，9. I，9. 2，9. 3，9. 4，9. 5，9. 6，9. 7，9. 8，
9.9，和 10. O0在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，緩沖劑選自由下列組成的組乙酸鈉，碳酸鈉，檸檬酸鹽，甘氨酰甘氨酸，組氨酸，甘氨酸，賴氨酸，精氨酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，磷酸鈉，和三羥甲基氨基甲烷，N-二(羥乙基)甘氨酸，三(羥甲基)甲基甘氨酸，蘋果酸，琥珀酸鹽，馬來酸，延胡索酸，酒石酸，天冬氨酸或它們的混合物。這些具體緩沖液中的每一種組成本發(fā)明的備選實(shí)施方案。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含藥用防腐劑。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述防腐劑選自由下列組成的組苯酚，鄰甲酚，間甲酚，對甲酚，對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸丙酯，2-苯氧乙醇，對羥基苯甲酸丁酯，2-苯基乙醇，苯甲醇，氯代丁醇，和thiomeiOsal，溴硝丙二醇，苯甲酸，咪脲，氯己定，脫氫乙酸鈉，氯甲酚，對羥苯甲酸乙酯，節(jié)索氯銨(benzethonium chloride),氯苯甘醚(chlorphenesine, 3p-(氯苯氧基丙烷)-1，2_ 二醇)或它們的混合物。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，防腐劑以0. lmg/ml至20mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，防腐劑以0. lmg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，防腐劑以5mg/ml至10mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，防腐劑以10mg/ml至20mg/ml的濃度存在。這些具體的防腐劑中的每一種組成本發(fā)明的一個備選實(shí)施方案。防腐劑在藥物組合物中的應(yīng)用對于專業(yè)人員來說是公知的。為方便，參考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓制藥科學(xué)和實(shí)踐)，第19版，1995。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含等滲劑。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述等滲劑選自由下列組成的組鹽(例如氯化鈉)，糖或糖醇，氨基酸(例如L-甘氨酸，L-組氨酸，精氨酸，賴氨酸，異亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，蘇氨酸)，糖醇(例如甘油(丙三醇)，1，2_丙二醇(丙二醇)，1，3_丙二醇，1，3_ 丁二醇)，聚乙二醇(例如PEG400)，或它們的混合物?？梢允褂萌我獾奶?，諸如單糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括，例如，果糖，葡萄糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麥芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，葡聚糖，芽霉菌糖，糊精，環(huán)糊精，可溶淀粉，羥乙基淀粉和羧甲纖維素鈉。在一些實(shí)施方案中，糖添加物是鹿糖。糖醇定義為具有至少一個-OH基團(tuán)的C4-C8碳水化合物(hydrocarbon),并且包括，例如，甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇、和阿拉伯糖醇。在一些實(shí)施方案中，所述糖醇是甘露醇。上文提及的糖或糖醇可以單獨(dú)或組合使用。對所用的量沒有固定的限制，只要所述糖或糖醇在液體制劑中可溶并且沒有不利地影響使用本發(fā)明的方法所獲得的穩(wěn)定作用。在一些實(shí)施方案中，糖或糖醇濃度為約lmg/ml至約150mg/ml。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，等滲劑以lmg/ml至50mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，等 滲劑以lmg/ml至7mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，等滲劑以8mg/ml至24mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，等滲劑以25mg/ml至50mg/ml的濃度存在。這些具體的等滲劑中的每一種組成本發(fā)明的備選實(shí)施方案。等滲劑在藥物組合物中的應(yīng)用對于專業(yè)人員來說是公知的。為方便,參考Remington :The Science and Practiceof Pharmacy (雷明頓制藥科學(xué)和實(shí)踐)，第19版，1995。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含螯合劑。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、和天冬氨酸的鹽，以及它們的混合物。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，螯合劑以O(shè). lmg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，螯合劑以O(shè). lmg/ml至2mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，螯合劑以2mg/ml至5mg/ml的濃度存在。這些具體的螯合劑中的每一種組成本發(fā)明的備選實(shí)施方案。螯合劑在藥物組合物中的應(yīng)用對于專業(yè)人員來說是公知的。為方便，參考Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓制藥科學(xué)和實(shí)踐)，第 19 版，1995。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑在藥物組合物中的應(yīng)用對于專業(yè)人員來說是公知的。為方便,參考Remington :The Science andPractice of Pharmacy (雷明頓制藥科學(xué)和實(shí)踐)，第19版，1995。更具體地，本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定的液體藥物組合物，其治療活性成分包括在以液體藥物制劑存儲過程中可能表現(xiàn)出聚集物形成的多肽?！熬奂镄纬伞币庵付嚯姆肿又g的物理相互作用，其導(dǎo)致形成可能保持可溶的寡聚物，或形成從溶液中沉淀下來的大的可見的聚集物?！霸诖鎯^程中”意指液體藥物組合物或制劑在制備后不立即施用給受試者。相反，在制備后，將其包裝進(jìn)行存儲，以液體形式、以冷凍狀態(tài)、或以干燥形式存儲，之后重構(gòu)成液體形式或其它適于施用給受試者的形式。“干燥形式”意指液體藥物組合物或制劑通過冷凍干燥(即，凍干；參見，例如，Williams和Polli (1984) J. Parenteral Sci.Technol.(腸胃外科學(xué)技術(shù)雜志)38 48-59)、噴霧干燥(參見Masters (1991) Spray-DryingHandbook (噴霧干燥手冊)(第 5 版；Longman Scientific and Technical (朗曼科學(xué)技術(shù))，Essez,英國)，第 491-676 頁；Broadhead 等(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206;和 Mumenthaler 等(1994) Pharm. Res.(藥物研究)11 12-20)、或空氣干燥(Carpenter 和Crowe (1988) Cryobiology (低溫生物學(xué))25 :459-470 ;和 Roser (1991) Biopharm.(生物制藥)4 47-53)進(jìn)行干燥。在液體藥物組合物存儲過程中多肽形成聚集物可以不利地影響所述多肽的生物學(xué)活性，導(dǎo)致藥物組合物的治療功效損失。此外，聚集物形成可以引起其它問題，諸如當(dāng)使用輸注系統(tǒng)施用含有多肽的藥物組合物時，引起輸液管、膜或泵的堵塞。本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含足以減少組合物存儲過程中多肽的聚集物形成的量的氨基酸堿。“氨基酸堿”意指氨基酸或氨基酸組合，其中任何給定的氨基酸以其游離堿形式或以其鹽形式存在。當(dāng)使用氨基酸組合時，所有的氨基酸可以以其游離堿形式存在，所有可以以其鹽形式存在，或一些可以以其游離堿形式存在而另一些以其鹽形式存在。在一些實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明的組合物的氨基酸是攜帶帶電荷側(cè)鏈的那些，諸如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、和谷氨酸。在本發(fā)明的藥物組合物中可以存在特定氨基酸(例如，甘氨酸，甲硫氨酸，組氨酸，咪唑，精氨酸，賴氨酸，異亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，蘇氨酸以及它們的混合物)的任意立體異構(gòu)體(即，L，D，或DL異構(gòu)體)或這些立體異構(gòu)體的組合， 只要所述特定的氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在。在一些實(shí)施方案中，使用L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明的組合物還可以用這些氨基酸的類似物配制?！鞍被犷愃莆铩币庵冈诒景l(fā)明的液體藥物組合物存儲過程中導(dǎo)致減少多肽的聚集物形成的理想作用的天然存在氨基酸的衍生物。適當(dāng)?shù)木彼犷愃莆锇?，例如，氨基精氨酸、鳥氨酸和N-單以及L-精氨酸，適當(dāng)?shù)募琢虬彼犷愃莆锇ㄒ伊虬彼岷投×虬彼?buthionine)，適當(dāng)?shù)陌腚装彼犷愃莆锇⊿-甲基-L半胱氨酸。如使用其它氨基酸一樣，氨基酸類似物以其游離堿形式或其鹽形式結(jié)合在組合物中。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，氨基酸或氨基酸類似物組合使用，其足以防止或延遲蛋白的聚集。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，為了抑制甲硫氨酸殘基氧化為甲硫氨酸亞砜，當(dāng)作用為治療劑的多肽為包含至少一個易于發(fā)生這樣的氧化的甲硫氨酸殘基的多肽時，可以添加甲硫氨酸(或其它硫氨基酸或氨基酸類似物)。“抑制”意指甲硫氨酸氧化的種類隨時 間的積聚最少。抑制甲硫氨酸氧化導(dǎo)致多肽更多保持為其正確的分子形式。可以使用甲硫氨酸(L，D，或DL異構(gòu)體)的任意立體異構(gòu)體或它們的組合。加入的量應(yīng)該是足以抑制甲硫氨酸殘基氧化的量，從而使甲硫氨酸亞砜的量對于管理結(jié)構(gòu)來說是可以接受的。典型地，這意指所述組合物包含不超過約10%至約30%的甲硫氨酸亞砜。通常，這可以通過添加甲硫氨酸實(shí)現(xiàn)，從而使添加的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基的比例在約I : I至約1000 I的范圍內(nèi)，諸如10 I至約100 I的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑選自高分子量聚合物或低分子量化合物的組。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG 3350)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮，羧基-/羥基纖維素或它們的衍生物(例如HPC，HPC-SL, HPC-L和HPMC)，環(huán)糊精，含硫物質(zhì)，如單硫甘油，巰基乙酸和2-甲基硫代乙醇，和不同的鹽(例如氯化鈉)。這些具體的穩(wěn)定劑中的每一種組成本發(fā)明的備選實(shí)施方案。所述藥物組合物還可以包含另外的穩(wěn)定試劑，其進(jìn)一步增強(qiáng)其中的治療活性多肽的穩(wěn)定性。本發(fā)明特別感興趣的穩(wěn)定試劑包括，但不限于，甲硫氨酸和EDTA，其保護(hù)多肽抗甲硫氨酸氧化，和非離子表面活性劑，其保護(hù)多肽抗與凍融或機(jī)械剪切相關(guān)的聚集。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述制劑進(jìn)一步包含表面活性劑。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述表面活性劑選自去污劑，乙氧基化蓖麻油，聚乙二醇化甘油酯，乙?；视蛦熙ィ嚼嫣谴贾舅狨?，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆如Pluronic F68,泊洛沙姆188和407，Triton X-100)，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯和聚乙烯衍生物，如烷基化和烷氧基化衍生物(吐溫，例如吐溫-20，吐溫-40，吐溫-80和Bri j-35)，單甘油酯或其乙氧基化衍生物，甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物，醇，甘油，凝集素和磷脂(例如，磷脂酰絲氨酸，磷酯酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，雙磷脂酰甘油和鞘磷脂)，磷脂衍生物(例如，二棕櫚酰磷脂酸)和溶血磷脂(例如，棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸和乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸的I-?；?sn-甘油-3-磷酸酯)和溶血磷脂酰和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧(烷基醚)_衍生物，例如，溶血磷脂酰膽堿的月桂酰和肉豆蘧酰衍生物，二棕櫚酰磷脂酰膽堿，和極性頭基團(tuán)的修飾，其為膽堿、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘油、肌醇、和帶正電荷的DODAC，DOTMA, DCP, BISHOP,溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酰蘇氨酸，和甘油磷脂(例如，腦磷脂)，甘油糖脂(例如， galactopyransoide),神經(jīng)鞘氨糖脂(例如，神經(jīng)酰胺，神經(jīng)節(jié)苷脂)，十二燒基磷酸膽堿，母雞卵溶血卵磷脂，梭鏈孢酸衍生物-(例如牛磺-二氫梭鏈孢酸鈉等)，長鏈脂肪酸和它們的C6-C12鹽(例如，油酸和辛酸)，酰基肉毒堿和衍生物，賴氨酸、精氨酸或組氨酸的N° -?；苌铮蛸嚢彼峄蚓彼岬膫?cè)鏈?；苌?，包含賴氨酸、精氨酸或組氨酸和中性或酸性氨基酸的的任意組合的二肽的N°-酰化衍生物，包含中性氨基酸和兩個帶電荷氨基酸的任意組合的三肽的N°-?；苌铮珼SS(多庫酯鈉，CAS注冊號[577-11-7])，多庫酯鈣，CAS注冊號[128-49-4])，多庫酯鉀，CAS注冊號[7491-09-0])，SDS (十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)，辛酸鈉，膽酸或它們的衍生物，膽汁酸及其鹽和甘氨酸或?；撬峋Y合物，烏索脫氧膽酸，膽酸鈉，脫氧膽酸鈉，?；悄懰徕c，甘膽酸鈉，N-十六烷基-N，N-二甲基-3-氨基-I-丙烷磺酸酯，陰離子(烷基-芳基-磺酸鹽)單價表面活性劑，兩性離子表面活性劑(例如，N-燒基-N, N-二甲基銨基-I-丙燒橫酸酯(N-alkyl-N, N-dimethylammonio-1-propanesulfonates) ,3-膽胺酸-I-丙基二甲基銨基-I-丙燒橫酸酯(3-cholamido-l-propyIdimethylammonio-1-propanesulfonate),陽離子表面活性劑(季銨堿)(例如，十六燒基-三甲基溴化銨，十六烷基氯化吡啶鐵)，非離子表面活性劑(例如，十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)，poloxamines (例如，Tetronic’ s),其是通過向乙二胺連續(xù)添加環(huán)氧丙燒和環(huán)氧乙烷衍生的四官能嵌段共聚物，或者所述表面活性劑可以選自咪唑衍生物或其混合物的組。這些具體的表面活性劑中的每一種組成本發(fā)明的備選實(shí)施方案。表面活性劑在藥物組合物中的應(yīng)用對于專業(yè)人員來說是公知的。為方便，參考Remington The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓制藥科學(xué)和實(shí)踐)，第 19版，1995?？赡艿氖?，在本發(fā)明的肽藥物制劑中可以存在其它成分。所述另外的成分可以包括濕潤劑，乳化劑，抗氧化劑，填充劑，張力改性劑，螯合劑，金屬離子，油狀賦形劑，蛋白(例如，人血清白蛋白，明膠或蛋白)和兩性離子(例如，氨基酸，如甜菜堿，牛磺酸，精氨酸，甘氨酸，賴氨酸和組氨酸)。當(dāng)然，所述另外的成分，不應(yīng)該不利地影響本發(fā)明的藥物制劑的整體穩(wěn)定性。本發(fā)明的包含ficolin相關(guān)多肽的藥物組合物可以在數(shù)個位點(diǎn)施用給需要所述治療的患者，例如，在局部位點(diǎn)，例如，皮膚和黏膜位點(diǎn)，在旁路吸收的位點(diǎn)，例如，在動脈、靜脈、在心臟施用，和在涉及吸收的位點(diǎn)，例如，在皮膚中、在皮膚下、在肌肉中或在腹部施用。局部施用可以特別有利于治療與局部炎癥相關(guān)的病癥，諸如治療與燒傷相關(guān)的炎癥或與皮膚相關(guān)的其它病癥。因此，在一些實(shí)施方案中，施用通過局部施用進(jìn)行。在一些具體的實(shí)施方案中，眼用滴劑可以用于與眼睛有關(guān)的病癥，如角膜炎(keratitis)，如彌散性薄層狀角膜炎(diffuse lamellar keratitis, DLK)。
本發(fā)明的藥物組合物的施用可以通過數(shù)種施用途徑，例如，舌部，舌下，含服，口腔中，口服，在胃和腸中，鼻部，肺部，例如，通過細(xì)支氣管和肺泡或它們的組合，表皮，皮膚，經(jīng)皮，陰道，直腸，眼睛，例如，通過結(jié)膜，輸尿管，和腸胃外施用給需要所述治療的患者。本發(fā)明的組合物可以以數(shù)種劑型施用，例如，作為溶液，混懸液，乳液，微乳液，多層乳液，泡沫劑，軟膏，糊劑，膏藥，油膏，片劑，包衣片劑，清洗劑(rinses),膠囊,例如,硬明膠膠囊和軟明膠膠囊，栓劑，直腸膠囊，滴劑，凝膠，噴霧劑，粉劑，氣霧劑，吸入劑，眼用滴齊U，眼用軟膏，眼用清洗劑，陰道子宮托，陰道環(huán)，陰道藥膏，注射液，原位轉(zhuǎn)化溶液，例如原位膠化，原位固定，原位沉淀，原位結(jié)晶，輸注溶液，和植入物。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步混合在、或附著到藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)上，例如，通過共價、疏水和靜電相互作用混合或附著，從而進(jìn)一步增加ficolin相關(guān)多肽的穩(wěn)定性，增加生物利用度，增加溶解性，減少副作用，實(shí)現(xiàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的擇時療法，并且增加患者的依從性或任意這些的組合。載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)的實(shí)例包括，但不限于，聚合物，例如纖維素和衍生物，多糖，例如葡聚糖和衍生物，淀粉和衍生物，聚(乙烯醇)，丙烯酸和甲基丙烯酸聚合物，聚乳酸和聚乙醇酸和它們的嵌段共聚物，聚乙二醇，載體蛋白，例如白蛋白，凝膠，例如熱膠化系統(tǒng)，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的嵌段共聚合系統(tǒng)，膠束，脂質(zhì)體，微球體，納米顆粒，液態(tài)晶體和其分散液，L2相和其分散液，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的脂質(zhì)-水系統(tǒng)中的相變行為，聚合膠束，多層乳液，自乳化，自微乳化，環(huán)糊精及其衍生物，和樹狀聚體。本發(fā)明的組合物用在適于肺部施用ficolin相關(guān)多肽的固體、半固體、粉末和溶液制劑中，例如，使用測定的劑量吸入器、干粉吸入器和噴霧器施用，所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的裝置。本發(fā)明的組合物特別用在可控釋放、緩釋、延長釋放、延遲釋放和緩慢釋放藥物遞送系統(tǒng)的制劑中。更具體地，但是不限于，組合物用在腸胃外可控釋放和緩釋系統(tǒng)(兩個系統(tǒng)導(dǎo)致給藥次數(shù)的多倍減少)的制劑中，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。甚至更優(yōu)選的是皮下施用的可控釋放和緩釋系統(tǒng)。不限制本發(fā)明的范圍，有用的控制釋放系統(tǒng)和組合物的實(shí)例是水凝膠、油狀凝膠、液態(tài)晶體、聚合膠束、微球體、納米顆粒。產(chǎn)生用于本發(fā)明的組合物的可控釋放系統(tǒng)的方法包括，但不限于，結(jié)晶，縮合，共結(jié)晶，沉淀，共沉淀，乳化，分散，高壓均化，包封，噴霧干燥，微型包封，凝聚，溶劑蒸發(fā)以產(chǎn)生微球體，擠出和超臨界流體工序。通用參考文獻(xiàn)參考Handbook of PharmaceuticalControlled Release (藥物控制釋放手冊)(Wise, D. L.編· Marcel Dekker,紐約，2000)和 Drug and the Pharmaceutical Sciences (藥物和制藥科學(xué))第 99 卷ProteinFormulation and Delivery (蛋白配制和遞送)(MacNally,E. J.編· Marcel Dekker,紐約,2000)。藥物施用可以通過利用注射器、任選筆式注射器的皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行。備選地，腸胃外施用可以通過輸注泵進(jìn)行。另一種選擇是可以是用于以鼻或肺部噴霧形式施用ficolin相關(guān)多肽的溶液或混懸液的組合物。還有另一個選擇，本發(fā)明含有ficolin相關(guān)多肽的藥物組合物還可以適于經(jīng)皮施用，例如，通過無針注射或從貼片，任選離子電滲療法貼片施用，或經(jīng)黏膜施用，例如口腔施用。術(shù)語“穩(wěn)定的制劑”是指具有增加的物理穩(wěn)定性、增加的化學(xué)穩(wěn)定性或增加的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的制劑。術(shù)語蛋白制劑的“物理穩(wěn)定性”用在本文中是指蛋白因所述蛋白暴露于熱-機(jī)械壓力和/或與不穩(wěn)定界面和表面(如疏水表面和界面)相互作用而形成無生物學(xué)活性和/或不溶聚集物的傾向性。水性蛋白制劑的物理穩(wěn)定性在將填裝在適當(dāng)容器(例如，筒或小 瓶)中的制劑在不同溫度暴露于機(jī)械/物理壓力(例如，振蕩)不同時間期間后通過視覺檢驗(yàn)和/或濁度測量評估。制劑的視覺檢驗(yàn)以具有黑暗背景的清晰聚焦光進(jìn)行。制劑的濁度通過排序渾濁程度的視覺得分表征，例如，以0-3的等級進(jìn)行(沒有表現(xiàn)出渾濁的制劑對應(yīng)于視覺得分0，在日光下表現(xiàn)出可見渾濁的制劑對應(yīng)于視覺得分3)。相對于蛋白聚集，當(dāng)制劑在日光下表現(xiàn)出可見渾濁時，制劑分類為物理不穩(wěn)定的。備選地，制劑的濁度可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的簡單濁度測量進(jìn)行評估。水性蛋白制劑的物理穩(wěn)定性還可以使用分光鏡試劑或蛋白構(gòu)象狀態(tài)的探針進(jìn)行評估。探針優(yōu)選是優(yōu)先結(jié)合蛋白的非天然構(gòu)象異構(gòu)體的小分子。蛋白結(jié)構(gòu)的小分子分光鏡探針的一個實(shí)例是Thioflavin T。Thioflavin T是一種熒光染料，其廣泛用于檢測淀粉樣蛋白原纖維。存在原纖維以及可能的其它蛋白構(gòu)型時，Thioflavin T在與原纖維蛋白形式結(jié)合時產(chǎn)生在約450nm的新激發(fā)最大值和在約482nm的增強(qiáng)的發(fā)射。未結(jié)合的Thioflavin T在所述波長基本上沒有熒光。其它小分子可以用作蛋白結(jié)構(gòu)從天然狀態(tài)到非天然狀態(tài)變化的探針。例如，“疏水片(hydrophobic patch) ”探針優(yōu)先結(jié)合蛋白暴露的疏水片。疏水片通常包埋在天然狀態(tài)的蛋白的三級結(jié)構(gòu)中，但是當(dāng)?shù)鞍组_始解折疊或變性時暴露出來。這些小分子、分光鏡探針的實(shí)例是芳香、疏水染料，諸如antrhacene，吖啶，菲咯啉等。其它分光鏡探針是金屬-氨基酸復(fù)合物，如疏水氨基酸(如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、和纈氨酸等)的鈷金屬復(fù)合物。術(shù)語蛋白制劑的“化學(xué)穩(wěn)定性”用在本文中是指與天然蛋白結(jié)構(gòu)相比，導(dǎo)致形成具有潛在較小的生物學(xué)功效和/或潛在增加的免疫原特性的化學(xué)降解產(chǎn)物的蛋白結(jié)構(gòu)的化學(xué)共價變化。取決于天然蛋白的類型和性質(zhì)以及所述蛋白暴露的環(huán)境，可以形成多種化學(xué)降解產(chǎn)物?；瘜W(xué)降解的消除可能是最不可能完全避免的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在存儲和使用蛋白制劑的過程中，通常觀察到增加量的化學(xué)降解產(chǎn)物。大部分蛋白傾向于脫酰胺，其為谷氨?；蛱於０孵；鶜埢械膫?cè)鏈酰胺基團(tuán)水解形成游離羧酸的過程。其它降解途徑涉及形成高分子量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中兩種或多種蛋白分子通過轉(zhuǎn)酰胺和/或二硫化物相互作用彼此共價結(jié)合，導(dǎo)致形成共價結(jié)合的二聚體、寡聚體和多聚體降解產(chǎn)物(Stabilityof Protein Pharmaceuticals (蛋白質(zhì)制藥的穩(wěn)定性)，Ahern. T. J. & Manning M. C.，Plenum Press,紐約1992)。氧化(例如，甲硫氨酸殘基的氧化)可能是所提到的另一種蛋白降解變化。蛋白制劑的化學(xué)穩(wěn)定性可以通過在暴露于不同環(huán)境條件(例如，通常通過升高溫度而加速降解產(chǎn)物形成)后測量不同時間點(diǎn)的化學(xué)降解產(chǎn)物的量而評估。每種個體降解產(chǎn)物的量通常通過分離該降解產(chǎn)物而確定，降解產(chǎn)物的分離依賴于分子大小和/或電荷利用各種層析技術(shù)(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)進(jìn)行。因此，如上文所述，“穩(wěn)定的制劑”是指具有增加的物理穩(wěn)定性、增加的化學(xué)穩(wěn)定性或增加的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的制劑。通常，制劑必須在使用和存儲過程中直至達(dá)到產(chǎn)品有效期時是穩(wěn)定的(按照推薦使用和存儲條件)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，包含ficolin相關(guān)多肽的藥物制劑超過6周使用和超過3年存儲是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，包含ficolin相關(guān)多肽的藥物制劑超過4周使用和超過3年存儲是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，包含ficolin相關(guān)多肽的藥物制劑超過4周使用和超過兩年存儲是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，包含ficolin相關(guān)多肽的藥物制劑超過2周使用和超過兩年存儲是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案如上述，本發(fā)明涉及分離的ficolin相關(guān)多肽以及包含氨基酸序列SEQID N0:4的多肽或其變體或免疫學(xué)片段。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是基本上純的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽能夠與甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)締合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽能夠與ficolin-1, ficolin-2,或ficolin-3中的任一種相締合。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽能夠與Clq，肺表面活性蛋白SP_A和/或SP_D，和細(xì)胞內(nèi)膠原樣防御分子，諸如CLL-Il中的任一種相締合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽能夠與特異性接受體蛋白，諸如特異性受體相
鋪A
φ π O在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ NO 3的氨基酸序列20-297、或其功能性變體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ NO 1的氨基酸序列20-380、或其功能性變體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列16-296或其功能性變體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽在非還原條件下在SDS-PAGE上具有約40kDa的
分子量。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽在與選自SEQ NO :1的49和178的位置相對應(yīng)的一個或兩個氨基酸處被N-連接糖基化。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是重組蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是同型二聚體形式的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQ ID NO I的氨基酸序列20-380組成。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列或其變體或免疫學(xué)片段。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQ ID NO :4、或其變體或免疫學(xué)片段組成。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽介導(dǎo)瀕死細(xì)胞或死亡細(xì)胞、和/或細(xì)胞碎片的吞噬，所述瀕死細(xì)胞或死亡細(xì)胞諸如凋亡細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽介導(dǎo)微生物的吞噬。在一些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體是多克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有與具有序列同源性的其它蛋白相似的活性，所述具有序列同源性的其它蛋白如吞沒銜接蛋白(GULP)。在一些實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸分子包含與SEQ NO 2的序列具有至少70%同一'丨生的核苷酸序列。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是哺乳動物來源的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞選自由CHO細(xì)胞、HEK細(xì)胞和BHK細(xì)胞組成的組。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于治療與炎癥、凋亡和/或自體免疫性相關(guān)的任意適應(yīng)證。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于治療任意自體免疫性病癥，諸如艾迪生病(Addison, s disease),自體免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia),自體免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis),局限性回腸炎(Crohn' s disease),格雷夫斯病(Graves' disease),吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome),系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE),狼瘡性腎炎(lupus nephritis),多發(fā)性硬化病(multiple sclerosis),重癥肌無力(myasthenia gravis),銀屑病(psoriasis),原發(fā)性膽汁性肝硬變(primary biliary cirrhosis),類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)和葡萄膜炎(uveitis),哮喘(asthma),動脈粥樣硬化(atherosclerosis), I型糖尿病(TypeI diabetes),銀屑病(psoriasis),各種過敏癥(allergies)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于治療選自由下列組成的組的任意炎性病癥闌尾炎(appendicitis),消化性潰瘍(peptic ulcer),胃潰瘍(gastric ulcer),十二指腸潰瘍(duodenal ulcer)，腹膜炎(peritonitis)，胰腺炎(pancreatitis)，潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)，假膜性結(jié)腸炎(pseudomembranous colitis),急性結(jié)腸炎(acute colitis),缺血性結(jié)腸炎(ischemic colitis),憩室炎(diverticulitis),會厭炎(epiglottitis),失弛緩癥(achalasia),膽管炎(cholangitis),膽囊炎(cholecystitis),月干炎(hepatitis),局限性回腸炎(Crohn 丨 s disease),腸炎(enteritis),惠普爾病(Whipple' sdisease),過敏癥(allergy),免疫復(fù)合物病(immunecomplex disease)，器官缺血(organ ischemia)，再灌注損傷(reperfusion injury)，器官壞死(organ necrosis),花粉癥(hay fever),膿毒癥(sepsis),敗血病(septicemia),內(nèi)毒素性休克(endotoxic shock),惡病質(zhì)(cachexia),高燒(hyperpyrexia),嗜酸性肉芽腫(eosinophilic granuloma),肉芽腫病(granulomatosis),肉瘤樣病(sarcoidosis),感染性流產(chǎn)(septic abortion)，附睪炎(epididymitis)，陰道炎(vaginitis)，前列腺炎(prostatitis),尿道炎(urethritis),支氣管炎(bronchitis),肺氣腫(emphysema),鼻炎(rhinitis)，月市炎(pneumonitis)，月市塵病(pneumotransmicroscopicsiIicovolcanoconiosis)，肺泡炎(alvealitis)，毛細(xì)支氣管炎(bronchiolitis)，咽頭炎(pharyngitis)，胸膜炎(pleurisy)，竇炎(sinusitis)，流感(influenza)，呼吸道合胞病毒感染(respiratory syncytial virus infection)，HIV 感染，乙型月干炎病毒感染(hepatitisB virus infection)，丙型肝炎病毒感染(hepatitis C virus infection)，彌散性菌血癥(disseminated bacteremia)，登革熱(Dengue fever)，念珠菌病(candidiasis)，癥疾(malaria)，絲蟲病(filariasis)，阿米巴病(amebiasis)，包蟲囊腫(hydatidcysts)，燒傷，皮炎(dermatitis)，皮肌炎(dermatomyositis)，曬傷(sunburn)，蕁麻疫(urticaria)，撫(warts)，風(fēng)疫塊(wheals)，血管炎(vasulitis)，脈管炎(angiitis)，心內(nèi)膜炎(endocarditis)，動脈炎(arteritis)，動脈粥樣硬化(atherosclerosis)，血栓性靜脈炎(thrombophlebitis)，心包炎(pericarditis)，心肌炎(myocarditis),心肌缺血(myocardial ischemia)，結(jié)節(jié)性動脈周圍炎(periarteritis nodosa)，風(fēng)濕熱(rheumatic fever)，阿爾茨海默病(Alzheimer ' s disease)，腹腔病(coeliacdisease)，充血性心力衰竭(congestive heart failure)，成人呼吸窘迫綜合征(adultrespiratory distress syndrome)，腦膜炎(meningitis)，腦炎(encephalitis)，多發(fā)性 硬化病，腦梗死(cerebral infarction)，腦栓塞(cerebral embolism)，吉蘭-巴雷綜合征(Guillame-Barre syndrome)，神經(jīng)炎(neuritis)，神經(jīng)痛(neuralgia)，脊髓損傷(spinal cord injury)，癱瘓(paralysis)，葡萄膜炎(uveitis)，關(guān)節(jié)炎(arthritides)，關(guān)節(jié)痛(arthralgias)，骨髓炎(osteomyelitis)，筋膜炎(fasciitis)，佩吉特病(Paget' sdisease)，痛風(fēng)(gout)，牙周病(periodontal disease)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，滑膜炎(synovitis)，重癥肌無力(myasthenia gravis)，甲狀腺炎(thyroiditis)，系統(tǒng)性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosis)，肺出血腎炎綜合征(Goodpasture' s syndrome),貝赫切特綜合征(Behcet, s syndrome)，同種異體移植排斥(allograft rejection)，移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)，I型糖尿病，強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)，貝格爾病(Berger' s disease)，萊特爾綜合征(Reiter' s syndrome)和霍奇金病(Hodgkin, s disease)，角膜炎(keratitis)，2型糖尿病，囊性纖維化(cysticfibrosis)，心肌梗死(myocardial infarction)，再灌注損傷，中風(fēng)(stroke)，皮肌炎，代謝綜合征(metabolic syndrome)，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatoryresponse syndrome)，膿毒癥，多器官功能衰竭(multiple organ failure)，彌漫性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation)，過敏性休克(anaphylacticshock)，血管并發(fā)癥(Vascular complication)和與I型和/或2型糖尿病相關(guān)的腎病(nephropathy associated with type I 和 / 或 type 2 diabetes)，腦膜炎，細(xì)菌性敗血病(bacterial septicaemia)，并發(fā)性癥疾(complicated malaria)，非典型的溶血性尿毒癥綜合征(atypic haemolytic uremic syndrome)，溶血性尿毒癥綜合征(haemolyticuremic syndrome)，年齡相關(guān)的黃斑變性(age related macular degeneration)，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)，蛇毒咬傷(snake venombite)，燒傷，和器官移植并發(fā)癥。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于治療選自由下列組成的組的任意炎性病癥器官缺血(organ ischemia)，再灌注損傷，器官壞死，血管炎，心內(nèi)膜炎(endocarditis),動脈粥樣硬化,血栓性靜脈炎(thrombophlebitis),心包炎,心肌炎,心肌缺血，結(jié)節(jié)性動脈周圍炎，風(fēng)濕熱，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫綜合征，腦梗死，腦栓塞，血管并發(fā)癥和與I型和/或2型糖尿病相關(guān)的腎病。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于治療與凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病有關(guān)的任意適應(yīng)證。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽治療與凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病或病癥有關(guān)的適應(yīng)證，包括炎性反應(yīng)和與纖維蛋白形成有關(guān)的慢性血栓栓塞疾病或病癥，包括血管病癥，如血栓形成(thrombosis)，諸如深靜脈血栓形成，動脈血栓形成，術(shù)后血栓形成，冠狀動脈旁路移植(CABG),經(jīng)皮透皮冠狀血管成形(percutaneous transdermalcoronary angioplastry, PTCA),血小板沉積中風(fēng)，腫瘤生長，腫瘤轉(zhuǎn)移，血管發(fā)生，血栓溶解，動脈粥樣硬化，再狹窄(restenosis)，如動脈硬化和/或血管成形后的再狹窄，急性和慢性適應(yīng)證，如炎癥，膿毒癥(sepsis),膿毒性休克(septic chock),敗血病(septicemia),低血壓，成人呼吸窘迫綜合征(adult respiratory distress syndrome,ARDS),系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),彌散 性血管內(nèi)凝血病(disseminated intravascular coagulopathy, DIC),肺栓塞(pulmonaryembolism),病理性血小板沉積(pathological platelet deposition),心肌梗死，或用于預(yù)防性治療具有動脈粥樣硬化血管的哺乳動物，所述哺乳動物有風(fēng)險患有血栓形成，外周血祖細(xì)胞(PBPC)移植后的靜脈閉塞病，溶血性尿毒癥綜合征(hemolytic uremicsyndrome, HUS),和血栓性血小板減少性紫癒(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)，和風(fēng)濕熱。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于治療與凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病或病癥有關(guān)的適應(yīng)證，包括炎性反應(yīng)和與纖維蛋白形成有關(guān)的慢性血栓栓塞疾病或病癥,包括血管病癥,如血栓形成,諸如深靜脈血栓形成,動脈血栓形成,術(shù)后血栓形成，冠狀動脈旁路移植(CABG)，經(jīng)皮透皮冠狀血管成形(PTCA)，血小板沉積中風(fēng)，腫瘤生長，腫瘤轉(zhuǎn)移，血管發(fā)生，血栓溶解，動脈粥樣硬化，再狹窄，如動脈硬化和/或血管成形后的再狹窄，急性和慢性適應(yīng)證如炎癥，病理性血小板沉積，心肌梗死，或用于預(yù)防性治療具有動脈粥樣硬化血管的哺乳動物，所述哺乳動物有風(fēng)險患有血栓形成，外周血祖細(xì)胞(PBPC)移植后的靜脈閉塞病，溶血性尿毒癥綜合征(HUS)，和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，和風(fēng)濕熱。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于預(yù)防在鑒定的高危患者中發(fā)生血栓栓塞并發(fā)癥，所述鑒定的高危患者如經(jīng)歷手術(shù)的那些或患有充血性心力衰竭的那些。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于治療與心臟相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽用于治療與ficolin-相關(guān)多肽缺乏有關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥。實(shí)施例I檢測MASPl基因的可變剪接轉(zhuǎn)錄物方法為了檢測MASPl的三種轉(zhuǎn)錄物MASP1，MASP3和FAP，設(shè)計用于每種變體的特異性引物。PCR使用在外顯子6中的通用正向引物(5' -gcacccagagccacagtg-3')和特異性反向引物MASP1在外顯子12中(5' -gccttccagtgtgtgggc-3' ) ,MASP3在外顯子11中(5_gccttccagagtgtggtca_3/ )和 FAP 在外顯子 8a 中(5' -cgatctggagagcgaactc-3')進(jìn)行(圖I)。PCR擴(kuò)增在20-μ I體積中進(jìn)行，其包含:50ng肝臟cDNA (Clontech)，O. 25 μ M每種引物，2. 5mM MgCl2,0. 2mM dNTP,50mM KCl, IOmM Tris · HCl，pH 8.4，和 0.4 單位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)。PCR反應(yīng)按照下述循環(huán)參數(shù)進(jìn)行10min 94 °C,30 或 40 個循環(huán)(30sec 94°C，50sec 58°C，90sec72°C )，IOmin 72。。。樣品在 2%瓊脂糖凝膠上分析。結(jié)果在肝臟cDNA中檢測到MASPl基因的可變轉(zhuǎn)錄。使用位于外顯子6的通用正向引物和位于外顯子12 (MASPl)、外顯子11(MASP3)、和外顯子8a(FAP)的特異性反向引物擴(kuò)增MASP1，MASP3，和FAP轉(zhuǎn)錄物。MASPl產(chǎn)生500bp的片段，MASP3產(chǎn)生506bp的片段，F(xiàn)AP產(chǎn)生309bp的片段。FAP片段的組織表達(dá)方法使用如上述相同的PCR測定法，研究商購人組織cDNA組(Clontech)的MASPI, MASP3，和FAP表達(dá)。樣品在2%瓊脂糖凝膠上分析。結(jié)果在來自Clontech的cDNA組中研究MASP1，MASP3,和FAP基因的組織分布(圖2)。使用通用正向引物和特異性反向引物擴(kuò)增MASP1，MASP3，和FAP轉(zhuǎn)錄物。GADPH用作參照基因。所有三種基因在肝臟中高度表達(dá)，另外，F(xiàn)AP在心臟組織中強(qiáng)表達(dá)(用黑色箭頭表示)。在腦、結(jié)腸、前列腺、骨骼肌、和小腸中檢測到FAP基因的較少表達(dá)(用白色箭頭表不)。100個個體的FAP外顯子8a的DNA測序方法在來自100名健康白種人個體的基因組DNA模板上進(jìn)行外顯子8a的直接測序，包括相對于翻譯ATG起點(diǎn)跨越位置+44，083至+44，431的MASP1/MASP3/FAP基因的內(nèi)含子-外顯子邊界。通過使用單一引物組(正向5' -ctgttcttcacactggctg-3 ',反向5' -ctgctgagatcatgttgttc-3 ')擴(kuò)增該片段，其中正向引物包含5 ' -T7序列(5' -ttatacgactcacta-3' )。PCR擴(kuò)增在20-μ I體積中進(jìn)行，其包含50ng基因組DNA，0.25“] 每種引物，2.5111^%(12，0.21111 dNTP,50mM KCl, IOmM Tris · HCl，pH 8· 4，和 O. 4單位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)。PCR反應(yīng)按照下述循環(huán)參數(shù)進(jìn)行2min94°C，15 個循環(huán)(30sec 94°C，60sec 64°C，60sec 72°C)，15 個循環(huán)(30sec 94°C，60sec58°C,60sec 72°C ), 5min 72°C，并且使用ABIBigDye循環(huán)測序終止子試劑盒(AppliedBiosystems (應(yīng)用生物系統(tǒng))，F(xiàn)oster City, CA)按流程使用5'-生物素酰化的測序引物在正向方向上測序。測序反應(yīng)使用鏈霉抗生物素蛋白珠(Geno Vision)在PyroMark VacuumPrep Workstation (Biotage)上純化。序列分析在 ABI Prism 3100 基因分析儀(AppliedBiosystems (應(yīng)用生物系統(tǒng)))上進(jìn)行。得到的DNA序列用BioEdit軟件比對,并且從序列電泳圖上視覺驗(yàn)證DNA的多態(tài)性。結(jié)果所有序列使用BioEdit軟件比對。在100名健康個體中沒有觀察到外顯子8a或外顯子-內(nèi)含子區(qū)域中的遺傳變異。實(shí)施例2免疫沉淀來自血清的MAP-I特異性免疫沉淀使用MAP-I特異性mAb 20C4(針對17 MAP-I 特異性C-端肽產(chǎn)生)或mAb 8B3進(jìn)行，mAb 8B3是一種針對MASP-1/3的共有重鏈反應(yīng)的單克隆抗體，其用作對照沉淀抗體。允許總共10 μ g抗MAP-I或MASP-1/3抗體與綿羊或小鼠或兔 IgG Dyna 珠(M-280，貨號 112. 02D/112. 04D, Dynal/Invitrogen)結(jié)合。在洗滌步驟后，將珠子用于正常人血清匯聚液(I I稀釋在TBS中)，并且在4°C顛倒溫育I小時。在最后的洗滌步驟和磁力分離后，將珠子在SDS上樣緩沖液中煮沸，并進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡，蛋白質(zhì)印跡使用針對MAP-UMBLjP Ficolin-3的抗體進(jìn)行探測。使用針對MBL(Hyb 131-11, Bioporto,丹麥)，F(xiàn)icolin-2(FCN219)和Ficolin-3 (FCN334)的mAbs進(jìn)行上述相同的沉淀步驟。為了補(bǔ)償MBL、Ficolin_2和-3血清濃度的差異，它們分別從lml、300 μ I和100 μ I血清中沉淀。通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析樣品，蛋白質(zhì)印跡使用針對MAP-I的pAb進(jìn)行。免疫組織化學(xué)在培養(yǎng)瓶中在RPMI+10%中生產(chǎn)表達(dá)rMAP-Ι的CHO細(xì)胞。在80_90%匯聚收集細(xì)胞，將細(xì)胞收集并且在4%甲醛-PBS中固定24小時，隨后包埋在石蠟中。還對六種不同的人肝臟組織和來自兩種不同的心肌組織、兩種骨骼肌組織的樣品和兩份獲自人主動脈的樣品進(jìn)行上述固定和石蠟包埋。使用Leitz Wetzlar切片機(jī)獲得5 μ m薄片的切片，并且置于 玻璃載玻片上，并且在4°C保存直至測定。按前述進(jìn)行預(yù)處理和分析。一級抗體是MAP-I特異性單克隆抗體mAb 12B11或親和純化的、單特異性兔抗所有均稀釋至5 μ g/ml。同種型抗體對照以相同的濃度應(yīng)用到組織。二級抗體是EnVision 抗體(HRP-抗小鼠或HRP-抗兔，Dako, Glostrup,丹麥)。在Leica DMLB2顯微鏡下進(jìn)行染色模式分析。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡基本上按照供應(yīng)商所述，使用NuPAGE 系統(tǒng)(Invitrogen),用不連續(xù)的緩沖液，在10%或4-12% (w/v)Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。蛋白質(zhì)印跡使用聚偏氟乙烯膜(PVDF-HyBond, Amersham Bioscience), 2 μ g/ml 一級 mAbs 和通過在 PBS, 0· 05% 吐溫20中I : 1500稀釋的HRP綴合的鏈霉抗生物素蛋白(Ρ0397，Dako)或I : 1000稀釋的HRP-兔抗小鼠IgG (Ρ0260，Dako)進(jìn)行二級顯影而進(jìn)行。膜使用在50mM乙酸鈉緩沖液pH 5中的3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)(在丙酮中O. 04% )和O. 015% H2O2進(jìn)行顯影。補(bǔ)體激活測定基本上如前述評估MAP-I對MBL和Ficolin_3介導(dǎo)的補(bǔ)體因子C4沉積的影響。簡言之，將甘露聚糖(MBL配體)(Sigma-Aldrich M7504)或乙?；呐Ｑ灏椎鞍?Ficolin-3配體)以10 μ g/ml固定到Maxisorp ELISA平板(Nunc,丹麥)上。洗漆后，添加rMBL或rFicolin-3 (O. 4 μ g/ml)并且溫育I. 5小時。在第一維度上以兩倍的連續(xù)稀釋應(yīng)用rMAP-Ι或rMASP-2 I小時，然后在第二維度上，在37°C用缺乏MBL或Ficolin-3的血清連續(xù)稀釋液溫育45分鐘。C4沉積使用針對C4c的pAb (Q0369, Dako, Glostrup/丹麥)進(jìn)行測量。另外，我們使用純系統(tǒng)評估MAP-I對MASP-2的置換。如前述，在rMBL/甘露聚糖矩陣中，在第一維度上，將rMASP-2在連續(xù)稀釋液中在20°C預(yù)先溫育45分鐘，然后在第二維度上，在20°C用rMAP-Ι稀釋液溫育45分鐘。純化的C4(來自Quidel，CA，USA)以I μ g/ml的濃度加入，并且在37°C溫育45分鐘。檢測如上述進(jìn)行。結(jié)果MAP-I 與 Ficolin-2、Ficolin-3 和 MBL 共沉淀為了研究MAP-I與MBL和Ficolin-3的可能的締合，我們使用抗MAP-1 mAb20C4與針對MASP-I和MASP-3共有重鏈的mAb (mAb8B3) 二者來沉淀血清復(fù)合物。隨后通過蛋白質(zhì)印跡分析沉淀物，所述蛋白質(zhì)印跡分別用針對MAP_1、MBL、和Ficolin-3的抗體探測。我們觀察到Ficolin-3共沉淀?xiàng)l帶，但是也觀察到具有MBL的較弱條帶(圖24A)。樣品不使用針對Ficolin-2的抗體探測，因?yàn)樗鼈冊诘鞍踪|(zhì)印跡中不作用。然后，我們使用針對MBL、Ficolin-2和Ficolin-3的mAbs來分別沉淀1ml、300 μ I和100 μ I血清(進(jìn)行其來分別調(diào)^ MBL (2 μ g/ml) >Ficolin-2 (5 μ g/ml)和 Ficolin-3 (20 μ g/ml)血清濃度的差異)來倒轉(zhuǎn)免疫沉淀。隨后，通過用針對MAP-I的抗體探測的蛋白質(zhì)印跡分析樣品。在來自Ficolin-2和_3的沉淀物中觀察到明顯的MAP-I條帶，在MBL沉淀物中顯現(xiàn)更弱得多的條帶，其中免疫沉淀的rMAP-Ι和血清MAP-I作為對照(圖24B)。MAP-I抑制凝集素途徑的補(bǔ)體活性使用缺乏MBL和Ficolin-3的血清與rMBL和rFicolin_3組合來重構(gòu)MBL和Ficolin-3的補(bǔ)體C4激活活性。甘露聚糖和乙?；腂SA分別作為MBL和Ficolin-3的配體。rMBL和rFicolin-3 二者都能夠分別起始MBL和Ficolin-3缺陷型血清中的C4沉積(圖25A和25D)。應(yīng)用rMASP-2導(dǎo)致通過Ficolin-3和MBL兩種激活途徑的C4沉積的強(qiáng) 陽性劑量依賴性增加(圖25B和25E)，而應(yīng)用rMAP-Ι導(dǎo)致通過兩種途徑的對C4沉積的明顯劑量依賴性抑制(圖25C和25F)。另外，我們使用僅包含rMBL，rMASP-2, rMAP-1和純化的C4的純組分系統(tǒng)來解決MAP-I對MASP-2的可能的置換。將rMASP-2用連續(xù)稀釋的甘露聚糖/rMBL復(fù)合物預(yù)先溫育。然后，加入變化濃度的rMAP-Ι，然后加入純化的C4。向該系統(tǒng)應(yīng)用rMAP-Ι明顯導(dǎo)致C4沉積的劑量依賴性抑制(圖26)。實(shí)施例3確定新型MBL/Ficolin相關(guān)蛋白I(MAP-I)的血清濃度和締合特異性在CH0-DG44細(xì)胞中產(chǎn)生并且穩(wěn)定表達(dá)MAP-I的全長無標(biāo)記的重組構(gòu)建體。產(chǎn)生針對MAP-I的特異性單克隆抗體。還建立關(guān)于MAP-I血清測量的定量ELISA，并且通過ELISA和密度梯度分級來檢驗(yàn)血清MAP-I與Ficolin-2、-3和MBL之間的締合。重組蛋白如其它地方所述(Hummelshoj等，Mol Immunol (分子免疫學(xué))44,401-11, 2007 ；Larsen等，J Biol Chem(生物化學(xué)雜志)279，21302-11，2004 ;Ma等，2009 J Biol Chem(生物化學(xué)雜志)，Oct 9 ;284(41))，改進(jìn)之處在于使用PowerCHOl無血清培養(yǎng)基(Lonza，Vallensbaek/丹麥，www. lonza. com)作為表達(dá)培養(yǎng)基，在CH0-DG44細(xì)胞中表達(dá)無標(biāo)記的人MAP-I的全長構(gòu)建體。如前述，我們利用抗體親和純化來純化rMAP-1 (Skjoedt等，2009 ；Immunobiology (免疫生物學(xué))，Nov 23)。簡言之,基本上按照Pfeiffer等所述(Pfeiffer等,J Immunol Methods (免疫學(xué)方法雜志)97,1-9,1987),將 15mg抗MAP-1 抗體(mAb 20C4)共價偶聯(lián)到CNBr活化的瓊脂糖上，并且用作純化基質(zhì)。還使用抗-MAP-I柱來耗盡血清中的 MAP-I。單克隆抗體的產(chǎn)生按前述進(jìn)行(Skjoedt等，J Biol Chem(生物化學(xué)雜志)285,8234-43,2010)。使用NuPAGE 系統(tǒng)(Invitrogen),按推薦,用不連續(xù)緩沖液,在10%或4-12%(w/ν) Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。使用聚偏氟乙烯膜(PVDF-HyBond, GEHealthcare)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。將膜用2 μ g/ml 一級抗體顯影,二級顯現(xiàn)通過用在50mM乙酸鈉緩沖液pH5中的O. 04% 3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma-Aldrich,Broendby/丹麥,www.sigmaaldrich. com) +0. 015% H202作為底物，用I : 1500稀釋的HRP綴合的鏈霉抗生物素蛋白或 HRP-兔抗小鼠 IgG(P0397/P0260, Dako, Glostrup/ 丹壽，www. dako. com)進(jìn)行。按推薦和先前所述(Skjoedt等，2009)，將rMAP_l用N-糖苷酶-F/END0_F(N-糖苷酶-F去糖基化試劑倉，Roche,Mannheim/Germany,www. roche. com)處理。產(chǎn)物通過在還原條件下的SDS-PAGE然后考馬斯染色或蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。先前已經(jīng)證實(shí)了抗-MAP-1 mAb 20C4的特異性(Skjoedt等，2010)。在定量MAP-1ELISA中，mAb 20C4用作捕獲抗體，其以6 μ g/ml固定在Maxisorb ELISA平板上(NUNC ，Roskilde/丹麥，www. nuncbrand. com)。校正劑(慘加在MAP-I耗盡血清中的rMAP-1或rMAP-Ι)的連續(xù)稀釋液或捐獻(xiàn)者血清樣品應(yīng)用在PBS+0. 05 %吐溫20+0. 5 %牛血清和IOmMEDTA中。檢測抗體是以3 μ g/ml使用的生物素標(biāo)記的mAb 8B3，其如前述與MASP_1、_3和 MAP-I 的共有鏈反應(yīng)(Skjoedt 等，2010 ；Skjoedt 等，2009)。 Ficolin-2 和 _3 血清濃度如 Munthe-Fog 等和 Hummelshoj 等(Hummelshoj 等，Hum Mol Genet (人類分子遺傳學(xué))14, 1651-8, 2005 ;Munthe_Fog 等，Scand J Tmmunol 65,383-92,2007 ;Munthe_Fog 等，MolImmunol (分子免疫學(xué))45，2660-6，2008)所述確定，MBL和MASP-3血清濃度如前述確定(Skjoedt等，2009)。顯色使用鄰苯二胺(Dako,Glostrup/丹麥)獲得，并且按推薦，用1MH2S04終止酶反應(yīng)。使用 V-max 動力學(xué)-讀數(shù)儀(分子裝置(Molecular Devices), Sunnyvale/CA/U. S)測量光學(xué)密度(0D490nm-650nm)水平。MAP-I與MBL、Ficolin-2和_3之間的相對締合基本上如前述測定(Skjoedt等，2009)，改進(jìn)之處在于，使用MAP-I特異性mAb 20C4作為捕獲抗體(以6 μ g/ml包被)。檢測mAbs是生物素標(biāo)記的FCN-219 (Ficolin-2特異性)或FCN-334 (Ficolin-3特異性)(24-25)、或Hyb 131-11，全部以2 μ g/ml應(yīng)用。分析來自如上述相同的100名丹麥獻(xiàn)血者
的血清樣品。將正常人血清進(jìn)行蔗糖梯度分離。將O. 75ml血清上樣到40ml離心柱上，該離心柱由緩沖在IOmM Tris,145mM NaCl, 3mM CaCl2和30 μ g/ml的人血清白蛋白中的10-30%蔗糖梯度組成。在L70 Beckmann超離心機(jī)中，使用SW28轉(zhuǎn)頭，將上樣的柱在4°C以150. OOOxg真空離心24小時。從底部收集I. 5ml級分，并且通過針對下述抗原的特異性ELISA或免疫印跡進(jìn)行分析MAP-1，MASP-I，MASP-2，MASP-3, sMAP, MBL, Ficolin-2 和 Ficolin-3。也評估血清IgM(19S)和IgG(7S)的峰，表明分子表面與質(zhì)量的比率。另外，分析級分激活外源應(yīng)用的C4的能力。簡言之，如前述(Skjoedt等，2010)，將級分以連續(xù)稀釋液應(yīng)用到用乙酰化BSA(Ficolin-3配體)或甘露聚糖(MBL配體)包被的ELISA平板上，然后在4°C搖動溫育I小時。然后，洗滌平板，并且在37°C用I μ g/ml純化的C4溫育I小時。隨后用針對C4c的多克隆抗體(Q 0369，Dako, Glostrup，丹麥)測量C4沉積。統(tǒng)計學(xué)分析使用Prism4 軟件(GraphPad Software, Inc. , La Jolla/CA/US, www. Rraphpad.com)，計算統(tǒng)計學(xué)(Spearman non-parametric correlation (Spearman 非參數(shù)相關(guān)性)，non-parametric two-tailed t-test (非參數(shù)雙尾 t 檢驗(yàn)))和MAP-l,MBL,Ficolin_2 與 _3血清水平。結(jié)果rMAP-Ι的純化和表征rMAP-Ι在CHO DG44中的表達(dá)導(dǎo)致在存在150nM甲氨蝶呤的條件下的高產(chǎn)率(在無血清培養(yǎng)基中的產(chǎn)率10-20 μ g/ml)。純化后，在SDS-PAGE中，然后考馬斯亮藍(lán)染色或免疫印跡，分析rMAP-Ι。SDS-PAGE/考馬斯染色分析顯現(xiàn)具有 45kDa的估算還原分子量的條帶(圖27)。用N-糖苷酶F對rMAP-Ι去糖基化導(dǎo)致分子量變化為 40kDa，這對應(yīng)于沒有信號肽的理論質(zhì)量。該模式也在使用針對MAP-I的特異性抗體的免疫印跡中觀察到。MAP-I血清水平我們開發(fā)了定量ELISA來確定MAP-I的血清水平。該測定法基于作為捕獲抗體的MAP-I特異性mAb 20C4和識別MASP-I、_3和MAP-I的共有重鏈的檢測抗體(mAb 8B3)。在純化的rMAP-Ι校正劑和以標(biāo)準(zhǔn)曲線的已知濃度摻加純化的MAP-I的MAP-I耗盡血清之間觀察到極好的平行性(圖28A)。我們分析100名丹麥獻(xiàn)血者中的MAP-I血清水平，并且發(fā)現(xiàn)平均值為240ng/ml，其范圍為115_466ng/ml (圖29A)。如前述，我們測量同一組中的MASP-3血清水平(Skjoedt等，2009)，并且繪制MAP-1和MASP-3濃度(圖29B)。我們發(fā)現(xiàn)在MAP-I和MASP-3血清濃度之間沒有相關(guān)性，盡管它們代表來自同一基因的可變轉(zhuǎn)錄物。我們評估了抗原和測定法在血清和在凍融循環(huán)中的穩(wěn)定性(圖29C)。我們觀察到MAP-I的評估非常穩(wěn)健，與凍融循環(huán)無關(guān)。MAP-I 與 Ficolin-2，_3 和 MBL 之間的締合為了測量MAP-I與MBL，F(xiàn)icolin-2和_3之間的相互作用，我們開發(fā)了三種不同的ELISAs，使用mAb 20C4作為捕獲抗體，并用下列生物素標(biāo)記的mAbs探測FCN-219 (Ficolin-2 特異性)，F(xiàn)CN-334 (Ficolin-3 特異性)或Hyb 131-11 (MBL特異性)。我們分析與用于MAP-I確定相同的100份捐獻(xiàn)者血清樣品，并且評估MAP-I與Ficolin-2，-3和MBL之間的血清締合水平，以相對O.D. 490-650nm給出(圖30A)。另外，我們按前述(Skjoedt 等，2009)測量了 MBL, Ficolin-2 和-3 的血清濃度。我們發(fā)現(xiàn)MAP-I以與MBL，F(xiàn)icolin-2和-3復(fù)合存在。然而，似乎MAP-I的主要部分與ficolins、且特別是Ficolin-3 (P < O. 0001)締合，該模式先前關(guān)于MASP-3也已經(jīng)觀察到過(Skjoedt 等，2009)。我們針對相對締合水平繪制MAP-1，MBL, Ficolin-2和_3的血清濃度，并且發(fā)現(xiàn)MAP-I與MBL之間的締合與MBL水平高度相關(guān)(Spearman r :0. 92，p < O. 0001)(圖30B,頂部右手側(cè))。與這相反，與Ficolin-2和-3的相對MAP-I締合與MAP-I血清水平相關(guān)(Spearman r :分別為O. 45和O. 61，p < O. 0001，圖30B左手側(cè))。盡管我們觀察到在MAP-1濃度和同MBL的相對締合以及Ficol in-3濃度之間的某種相關(guān)性，但是這種趨勢較不明顯。 密度梯度分級為了研究MAP-I關(guān)于締合的分子的分布和檢驗(yàn)有多少表現(xiàn)為不締合的，我們將正常的人血清使用10-30%蔗糖梯度和超離心進(jìn)行密度分級。隨后，通過ELISA分析收集的級分的MAP-1，MASP-3, MBL, Ficolin-2和_3 (圖31A)，通過蛋白質(zhì)印跡分析收集的級分的獻(xiàn)？-1，嫩5 -1，-2和-3，8嫩卩，]\^1^卩化01111-2和-3(圖31B)。結(jié)果顯示，血清MAP-1僅存在于具有ficolins和MBL的級分中，這表明MAP-I不作為未締合的分子存在。對于sMAP，MASP-1, -2和-3觀察到相同的模式。另外，數(shù)據(jù)表明，MAP-1, sMAP和MASP-1，-2和-3的大部分共同定位在Ficolin-3的峰值級分中。這種分布還通過在sephadex_200柱上的大小排阻層析進(jìn)行分析。觀察到分子的等價分布模式(數(shù)據(jù)未顯示)。最后，我們評估蔗糖梯度級分激活外源應(yīng)用的C4的能力。使用固相甘露聚糖和乙酰化的BSA分別作為關(guān)于MBL和Ficolin-3的配體。我們觀察到兩條不同的C4沉積曲線，這反映通過蔗糖梯度分離的Ficolin-3和MBL復(fù)合物的峰(圖31C)。討論為了研究結(jié)構(gòu)方面和確定新型MBL/Ficolin相關(guān)蛋白I(MAP-I)的血清水平，我們表達(dá)了無標(biāo)記的重組MAP-I，并且產(chǎn)生針對其的特異性抗體。N-糖苷酶F處理和SDS-PAGE分析表明MAP-I被糖基化，這產(chǎn)生具有N-聚糖的 45kDa的分子量，并且在去糖基化后分子量為 40kDa，這等價于由不具有信號肽的推定氨基酸序列計算的分子量。
我們使用針對MAP-I特異性C末端產(chǎn)生的單克隆抗體來建立定量MAP-1 ELISA，并且確定100名健康丹麥獻(xiàn)血者中的血清濃度范圍。在捐獻(xiàn)者組中，我們發(fā)現(xiàn)較MASP-3濃度(平均6500ng/ml)相對低的血清濃度(平均240ng/ml,范圍115_466ng/ml)。另外,在兩種蛋白的血清濃度之間沒有相關(guān)性，這表明，盡管這兩種分子是同一基因的不同剪接變體，但是表達(dá)調(diào)控是不同的。近來，記述了 MASP-1，-3和MAP-I組織分布的顯著不同(Degn等，2009 ；Skjoedt等，2010)。在MASP-3和MAP-I之間血清濃度的主要差異的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持來源于MASPl基因的轉(zhuǎn)錄變體的調(diào)控機(jī)制不同的觀點(diǎn)。我們開發(fā)了基于ELISA的測定法來分別評估血清MAP-1與MBL，F(xiàn)icolin-2和_3之間的相對締合。另外，我們確定Ficolin-2，-3和MBL的血清濃度，從而使其與相對締合水平相關(guān)。結(jié)果表明，MAP-I主要與Ficolin-3和Ficolin-2締合，與MBL的相對締合表現(xiàn)得較不明顯?？梢誀庌q說這種分布反映MBL，F(xiàn)icolin-2和-3平均血清濃度的差異。然而，盡管MBL-MAP-I締合與MBL濃度相關(guān)，對于Ficolin-2，其中MAP-I血清濃度與同F(xiàn)icolin-2的締合水平相關(guān)，同樣不明顯。Ficolin-3和MAP-I之間的相對締合與MAP-I血清濃度高度相關(guān)，而與Ficolin-3血清水平的正相關(guān)性很弱。上述發(fā)現(xiàn)表明，MAP-I與Ficolin-2和-3之間的主要締合不僅僅是由于相對較高的Ficol in-2和-3濃度。通過分析進(jìn)行密度梯度分 離的血清，進(jìn)一步證實(shí)了這種分布模式。我們發(fā)現(xiàn)一種清楚的趨勢不僅MAP-1，而且sMAP，MASP-I，-2和-3與Ficol in-3峰值級分共同定位。這是我們先前對于MASP-3所觀察到的現(xiàn)象(Skjoedt等,2009)。Ficolin-3和MBL峰值級分的分離還通過在乙?；疊SA (Ficolin-3配體)和甘露聚糖(MBL配體)上激活外源加入的C4的能力進(jìn)行評估。在這兩種不同的活化表面上的C4沉積清楚地表明包含MBL或Ficolin-3復(fù)合物的不同的峰值級分。蔗糖梯度密度分析的數(shù)據(jù)還表明，對于MBL的表面與質(zhì)量比率高于Ficolin-2和Ficolin-3的，這支持最近的研究的觀察結(jié)果，其表明MBL在四級結(jié)構(gòu)中具有非常松散和開放的構(gòu)象(Jensenius等,2009)。然而，ficolins的較小的表面與質(zhì)量比率也可能反映具有締合的分子如MAP-1、sMAP和MASPs的分子分布。在這一方面，與MAP-1/sMAP/MASPs締合越多可能導(dǎo)致更高的質(zhì)量和通過密度梯度的進(jìn)一步遷移?？傊?，我們已經(jīng)表明，與MASP-3相比，MAP-I以低血清濃度存在，并且MAP-I主要以與ficolins的復(fù)合物進(jìn)行循環(huán)，但是在某種程度上也與MBL的復(fù)合物進(jìn)行循環(huán)。此外，我們可能證明，在LCP識別分子中，F(xiàn)icolin-3似乎是主要的MAP-I締合分子。
SEQ ID NO :1.人FAP的完整的380個氨基酸的序列。(突出顯示了在氨基酸位置49和178鑒定的兩個潛在的糖基化位點(diǎn))。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKV 80ETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNY 160IGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEV 240PCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYF 320FKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKKNEIDLESELKSEQVTE SEQ ID NO :2.人FAP的完整的cDNA核苷酸序列。atgaggtggctgcttctctattatgctctgtgcttctccctgtcaaaggcttcagcccacaccgtggagο βββοββ βtgtttggccagatccagtcgcctggttatccagactcctatcccagtgattcagaggtgacttggaatatcactgtcccagatgggtttcggatcaagctttacttcatgcacttcaacttggaatcctcctacctttgtgaatatgactatgtgaaggtagaaactgaggaccaggtgctggcaaccttctgtggcagggagaccacagacacagagcagactcccggccaggaggtggtcctctcccctggctccttcatgtccatcactttccggtcagatttctccaatgaggagcgtttcacaggctttgatgcccactacatggctgtggatgtggacgagtgcaaggagagggaggacgaggagctgtcctgtgaccactactgccacaactacattggcggctactactgctcctgccgcttcggctacatcctccacacagacaacaggacctgccgagtggagtgcagtgacaacctcttcactcaaaggactggggtgatcaccagccctgacttcccaaacccttaccccaagagctctgaatgcctgtataccatcgagctggaggagggtttcatggtcaacctgcagtttgaggacatatttgacattgaggaccatcctgaggtgccctgcccctatgactacatcaagatcaaagttggtccaaaagttttggggcctttctgtggagagaaagccccagaacccatcagcacccagagccacagtgtcctgatcctgttccatagtgacaactcgggagagaaccggggctggaggctctcatacagggctgcaggaaatgagtgcccagagctacagcctcctgtccatgggaaaatcgagccctcccaagccaagtatttcttcaaagaccaagtgctcgtcagctgtgacacaggctacaaagtgctgaaggataatgtggagatggacacattccagattgagtgtctgaaggatgggacgtggagtaacaagattcccacctgtaaaaaaaatgaaatcgatctggagagcgaactcaagtcagagcaagtgacagagtgaSEQ NO :3.包含CUB1-EGF-CUB2結(jié)構(gòu)域的ficolin相關(guān)多肽的最小序列，其包含氨基酸1-19的信號肽。該序列對應(yīng)于外顯子2至外顯子6。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKV 80ETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNY 160IGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFE DIFDIEDHPEV 240PCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAASEQ ID NO :4. FAP特有的末端17個氨基酸KNEIDLESELKSEQVTESEQ ID NO :5 人 MASP-1 的蛋白質(zhì)序列。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKIVDCRAPGELEHGLITFSTRNNLTTYKSEIKYSCQEPYYKM.NNNTGIYTCSAQGVWMNKVLGRSLPTCLPVCGLPKFSRKLMARIFNGRPAQKGTTPffIAM,Sffl,NGQPFCGGSLLGSSffIVTAAHCLHQSLDPEDPTLRDSDLLSPSDFKIILGKHffRLRSDENEQHLGVKHTTLHPQYDPNTFENDVALVELLESPVLNAFVMPICLPEGPQQEGAMVIVSGWGKQFLQRFPETLNEIEIPIVDHSTCQKAYAPLKKKVTRDMICAGEKEGGKDACAGDSGGPMVTLNRERGQWYLVGTVSWGDDCGKKDRYGVYSYIHHNKDWIQRVTGVRNSEQ ID NO :6 人 MASP-1 的 cDNA 序列GMGTCAGCCACACAGGATAAAGGAGGGAAGGGMGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGMGACAGATTTTGTTGTCAGGTTCCTGGGAGTGCAAGAGCAAGTCAAAGGAGAGAGAGAGGAGAGAGGAAMGCCAGAGGGAGAGAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGGGGAAGGCGTGACCTGAATGGAGMTGCCAGCCMTTCCAGAGACACACAGGGACCTCAGMCAMGATAAGGCATCACGGACACCACACCGGGCACGAGCTCACAGGCMGTCMGCTGGGAGGACCMGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTGGCTGCTTCTCTATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAMGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAMCAATATGTTTGGCCAGATCCAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGGTGACTTGGMTATCACTGTCCCAGATGGGTTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGMTCCTCCTACCTTTGTGMTATGACTATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGCAACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGCAGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTCCMTGAGGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCCCACTACATGGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGGAGAGGGAGGACGAGGAGCTGTCCTGTGACCACTACTGCCACMCTACATTGGCGGCTACTACTGCTCCTGCCGCTTCGGCTACATCCTCCACACAGACMCAGGACCTGCCGAGTGGAGTGCAGTGACAACCTCTTCACTCAAAGGACTGGGGTGATCACCAGCCCTGACTTCCCAMCCCTTACCCCAAGAGCTCTGAATGCCTGTATACCATC
GAGCTGGAGGAGGGTTTCATGGTCAACCTGCAGTTTGAGGACATATTTGACATTGAGGACCATCCTGAGGTGCCCTGCCCCTATGACTACATCMGATCAAAGTTGGTCCAAMGTTTTGGGGCCTTTCTGTGGAGAGMAGCCCCAGAACCCATCAGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAGTGACMCTCGGGAGAGAACCGGGGCTGGAGGCTCTCATACAGGGCTGCAGGAMTGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTGTCCATGGGAAAATCGAGCCCTCCCAAGCCMGTATTTCTTCAMGACCMGTGCTCGTCAGCTGTGACACAGGCTACAAAGTGCTGAAGGATAATGTGGAGATGGACACATTCCAGATTGAGTGTCTGMGGATGGGACGTGGAGTAACMGATTCCCACCTGTAAAATTGTAGACTGTAGAGCCCCAGGAGAGCTGGMCACGGGCTGATCACCTTCTCTACMGGMCAACCTCACCACATACMGTCTGAGATCAMTACTCCTGTCAGGAGCCCTATTACM GATGCTCMCAATMCACAGGTATATATACCTGTTCTGCCCAAGGAGTCTGGATGAATAAAGTATTGGGGAGAAGCCTACCCACCTGCCTTCCAGTGTGTGGGCTCCCCAAGTTCTCCCGGAAGCTGATGGCCAGGATCTTCAATGGACGCCCAGCCCAGAMGGCACCACTCCCTGGATTGCCATGCTGTCACACCTGAATGGGCAGCCCTTCTGCGGAGGCTCCCTTCTAGGCTCCAGCTGGATCGTGACCGCCGCACACTGCCTCCACCAGTCACTCGATCCGGMGATCCGACCCTACGTGATTCAGACTTGCTCAGCCCTTCTGACTTCAAMTCATCCTGGGCAAGCATTGGAGGCTCCGGTCAGATGAAAATGAACAGCATCTCGGCGTCAMCACACCACTCTCCACCCCCAGTATGATCCCAACACATTCGAGAATGACGTGGCTCTGGTGGAGCTGTTGGAGAGCCCAGTGCTGMTGCCTTCGTGATGCCCATCTGTCTGCCTGAGGGACCCCAGCAGGMGGAGCCATGGTCATCGTCAGCGGCTGGGGGAAGCAGTTCTTGCAAAGGTTCCCAGAGACCCTGATGGAGATTGAMTCCCGATTGTTGACCACAGCACCTGCCAGMGGCTTATGCCCCGCTGMGAAGAAAGTGACCAGGGACATGATCTGTGCTGGGGAGMGGMGGGGGAAAGGACGCCTGTGCGGGTGACTCTGGAGGCCCCATGGTGACCCTGAATAGAGAAAGAGGCCAGTGGTACCTGGTGGGCACTGTGTCCTGGGGTGATGACTGTGGGAAGMGGACCGCTACGGAGTATACTCTTACATCCACCACAACMGGACTGGATCCAGAGGGTCACCGGAGTGAGGMCTGAATTTGGCTCCTCAGCCCCAGCACCACCAGCTGTGGGCAGTCAGTAGCAGAGGACGATCCTCCGATGAAAGCAGCCATTTCTCCTTTCCTTCCTCCCATCCCCCCTCCTTCGGCCTATCCATTACTGGGCAATAGAGCAGGTATCTTCACCCCCTTTTCACTCTCTTTAAAGAGATGGAGCAAGAGAGTGGTCAGMCACAGGCCGAATCCAGGCTCTATCACTTACTAGTTTGCAGTGCTGGGCAGGTGACTTCATCTCTTCGAACTTCAGTTTCTTCATMGATGGAMTGCTATACCTTACCTACCTCGTAAAAGTCTGATGAGGAAMGATTAACTAATAGATGCATAGCACTTAACAGAGTGCATAGCATACACTGTTTTCMTAMTGCACCTTAGCAGMGGTCGATGTGTCTACCAGGCAGACGAAGCTCTCTTACAAACCCCTGCCTGGGTCTTAGCATTGATCAGTGACACACCTCTCCCCTCMCCTTGACCATCTCCATCTGCCCTTAMTGCTGTATGCTTTTTTGCCACCGTGCAACTTGCCCMCATCMTCTTCACCCTCATCCCTAAAAMGTAAMCAGACAAGGTTCTGAGTCCTGTGGTATGTCCCCTAGCAAATGTMCTAGGAACATGCACTAGATGACAGATTGCGGGAGGGCCTGAGAGMGCAGGGACAGGAGGGAGCCTGGGGATTGTGGTTTGGGMGGCAGACACCTGGTTCTAGAACTAGCTCTGCCCTTAGCCCCCTGTATGACCCTATGCMGTCCTCCTCCCTCATCTCAMGGGTCCTCAAAGCTCTGACGATCTAAGATACMTGMGCCATTTTCCCCCTGATAAGATGAGGTAAAGCCMTGTAACCAAAAGGCAAAMTTACMTCGGTTCAMGGMCTTTGATGCAGACAAMTGCTGCTGCTGCTGCTCCTGAAATACCCACCCCTTTCCACTACGGGTGGGTTCCCMGGACATGGGACAGGCAAAGTGTGAGCCAAAGGATCCTTCCTTATTCCTMGCAGAGCATCTGCTCTGGGCCCTGGCCTCCTTCCCTTCTTGGGAAACTGGGCTGCATGAGGTGGGCCCTGGTAGTTTGTACCCCAGGCCCCTATACTCTTCCTTCCTATGTCCACAGCTGACCCCMGCAGCCGTTCCCCGACTCCTCACCCCTGAGCCTCACCCTGAACTCCCTCATCTTGCMGGCCATMGTGTTTTCCAAGCAAMTGCCTCTCCCATCCTCTCTCAGGAAGCTTC
TAGAGACTTTATGCCCTCCAGAGCTCCMGATATMGCCCTCCAAGGGATCAGAAGCTCCMGTTCCTGTCTTCTGTTTTATAGAMTTGATCTTCCCTGGGGGACTTTAACTCTTGACCTGTATGCAGCTGTTGGAGTAATTCCAGGTCTCTTGAAAAAAMGAGGMGATAATGGAGAATGAGAACATATATATATATATATTAAGCCCCAGGCTGAATACTCAGGGACAGCAATTCACAGCCTGCCTCTGGTTCTATAAACMGTCATTCTACCTCTTTGTGCCCTGCTGTTTATTCTGTMGGGGMGGTGGCAATGGGACCCAGCTCCATCAGACACTTGTCAAGCTAGCAGAAACTCCATTTTCAATGCCAMGAAGMCTGTAATGCTGTTTTGGMTCATCCCAAGGCATCCCMGACACCATATCTTCCCATTTCAAGCACTGCCTGGGCACACCCCMCATCCCAGGCTGTGGTGGCTCCTGTGGGAACTACCTAGATGMGAGAGTATCATTTATACCTTCTAGGAGCTCCTATTGGGAGACATGAAACATATGTAATTGACTACCATGTMTAGAACAAACCCTGCCAAGTGCTGCTTTGGAMGTCATGGAGGTAMAGAAAGACCATTCSEQ ID NO :7 人 MASP-3 的蛋白質(zhì)序列。MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKTKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKIVDCRAPGELEHGLITFSTRNNLTTYKSEIKYSCQEPYYKMLNNNTGTYTCSAQGVWMNKVL GRSLPTCLPECGQPSRSLPSLVKRIIGGRNAEPGLFPWQALIVVEDTSRVPNDKWFGSGALLSASWILTAAHVLRSQRRDTTVIPVSKEHVTVYLGLHDVRDKSGAVNSSAARVVLHPDFNIQNYNHDTALVQLQEPVPLGPHVMPVCLPRLEPEGPAPHMLGLVAGffGISNPNVTVDETISSGTRTLSDVLQYVKLPVVPHAECKTSYESRSGNYSVTENMFCAGYYEGGKDTCLGDSGGAFVIFDDLSQRffVVQGLVSWGGPEECGSKQVYGVYTKVSNYVDWVWEQMGLPQSVVEPQVERSEQ ID NO :8 人 MASP-3 的 cDNA 序列GMGTCAGCCACACAGGATAAAGGAGGGAAGGGMGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGMGACAGATTTTGTTGTCAGGTTCCTGGGAGTGCAAGAGCAAGTCAAAGGAGAGAGAGAGGAGAGAGGAAMGCCAGAGGGAGAGAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGGGGAAGGCGTGACCTGAATGGAGMTGCCAGCCMTTCCAGAGACACACAGGGACCTCAGMCAMGATAAGGCATCACGGACACCACACCGGGCACGAGCTCACAGGCMGTCMGCTGGGAGGACCMGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTGGCTGCTTCTCTATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAMGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAMCAATATGTTTGGCCAGATCCAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGGTGACTTGGMTATCACTGTCCCAGATGGGTTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGMTCCTCCTACCTTTGTGMTATGACTATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGCAACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGCAGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTC6b
0X33VXXV03X0VXX3V0000XVXW033300V3330W0X33VX300VW0X3XVXXVX0XVW0XX30[81790]
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3V330XVXV333000XXXV3V3W0V3X3W3X0XXV333XXVWXX3330W33V33300V000X0330[91790]
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X333XV0X0X0VXX3X3X3X33330W330VXV3X300XV0V000XXXX00V3XXV30V0W0V00VX0X[ε^90]
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XX3V33V0X33X3V3XXVXXX3300X0V3333VXX3XX30XV3300V33XXX33X3V30V333XW300X
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X30330X33X30X3VX3VX300300XXV3VX3W3V330X3VX3V33V0X0X33X0X30V00V00V00V0[ 1190]
~\ ~\Λ Τ ~\Λ Τ ~\ ~\Λ ΤΛ τ/-\Γ\ τ ~\Λ ΤΓ/-\Λ ΤΓ\Γ\ r\ λ ΤΓ\Γ\ r\ r\r\r\ λ τ/-\Λ Τ /-\Λ T/-\r\r\r\ τ λ rr\ τ τ ττ/-\λ τ/-\ r\r\ r\i rr\r\T τγ\ λτ\τ/-\Γλ ■ λλ
GAAAAAGAAMGACCCACACTGTGTCCTGCTGTGCTTTTGGGCAGGAAMTGGAAGAAAGAGTGGGGTGGGCACATTAGMGTCACCCAMTCCTGCCAGGCTGCCTGGCATCCCTGGGGCATGAGCTGGGCGGAGMTCCACCCCGCAGGATGTTCAGAGGGACCCACTCCTTCATTTTTCAGAGTCAAAGGAATCAGAGGCTCACCCATGGCAGGCAGTGAAAAGAGCCAGGAGTCCTGGGTTCTAGTCCCTGCTCTGCCCCCAACTGGCTGTATAACCTTTGAAAAATCATTTTCTTTGTCTGAGTCTCTGGTTCTCCGTCAGCAACAGGCTGGCATMGGTCCCCTGCAGGTTCCTTCTAGCTGGAGCACTCAGAGCTTCCCTGACTGCTAGCAGCCTCTCTGGCCCTCACAGGGCTGATTGTTCTCCTTCTCCCTGGAGCTCTCTCTCCTGAAMTCTCCATCAGAGCAAGGCAGCCAGAGMGCCCCTGAGAGGGMTGATTGGGMGTGTCCACTTTCTCAACCGGCTCATCAMCACACTCCTTTGTCTATGAATGGCACATGTAMTGATGTTATATTTTGTATCTTTTATATCATATGCTTCACCATTCTGTAAAGGGCCTCTGCATTGTTGCTCCCATCAGGGGTCTCMGTGGAMTAMCCCTCGTGGATAACCAAAAAAAAAAAMAAAAAMSEQ ID NO :9人MASP-2的蛋白質(zhì)序列MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSffl.CEYDFVKLSSGAKVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAPGFAPTCDHHCHNH.GGFYCSCRAGYVLHRNKRTCSALCSGQVFTQRSGELSSPEYPRPYPKLSSCTYSISLEEGFSVILDFVESFDVETHPETLCPYDFLKIQTDREEHGPFCGKTLPHRIETKSNTVTITFVTDESGDHTGWKIHYTSTAQPCPYPMAPPNGHVSPVQAKYILKDSFSIFCETGYELLQGHLPLKSFTAVCQKDGSWDRPMPACSIVDCGPPDDLPSGRVEYITGPGVTTYKAVIQYSCEETFYTMKVNDGKYVCEADGFWTSSKGEKSLPVCEPVC GLSARTTGGRIYGGQKAKPGDFPWQVLILGGTTMGALLYDNWVLTAAHAVYEQKHDASALDIRMGTLKRLSPHYTQAWSEAVFIHEGYTHDAGFDNDIALIKLNMVVINSNITPICLPRKEAESFMRTDDIGTASGWGLTQRGFLARNLMYVDIPIVDHQKCTAAYEKPPYPRGSVTANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALVFLDSETERWFVGGIVSWGSMNCGEAGQYGVYTKVINYIPWIENIISDF
SEQ ID NO : 10 人 MASP-2 的 cDNA 序列GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCCCCTTGGGCCCGMGTGGCCTGMCCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCAGGGGAGTATGCCMTGACCAGGAGCGGCGCTGGACCCTGACTGCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCACTTCGACCTGGAGCTCTCCCACCTCTGCGAGTACGACTTCGTCMGCTGAGCTCGGGGGCCMGGTGCTGGCCACGCTGTGCGGGCAGGAGAGCACAGACACGGAGCGGGCCCCTGGCAAGGACACTTTCTACTCGCTGGGCTCCAGCCTGGACATTACCTTCCGCTCCGACTACTCCAACGAGAAGCCGTTCACGGGGTTCGAGGCCTTCTATGCAGCCGAGGACATTGACGAGTGCCAGGTGGCCCCGGGAGAGGCGCCCACCTGCGACCACCACTGCCACAACCACCTGGGCGGTTTCTACTGCTCCTGCCGCGCAGGCTACGTCCTGCACCGTMCAAGCGCACCTGCTCAGCCCTGTGCTCCGGCCAGGTCTTCACCCAGAGGTCTGGGGAGCTCAGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAACTCTCCAGTTGCACTTACAGCATCAGCCTGGAGGAGGGGTTCAGTGTCATTCTGGACTTTGTGGAGTCCTTCGATGTGGAGACACACCCTGAMCCCTGTGTCCCTACGACTTTCTCAAGATTCAAACAGACAGAGAAGMCATGGCCCATTCTGTGGGMGACATTGCCCCACAGGATTGAMCAAAMGCMCACGGTGACCATCACCTTTGTCACAGATGMTCAGGAGACCACACAGGCTGGMGATCCACTACACGAGCACAGCGCAGCCTTGCCCTTATCCGATGGCGCCACCTAATGGCCACGTTTCACCTGTGCMGCCAMTACATCCTGAAAGACAGCTTCTCCATCTTTTGCGAGACTGGCTATGAGCTTCTGCAAGGTCACTTGCCCCTGAAATCCTTTACTGCAGTTTGTCAGAMGATGGATCTTGGGACCGGCCAATGCCCGCGTGCAGCATTGTTGACTGTG
GCCCTCCTGATGATCTACCCAGTGGCCGAGTGGAGTACATCACAGGTCCTGGAGTGACCACCTACAMGCTGTGATTCAGTACAGCTGTGAAGAGACCTTCTACACMTGAAAGTGMTGATGGTAMTATGTGTGTGAGGCTGATGGATTCTGGACGAGCTCCAMGGAGAAAMTCACTCCCAGTCTGTGAGCCTGTTTGTGGACTATCAGCCCGCACAACAGGAGGGCGTATATATGGAGGGCAAMGGCAAAACCTGGTGATTTTCCTTGGCMGTCCTGATATTAGGTGGMCCACAGCAGCAGGTGCACTTTTATATGACMCTGGGTCCTAACAGCTGCTCATGCCGTCTATGAGCAAAAACATGATGCATCCGCCCTGGACATTCGMTGGGCACCCTGAAAAGACTATCAC
CTCATTATACACAAGCCTGGTCTGAAGCTGTTTTTATACATGMGGTTATACTCATGATGCTGGCTTTGACMTGACATAGCACTGATTAAATTGMTAACAAAGTTGTAATCAATAGCAACATCACGCCTATTTGTCTGCCAAGAAMGAAGCTGAATCCTTTATGAGGACAGATGACATTGGMCTGCATCTGGATGGGGATTAACCCAMGGGGTTTTCTTGCTAGAAATCTMTGTATGTCGACATACCGATTGTTGACCATCAAAMTGTACTGCTGCATATGAAAAGCCACCCTATCCAAGGGGAAGTGTMCTGCTAACATGCTTTGTGCTGGCTTAGAMGTGGGGGCAAGGACAGCTGCAGAGGTGACAGCGGGGGGCACTGGTGTTTCTAGATAGTGAMCAGAGAGGTGGTTTGTGGGAGGMTAGTGTCCTGGGGTTCCATGAATTGTGGGGAAGCAGGTCAGTATGGAGTCTACACAAAAGTTATTAACTATATTCCCTGGATCGAGMCATMTTAGTGATTTTTMCTTGCGTGTCTGCAGTCAAGGATTCTTCATTTTTAGAMTGCCTGTGMGACCTTGGCAGCGACGTGGCTCGAGMGCATTCATCATTACTGTGGACATGGCAGTTGTTGCTCCACCCAAAAAAACAGACTCCAGGTGAGGCTGCTGTCATTTCTCCACTTGCCAGTTTMTTCCAGCCTTACCCATTGACTCAAGGGGACATAMCCACGAGAGTGACAGTCATCTTTGCCCACCCAGTGTAATGTCACTGCTCAAATTACATTTCATTACCTTAAAMGCCAGTCTCTTTTCATACTGGCTGTTGGCATTTCTGTAAACTGCCTGTCCATGCTCTTTGTTTTTAMCTTGTTCTTATTGAAAAAMAAAAAAAAAASEQ ID NO :11 人 sMAP(MApl9)的蛋白質(zhì)序列MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSffl,CEYDFVKLSSGAKVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAPGEAPTCDHHCHNH.GGFYCSCRAGYVLHRNKRTCSEQSLSEQ ID NO :12 人 sMAP(MApl9)的 cDNA 序列GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCCCCTTGGGCCCGMGTGGCCTGMCCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCAGGGGAGTATGCCMTGACCAGGAGCGGCGCTGGACCCTGACTGCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCACTTCGACCTGGAGCTCTCCCACCTCTGCGAGTACGACTTCGTCMGCTGAGCTCGGGGGCCMGGTGCTGGCCACGCTGTGCGGGCAGGAGAGCACAGACACGGAGCGGGCCCCTGGCAAGGACACTTTCTACTCGCTGGGCTCCAGCCTGGACATTACCTTCCGCTCCGACTACTCCAACGAGAAGCCGTTCACGGGGTTCGAGGCCTTCTATGCAGCCGAGGACATTGACGAGTGCCAGGTGGCCCCGGGAGAGGCGCCCACCTGCGACCACCACTGCCACAACCACCTGGGCGGTTTCTACTGCTCCTGCCGCGCAGGCTACGTCCTGCACCGTMCAAGCGCACCTGCTCAGAGCAGAGCCTCTAGCCTCCCCTGGAGCTCCGGCCTGCCCAGCAGGTCAGMGCCAGAGCCAGCCTGCTGGCCTCAGCTCCGGGTTGGGCTGAGATGGCTGTGCCCCAACTCCCATTCACCCACCATGGACCCAATAATAAACCTGGCCCCACCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAADNA 引物SEQ ID NO :13 :5' -gcacccagagccacagtg-3'SEQ ID NO :14 :5' -gccttccagtgtgtgggc-31
SEQ ID NO : 15 :5_gccttccagagtgtggtca_3'SEQ ID NO :16 :5' -cgatctggagagcgaactc-3!SEQ ID NO :17 5f -ctgttcttcacactggctg-3fSEQ ID NO :18 :5' -ctgctgagatcatgttgttc-3f SEQ ID NO :19 :5' -TTATACGACTCACTA-3'
權(quán)利要求
1.分離的ficolin-相關(guān)多肽。
2.按照權(quán)利要求I的多肽，其基本上是純的。
3.按照權(quán)利要求I或2的多肽，其中所述多肽能夠與甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)締合。
4.按照權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽,其中所述多肽能夠與ficolin-1,ficolin-2,或ficolin-3中的任一種相締合。
5.按照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽能夠與Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D，和細(xì)胞內(nèi)膠原樣防御分子，諸如CL-Ll中的任一種相締合。
6.按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽能夠與特異性接受體蛋白，諸如特異性受體相締合。
7.按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽包含SEQNO 3的氨基酸序列20-297、或其功能性變體。
8.按照權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽包含SEQNO 1的氨基酸序列20-380、或其功能性變體。
9.按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO 9的氨基酸序列16-296或其功能性變體。
10.按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽在非還原條件下在SDS-PAGE上具有約40kDa的分子量。
11.按照權(quán)利要求1-8或10中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽在與選自SEQNO 1的49和178的位置相對應(yīng)的一個或兩個氨基酸處被N-連接糖基化。
12.按照權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽是重組蛋白。
13.按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽是同型二聚體形式的。
14.按照權(quán)利要求1-8、10-13中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽由SEQIDNO I的氨基酸序列20-380組成。
15.按照權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的多肽，其包含SEQID NO 4的氨基酸序列或其變體或免疫學(xué)片段。
16.包含SEQID NO 4的氨基酸序列或其變體或免疫學(xué)片段的多肽。
17.按照權(quán)利要求16的多肽，其由SEQID NO :4、或其變體或免疫學(xué)片段組成。
18.按照權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽介導(dǎo)瀕死細(xì)胞或死亡細(xì)胞、和/或細(xì)胞碎片的吞噬，所述瀕死細(xì)胞或死亡細(xì)胞諸如凋亡細(xì)胞。
19.按照權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽介導(dǎo)微生物的吞噬。
20.按照權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽具有與具有序列同源性的其它蛋白相似的活性，所述其它蛋白如吞沒銜接蛋白(GULP)。
21.特異性結(jié)合按照權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的多肽的抗體。
22.編碼權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的多肽的分離的核酸分子。
23.包含與SEQNO :2的序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的分尚的核酸分子。
24.包含按照權(quán)利要求22-23中任一項(xiàng)的分離的核酸分子的載體。
25.包含按照權(quán)利要求24的載體的宿主細(xì)胞。
26.按照權(quán)利要求25的宿主細(xì)胞，其是真核細(xì)胞。
27.按照權(quán)利要求26的宿主細(xì)胞，其是哺乳動物來源的。
28.按照權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自由CHO細(xì)胞、HEK細(xì)胞和BHK細(xì)胞組成的組。
29.產(chǎn)生如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽的方法，所述方法包括在允許多核苷酸構(gòu)建體表達(dá)的條件下在適合的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)定義的細(xì)胞，并且從所述培養(yǎng)基中回收得到的多肽。
30.包含如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽的組合物。
31.包含如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽的藥物組合物。
32.檢測生物學(xué)樣品中的如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽的方法，所述方法包括 a)獲得生物學(xué)樣品； b)使所述生物學(xué)樣品與按照權(quán)利要求21的抗體接觸；并且 c)如果有的話，檢測所述抗體與所述多肽的復(fù)合物； 作為所述樣品中存在所述多肽的指示。
33.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用作藥物。
34.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽用于制備藥物的用途。
35.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用于治療與炎癥、凋亡和/或自體免疫性相關(guān)的任意適應(yīng)證。
36.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用于治療任意自體免疫性病癥，諸如艾迪生病，自體免疫性溶血性貧血，自體免疫性甲狀腺炎，局限性回腸炎，格雷夫斯病，吉蘭-巴雷綜合征，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，狼瘡性腎炎，多發(fā)性硬化病，重癥肌無力，銀屑病，原發(fā)性膽汁性肝硬變，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和葡萄膜炎，哮喘，動脈粥樣硬化，I型糖尿病，銀屑病，各種過敏癥。
37.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用于治療選自由下列組成的組的任意炎性病癥闌尾炎，消化性潰瘍，胃潰瘍，十二指腸潰瘍，腹膜炎，胰腺炎，潰瘍性結(jié)腸炎，假膜性結(jié)腸炎，急性結(jié)腸炎，缺血性結(jié)腸炎，憩室炎，會厭炎，失弛緩癥，膽管炎，膽囊炎，肝炎，局限性回腸炎，腸炎，惠普爾病，過敏癥，免疫復(fù)合物病，器官缺血，再灌注損傷，器官壞死，花粉癥,膿毒癥,敗血病，內(nèi)毒素性休克,惡病質(zhì),高燒,嗜酸性肉芽腫，肉芽腫病，肉瘤樣病,感染性流產(chǎn)，附睪炎，陰道炎，前列腺炎，尿道炎，支氣管炎，肺氣腫，鼻炎，肺炎，肺塵病，肺泡炎，毛細(xì)支氣管炎，咽頭炎，胸膜炎，竇炎，流感，呼吸道合胞病毒感染，HIV感染，乙型肝炎病毒感染，丙型肝炎病毒感染，彌散性菌血癥，登革熱，念珠菌病，瘧疾，絲蟲病，阿米巴病，包蟲囊腫，燒傷，皮炎，皮肌炎，曬傷，蕁麻疫，撫，風(fēng)疹塊，血管炎，脈管炎，心內(nèi)膜炎，動脈炎，動脈粥樣硬化，血栓性靜脈炎，心包炎，心肌炎，心肌缺血，結(jié)節(jié)性動脈周圍炎，風(fēng)濕熱，阿爾茨海默病，腹腔病，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫綜合征，腦膜炎，腦炎，多發(fā)性硬化病，腦梗死，腦栓塞，吉蘭-巴雷綜合征，神經(jīng)炎，神經(jīng)痛，脊髓損傷，癱瘓，葡萄膜炎，關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特病，痛風(fēng)，牙周病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，滑膜炎，重癥肌無力，甲狀腺炎，系統(tǒng)性紅斑性狼瘡，肺出血腎炎綜合征，貝赫切特綜合征，同種異體移植排斥，移植物抗宿主病，I型糖尿病，強(qiáng)直性脊柱炎，貝格爾病，萊特爾綜合征和霍奇金病，角膜炎，2型糖尿病，囊性纖維化，心肌梗死，再灌注損傷，中風(fēng)，皮肌炎，代謝綜合征，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，膿毒癥，多器官衰竭，彌漫性血管內(nèi)凝血，過敏性休克，血管并發(fā)癥和與I型和/或2型糖尿病相關(guān)的腎病，腦膜炎，細(xì)菌性敗血病，并發(fā)性瘧疾，非典型的溶血性尿毒癥綜合征，溶血性尿毒癥綜合征，年齡相關(guān)的黃斑變性，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥，蛇毒咬傷，燒傷，和器官移植并發(fā)癥。
38.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用于治療選自由下列組成的組的任意炎性病癥器官缺血，再灌注損傷，器官壞死，血管炎，心內(nèi)膜炎，動脈粥樣硬化，血栓性靜脈炎,心包炎,心肌炎,心肌缺血,結(jié)節(jié)性動脈周圍炎，風(fēng)濕熱，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫綜合征，腦梗死，腦栓塞，血管并發(fā)癥和與I型和/或2型糖尿病相關(guān)的腎病。
39.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用于治療與凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病有關(guān)的任意適應(yīng)證。
40.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用于治療與凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病或病癥有關(guān)的適應(yīng)證，包括炎性反應(yīng)和與纖維蛋白形成有關(guān)的慢性血栓栓塞疾病或病癥,包括血管病癥,如血栓形成,諸如深靜脈血栓形成,動脈血栓形成,術(shù)后血栓形成，冠狀動脈旁路移植(CABG)，經(jīng)皮透皮冠狀血管成形(PTCA)，血小板沉積中風(fēng)，腫瘤生長，腫瘤轉(zhuǎn)移，血管發(fā)生，血栓溶解，動脈粥樣硬化，再狹窄，如動脈硬化和/或血管成形后的再狹窄，急性和慢性適應(yīng)證，如炎癥，膿毒癥，膿毒性休克，敗血病，低血壓，成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，彌散性血管內(nèi)凝血病(DIC)，肺栓塞，病理性血小板沉積，心肌梗死，或用于預(yù)防性治療具有動脈粥樣硬化血管的哺乳動物，所述哺乳動物有風(fēng)險患有血栓形成,外周血祖細(xì)胞(PBPC)移植后的靜脈閉塞病，溶血性尿毒癥綜合征(HUS)，和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，和風(fēng)濕熱。
41.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用于治療與凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病或病癥有關(guān)的適應(yīng)證，包括炎性反應(yīng)和與纖維蛋白形成有關(guān)的慢性血栓栓塞疾病或病癥,包括血管病癥,如血栓形成,諸如深靜脈血栓形成,動脈血栓形成,術(shù)后血栓形成，冠狀動脈旁路移植(CABG)，經(jīng)皮透皮冠狀血管成形(PTCA)，血小板沉積中風(fēng)，腫瘤生長，腫瘤轉(zhuǎn)移，血管發(fā)生，血栓溶解，動脈粥樣硬化，再狹窄，如動脈硬化和/或血管成形后的再狹窄，急性和慢性適應(yīng)證如炎癥，病理性血小板沉積，心肌梗死，或用于預(yù)防性治療具有動脈粥樣硬化血管的哺乳動物，所述哺乳動物有風(fēng)險患有血栓形成，外周血祖細(xì)胞(PBPC)移植后的靜脈閉塞病，溶血性尿毒癥綜合征(HUS)，和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，和風(fēng)濕熱。
42.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用于預(yù)防在鑒定的高危患者中發(fā)生血栓栓塞并發(fā)癥，所述鑒定的高?；颊呷缃?jīng)歷手術(shù)的那些或患有充血性心力衰竭的那些。
43.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用于治療與心臟相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥。
44.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽，其用于治療與ficolin-相關(guān)多肽缺乏有關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥。
45.用于治療與炎癥、凋亡和/或自體免疫性相關(guān)的任意適應(yīng)證的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽。
46.用于治療任意自體免疫性疾病或與自體免疫性表現(xiàn)有關(guān)的疾病的方法，所述疾病如艾迪生病，自體免疫性溶血性貧血，自體免疫性甲狀腺炎，局限性回腸炎，格雷夫斯病，吉蘭-巴雷綜合征，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，狼瘡性腎炎，多發(fā)性硬化病，重癥肌無力，銀屑病，原發(fā)性膽汁性肝硬變，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和葡萄膜炎，哮喘，動脈粥樣硬化，I型糖尿病，銀屑病，和各種過敏癥，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的如權(quán)利要求.1-20中任一項(xiàng)定義的多肽。
47.用于治療選自由下列組成的組的任意炎性病癥的方法闌尾炎，消化性潰瘍，胃潰瘍，十二指腸潰瘍，腹膜炎，胰腺炎，潰瘍性結(jié)腸炎，假膜性結(jié)腸炎，急性結(jié)腸炎，缺血性結(jié)腸炎，憩室炎，會厭炎，失弛緩癥，膽管炎，膽囊炎，肝炎，局限性回腸炎，腸炎，惠普爾病，過敏癥,過敏性休克,免疫復(fù)合物病,器官缺血,再灌注損傷,器官壞死,花粉癥,膿毒癥,敗血病，內(nèi)毒素性休克，惡病質(zhì)，高燒，嗜酸性肉芽腫，肉芽腫病，肉瘤樣病，感染性流產(chǎn)，附睪炎，陰道炎，前列腺炎，尿道炎，支氣管炎，肺氣腫，鼻炎，肺炎，肺塵病，肺泡炎，毛細(xì)支氣管炎，咽頭炎，胸膜炎，竇炎，流感，呼吸道合胞病毒感染，HIV感染，乙型肝炎病毒感染，丙型肝炎病毒感染，彌散性菌血癥，登革熱，念珠菌病，瘧疾，絲蟲病，阿米巴病，包蟲囊腫，燒傷，皮炎，皮肌炎，曬傷，蕁麻疹，疣，風(fēng)疹塊，血管炎，脈管炎，心內(nèi)膜炎，動脈炎，動脈粥樣硬化，血栓性靜脈炎，心包炎，心肌炎，心肌缺血，結(jié)節(jié)性動脈周圍炎，風(fēng)濕熱，阿爾茨海默病，腹腔病，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫綜合征，腦膜炎，腦炎，多發(fā)性硬化病，腦梗死，腦栓塞，吉蘭-巴雷綜合征，神經(jīng)炎，神經(jīng)痛，脊髓損傷，癱瘓，葡萄膜炎，關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特病，痛風(fēng)，牙周病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，滑膜炎，重癥肌無力，甲狀腺炎，系統(tǒng)性紅斑性狼瘡，肺出血腎炎綜合征，貝赫切特綜合征，同種異體移植排斥，移植物抗宿主病，I型糖尿病，強(qiáng)直性脊柱炎，貝格爾病，萊特爾綜合征和霍奇金病；所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽。
48.用于治療與凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病有關(guān)的任意適應(yīng)證的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽。
49.用于治療與凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病或病癥有關(guān)的適應(yīng)證，或用于預(yù)防性治療具有動脈粥樣硬化血管有風(fēng)險患有血栓形成、外周血祖細(xì)胞(PBPC)移植后的靜脈閉塞病、溶血性尿毒癥綜合征(HUS)、和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)的哺乳動物的方法，所述適應(yīng)證包括炎性反應(yīng)和與纖維蛋白形成有關(guān)的慢性血栓栓塞疾病或病癥，包括血管病癥,如血栓形成,諸如深靜脈血栓形成,動脈血栓形成,術(shù)后血栓形成,冠狀動脈旁路移植(CABG)，經(jīng)皮透皮冠狀血管成形(PTCA)，血小板沉積中風(fēng)，腫瘤生長，腫瘤轉(zhuǎn)移，血管發(fā)生，血栓溶解，動脈粥樣硬化，再狹窄，如動脈硬化和/或血管成形后的再狹窄，急性和慢性適應(yīng)證，如炎癥，膿毒癥，膿毒性休克，敗血病，低血壓，成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，彌散性血管內(nèi)凝血病(DIC)，肺栓塞，病理性血小板沉積，心肌梗死，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽。
50.用于預(yù)防在鑒定的高?；颊咧邪l(fā)生血栓栓塞并發(fā)癥的方法，所述高?；颊呷缃?jīng)歷手術(shù)的那些或患有充血性心力衰竭的那些，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽。
51.用于治療與心臟相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽。
52.用于治療與ficolin-相關(guān)多肽缺乏有關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用治療或預(yù)防有效量的如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽。
53.在嚴(yán)格條件下能夠與權(quán)利要求22-23中任一項(xiàng)的核酸序列雜交的核酸探針。
54.檢測生物學(xué)樣品中存在編碼權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽的核酸的方法，所述方法包括 a)獲得生物學(xué)樣品； b)使所述生物學(xué)樣品與權(quán)利要求53的核酸探針接觸；并且 c)如果有的話，檢測所述核酸探針與編碼所述多肽的所述核酸的復(fù)合物； 作為在所述樣品中存在編碼所述多肽的所述核酸的指示。
55.診斷與ficolin-相關(guān)多肽異常表達(dá)有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括獲得來自患者的生物學(xué)樣品，并且測量所述生物學(xué)樣品中所述ficolin-相關(guān)多肽的表達(dá)，其中，與對照相比，所述生物學(xué)樣品中所述ficolin-相關(guān)多肽增加或減少的表達(dá)表示所述患者患有與ficolin-相關(guān)多肽異常表達(dá)有關(guān)的病癥。
56.分離的組合物，其包括如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽與選自下列的一種或多種蛋白的組合Ficolin-l、2、3，甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP-D，和細(xì)胞內(nèi)膠原樣防御分子，諸如CL-Ll。
57.按照權(quán)利要求56的組合物，其是藥物組合物。
58.如權(quán)利要求57定義的藥物組合物，其用作藥物。
59.如權(quán)利要求56定義的組合物用于制備藥物的用途。
60.如權(quán)利要求57定義的藥物組合物，其用于治療與炎癥、凋亡和/或自體免疫性相關(guān)的任意適應(yīng)證。
61.如權(quán)利要求57定義的藥物組合物，其用于治療如權(quán)利要求36-44中任一項(xiàng)定義的任意適應(yīng)證。
62.用于治療如權(quán)利要求35-44中任一項(xiàng)定義的任意適應(yīng)證的方法,所述方法包括同時或順次施用治療或預(yù)防有效量的如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽和一種或多種選自Ficolin-l、2、3，和甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)，Clq，肺表面活性蛋白SP-A和/或SP_D，和細(xì)胞內(nèi)膠原樣防御分子，諸如CL-Ll的蛋白。
63.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽作為血液和組織中的生物標(biāo)記的用途，用于惡性疾病，諸如癌癥疾病，諸如腦瘤、肝腫瘤和生殖道腫瘤的診斷和/或預(yù)后。
64.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)定義的多肽作為血液和組織中的生物標(biāo)記的用途，用于如權(quán)利要求35-44中任一項(xiàng)定義的自體免疫、代謝和/或炎性病癥的診斷和/或預(yù)后。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型ficolin-相關(guān)多肽，和衍生于這些ficolin-相關(guān)多肽的多肽，其用于治療與炎癥、凋亡、自體免疫性、凝結(jié)、血栓形成或凝血病相關(guān)的疾病有關(guān)的病癥的治療，以及用作生物標(biāo)記。本發(fā)明還涉及識別所述新型ficolin-相關(guān)多肽和衍生于其的多肽的抗體、編碼所述多肽的核酸分子、用于生產(chǎn)所述多肽的載體和宿主細(xì)胞。
文檔編號C07K14/47GK102712687SQ201080041321
公開日2012年10月3日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者彼得·加雷爾, 米克爾-奧勒·舍爾德, 蒂娜·胡梅爾肖伊·格盧 申請人:丹麥國家醫(yī)院, 南丹麥大學(xué), 哥本哈根大學(xué)