專利名稱：二鳥苷酸環(huán)化酶、其生產(chǎn)方法及其在制備環(huán)化-di-GMP及其類似物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的二鳥苷酸環(huán)化酶、其制備方法以及其在生產(chǎn)環(huán)化-di-GMP及環(huán)化-di-GMP類似物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
C-di-GMP或者雙_(3' -5' )_環(huán)化二聚體鳥苷一磷酸(環(huán)化-di-GMP或者 c-di-GMP)是在細菌中發(fā)現(xiàn)的進行胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使(1，2)。積累的證據(jù)提示 c-di-GMP調(diào)節(jié)多種細菌行為，如生物膜形成、能動性以及毒力表達(2)。c-di-GMP在生物膜形成和毒力表達中的關(guān)鍵作用表明c-di-GMP在由一些病原菌導(dǎo)致的慢性和急性感染中起關(guān)鍵作用。環(huán)化-di-GMP是廣泛的細菌信使分子，具有作為治療細菌感染的治療劑的潛力。 環(huán)化-di-GMP及其類似物作為治療劑的潛在應(yīng)用包括抑制金黃色葡萄球菌(S. aureus) 建群和生物膜形成；抑制人結(jié)腸癌細胞增殖；免疫調(diào)節(jié)分子以及對于抗體產(chǎn)生具有強力作用，及在醫(yī)療設(shè)備和裝置中如在肺吸入器、心臟支架、心臟瓣膜、腸道插管等中防止生物膜形成或者促進生物膜分散。鑒于越來越多的c-di-GMP信號傳導(dǎo)與細菌發(fā)病機制之間的明顯關(guān)聯(lián)，在微生物學(xué)界特別感興趣鑒別和鑒定c-di-GMP信號網(wǎng)絡(luò)的成分。同時，也探索了 c-di-GMP直接作為治療細菌感染的治療劑的應(yīng)用。據(jù)報道外源c-di-GMP可以降低體外細胞-細胞相互作用以及革蘭氏陽性病原體金黃色葡萄球菌包括人甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌菌株和動物臨床分離株的生物膜形成(9)。在乳腺炎感染的鼠模型中發(fā)現(xiàn)c-di-GMP抑制金黃色葡萄球菌建群和生物膜形成，導(dǎo)致宿主清除該病原體的能力增強(10)。研究表明c-di-GMP可以通過抑制人結(jié)腸癌細胞的基礎(chǔ)增殖和生長因子誘導(dǎo)的增殖而調(diào)節(jié)宿主細胞應(yīng)答(11)。研究還提示c-di-GMP是具有強力免疫預(yù)防性質(zhì)和對抗體產(chǎn)生具有疫苗佐劑作用的免疫調(diào)節(jié)分子(12)。參與c-di-GMP信號傳導(dǎo)的大分子包括酶和受體的生物化學(xué)鑒定需要使用 c-di-GMP作為生物化學(xué)測定的底物或者配體。C-di-GMP也可以用作起始材料以合成 c-di-GMP類似物作為化學(xué)探針或者抑制劑。盡管c-di-GMP可以直接得自細菌細胞，但是 c-di-GMP的較低細胞內(nèi)濃度使得這種方法不適于c-di-GMP生產(chǎn)。環(huán)化di-GMP是由具有二鳥苷酸環(huán)化酶活性的蛋白質(zhì)合成。這些蛋白質(zhì)典型具有特征性GGDEF基序，其是指5個氨基酸的保守序列。所述GGDEF基序位于已經(jīng)在681個細菌菌種中觀測到的GGDEF結(jié)構(gòu)域內(nèi)。關(guān)于該結(jié)構(gòu)域的信息可見于Pfam蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫 (http //pfam. sanger. ac. uk/family ？ acc = PF00990)。目前使用已知的二鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)蛋白質(zhì)通過酶學(xué)合成c-di-GMP的產(chǎn)量低。環(huán)化di-GMP也是Gluconacetobacte.xylinus中纖維素合酶的別構(gòu)抑制劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)c-di-GMP在許多細菌中起作用，這通過大量含有GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的存在而證實(3，4)。GGDEF結(jié)構(gòu)域發(fā)揮二鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)功能，催化從GTP合成c-di-GMP (5,6), EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域發(fā)揮磷酸二酯酶(PDE-A)功能，降解 c-di-GMP (7，8)。目前在研究實驗室中c-di-GMP是經(jīng)化學(xué)或者酶法少量合成。溶液和固相化學(xué)合成方法由于合成途徑的多個步驟而是昂貴且耗時的(13-17)。另一方面，通過使用含有DGC 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)經(jīng)酶學(xué)產(chǎn)生c-di-GMP的方法僅包括兩個GTP分子的單縮合(6)。所述酶方法已經(jīng)由一些實驗室用于產(chǎn)生c-di-GMP以通過使用WspR、PIeD或者VCA0956進行生物化學(xué)測定，WspR、PieD和VCA0956是分別來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的三個含有嗜中溫 DGC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(18-21)。先前我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用嗜中溫DGC蛋白質(zhì)如WspR制備 c-di-GMP僅產(chǎn)生有限量的c-di-GMP (8)。已知DGC蛋白質(zhì)由細胞c-di-GMP濃度緊密調(diào)節(jié)。推測這種調(diào)節(jié)涉及PIeD中的 I-位點(22，23)。PIeD和WspR的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)顯示所述I-位點含有RXXD基序(23，24)。因為其作為細菌信號分子的作用及其在細菌毒力、發(fā)病機制和生物膜形成中的重要性，目前對c-di-GMP及其類似物特別感興趣。作為主要的研究和開發(fā)焦點，需要產(chǎn)生大體積的c-di-GMP或者類似物。使用熟知的DGC蛋白質(zhì)如WspR和PA290生產(chǎn)c-di-GMP的主要限制之一是在c-di-GMP制備期間酶活性明顯喪失。目前可利用的方法有所不足，僅產(chǎn)生有限量的c-di-GMP。能獲得大量環(huán)化di-GMP是開發(fā)該分子作為抗菌劑的前提條件。先前用于合成環(huán)化di-GMP的方法成本太高或者太耗時/耗力。發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供了包含GGDEF基序和I-位點的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中I位點的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一個由中性氨基酸置換，形成不結(jié)合c-di-GMP 的突變體二鳥苷酸環(huán)化酶。優(yōu)選所述中性氨基酸是非極性氨基酸或者不帶電荷的極性氨基酸。在一個實施方案中，所述非極性氨基酸是丙氨酸。在一個實施方案中，所述不帶電荷的極性氨基酸是谷氨酰胺。在優(yōu)選的實施方案中，所述二鳥苷酸環(huán)化酶多肽包含這樣的氨基酸序列，其與分離自嗜熱細菌的包含GGDEF基序的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽具有至少90%同源性。優(yōu)選所述嗜熱細菌選自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、產(chǎn)乙醇熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、泉生熱袍菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、多節(jié) I^]爍桿菌 (Fervidobacterium nodosum) > Thermosipho melanesiensis> thermotoga petrophila 或者熱醋穆爾氏菌(Moorella thermoacetica)。在一個實施方案中，所述嗜熱細菌是海棲熱袍菌。優(yōu)選所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶包含在溶液中的單體。在優(yōu)選的實施方案中，所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示或者SEQ ID NO 3所示序列。在一個實施方案中，所述二鳥苷酸環(huán)化酶與支持物偶聯(lián)。在一個實施方案中，所述支持物是sol-gel。
本發(fā)明另一方面提供了能表達突變體二鳥苷酸環(huán)化酶多肽的多核苷酸，所述多肽包含GGDEF基序及I-位點，其中I位點的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一個由中性氨基酸置換。在一個實施方案中，權(quán)利要求10的多核苷酸包含SEQ ID NO :1所示序列。本發(fā)明另一方面提供了包含本發(fā)明多核苷酸的表達載體，所述多核苷酸與能指導(dǎo)所述多核苷酸在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)序列可操縱地連接。本發(fā)明另一方面提供了產(chǎn)生不結(jié)合c-di-GMP的本發(fā)明突變體二鳥苷酸環(huán)化酶多肽的方法。在一個實施方案中，所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶多肽是化學(xué)合成的。在另一個實施方案中，所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶多肽在具有本發(fā)明的多核苷酸的本發(fā)明的表達載體中產(chǎn)生。本發(fā)明另一方面提供了制備環(huán)化di-GMP或者環(huán)化di-GMP類似物的方法，所述方法包括步驟a)將本發(fā)明的突變體二鳥苷酸環(huán)化酶多肽與鳥苷-5'-三磷酸溫育；及b)分離所述環(huán)化di-GMP或者環(huán)化di-GMP類似物。在一個實施方案中，所述類似物包括6-硫代-環(huán)化di-GMP。在另一個實施方案中，所述類似物包括32P-放射性同位素標記的環(huán)化di-GMP。本發(fā)明另一方面提供了通過本發(fā)明的方法制備的包含下式的類似物
權(quán)利要求
1.包含GGDEF基序及I-位點的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中I-位點的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一個由中性氨基酸置換，形成不結(jié)合c-di-GMP的突變體二鳥苷酸環(huán)化酶。
2.權(quán)利要求1的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述中性氨基酸是非極性氨基酸。
3.權(quán)利要求2的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述非極性氨基酸是丙氨酸。
4.權(quán)利要求1的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述中性氨基酸是不帶電荷的極性氨基酸。
5.權(quán)利要求4的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述不帶電荷的極性氨基酸是谷氨酰胺。
6.權(quán)利要求1或2的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其包含與分離自嗜熱細菌的包含GGDEF基序的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽具有至少90%同源性的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述嗜熱細菌選自海棲熱袍菌 (Thermotoga maritima)、產(chǎn)乙酉享熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、泉生熱袍菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、多節(jié)閃爍桿菌(Fervidobacterium nodosum)、Thermosipho melanesiensis、thermotoga petrophila 或者熱醋禾裏爾氏菌 (Moorella thermoacetica)0
8.權(quán)利要求6的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述嗜熱細菌是海棲熱袍菌。
9.權(quán)利要求1-8任一項的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶包含在溶液中的單體。
10.權(quán)利要求1-8任一項的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶包含 SEQ ID NO :2ο
11.權(quán)利要求1-8任一項的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶包含 SEQ ID NO :3ο
12.權(quán)利要求1-8任一項的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶包含 SEQ ID NO :4ο
13.前述權(quán)利要求任一項的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶與支持物偶聯(lián)。
14.權(quán)利要求13的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述支持物是sol-gel。
15.一種多核苷酸，所述多核苷酸能表達包含GGDEF基序及I-位點的突變體二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述I-位點的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一個由中性氨基酸置換。
16.權(quán)利要求15的多核苷酸，其包含SEQID NO=I的序列。
17.—種表達載體，其包含權(quán)利要求15或16的多核苷酸，所述多核苷酸與能指導(dǎo)所述多核苷酸在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)序列可操縱地連接。
18.權(quán)利要求1-14任一項的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶多肽是化學(xué)合成的。
19.權(quán)利要求1-14任一項的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其中所述突變體二鳥苷酸環(huán)化酶多肽在權(quán)利要求17的表達載體中產(chǎn)生。
20.生產(chǎn)環(huán)化-di-GMP或者環(huán)化-di-GMP類似物的方法，包括步驟a.將權(quán)利要求1-14任一項的突變體二鳥苷酸環(huán)化酶多肽與鳥苷-5’-三磷酸溫育；及b.分離所述環(huán)化-di-GMP或者環(huán)化-di-GMP類似物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述類似物包含6-硫代環(huán)化-di-GMP。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述類似物包含32P-放射性同位素標記的環(huán)化-di-GMP。
23.通過權(quán)利要求20的方法制備的類似物，其包含下式
全文摘要
本發(fā)明描述了一種新的獨立的二鳥苷酸環(huán)化酶多肽，其具有GGDEF基序及不結(jié)合c-di-GMP的一個突變的I-位點。我們證實了通過推定的調(diào)節(jié)性I-位點中保守殘基的突變顯著增加c-di-GMP及類似物的產(chǎn)量。本發(fā)明報道了c-di-GMP類似物的合成。
文檔編號C07K17/04GK102421892SQ201080019476
公開日2012年4月18日 申請日期2010年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日
發(fā)明者梁照珣, 饒楓 申請人:南洋理工大學(xué)