專利名稱：效應(yīng)子功能降低的穩(wěn)定Fc多肽及使用方法
效應(yīng)子功能降低的穩(wěn)定Fc多肽及使用方法相關(guān)申請(qǐng)本專利申請(qǐng)要求2009年1月23日提交的標(biāo)題為“STABILUED Fc POLYPEPTIDES WITH REDUCED EFFECTOR FUNCTION AND METHODS OF USE” 的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào) 61/146,950的權(quán)益。以上提及的臨時(shí)專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
獲得性免疫應(yīng)答是身體保護(hù)自身免受外來(lái)生物侵害身體引起感染或疾病的機(jī)制。 一種機(jī)制基于生成的或施用于宿主的抗體通過(guò)其可變區(qū)結(jié)合抗原的能力。一旦抗體結(jié)合了抗原，抗原就成為破壞的靶標(biāo)，通常至少部分通過(guò)抗體的恒定區(qū)或Fc區(qū)介導(dǎo)。存在若干經(jīng)抗體的Fc區(qū)介導(dǎo)的效應(yīng)子功能或活性。一種效應(yīng)子功能是在稱為補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)的過(guò)程中結(jié)合可協(xié)助溶解靶抗原(例如，細(xì)胞病原體)的補(bǔ)體蛋白的能力。Fc區(qū)的另一效應(yīng)活性為結(jié)合免疫細(xì)胞表面的Fc受體(例如，F(xiàn)cyRS)或通常所說(shuō)的效應(yīng)細(xì)胞，該效應(yīng)細(xì)胞具有觸發(fā)其它免疫作用的能力。這些免疫作用(例如，抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)和抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(ADCP))通過(guò)(例如)釋放免疫活化劑和調(diào)節(jié)抗體生成、胞吞作用、吞噬作用以及細(xì)胞殺傷在去除病原體/抗原中起作用。在一些臨床應(yīng)用中，這些應(yīng)答對(duì)于抗體的功效至關(guān)重要，而在其它情況下這些應(yīng)答引起有害的副作用。效應(yīng)介導(dǎo)的副作用的一個(gè)實(shí)例為釋放引起急性發(fā)熱反應(yīng)的炎癥性細(xì)胞因子。另一個(gè)實(shí)例是長(zhǎng)期缺失抗原攜帶細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)使用缺少Fc區(qū)的抗體片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab' )2或單鏈Fv(scFv))避免抗體的效應(yīng)子功能。然而，由于通過(guò)腎臟快速清除，這些片段的半衰期縮短；在Fab和scFv 片段僅具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)而不是兩個(gè)由于結(jié)合親合力可能損害任何優(yōu)點(diǎn)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的情況下；并且在制造中可能存在挑戰(zhàn)。替代性方法旨在降低全長(zhǎng)抗體的效應(yīng)子功能，同時(shí)保持Fc區(qū)其它有價(jià)值的屬性 (例如，半衰期延長(zhǎng)和異質(zhì)二聚體化)。降低效應(yīng)子功能的一種方法是通過(guò)去除與Fc區(qū)中的特定殘基連接的糖生成通常所說(shuō)的無(wú)糖基化抗體。例如，可通過(guò)刪除或改變與糖連接的殘基、通過(guò)酶促去除糖、在有糖基化抑制劑存在下培養(yǎng)的細(xì)胞中生成抗體，或通過(guò)在不能使蛋白質(zhì)糖基化的細(xì)胞(例如，細(xì)菌宿主細(xì)胞)中表達(dá)抗體而生成無(wú)糖基化抗體。另一種方法是采用來(lái)自IgG4而非IgGl抗體的Fc區(qū)。眾所周知，IgG4抗體特征在于具有比IgGl更低的補(bǔ)體活化和抗體依賴性細(xì)胞毒作用水平。盡管這些替代性方法有優(yōu)點(diǎn)，但現(xiàn)已確認(rèn)從抗體的Fc區(qū)去除低聚糖對(duì)其構(gòu)象和穩(wěn)定性有明顯的不利影響。另外，由于IgG4的CH3域與IgGl的CH3域相比缺乏穩(wěn)定性，所以IgG4抗體的穩(wěn)定性通常較低。就一切情況而論，抗體穩(wěn)定性損失或降低可呈現(xiàn)對(duì)抗體藥物開(kāi)發(fā)有不利影響的工藝開(kāi)發(fā)挑戰(zhàn)。因此，需要改良抗體和其它效應(yīng)子功能改變或降低、穩(wěn)定性提高的含F(xiàn)c的多肽和制備這些分子的方法。發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)提供用于提高Fc區(qū)穩(wěn)定性的改進(jìn)方法解決了現(xiàn)有技術(shù)“無(wú)效應(yīng)子”抗體，實(shí)際上為任何含F(xiàn)c的“無(wú)效應(yīng)子”蛋白的問(wèn)題。例如，本發(fā)明提供了穩(wěn)定性設(shè)計(jì)的Fc多肽，例如，穩(wěn)定的IgG抗體或其它含F(xiàn)c的結(jié)合分子，其包含在多肽的Fc區(qū)中的穩(wěn)定氨基酸。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在親本Fc多肽的Fc區(qū)中的特定氨基酸殘基處弓I入導(dǎo)致Fc區(qū)穩(wěn)定性提高的突變的方法。優(yōu)選地，穩(wěn)定的Fc多肽的效應(yīng)子功能改變或降低(與不包含穩(wěn)定氨基酸的多肽相比)，并且與親本Fc多肽相比表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明具有包括但不限于以下的若干優(yōu)點(diǎn)-提供包含穩(wěn)定的無(wú)糖基化Fc區(qū)的穩(wěn)定的無(wú)糖基化Fc多肽，例如，穩(wěn)定的融合蛋白或無(wú)糖基化IgG抗體，由于其效應(yīng)子功能降低而適于用作治療劑；-提供包含源自IgG4抗體的Fc區(qū)的穩(wěn)定的Fc多肽，例如，穩(wěn)定的糖基化或無(wú)糖基化融合蛋白或IgG4抗體，由于其效應(yīng)子功能降低為適于用作治療劑；-對(duì)多肽進(jìn)行最低限度的改變(例如，通過(guò)為不穩(wěn)定的親本多肽引入電荷或表達(dá)編碼穩(wěn)定的Fc多肽的核酸分子)生成穩(wěn)定的Fc多肽的有效方法；-在避免任何免疫原性和/或效應(yīng)子功能升高的同時(shí)提高Fc多肽穩(wěn)定性的方法；-提高Fc多肽的可量測(cè)性、生產(chǎn)和/或長(zhǎng)期穩(wěn)定性的方法；-用本發(fā)明的穩(wěn)定的Fc多肽治療需要治療的受試者的方法。一方面，本發(fā)明涉及包含嵌合Fc區(qū)的穩(wěn)定多肽，其中所述穩(wěn)定多肽包含至少一個(gè)源自人IgG4抗體的恒定域和至少一個(gè)源自人IgGl抗體的恒定域。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)為糖基化Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)為無(wú)糖基化Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)為包含位于Fc區(qū)的位置四7的谷氨酰胺(Q)和位置299 的丙氨酸(A)(歐盟編號(hào)規(guī)定)的無(wú)糖基化Fc區(qū)。另一方面，本發(fā)明涉及包含無(wú)糖基化Fc區(qū)的穩(wěn)定多肽，其中所述穩(wěn)定多肽包含位于所述Fc區(qū)的至少一個(gè)Fc部分中一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定Fc氨基酸，其中所述氨基酸位置選自297、299、307、309、399、409和427 (歐盟編號(hào)規(guī)定)。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合Fc區(qū)包含來(lái)自IgG4同種型的IgG抗體的CH2域和來(lái)自 IgGl同種型的IgG抗體的CH3域。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合Fc區(qū)包含來(lái)自IgG4同種型的IgG抗體的鉸鏈、CHl和CH2 域和來(lái)自IgGl同種型的IgG抗體的CH3域，并且其中抗體包含位于氨基酸位置2 的脯氨酸(歐盟編號(hào))。另一方面，本發(fā)明涉及包含來(lái)自IgG4抗體的Fc區(qū)的CH2部分的穩(wěn)定多肽，其中所述穩(wěn)定多肽包含位于一個(gè)或多個(gè)選自240FJ62LJ64T、266FJ97Q、299AJ99K、307P、309K、 309M、309P、323F、399S和427F(歐盟編號(hào)規(guī)定)氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定多肽包含位于氨基酸位置四7的Gin。一方面，本發(fā)明涉及包含來(lái)自IgGl抗體的Fc區(qū)的CH2部分的穩(wěn)定多肽，其中所述穩(wěn)定多肽包含位于一個(gè)或多個(gè)選自和(歐盟編號(hào)規(guī)定)氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含位于氨基酸位置四9的賴氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含位于氨基酸位置四9的賴氨酸和位于氨基酸位置四7的天冬氨酸。
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在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)為無(wú)糖基化Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，IgG抗體為人源抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于缺乏穩(wěn)定氨基酸的親本多肽，穩(wěn)定多肽的解鏈溫度 (Tm)升高至少1°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定的Fc多肽的解鏈溫度(Tm)升高約1°C或更多、約2°C或更多、約3°C或更多、約4°C或更多、約5°C或更多、約6°C或更多、約7°C或更多、約8°C或更多、約9°C或更多、約10°C或更多、約15°C或更多以及約20°C或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，在中性pH(約6. 5至約7. 5)下解鏈溫度(Tm)升高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在約6. 5或更低、約6. 0或更低、約5. 5或更低、約5. 0或更低、約4. 5或更低和約4. 0或更低的酸性pH下，解鏈溫度(Tm)升高。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于缺乏穩(wěn)定突變的親本多肽，穩(wěn)定多肽以更高的產(chǎn)量表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)物中，穩(wěn)定的Fc多肽以約5mg/L或更高、約 10mg/L或更高、約15mg/L或更高、約20mg/L或更高的產(chǎn)量表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于缺乏穩(wěn)定氨基酸的親本多肽，穩(wěn)定多肽的濁度降低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，濁度降低選自以下各項(xiàng)的倍數(shù)約1倍或更高、約2倍或更高、約3倍或更高、約4倍或更高、約5倍或更高、約6倍或更高、約7倍或更高、約8倍或更高、約9倍或更高、約10倍或更高、約15倍或更高、約50倍或更高和約100倍或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與缺乏穩(wěn)定突變的親本Fc多肽相比，所述穩(wěn)定多肽的效應(yīng)子功能降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，降低的效應(yīng)子功能為降低的ADCC活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，降低的效應(yīng)子功能為降低的與選自Fc γ RI、Fc γ RII和 Fc γ RIII的Fc受體(FcR)的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)子功能降低選自以下各項(xiàng)的倍數(shù)約1倍或更多、約2倍或更多、約3倍或更多、約4倍或更多、約5倍或更多、約6倍或更多、約7倍或更多、約8倍或更多、約9倍或更多、約10倍或更多、約15倍或更多、約50倍或更多和約100倍或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，與親本Fc多肽相比，所述穩(wěn)定多肽的半衰期增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，半衰期增加歸因于與新生兒受體(Fcfoi)的結(jié)合增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，半衰期增加選自以下各項(xiàng)的倍數(shù)約1倍或更多、約2倍或更多、約3倍或更多、約4倍或更多、約5倍或更多、約6倍或更多、約7倍或更多、約8倍或更多、約9倍或更多、約10倍或更多、約15倍或更多、約50倍或更多和約100倍或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)為二聚Fc區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)為單鏈Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)的所有Fc部分均被無(wú)糖基化。 在一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)糖基化Fc區(qū)包含位于Fc區(qū)的位置299 (歐盟編號(hào)規(guī)定)的取代。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)糖基化Fc區(qū)由于其在細(xì)菌宿主細(xì)胞中生成而被無(wú)糖基化。在一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)糖基化Fc區(qū)由于通過(guò)化學(xué)或酶促方法的去糖基化作用而被無(wú)糖基化。在一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)糖基化Fc區(qū)包含嵌合鉸鏈域。
在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合鉸鏈域包含在氨基酸位置228(歐盟編號(hào)規(guī)定)用脯氨酸殘基進(jìn)行的取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定氨基酸獨(dú)立地選自(i)位于位置四7的不帶電氨基酸、 (ii)位于位置299帶正電的氨基酸、(iii)位于位置307的極性氨基酸、(iv)位于位置309 帶正電的氨基酸或極性氨基酸、(ν)位于位置399的極性氨基酸、(vi)位于位置409帶正電的氨基酸或極性氨基酸和(vii)位于位置427的極性氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)穩(wěn)定氨基酸為位于氨基酸位置四7(歐盟編號(hào))的谷氨酰胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)穩(wěn)定氨基酸為位于位置四9的賴氨酸(K)或酪氨酸 ⑴。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)穩(wěn)定氨基酸為位于位置307的脯氨酸(P)或甲硫氨酸(M)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)穩(wěn)定氨基酸為位于位置309的脯氨酸(P)、甲硫氨酸 (M)或賴氨酸(K)。在--個(gè)實(shí)施方案中，至少--個(gè)穩(wěn)定突變?yōu)槲挥谖恢?99的絲氨酸⑶。
在--個(gè)實(shí)施方案中，至少--個(gè)穩(wěn)定突變?yōu)槲挥谖恢?40的苯丙氨丨f (F)0
在--個(gè)實(shí)施方案中，至少--個(gè)穩(wěn)定突變?yōu)槲挥谖恢?62的亮氨酸(L)。
在--個(gè)實(shí)施方案中，至少--個(gè)穩(wěn)定突變?yōu)槲挥谖恢?64的蘇氨酸⑴。
在--個(gè)實(shí)施方案中，至少--個(gè)穩(wěn)定突變?yōu)槲挥谖恢?66的苯丙氨丨f (F)0
在--個(gè)實(shí)施方案中，至少--個(gè)穩(wěn)定突變?yōu)槲挥谖恢?23的苯丙氨丨f (F)0
在--個(gè)實(shí)施方案中，至少--個(gè)穩(wěn)定突變?yōu)槲挥谖恢?09的賴氨酸⑷或甲硫氨
(M)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)穩(wěn)定突變?yōu)槲挥谖恢?27的苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括⑴位于位置299的丙氨酸㈧或賴氨酸⑷和(ii)位于位置266的苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括⑴位于位置四9的丙氨酸㈧或賴氨酸⑷和(ii)位于位置307的脯氨酸⑵。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置四9的賴氨酸(K)和(ii)位于位置399的絲氨酸(S)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置四9的賴氨酸(K)和(ii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含三個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置四9的丙氨酸(A)或賴氨酸(K)、(ii)位于位置沈2的亮氨酸(L)和 (iii)位于位置264的蘇氨酸(T)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含三個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括⑴位于位置四9的賴氨酸⑷、(ii)位于位置307的脯氨酸⑵和(iii)位于位置399的絲氨酸⑶。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含三個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括⑴位于位置四9的賴氨酸⑷、(ii)位于位置309的賴氨酸⑷和(iii)位于位置399的絲氨酸⑶。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含三個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括⑴位于位置四9的賴氨酸⑷、(ii)位于位置348的苯丙氨酸(F)和(iii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含三個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置四9的賴氨酸(K)、(ii)位于位置399的絲氨酸(S)和(iii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含四個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括⑴位于位置四9的丙氨酸㈧或賴氨酸⑷、(ii)位于位置沈2的亮氨酸(L)、 (iii)位于位置沈4的蘇氨酸(T)和(iv)位于位置沈6的苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置276的絲氨酸(S)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置觀6的蘇氨酸(T)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置323的苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括⑴位于位置307的脯氨酸⑵和(ii)位于位置309的脯氨酸⑵、賴氨酸⑷或甲硫氨酸(M)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置399的絲氨酸(S)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含三個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)、(ii)位于位置276的絲氨酸(S)和(iii)位于位置觀6的蘇氨酸⑴。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含三個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置307的脯氨酸(P) ； (ii)位于位置309的脯氨酸(P)、賴氨酸(K)或甲硫氨酸(M)和(iii)位于位置399的絲氨酸(S)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含三個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)、(ii)位于位置399的絲氨酸(S)和(iii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含三個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置309的脯氨酸(P)、賴氨酸(K)或甲硫氨酸(M)和(ii)位于位置308 的異亮氨酸(I)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定突變，所述穩(wěn)定突變包括(i)位于位置309的脯氨酸(P)、賴氨酸(K)或甲硫氨酸(M)和(ii)位于位置399 的絲氨酸⑶。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)可操作地連接至結(jié)合位點(diǎn)。
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在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)選自抗原結(jié)合位點(diǎn)、受體的配體結(jié)合部分或配體的受體結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)源自選自以下各項(xiàng)的修飾抗體SCFv、Fab、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、納米抗體、駱駝抗體和Dab。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定多肽為穩(wěn)定的全長(zhǎng)抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體選自單克隆抗體、嵌合抗體、人源抗體和人源化抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)包含六個(gè)⑶R，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)或來(lái)自選自以下的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)Rituximab、Daclizumab、Galiximab、CB6、Li33、5c8、 CBElU BDA8、14A2、B3F6、2B8、Lyml、Lym2、LL2、Her2、5E8、B1、MB 1、BH3、B4、B72. 3、CC49 和 5E10。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定的全長(zhǎng)抗體與常規(guī)或穩(wěn)定的scFv分子融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定多肽為穩(wěn)定的免疫粘附素。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)覆蓋在穩(wěn)定多肽的Fc區(qū)表面。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)源自非免疫球蛋白結(jié)合分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，非免疫球蛋白結(jié)合分子選自adnectin、親合體(affibody)、 DARPin 禾口 anticalin。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體的配體結(jié)合部分源自選自以下各項(xiàng)的受體免疫球蛋白(Ig)超家族的受體、TNF受體超家族的受體、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的受體、酪氨酸激酶(TK)受體超家族的受體、配體門控(LG)超家族的受體、趨化因子受體超家族的受體、IL-1/Toll樣受體(TLR)超家族、神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)受體家族的受體和細(xì)胞因子受體超家族。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述配體的受體結(jié)合部分源自抑制性配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體的所述受體結(jié)合部分源自活化配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述配體結(jié)合選自以下各項(xiàng)的受體免疫球蛋白(Ig)超家族的受體、TNF受體超家族的受體、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCI )超家族的受體、酪氨酸激酶(TK)受體超家族的受體、配體門控(LG)超家族的受體、趨化因子受體超家族的受體、IL-1/Toll樣受體(TLR)超家族和細(xì)胞因子受體超家族。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包含本發(fā)明的穩(wěn)定多肽的組合物及藥學(xué)上可接受的載體。一方面，本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定包含無(wú)糖基化嵌合Fc區(qū)或其部分的親本Fc多肽的方法，所述方法包括用穩(wěn)定氨基酸取代Fc區(qū)的至少一個(gè)Fc部分中的所選氨基酸從而生成相對(duì)于所述起始多肽穩(wěn)定性增強(qiáng)的穩(wěn)定Fc多肽，其中對(duì)選自位于四7、四9、307、309、399、 409和427(歐盟編號(hào)規(guī)定)的氨基酸位置的Fc部分的氨基酸進(jìn)行取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合Fc區(qū)包含來(lái)自IgG4同種型的IgG抗體的CH2域和來(lái)自 IgGl同種型的IgG抗體的CH3域。在一個(gè)實(shí)施方案中，存在于穩(wěn)定Fc多肽的氨基酸的氨基酸位置選自^7Q、299A、 299K、307P、309K、309M、309P、323F、399E、399S、409K、409M 和 427F。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定Fc多肽包含位于位置四7(歐盟編號(hào))的谷氨酰胺。另一方面，本發(fā)明涉及提高包含F(xiàn)c區(qū)或其部分的親本Fc多肽的產(chǎn)量的方法，所述方法包括用一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定氨基酸取代Fc區(qū)的至少一個(gè)Fc部分中的所選氨基酸以生成相對(duì)于所述親本多肽產(chǎn)量提高的穩(wěn)定的Fc多肽，其中穩(wěn)定氨基酸獨(dú)立地選自M0F、262L、 264T、266F、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S 和 427F(歐盟編號(hào)規(guī)定)。在一個(gè)實(shí)施方案中，起始Fc區(qū)為IgGlFc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明穩(wěn)定多肽的起始Fc區(qū)為IgG4Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，起始Fc區(qū)為無(wú)糖基化IgGlFc區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，起始Fc區(qū)為無(wú)糖基化IgG4Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定多肽包含兩個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中， 穩(wěn)定多肽包含三個(gè)或更多個(gè)穩(wěn)定氨基酸。另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定的結(jié)合多肽的核苷酸序列的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子包含編碼穩(wěn)定的結(jié)合多肽的多肽鏈的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含編碼穩(wěn)定的結(jié)合多肽或其多肽鏈的核酸分子的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種生成本發(fā)明的穩(wěn)定的Fc多肽的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞以便生成穩(wěn)定的Fc多肽?！矫妫景l(fā)明涉及一種大批量制備包含穩(wěn)定的Fc區(qū)的多肽的方法，所述方法包括(d)將至少一個(gè)穩(wěn)定的Fc部分基因融合至多肽，以形成穩(wěn)定的融合蛋白；(e)用編碼所述穩(wěn)定的融合蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞；(f)在使得穩(wěn)定的融合蛋白表達(dá)的條件下，在IOL或更多的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(f) 的宿主細(xì)胞；從而生成穩(wěn)定的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定的Fc區(qū)為包含來(lái)自IgG4同種型的IgG抗體的CH2域和來(lái)自IgGl同種型的IgG抗體的CH3域的嵌合Fe。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定的Fc區(qū)包含位于氨基酸位置四7(歐盟編號(hào))的谷氨酰胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療或預(yù)防受試者疾病或病癥的方法，其包括將本發(fā)明的結(jié)合分子或包含此類結(jié)合分子的組合物結(jié)合至患有所述疾病或病癥的受試者，從而治療或預(yù)防疾病或病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病或病癥選自炎癥性疾病、神經(jīng)障礙、自身免疫性疾病和腫瘤性疾病。從以下的詳細(xì)描述和權(quán)利要求將顯而易見(jiàn)本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了典型抗原結(jié)合多肽(IgG抗體)的結(jié)構(gòu)和抗體的抗原結(jié)合和效應(yīng)子功能(例如，F(xiàn)c受體(FcR)結(jié)合)的功能性質(zhì)。還示出了抗體CH2域中糖的存在(糖基化) 如何改變效應(yīng)子功能(FcR結(jié)合)，但不影響抗原結(jié)合。圖2描述了兩個(gè)來(lái)自IgGl的χ射線晶體結(jié)構(gòu)(pdb密碼lhzh)的相互作用的CH3域(圖2A)。突出了 IgGl殘基K409和D399。圖2B描述了使用基于結(jié)構(gòu)的HMM對(duì)人IgGl/ κ 恒定域序列的比對(duì)(Wang，N. ,Smith, W. ,Miller,B.，Aivazian，D. , Lugovskoy, A. ,Reff, Μ. ,Glaser,S. ,Croner,L. ,Demarest,S. (2008)Conserved amino acid networks involved in antibody variable domain interactions Proteins :Struct. Funct. Bioinform. In Press.)。以灰色突出域間相互作用涉及的Q、ChI和CH3的殘基位置和與碳水化合物直接接觸的那些氨基酸一起共同強(qiáng)烈變化的氨基酸位置。在比對(duì)下方提供了 Kabat和EU編號(hào)。 圖2C描述了 IgGl-CH2域的結(jié)構(gòu)的帶狀圖(Sondermarm等，2000)。標(biāo)記被N連接碳水化合物隱蔽的纈氨酸殘基和Ch2域中唯一的6氨基酸環(huán)。圖2D描述了天然IgGl-CH2序列和經(jīng)完全修飾的IgGl-C^序列的比對(duì)。經(jīng)修飾的殘基位置以黑色示出。在比對(duì)的上面示出修飾位置的EU編號(hào)。圖3描述了攪拌之后本發(fā)明的示例性IgG Fc構(gòu)建體的濁度(圖A)和％單體含量 (圖 B)。圖4描述了在保持低pH(pH 3. 1)時(shí)IgG Fc構(gòu)建體隨時(shí)間的相對(duì)峰高。圖5描述了通過(guò)溶液親合力表面等離子體共振測(cè)量的本發(fā)明的示例性IgGl和 IgG4Fc構(gòu)建體與Fc γ受體的初始結(jié)合率。圖6描述了用于計(jì)算本發(fā)明的示例性IgGl和IgG4Fc構(gòu)建體與⑶64(Fe Y RI)(圖 6A)和CD16 (Fe YRIIIa V158)(圖6B)的結(jié)合的IC50的滴定曲線。圖7描述了滴定曲線，突出與IgGlD99A和IgGl野生型相比，IgGlD99K與 CD64 (Fe y RI)的結(jié)合降低(圖7A)，與其它含有D99A突變的示例性IgG4Fc構(gòu)建體和IgGl 野生型相比含有D99K突變的示例性IgG4Fc構(gòu)建體與⑶64 (Fe y RI)的結(jié)合降低(圖7Β)。圖8描述了與其它含有D99A突變的示例性IgG4Fc構(gòu)建體和IgGl野生型相比， 含有T299K突變的示例性IgG4Fc構(gòu)建體與CD16(FcYRIIIa V158)的結(jié)合。圖9描述了用于評(píng)估本發(fā)明示例性IgGl構(gòu)建體和IgG4Fc構(gòu)建體與補(bǔ)體因子的結(jié)合的滴定曲線。圖10圖A和B分別示出用于評(píng)估各Fc構(gòu)建體與⑶64和⑶16的結(jié)合的滴定曲線。圖C示出N297Q IgG4-CH2/IgGl-CH3的半衰期與T299A抗體(其比無(wú)糖基化IgGl稍短)相同。圖11圖A示出用于評(píng)估D99X構(gòu)建體與⑶64結(jié)合的滴定曲線，并說(shuō)明帶正電的側(cè)鏈T299R和T299K對(duì)⑶64的親合力低。圖B示出用于評(píng)估⑶64與各替代性構(gòu)建體的結(jié)合的滴定曲線。圖C和D示出用于評(píng)估構(gòu)建體與CD32aR的結(jié)合的滴定曲線，以及圖E和F 示出構(gòu)建體與⑶16的結(jié)合。圖G和H示出Clq ELISA的結(jié)果。圖12圖A示出用于評(píng)估構(gòu)建體與CD64的結(jié)合的滴定曲線，以及圖B示出用于評(píng)估構(gòu)建體與CD16的結(jié)合的滴定曲線。
具體實(shí)施例方式已發(fā)展了一種方法用于通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定氨基酸包含在Fc多肽的Fc區(qū)中以生成效應(yīng)子功能降低的穩(wěn)定的Fc多肽，例如，無(wú)糖基化抗體或IgG4抗體。該方法尤其適于僅通過(guò)對(duì)多肽進(jìn)行最低限度的氨基酸改變而在真核細(xì)胞中生成含F(xiàn)c的治療性多肽。從而本發(fā)明的方法避免將氨基酸序列引入可致免疫的多肽中。優(yōu)選地，穩(wěn)定氨基酸使多肽的Fc區(qū)穩(wěn)定，而不影響多肽的糖基化和/或效應(yīng)子功能，且不會(huì)顯著改變多肽的其它所需功能 (例如，抗原結(jié)合親合力或半衰期)。為了清楚地理解說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)，下文方便地給出了以下定義。定義本文所使用的術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)子功能”指!^c區(qū)或其部分結(jié)合免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞以及介導(dǎo)各種生物效應(yīng)的功能性能力。效應(yīng)子功能可為抗原依賴性或抗原非依賴性。 效應(yīng)子功能降低指一種或多種效應(yīng)子功能的降低，同時(shí)保持抗體(或其片段)可變區(qū)的抗原結(jié)合活性。效應(yīng)子功能(例如，與Fc受體或補(bǔ)體蛋白的Fc結(jié)合)的升高或降低可用倍數(shù)變化(例如，改變1倍、2倍等)來(lái)表示，并且可基于例如用本領(lǐng)域熟知的測(cè)定而確定的結(jié)合活性的變化百分比來(lái)計(jì)算。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗原依賴性效應(yīng)子功能”指通常在抗體結(jié)合相應(yīng)抗原之后誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能。典型的抗原依賴性效應(yīng)子功能包括結(jié)合補(bǔ)體蛋白(如Clq)的能力。例如，補(bǔ)體的Cl組分與Fc區(qū)的結(jié)合可激活典型的補(bǔ)體系統(tǒng)，其引起細(xì)胞病原體的調(diào)理素作用和溶解，這是稱為補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDCC)的過(guò)程。補(bǔ)體的激活也刺激炎癥反應(yīng)并且也可能參與自身免疫超敏反應(yīng)。其它抗原依賴性效應(yīng)子功能由抗體通過(guò)其Fc區(qū)與細(xì)胞上某些Fc受體(〃 FcR") 結(jié)合來(lái)介導(dǎo)。存在若干對(duì)不同種類抗體的特異的Fc受體，包括IgG( γ受體或Ig Y Rs)、 IgE( ε受體或IgeR)、IgA(α受體或IgaR)和IgM(μ受體或IgyR)。抗體與細(xì)胞表面上的Fc受體的結(jié)合觸發(fā)若干重要的不同生物反應(yīng)，包括免疫復(fù)合物的胞吞作用、吞沒(méi)和破壞抗體包被微粒或微生物(也稱為抗體依賴性吞噬作用或ADCP)、清除免疫復(fù)合物、殺傷細(xì)胞溶解抗體包被的靶細(xì)胞(也稱為抗體依賴性細(xì)胞毒作用或ADCC)、釋放炎癥性介質(zhì)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細(xì)胞激活、胎盤轉(zhuǎn)移和控制免疫球蛋白生成。某些Fc受體，F(xiàn)cy受體(FCYR)在取消或增強(qiáng)免疫募集中起關(guān)鍵性作用。FCYR 在白細(xì)胞上表達(dá)，并且由三個(gè)不同種類組成FcyRI、FcyRII和Fc γ RIII (Gessner等， Ann. Hemato 1. , (1998)，76 :231-48)。在結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)c γ R是免疫球蛋白超家族的所有成員， 具有帶有由兩個(gè)或三個(gè)Ig樣域組成的胞外部分的IgG結(jié)合α鏈。人FcyRI(CD64)在人單核細(xì)胞上表達(dá)，顯示出與單體IgGl、IgG3、IgG4的高親合力結(jié)合(Ka = IO8-IO9Ml。人 Fc yRII(CD32)和 Fc yRIII(CD16)對(duì) IgGl 和 IgG3 的親合力低(Ka < ΙΟΙ1)，并且可僅結(jié)合這些IgG同種型的復(fù)合或聚合形式。而且，F(xiàn)c γ RII和Fc γ RIII類包括“A”和“B”兩種形式。Fc YRIIa(CD32a)和Fc γ RIIIa(CD16a)通過(guò)跨膜域與巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和一些T細(xì)胞的表面結(jié)合，而FcYRIIa(CD32a)和Fc γ RIIIa (CD16a)通過(guò)磷脂酰肌醇聚糖(GPI)錨點(diǎn)選擇性地與粒細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞)的細(xì)胞表面結(jié)合。人Fc γ RI、Fc y RII和Fc y RIII 的各鼠科同系物為Fc y RIIa, Fc y RIIb/1和Fc y Rio。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗原非依賴性效應(yīng)子功能”指可由抗體誘導(dǎo)的效應(yīng)子功能， 而不管其是否已經(jīng)結(jié)合其相應(yīng)的抗原。典型的抗原非依賴性效應(yīng)子功能包括細(xì)胞運(yùn)輸、免疫球蛋白的循環(huán)半衰期和清除率以及促進(jìn)提純。結(jié)構(gòu)獨(dú)特的Fc受體、“新生兒Fc受體”或 “Fcto”(也稱為救治受體)在調(diào)節(jié)半衰期和細(xì)胞運(yùn)輸中起關(guān)鍵性作用。從微生物細(xì)胞提純的其它Fc受體(例如，葡萄球菌蛋白A或G)能夠以高親合力結(jié)合Fc區(qū)并且可用于促進(jìn)含 Fc的多肽的提純。
與屬于免疫球蛋白超家族的Fc γ R不同，人Fcfoi在結(jié)構(gòu)上類似于I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的多肽(Ghetie 和 Ward，Immunology Today, (1997), 18(12) :592-8)。 Fcfoi通常表示為異質(zhì)二聚體，該異質(zhì)二聚體由跨膜α或重鏈與可溶β或輕鏈(β 2微球蛋白)形成的復(fù)合物組成。Fcfoi與I類MHC分子有22-29%的序列同一性，并具有非功能型 MHC肽結(jié)合溝槽(Simister 和 Mostov，Nature，(1989) ,337 :184-7)。如同 MHC，F(xiàn)cfoi 的 α 鏈由三個(gè)胞外域(α 1、α 2、α幻組成，且胞質(zhì)短尾區(qū)將蛋白質(zhì)錨定在細(xì)胞表面。α 1域和α 2 域與抗體Fc區(qū)中的FcR結(jié)合位點(diǎn)相互作用(Raghavan等，Immunity, (1994)，1 :303-15)。 FcRn在哺乳動(dòng)物母體胎盤或卵黃囊中表達(dá)，并且其參與將IgG從母體轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒。Fcfoi也在嚙齒動(dòng)物新生兒的小腸中表達(dá)，其中其參與將母體IgG從攝取的初乳或奶中轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)刷狀緣上皮細(xì)胞。Fcfoi還在許多物種的許多其它組織以及各種內(nèi)皮細(xì)胞系中表達(dá)。它還在成人血管內(nèi)皮、肌肉脈管系統(tǒng)和肝竇狀隙中表達(dá)。認(rèn)為Fcfoi通過(guò)結(jié)合IgG并將其在血清中再利用而在保持IgG的循環(huán)半衰期或血清水平中起附加作用。Fcfoi與IgG分子的結(jié)合嚴(yán)格依賴于pH，在pH低于7.0時(shí)結(jié)合最佳。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“半衰期”指體內(nèi)特定結(jié)合多肽的生物半衰期。可用施用于受試者的量的一半從動(dòng)物體內(nèi)的循環(huán)和/或其它組織清除所需的時(shí)間來(lái)表示半衰期。當(dāng)將給定結(jié)合多肽的清除曲線構(gòu)造為時(shí)間函數(shù)時(shí)，該曲線通常為兩相，即快速α相和較長(zhǎng)的β相。 α相通常表示所施用的Fc多肽在血管內(nèi)外空間之間的平衡，并且部分由多肽的大小確定。 β相通常表示結(jié)合多肽在血管內(nèi)空間中的分解代謝。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所使用的術(shù)語(yǔ)半衰期指在β相中結(jié)合多肽的半衰期。人源抗體在人體內(nèi)的典型β相半衰期為 21天。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”指兩個(gè)或更多個(gè)天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。 術(shù)語(yǔ)“Fe多肽”指包含F(xiàn)c區(qū)或其部分(例如，F(xiàn)c部分)的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法使Fc多肽穩(wěn)定。在任選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c多肽進(jìn)一步包含與Fc多肽的Fc 區(qū)(或其部分)可操作地連接或融合的結(jié)合位點(diǎn)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”指多肽(例如，F(xiàn)c多肽)或包含一個(gè)以上多肽的組合物。因此，蛋白質(zhì)可為單體(例如，單鏈Fc多肽)或多聚體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中， 本發(fā)明的蛋白質(zhì)為二聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體為包含兩個(gè)相同單體亞單位或多肽(例如，兩個(gè)相同的Fc多肽)的同型二聚體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的二聚體為包含兩個(gè)不同單體亞單位或多肽(例如，兩個(gè)不同F(xiàn)c多肽或一個(gè)Fc多肽和另一個(gè)不同于所述Fc多肽的多肽)的異質(zhì)二聚體。二聚體的亞單位可包含一條或多條多肽鏈，其中至少一條多肽鏈為Fc多肽。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，二聚體包含至少兩條多肽鏈(例如，至少兩條Fc多肽鏈)。在一個(gè)實(shí)施方案中，二聚體包含兩條多肽鏈，其中一條或兩條鏈為Fc多肽鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，二聚體包含三條多肽鏈，其中一條、兩條或所有多肽鏈為Fc多肽鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，二聚體包含四條多肽鏈，其中一條、兩條、三條或所有多肽鏈為Fc多肽鏈。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“連接的”、“融合的，，或“融合，，可交換使用。這些術(shù)語(yǔ)指兩個(gè)以上的元件分或組分通過(guò)包括化學(xué)共軛或重組方式在內(nèi)的任何方式連接在一起。本領(lǐng)域已知化學(xué)共軛方法(例如，使用異雙功能交聯(lián)劑)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“基因融合的”或“基因融合”指通過(guò)編碼所述蛋白質(zhì)、多肽或片段的單個(gè)多核苷酸分子的基因表達(dá)，兩個(gè)或更多
15個(gè)蛋白質(zhì)、多肽或其片段經(jīng)由其各自的肽主鏈共線、共價(jià)連接或附接。這種基因融合引起單個(gè)鄰接基因序列的表達(dá)。優(yōu)選的基因融合是在框中，即兩個(gè)或更多個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)按保持原始ORF的正確閱讀框的方式融合以形成連續(xù)更長(zhǎng)的0RF。因此，所得到的重組融合蛋白為單一多肽，其含兩個(gè)或更多個(gè)與由原始ORF編碼的多肽相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)片段(實(shí)際上該片段通常并非如此連接)。盡管這樣使得閱讀框在整個(gè)融合基因片段上連續(xù)，但是可通過(guò) (例如)框內(nèi)多肽連接頭在物理上或空間上分離蛋白質(zhì)片段。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“Fe區(qū)”應(yīng)定義為由抗體重鏈的兩個(gè)或更多個(gè)Fc部分形成的免疫球蛋白的部分。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)為二聚Fc區(qū)?！岸跢c區(qū)”或“dcFc”指由兩條單獨(dú)的免疫球蛋白重鏈的Fc部分形成的二聚體。二聚Fc區(qū)可為兩個(gè)相同F(xiàn)c部分的同型二聚體(例如，天然存在的免疫球蛋白的Fc區(qū))或兩個(gè)不同F(xiàn)c部分的異質(zhì)二聚體。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)為單體或“單鏈” Fc區(qū)(S卩，scFc區(qū))。單鏈Fc區(qū)由單一多肽鏈中基因連接的Fc部分(即，在單一鄰接基因序列中編碼的)組成。2008年5月14日提交的 PCT申請(qǐng)第PCT/US2008/006^0號(hào)中公開(kāi)了示例性scFc區(qū)，該申請(qǐng)通過(guò)引用的方式并入本文。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“Fe部分”指源自免疫球蛋白重鏈的部分的序列，其從正好位于木瓜蛋白酶裂解位點(diǎn)上游的鉸鏈區(qū)開(kāi)始(即，IgG的216位殘基，將重鏈恒定區(qū)的第一個(gè)殘基移至114位)并在免疫球蛋白重鏈的C端結(jié)束。因此，F(xiàn)c部分可為完整的Fc部分或其部分(即，域)。完整的Fc部分包含至少一個(gè)鉸鏈域、CH2域和CH3域(例如，EU氨基酸位置216-446)。Fc部分的C末端有時(shí)存在另外的賴氨酸殘基(K)，但往往與成熟抗體分開(kāi)。 Fc區(qū)中每個(gè)氨基酸位置已根據(jù)本領(lǐng)域公認(rèn)的Kabat的歐盟編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)，見(jiàn)例如1983年和 1987 年 U. S. Dept. Health and Human Services, Kabat 等的 “Sequences of Proteins of Immunological Interest，，。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含以下的至少一個(gè)鉸鏈(例如，上、中和/或下鉸鏈區(qū))域、CH2域、CH3域或其變體、部分或片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分包含至少一個(gè)CH2域或CH3域。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分為完整的Fc部分。在其它實(shí)施方案中，相對(duì)于天然存在的Fc部分，所述Fc部分包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、缺失或取代。例如，可能缺失鉸鏈域、CH2域或CH3域(或其部分)中的至少一個(gè)。例如，F(xiàn)c部分可包含或由以下域組成(i)與CH2域(或其部分)融合的鉸鏈域(或其部分)、(ii)與CH3域(或其部分)融合的鉸鏈域(或其部分)、(iii)與CH3域(或其部分)融合的CH2域(或其部分)、 (iv)CH2域(或其部分)和(v)CH3域或其部分。如前所述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解可修飾Fc部分以致其在氨基酸序列上與天然存在的免疫球蛋白分子的完整Fc部分不同，同時(shí)保持至少一種天然存在的Fc部分賦予的所需功能。例如，F(xiàn)c部分可至少包含本領(lǐng)域已知的Fcfoi結(jié)合或延長(zhǎng)半衰期所需的 Fc部分的部分或由其組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分至少包含本領(lǐng)域已知的Fc YR結(jié)合所需的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc區(qū)至少包含本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)A結(jié)合所需的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc部分至少包含本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)G結(jié)合所需的Fc分子的部分。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)的Fc部分為相同的同種型。例如，F(xiàn)c部分可源自IgGl 或IgG4同種型的免疫球蛋白(例如，人免疫球蛋白)。然而，F(xiàn)c區(qū)(或Fc區(qū)的一個(gè)或多個(gè)Fc部分)也可以是嵌合的。嵌合Fc區(qū)可包含源自不同免疫球蛋白同種型的Fc部分。在某些實(shí)施方案中，二聚或單鏈Fc區(qū)的至少兩個(gè)Fc部分可來(lái)自不同的免疫球蛋白同種型。在另外的或替代性實(shí)施方案中，嵌合Fc區(qū)可包含一個(gè)或多個(gè)嵌合Fc部分。例如，嵌合Fc區(qū)或部分可包含一個(gè)或多個(gè)源自第一同種型(例如，IgGl、IgG2或IgG3同種型)的免疫球蛋白的部分，而Fc區(qū)或部分的其余部分為不同的同種型。例如，F(xiàn)c多肽的Fc區(qū)或部分可包含源自第一同種型(例如，IgGl、IgG2或IgG4同種型)的免疫球蛋白的CH2域和/或CH3 域和來(lái)自第二同種型(例如，IgG3同種型)的免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中， Fc區(qū)或部分包含源自第一同種型(例如，IgG4同種型)的免疫球蛋白的鉸鏈和/或CH2域和來(lái)自第二同種型(例如，IgGl、IgG2或IgG3同種型)的免疫球蛋白的CH3域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合Fc區(qū)包含來(lái)自第一同種型(例如，IgG4同種型)的免疫球蛋白的Fc部分(例如，完整的Fc部分)和來(lái)自第二同種型(例如，IgGl、IgG2或IgG3同種型)的免疫球蛋白的Fc部分。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)或部分包含來(lái)自IgG4免疫球蛋白的 CH2域和來(lái)自IgGl免疫球蛋白的CH3域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)或部分包含來(lái)自IgG4 分子的CHl域和CH2域以及來(lái)自IgGl分子的CH3域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)或部分包含來(lái)自抗體的特定同種型的CH2域的部分，例如，CH2域的EU位置四2-340。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)或部分包含源自IgG4部分的CH2的氨基酸位置四2-34和源自IgGl部分的CH2的其余部分(或者，CH2的位置四2-34可源自IgGl部分，且CH2的其余部分源自 IgG4部分)。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)或部分可包含嵌合鉸鏈區(qū)。嵌合鉸鏈可部分源自IgGl、 IgG2或IgG4分子(例如，上和下中部鉸鏈序列)，而部分源自IgG3分子(例如，中部鉸鏈序列)。在另一個(gè)實(shí)例中，F(xiàn)c區(qū)或部分可包含部分源自IgGl分子而部分源自IgG4分子的嵌合鉸鏈。在具體的實(shí)施方案中，嵌合鉸鏈可包含來(lái)自于IgG4分子的上部和下部鉸鏈域和來(lái)自于IgGl分子的中部鉸鏈域。可通過(guò)在IgG4鉸鏈區(qū)的中部鉸鏈域中的EU位置2 處引入脯氨酸取代來(lái)制備此類嵌合鉸鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合鉸鏈可包含位于EU位置233-236的氨基酸，這些氨基酸來(lái)自IgG2抗體和/或Ser228Pro突變，其中鉸鏈的其余氨基酸來(lái)自IgG4抗體(例如，序列ESKYGPPCPPCPAPPVAGP的嵌合鉸鏈)。美國(guó)專利申請(qǐng)第10/880，320號(hào)中描述了另外的嵌合鉸鏈，該專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用的方式并入本文。定義“Fe區(qū)”特別包括“無(wú)糖基化Fc區(qū)”。本文所使用的“無(wú)糖基化Fc區(qū)”為例如在其一個(gè)或多個(gè)Fc部分中位于EU位置297的N糖基化位點(diǎn)處缺乏共價(jià)連接的低聚糖或多糖的Fc區(qū)。在某些實(shí)施方案中，無(wú)糖基化Fc區(qū)被完全無(wú)糖基化，即，其所有Fc部分均缺乏糖。在其它實(shí)施方案中，無(wú)糖基化為部分無(wú)糖基化(即，半糖基化)。無(wú)糖基化Fc區(qū)可為去糖基化Fc區(qū)，即已通過(guò)例如化學(xué)或酶促方法除去Fc糖的Fc區(qū)?；蛘?，無(wú)糖基化Fc區(qū)可以是非糖基化的或未糖基化的，即表達(dá)抗體而沒(méi)有Fc碳水化合物，方式例如是使例如位于EU 位置297或四9的N糖基化位點(diǎn)的編碼糖基化模式的一個(gè)或多個(gè)殘基突變，在并非天然地將碳水化合物附接至蛋白質(zhì)的生物(例如，細(xì)菌)中表達(dá)，或在通過(guò)基因操作或添加糖基化抑制劑(例如，糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)致使其糖基化機(jī)構(gòu)有缺陷的宿主細(xì)胞或生物體中表達(dá)。 在替代性實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)為“糖基化Fc區(qū)”，即，其在所有可用糖基化位點(diǎn)被完全糖基化。術(shù)語(yǔ)“親本Fc多肽”包括含有需要穩(wěn)定的Fc區(qū)的多肽(例如，IgG抗體)。優(yōu)選地，親本Fc多肽為無(wú)效應(yīng)子Fc多肽。因此，親本Fc多肽表示對(duì)其實(shí)施本發(fā)明的方法或可用作穩(wěn)定性比較的參考點(diǎn)的原始Fc多肽。親本多肽可包含天然的(即天然存在的)Fc區(qū)或部分(例如，人IgG4Fc區(qū)域或部分)或具有對(duì)天然存在的序列進(jìn)行的預(yù)先存在氨基酸序列修飾(如插入、缺失和/或其它改變)，但缺乏一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定氨基酸的Fc區(qū)。術(shù)語(yǔ)“突變”或“突變的”應(yīng)理解為包括在物理上對(duì)親本Fc多肽進(jìn)行突變(例如， 通過(guò)(例如，通過(guò)定點(diǎn)誘變)將編碼一個(gè)氨基酸的核酸分子的密碼子改變?yōu)榫幋a不同氨基酸的密碼子)或合成具有親本Fc區(qū)中沒(méi)有的氨基酸的變體Fc區(qū)(例如，通過(guò)分辨編碼親本Fc區(qū)的核酸分子的核苷酸序列和設(shè)計(jì)合成包含編碼親本Fc區(qū)的變體的核苷酸序列的核酸分子，而無(wú)需使編碼本發(fā)明穩(wěn)定多肽的核酸分子的一個(gè)或多個(gè)核苷酸突變)。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，親本Fc多肽包含來(lái)自無(wú)效應(yīng)子Fc多肽的Fc區(qū)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“無(wú)效應(yīng)子Fc多肽”指與IgGl同種型的野生型無(wú)糖基化抗體相比，效應(yīng)子功能改變或降低的Fc多肽。優(yōu)選地，降低或改變的效應(yīng)子功能為抗體依賴性效應(yīng)子功能， 例如，ADCC和/或ADCP。在一個(gè)實(shí)施方案中，由于Fc多肽的Fc區(qū)(例如，無(wú)糖基化Fc區(qū)) 中經(jīng)修飾或降低的糖基化作用，無(wú)效應(yīng)子Fc多肽的效應(yīng)子功能降低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由于并入IgG4Fc區(qū)或其部分(例如，IgG4抗體的CH2域和/或CH3域)，無(wú)效應(yīng)子Fc 多肽的效應(yīng)子功能降低。術(shù)語(yǔ)“變體Fc多肽”或“Fe變體”包括源自親本Fc多肽的Fc多肽。Fc變體與親本Fc多肽不同之處在于例如，由于引入至少一個(gè)Fc穩(wěn)定突變，F(xiàn)c變體包括穩(wěn)定一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定氨基酸殘基。在某些實(shí)施方案中，除存在一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定Fc氨基酸外，本發(fā)明的Fc 變體包含序列與親本多肽的序列相同的Fc區(qū)(或Fc部分)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與親本 Fc多肽相比，F(xiàn)c變體穩(wěn)定性增強(qiáng)，并且與親本Fc多肽相比，F(xiàn)c變體的效應(yīng)子功能任選地相當(dāng)或降低?！霸醋裕?，指定多肽或蛋白質(zhì)的多肽或氨基酸序列指多肽的來(lái)源。優(yōu)選地，源自特定序列的多肽或氨基酸序列具有基本上與所述序列或其部分相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少10-20個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少20-30個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少30-50個(gè)氨基酸組成，或者本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可識(shí)別為該序列中具有其起源。在多肽的情況下，“線性序列”或 “序列”為多肽中從氨基至羧基末端方向的氨基酸順序，其中在多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)中所述序列中相鄰的殘基鄰接。相對(duì)于原多肽或親本多肽，源自另一個(gè)多肽(例如，親本Fc多肽)的多肽(例如， 變體Fc多肽)可有一個(gè)或多個(gè)突變，例如，被另一個(gè)氨基酸殘基取代或有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基插入或缺失的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，多肽包含非天然存在的氨基酸序列。 這種變體與原多肽的序列同一性或相似性必定低于100%。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如在變體分子的全長(zhǎng)或其一部分(例如，F(xiàn)c區(qū)或Fc部分)上，變體的氨基酸序列與原多肽的氨基酸序列將具有約75%至低于100%氨基酸序列同一性或相似性，更優(yōu)選為約80%至低于 100%，更優(yōu)選為約85%至低于100%，更優(yōu)選為約90%至低于100% (例如，91%、92%、 93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% )和最優(yōu)選為約95%至低于100%。在一個(gè)實(shí)施方案中，原多肽序列(例如，親本Fc多肽的Fc區(qū))和源自原多肽序列的序列(如變體Fc多肽的Fc區(qū))之間有一個(gè)氨基酸差異。在其它實(shí)施方案中，在原多肽序列和變體多肽之間有介于兩個(gè)和十個(gè)之間的氨基酸差異(例如，約2-20、約2-15、約2-10、約5_20、約5_15、約5-15、約5-10個(gè)氨基酸差異)。例如，可能有少于約10個(gè)氨基酸差異(例如，2、3、4、5、6、7、 8、9或10個(gè)氨基酸差異)。本文將相對(duì)于該序列的同一性或相似性定義為在比對(duì)序列并在必要時(shí)引入空隙獲得最高百分比序列同一性之后，與原氨基酸殘基相同的(即，相同的殘基)候選序列中的氨基酸殘基百分比。本發(fā)明的優(yōu)選Fc多肽包含源自人免疫球蛋白序列(例如，來(lái)自人IgG分子的Fc區(qū)或Fc部分)的氨基酸序列(例如，至少一個(gè)Fc區(qū)或Fc部分)。然而，多肽可包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)自另外的哺乳動(dòng)物的氨基酸。例如，受試多肽中可包含靈長(zhǎng)類Fc部分或靈長(zhǎng)類結(jié)合位點(diǎn)?；蛘?，F(xiàn)c多肽中可存在一個(gè)或多個(gè)鼠類氨基酸。本發(fā)明的優(yōu)選Fc多肽不產(chǎn)生免疫性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還應(yīng)了解可改變本發(fā)明的Fc多肽以致與其來(lái)源的親本多肽在氨基酸序列上不同，同時(shí)保持親本多肽的一種或多種所需活性(例如，效應(yīng)子功能降低)。在具體的實(shí)施方案中，進(jìn)行使Fc多肽穩(wěn)定的核苷酸或氨基酸取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)對(duì)親本Fc多肽的核苷酸序列引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失而生成編碼Fc變體的分離的核酸分子，從而將一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失引入編碼的蛋白質(zhì)。可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變來(lái)引入突變(例如，穩(wěn)定突變)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)穩(wěn)定性”指本領(lǐng)域公認(rèn)的蛋白質(zhì)響應(yīng)于環(huán)境條件(例如，溫度升高或降低)的一種或多種物理性質(zhì)保持性的量度。在一個(gè)實(shí)施方案中，物理性質(zhì)為蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)的保持(例如，沒(méi)有蛋白裂解、有害的氧化或脫酰胺作用)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，物理性質(zhì)為存在呈適當(dāng)折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)(例如，沒(méi)有可溶性或不溶性聚集物或沉淀)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的生物物理學(xué)性質(zhì)，如熱穩(wěn)定性、PH解折疊性、穩(wěn)定的去除糖基化、溶解性、生化功能(例如，結(jié)合蛋白質(zhì)(例如，配體、受體、抗原等) 或化學(xué)部分等的能力)，和/或其組合來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用相互作用的結(jié)合親合力證明生化功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的量度為熱穩(wěn)定性， 即，對(duì)熱激發(fā)的抵抗力?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法和/或本文所描述的方法測(cè)量穩(wěn)定性。例如，可測(cè)量“Tm”(也稱為“轉(zhuǎn)變溫度”)。Tm是使50%的大分子(例如，結(jié)合分子)變性的溫度，并被視為用于描述蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、 天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸 (Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、賴氨酸(Lys或K)、 甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、絲氨酸(Ser或幻、蘇氨酸 (Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和纈氨酸(Val或V)。非傳統(tǒng)氨基酸也在本發(fā)明范圍之內(nèi)，并包括正亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它氨基酸殘基類似物， 如Ellman等，Meth. Enzym. 202 :301-336(1991)中所描述的那些。為了生成這種非天然存在的氨基酸殘基，可使用Noren等，Science 244:182(1989)和Ellman等，上文獻(xiàn)中的方法。簡(jiǎn)言之，這些方法涉及化學(xué)激活帶非天然存在氨基酸殘基的抑制型tRNA，然后在體外轉(zhuǎn)錄并翻譯RNA。還可使用本領(lǐng)域已知的肽化學(xué)法實(shí)現(xiàn)非傳統(tǒng)氨基酸的引入。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“極性氨基酸”包括具有零凈電荷，但在其側(cè)鏈的不同部位具有局部非零電荷的氨基酸 (例如M、F、W、S、Y、N、Q、C)。這些氨基酸可參與疏水相互作用和靜電相互作用。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“帶電氨基酸”包括在其側(cè)鏈可具有非零凈電荷的氨基酸(例如R、K、H、E、D)。這些氨基酸可參與疏水相互作用和靜電相互作用。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“空間體積足夠大的氨基酸”包括那些側(cè)鏈占有較大三維空間的氨基酸。具有足夠大空間體積的側(cè)鏈化學(xué)性質(zhì)的示例性氨基酸包括酪氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸或其類似物或模擬物?！鞍被崛〈敝赣昧硪徊煌摹爸脫Q，，氨基酸殘基置換預(yù)定氨基酸序列(原多肽的氨基酸序列)中至少一個(gè)現(xiàn)有氨基酸殘基?！鞍被岵迦搿敝笇⒅辽僖粋€(gè)額外的氨基酸并入預(yù)定氨基酸序列。雖然插入將通常由插入一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基組成，但可進(jìn)行當(dāng)前更大的“肽插入”，例如插入約3個(gè)至約5個(gè)或甚至多達(dá)約10個(gè)、15個(gè)或20個(gè)氨基酸殘基。 如上所述，插入的殘基可為天然存在的或非天然存在的?！鞍被崛笔А敝笍念A(yù)定氨基酸序列去除至少一個(gè)氨基酸殘基。如上所述，這些術(shù)語(yǔ)包括現(xiàn)有物理核酸分子的實(shí)際變化或在設(shè)計(jì)過(guò)程(例如，在書(shū)面上或電腦上)中對(duì)現(xiàn)有核酸序列所作的變化。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽為結(jié)合多肽。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合多肽”指包含至少一個(gè)特異性結(jié)合靶分子(如抗原或結(jié)合配偶體)的靶結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)合域的多肽 (例如，F(xiàn)c多肽)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含免疫球蛋白抗原結(jié)合位點(diǎn)或負(fù)責(zé)配體結(jié)合的受體分子的部分或負(fù)責(zé)受體結(jié)合的配體分子的部分。本發(fā)明的結(jié)合多肽包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)相互連接在一起。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)位于結(jié)合多肽的不同位置，例如位于Fc多肽的Fc區(qū)的一個(gè)或多個(gè)N或C端。例如，當(dāng)Fc區(qū)為scFc區(qū)時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)可連接至 scFc區(qū)的N端、C端或其二者。當(dāng)Fc區(qū)為二聚Fc區(qū)時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)可連接至一個(gè)或兩個(gè)N端和/或一個(gè)或兩個(gè)C端。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合域”、“結(jié)合位點(diǎn)，，或“結(jié)合部分，，指結(jié)合多肽具有生物活性(Fe介導(dǎo)的生物活性除外)的部分、區(qū)或位點(diǎn)，例如，介導(dǎo)與靶分子(如抗原、配體、受體、 底物或抑制劑)的特異性結(jié)合的部分、區(qū)或位點(diǎn)。示例性結(jié)合域包括生物活性蛋白或部分、 抗原結(jié)合位點(diǎn)、配體的受體結(jié)合域、受體的配體結(jié)合域或酶結(jié)合域。在另一個(gè)實(shí)例中，術(shù)語(yǔ) “結(jié)合部分”指結(jié)合生物系統(tǒng)的組分(例如，血清或細(xì)胞表面蛋白或細(xì)胞基質(zhì)中的蛋白質(zhì)) 的生物活性分子或其部分，并且這種結(jié)合導(dǎo)致生物效應(yīng)(例如，通過(guò)改變與之結(jié)合的活性部分和/或組分進(jìn)行測(cè)量(例如，裂解與之結(jié)合的活性部分和/或組分，傳輸信號(hào)或加強(qiáng)或抑制細(xì)胞或受試者體內(nèi)的生物反應(yīng)))。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“配體結(jié)合域”指保持至少一種定性配體結(jié)合能力，并優(yōu)選保持相應(yīng)天然受體的生物活性的天然受體(例如，細(xì)胞表面受體)或其區(qū)或衍生物。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“受體結(jié)合域”指保持至少一種定性受體結(jié)合能力，并優(yōu)選保持相應(yīng)天然配體的生物活性的天然配體或其區(qū)或衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽具有至少一個(gè)對(duì)被靶向減少或消除的分子有特異性的結(jié)合域，例如，細(xì)胞表面抗原或可溶性抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合域包含抗原結(jié)合位點(diǎn)或由抗原結(jié)合位點(diǎn)組成(例如，包含來(lái)自置于選擇性骨架區(qū)(例如，任選包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的人骨架區(qū))的抗體的可變重鏈序列和可變輕鏈序列或六個(gè)CDR)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合親合力”包括結(jié)合相互作用的強(qiáng)度，且因此包括實(shí)際結(jié)合親合力以及表觀結(jié)合親合力。實(shí)際結(jié)合親合力為締合速率與解離速率的比率。因此，授予或優(yōu)化結(jié)合親合力包括改變這兩個(gè)部分之一或其二者以達(dá)到所需水平的結(jié)合親合力。表觀親合力可包括例如相互作用的親合力等。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合自由能”或“結(jié)合的自由能”包括其領(lǐng)域公認(rèn)的含義，并且尤其適用于溶劑中結(jié)合位點(diǎn)-配體或Fc-FcR的相互作用。結(jié)合自由能降低使親合力增強(qiáng)，而結(jié)合自由能升高使親合力下降。術(shù)語(yǔ)“特異性”包括特異性結(jié)合給定靶標(biāo)(例如，與之免疫反應(yīng))的潛在結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量。結(jié)合多肽可為單特異性的并含有一個(gè)或多個(gè)特異性結(jié)合相同的靶標(biāo)(例如，相同的表位)的結(jié)合位點(diǎn)，或者結(jié)合多肽可為多特異性的并含有兩個(gè)或更多個(gè)特異性結(jié)合相同靶標(biāo)的不同區(qū)(例如，不同的表位)或不同靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可制備對(duì)一個(gè)以上的靶分子(例如，一個(gè)以上的抗原或相同抗原上的一個(gè)以上的表位)具有結(jié)合特異性的多特異性結(jié)合多肽(例如，雙特異性多肽)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合多肽具有至少一個(gè)對(duì)被靶向減少或消除的分子有特異性的結(jié)合域和至少一個(gè)對(duì)細(xì)胞上的靶分子有特異性的結(jié)合域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合多肽具有至少一個(gè)對(duì)被靶向減少或消除的分子有特異性的結(jié)合域和至少一個(gè)對(duì)藥物有特異性的結(jié)合域。在又一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合多肽具有至少一個(gè)對(duì)被靶向減少或消除的分子有特異性的結(jié)合域和至少一個(gè)對(duì)藥物前體有特異性的結(jié)合域。在又一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性結(jié)合多肽為四價(jià)抗體，其具有兩個(gè)對(duì)一個(gè)靶分子有特異性的結(jié)合域和兩個(gè)對(duì)另一靶分子有特異性的結(jié)合位點(diǎn)ο本文所使用的術(shù)語(yǔ)“價(jià)”指結(jié)合多肽或蛋白質(zhì)中潛在結(jié)合域的數(shù)量。各結(jié)合域特異性結(jié)合一個(gè)靶分子。當(dāng)結(jié)合多肽包含一個(gè)以上結(jié)合域時(shí)，各結(jié)合域可特異性結(jié)合相同或不同的分子(例如，可結(jié)合不同的配體或不同的抗原或相同抗原上的不同表位)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽為單價(jià)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽為多價(jià)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽為二價(jià)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽為三價(jià)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽為四價(jià)。在某些方面，本發(fā)明的結(jié)合多肽采用多肽接頭。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多肽接頭”指連接多肽鏈的線性氨基酸序列中的兩個(gè)域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。例如，多肽接頭可用于將結(jié)合位點(diǎn)連接到本發(fā)明Fc多肽的Fc區(qū)(或Fc部分)。優(yōu)選地，這種多肽接頭為多肽分子提供撓性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，VH域或VL域與多肽接頭融合或連接，且多肽接頭的N端或C端與Fc區(qū)(或Fc部分)的C端或N端連接，且多肽接頭的N 端與VH域或VL域的N端或C端連接。在某些實(shí)施方案中，多肽接頭用于連接(例如，基因融合)scFc多肽的兩個(gè)Fc部分或域。本文也將這種多肽接頭稱為Fc連接多肽。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“Fe連接多肽”尤其指連接(例如，基因融合)兩個(gè)Fc部分或域的連接多肽。本發(fā)明的結(jié)合分子可包含一個(gè)以上的肽接頭。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“適當(dāng)折疊的多肽”包括其中組成多肽的所有功能域均具有明顯活性的多肽(例如，本發(fā)明的結(jié)合多肽)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“不當(dāng)折疊的多肽”包括其中多肽的至少一個(gè)功能區(qū)無(wú)活性的多肽。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“適當(dāng)折疊的Fc多肽”或“適當(dāng)折疊的Fc區(qū)”包括其中至少兩個(gè)Fc組成部分適當(dāng)折疊以致所得到的Fc區(qū)包含至少一種效應(yīng)子功能的Fc區(qū)(例如，scFc區(qū))。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”包括具有兩條重鏈和兩條輕鏈的組合而無(wú)論其
21是否具有任何相關(guān)特異免疫反應(yīng)性的多肽。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”指這種對(duì)目標(biāo)抗原 (例如，腫瘤相關(guān)抗原)有顯著的已知特異免疫反應(yīng)活性的集合(例如，全抗體分子、抗體片段或其變體)。抗體和免疫球蛋白包含其間有或無(wú)鏈間共價(jià)鍵的輕鏈和重鏈。脊椎動(dòng)物系統(tǒng)的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)很好理解。如以下將更詳細(xì)討論的，通用術(shù)語(yǔ)“抗體”包括五個(gè)可用生化方法區(qū)別的不同種類的抗體。來(lái)自各類抗體的Fc部分明顯在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，以下討論通常針對(duì)IgG類免疫球蛋白分子。對(duì)于IgG而言，免疫球蛋白包含兩條分子量約為23，000道爾頓的相同多肽輕鏈和兩條分子量為53，000-70，000道爾頓的相同多肽重鏈。用二硫鍵將這四條鏈連接成 “Y”構(gòu)型，其中輕鏈將起始于“Y” 口部并繼續(xù)通過(guò)可變域的重鏈括在一起。將免疫球蛋白的輕鏈歸類為κ或λ。每個(gè)重鏈種類可與κ或λ輕鏈結(jié)合。通常，當(dāng)免疫球蛋白由雜交瘤、B細(xì)胞或基因工程宿主細(xì)胞生成時(shí)，輕鏈和重鏈相互共價(jià)結(jié)合， 兩條重鏈的“尾”部通過(guò)共價(jià)二硫鍵或非共價(jià)鍵相互結(jié)合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構(gòu)型叉端處的N端至各鏈底部的C端。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解重鏈歸類為Y、μ、α、δ、ε， 其間有許多子類(例如，Y I-Y 4)。該鏈的特性在于將抗體的“種類”分別確定為IgG、IgM、 IgA、IgG或IgE0免疫球蛋白子類(同種型)，例如，IgG1UgG2, IgG3、IgG4, IgA1等也是定性清楚的并且已知使之功能特化。由本公開(kāi)內(nèi)容來(lái)看，這些各種類和同種型的修飾類型對(duì)于技術(shù)人員是易于辯別的，并因此在本發(fā)明范圍之內(nèi)。輕鏈和重鏈均分為結(jié)構(gòu)區(qū)和功能同源區(qū)。術(shù)語(yǔ)“區(qū)”指單個(gè)免疫球蛋白或抗體單鏈的局部或部分(術(shù)語(yǔ)“Fe區(qū)”也是如此)，并包括恒定區(qū)或可變區(qū)以及所述域的更多的分離局部或部分。例如，輕鏈可變域包括散布于本文所定義的“骨架區(qū)”或“FR”間的“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”。在“恒定區(qū)”的情況下根據(jù)各類成員的區(qū)中相對(duì)缺乏的序列變體，或在“可變區(qū)” 的情況下根據(jù)各類成員的區(qū)中相對(duì)缺乏的顯著變體，可將免疫球蛋白的某些區(qū)定義為“恒定”(C)區(qū)或“可變”(V)區(qū)。術(shù)語(yǔ)“恒定區(qū)”和“可變區(qū)”在功能上也可用。在這點(diǎn)上，應(yīng)了解免疫球蛋白或抗體的可變區(qū)決定抗原識(shí)別和特異性。相反地，免疫球蛋白或抗體的恒定區(qū)賦予重要的效應(yīng)子功能，如分泌、經(jīng)胎盤移動(dòng)、Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合等。各種免疫球蛋白種類的恒定區(qū)的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定區(qū)和可變區(qū)折疊成域。術(shù)語(yǔ)“域”指包含(例如)用 β-折疊片和/或鏈內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定的肽環(huán)(例如，包括3至4個(gè)肽環(huán))的重鏈或輕鏈多肽的獨(dú)立折疊球形區(qū)。免疫球蛋白輕鏈上的恒定區(qū)域可交換地稱為“輕鏈恒定區(qū)域”、“CL區(qū)” 或“CL域”。重鏈上的恒定域(例如，鉸鏈、CHl域、CH2域或CH3域)可交換地稱為“重鏈恒定區(qū)域”、“CH區(qū)域”或“CH域”。輕鏈上的可變域可交換地稱為“輕鏈可變區(qū)域”、“VL區(qū)域”或“VL域”。重鏈上的可變域可交換地稱為“重鏈可變區(qū)域”、“VH區(qū)域”或“VH域”。按照慣例，隨著可變區(qū)域和恒定區(qū)域離免疫球蛋白或抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或氨基末端越遠(yuǎn)，可變區(qū)域和恒定區(qū)域的編號(hào)增加。各免疫球蛋白重鏈和輕鏈的N端為可變區(qū)，而 C端為恒定區(qū)；CH3域和CL域?qū)嶋H上分別包含重鏈和輕鏈的羧基端。因此，輕鏈免疫球蛋白域按VL-CL方向排列，而重鏈域按VH-CHl-鉸鏈-CH2-CH3方向排列。本文根據(jù)歐盟索引編號(hào)系統(tǒng)(見(jiàn)1991年U. S. Dept. Health and Human Services H 5 片反中，Kabat ·的“Sequences of Proteins of Immunological Interest") X^SIjIfl定區(qū)中的氨基酸位置(包括CHl域、鉸鏈域、CH2域和CH3域中的氨基酸位置)進(jìn)行編號(hào)。 相反，在本文中，根據(jù)Kabat索引編號(hào)系統(tǒng)(見(jiàn)如上Kabat等)對(duì)輕鏈恒定區(qū)(例如CL域) 中的氨基酸位置進(jìn)行編號(hào)。根據(jù)Kabat索引編號(hào)系統(tǒng)，本文所使用的術(shù)語(yǔ)“VH域”包括免疫球蛋白重鏈的氨基端可變域，且術(shù)語(yǔ)域”包括免疫球蛋白輕鏈的氨基端可變域。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“CH1域”包括例如從EU位置約118-215延伸的免疫球蛋白重鏈的第一(最氨基端)恒定區(qū)域。CHl域鄰近Vh域和免疫球蛋白重鏈分子的鉸鏈區(qū)的氨基末端，并未形成免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含源自免疫球蛋白重鏈分子(例如，人IgGl或IgG4分子)的CHl域。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“鉸鏈區(qū)”包括將CHl域連至CH2域的重鏈分子的部分。該鉸鏈區(qū)包含約25個(gè)殘基并且有撓性，從而使兩個(gè)N端抗原結(jié)合區(qū)獨(dú)立移動(dòng)。鉸鏈區(qū)可再分為三個(gè)不同的域上、中、下鉸鏈域(Roux等，J. Immunol. 1998,161 :4083)本文所使用的術(shù)語(yǔ)“CH2域”包括例如從EU位置約231-340延伸的重鏈免疫球蛋白分子的部分。CH2域獨(dú)特之處在于其并未與另外的域緊密配對(duì)。相反，兩個(gè)N連接碳水化合物支鏈插入完整的天然IgG分子的兩個(gè)CH2域之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含源自IgGl分子(例如人IgGl分子)的CH2域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含源自IgG4分子(例如人IgG4分子)的CH2域。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中， 本發(fā)明的多肽包含CH2域(EU位置231-340)或其部分。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“CH3域”包含從CH2域的N端(例如從位置約341_446b (歐盟編號(hào)系統(tǒng)))延伸約110個(gè)殘基的重鏈免疫球蛋白分子的部分。CH3域通常形成抗體的C端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，另外的域可能從CH3域延伸以形成分子的C端部分(例如，IgM的μ鏈和IgE的ε鏈中的CH4域)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含源自IgGl分子(例如，人IgGl分子)的CH3域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含源自IgG4分子(例如，人IgG4分子)的CH3域。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“CL域”包括例如從Kabat位置約107A-216延伸的免疫球蛋白輕鏈的第一(最氨基端)恒定區(qū)域。CL域鄰近\域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含源自κ輕鏈(例如，人κ輕鏈)的CL域。如上所示，抗體的可變區(qū)使其選擇性識(shí)別并特異性結(jié)合抗原上的表位。即，抗體的八域和Vh域聯(lián)合形成限定三維抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)(Fv)。這種四元抗體結(jié)構(gòu)形成存在于Y的每個(gè)臂末端處的抗原結(jié)合位點(diǎn)。更具體地說(shuō)，抗原結(jié)合位點(diǎn)由每個(gè)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)上的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)限定。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合位點(diǎn)”包括特異性結(jié)合(與之免疫反應(yīng))抗原(如細(xì)胞表面或可溶性抗原)的位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)包括免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)，并且由這些可變區(qū)形成的結(jié)合位點(diǎn)決定抗體的特異性?？乖Y(jié)合位點(diǎn)由多肽不同的可變區(qū)形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含含有抗體分子的至少一個(gè)重鏈或輕鏈CDR(例如，其序列為本領(lǐng)域已知或如本文所描述)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含含有至少兩個(gè)來(lái)自于一個(gè)或多個(gè)抗體分子的CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含含有至少三個(gè)來(lái)自于一個(gè)或多個(gè)抗體分子的CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含含有至少四個(gè)來(lái)自于一個(gè)或多個(gè)抗體分子的CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含含有至少五個(gè)來(lái)自于一個(gè)或多個(gè)抗體分子的CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含含有至少六個(gè)來(lái)自于一個(gè)或多個(gè)抗體分子的CDR的抗原結(jié)合位點(diǎn)。本領(lǐng)域已知包含至少一個(gè)可包括在受試結(jié)合多肽內(nèi)的CDR的示例性抗體分子， 且本文描述了示例性分子。 本文所使用的術(shù)語(yǔ)“⑶R”或“互補(bǔ)決定區(qū)”指重鏈和輕鏈多肽的可變區(qū)內(nèi)存在的非鄰接抗原結(jié)合位點(diǎn)。Kabat 等在 J. Biol. Chem. 252,6609-6616(1977)和“Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1991) ψ, Chothia ^ ^ J. Mol. Biol. 196 901-917(1987)中和 MacCallum 等在 J. Mol. Biol. 262 :732-745(1996)中已描述了這些特殊區(qū)，其中定義包括相互比較時(shí)氨基酸殘基的重疊或子集。提出包含每個(gè)以上所引用的參考文獻(xiàn)所定義的CDR的氨基酸殘基以便進(jìn)行比較。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“CDR”為由Kabat根據(jù)序列比較定義的⑶R。
權(quán)利要求
1.一種包含嵌合Fc區(qū)的穩(wěn)定多肽，其中所述穩(wěn)定多肽包含至少一個(gè)來(lái)自IgG4同種型的IgG抗體的CH2域和至少一個(gè)來(lái)自IgGl同種型的IgG抗體的CH3域，其中所述穩(wěn)定多肽包含位于一個(gè)或多個(gè)選自297、299、307、309、399、409和427(歐盟編號(hào)規(guī)定)的氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定Fc氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定多肽，其中所述嵌合Fc區(qū)包含鉸鏈、來(lái)自IgG4同種型的 IgG抗體的CHl域和CH2域和來(lái)自IgGl同種型的IgG抗體的CH3域，并且其中所述抗體包含位于氨基酸位置2 (歐盟編號(hào))的脯氨酸。
3.一種包含來(lái)自IgG4抗體的Fc區(qū)的CH2部分的穩(wěn)定多肽，其中所述穩(wěn)定多肽包含位于一個(gè)或多個(gè)選自 240F、262L、264T、266F、297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、 399S和427F(歐盟編號(hào)規(guī)定)的氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的穩(wěn)定多肽，其包含位于氨基酸位置四7的谷氨酰胺。
5.一種包含來(lái)自IgGl抗體的Fc區(qū)的CH2部分的穩(wěn)定多肽，其中所述穩(wěn)定多肽包含位于一個(gè)或多個(gè)選自四91(和四70(歐盟編號(hào)規(guī)定)的氨基酸位置的一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定多肽，其包含位于氨基酸位置四9的賴氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的穩(wěn)定多肽，其包含位于氨基酸位置四9的賴氨酸和位于氨基酸位置四7的天冬氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定多肽，其中所述Fc區(qū)為無(wú)糖基化Fc區(qū)。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中IgG抗體為人源抗體。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中相對(duì)于缺乏穩(wěn)定氨基酸的親本多肽，所述穩(wěn)定多肽的解鏈溫度(Tm)至少升高1°C。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的穩(wěn)定多肽，其中所述穩(wěn)定Fc多肽的解鏈溫度(Tm)升高約 1°C或更多、約2°C或更多、約；3°C或更多、約4°C或更多、約5°C或更多、約6°C或更多、約7°C 或更多、約8°C或更多、約9°C或更多、約10°C或更多、約15°C或更多和約20°C或更多。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的穩(wěn)定多肽，其中在中性pH(約6.5至約7.5)下所述解鏈溫度CTm)升高。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的穩(wěn)定多肽，其中在約6.5或更低、約6. 0或更低、約5. 5或更低、約5.0或更低、約4. 5或更低和約4.0或更低的酸性pH下，所述解鏈溫度(Tm)升高。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中相對(duì)于缺乏穩(wěn)定突變的親本多肽，所述穩(wěn)定多肽以更高的產(chǎn)量表達(dá)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的穩(wěn)定多肽，其中在細(xì)胞培養(yǎng)物中穩(wěn)定Fc多肽以產(chǎn)量為約 5mg/L或更高、約10mg/L或更高、約15mg/L或更高、約20mg/L或更高表達(dá)。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中相對(duì)于缺乏所述穩(wěn)定氨基酸的親本多肽，所述穩(wěn)定多肽的濁度降低。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的穩(wěn)定多肽，其中所述濁度以選自以下各項(xiàng)的倍數(shù)降低約 1倍或更高、約2倍或更高、約3倍或更高、約4倍或更高、約5倍或更高、約6倍或更高、約 7倍或更高、約8倍或更高、約9倍或更高、約10倍或更高、約15倍或更高、約50倍或更高和約100倍或更高。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中與缺乏所述穩(wěn)定突變的親本Fc 多肽相比，所述穩(wěn)定多肽的效應(yīng)子功能降低。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的穩(wěn)定多肽，其中所述降低的效應(yīng)子功能為降低的ADCC活性。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的穩(wěn)定多肽，其中所述降低的效應(yīng)子功能為降低的與選自 FcyRI.FcyRII 禾口 Fc γ RIII 的 Fc 受體(FcR)的結(jié)合。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的穩(wěn)定多肽，其中所述效應(yīng)子功能以選自以下各項(xiàng)的倍數(shù)降低約1倍或更多、約2倍或更多、約3倍或更多、約4倍或更多、約5倍或更多、約6倍或更多、約7倍或更多、約8倍或更多、約9倍或更多、約10倍或更多、約15倍或更多、約50倍或更多和約100倍或更多。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中與親本Fc多肽相比，所述穩(wěn)定多肽的半衰期增加。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的穩(wěn)定多肽，其中所述半衰期增加歸因于與新生兒受體 (FcRn)的結(jié)合增強(qiáng)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的穩(wěn)定多肽，其中所述半衰期以選自以下各項(xiàng)的倍數(shù)增加 約1倍或更多、約2倍或更多、約3倍或更多、約4倍或更多、約5倍或更多、約6倍或更多、 約7倍或更多、約8倍或更多、約9倍或更多、約10倍或更多、約15倍或更多、約50倍或更多和約100倍或更多。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至M中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中所述Fc區(qū)為包含兩條多肽鏈的二聚Fc區(qū)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至M中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中所述Fc區(qū)為單鏈Fc區(qū)。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中所述Fc區(qū)的所有Fc部分均被無(wú)糖基化。
28.根據(jù)權(quán)利要求7所述的穩(wěn)定多肽，其中所述無(wú)糖基化Fc區(qū)包含位于Fc區(qū)的位置四9(歐盟編號(hào)規(guī)定)的取代。
29.根據(jù)權(quán)利要求7所述的穩(wěn)定多肽，其中所述無(wú)糖基化Fc區(qū)由于其在細(xì)菌宿主細(xì)胞中生成而被無(wú)糖基化。
30.根據(jù)權(quán)利要求7所述的穩(wěn)定多肽，其中所述無(wú)糖基化Fc區(qū)由于通過(guò)化學(xué)或酶促方法的去糖基化作用而被無(wú)糖基化。
31.根據(jù)權(quán)利要求7所述的穩(wěn)定多肽，其中所述無(wú)糖基化Fc區(qū)包含嵌合鉸鏈域。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的穩(wěn)定多肽，其中所述嵌合鉸鏈域包含位于氨基酸位置 228(歐盟編號(hào)規(guī)定)用脯氨酸殘基進(jìn)行的取代。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定多肽，其中所述穩(wěn)定氨基酸獨(dú)立地選自以下氨基酸 (i)位于位置四7的不帶電氨基酸、(ii)位于位置四9的帶正電的氨基酸、(iii)位于位置 307的極性氨基酸、(iv)位于位置309的帶正電的氨基酸或極性氨基酸、(ν)位于位置399 的極性氨基酸、(vi)位于位置409的帶正電的氨基酸或極性氨基酸和(vii)位于位置427 的極性氨基酸。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定多肽，其中至少一個(gè)穩(wěn)定氨基酸為位于氨基酸位置四7(歐盟編號(hào))的谷氨酰胺。
35.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中至少一個(gè)所述穩(wěn)定氨基酸為位于位置四9的賴氨酸(K)或酪氨酸(Y)。
36.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中至少一個(gè)所述穩(wěn)定氨基酸為位于位置307的脯氨酸⑵或甲硫氨酸(M)。
37.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中至少一個(gè)所述穩(wěn)定氨基酸為位于位置309的脯氨酸⑵、甲硫氨酸(M)或賴氨酸⑷。
38.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中至少一個(gè)所述穩(wěn)定突變?yōu)槲挥谖恢?99的絲氨酸⑶。
39.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽，其中所述Fc區(qū)可操作地連接至結(jié)合位點(diǎn)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的穩(wěn)定多肽，其中所述結(jié)合位點(diǎn)選自抗原結(jié)合位點(diǎn)、受體的配體結(jié)合部分或配體的受體結(jié)合部分。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的穩(wěn)定多肽，其中所述結(jié)合位點(diǎn)源自選自以下各項(xiàng)修飾的抗體scFv、Fab、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、納米抗體、駱駝抗體和Dab。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的穩(wěn)定多肽，其為穩(wěn)定的全長(zhǎng)抗體。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的穩(wěn)定多肽，其中所述抗體選自單克隆抗體、嵌合抗體、人源抗體和人源化抗體。
44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的穩(wěn)定多肽，其中所述穩(wěn)定的全長(zhǎng)抗體與常規(guī)或穩(wěn)定的scFv 分子融合。
45.根據(jù)權(quán)利要求39所述的穩(wěn)定多肽，其為穩(wěn)定的免疫粘附素。
46.根據(jù)權(quán)利要求39所述的穩(wěn)定多肽，其中結(jié)合位點(diǎn)覆蓋在所述穩(wěn)定多肽的Fc區(qū)的表
47.根據(jù)權(quán)利要求39所述的穩(wěn)定多肽，其中所述結(jié)合位點(diǎn)源自非免疫球蛋白結(jié)合分子。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的穩(wěn)定多肽，其中所述非免疫球蛋白結(jié)合分子選自 adnectin、親合體、DARPin 禾口 anticalin。
49.根據(jù)權(quán)利要求40所述的穩(wěn)定多肽，其中所述受體的配體結(jié)合部分源自選自以下各項(xiàng)的受體免疫球蛋白(Ig)超家族的受體、TNF受體超家族的受體、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR) 超家族的受體、酪氨酸激酶(TK)受體超家族的受體、配體門控(LG)超家族的受體、趨化因子受體超家族的受體、IL-1/Toll樣受體(TLR)超家族、神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)受體家族的受體和細(xì)胞因子受體超家族。
50.根據(jù)權(quán)利要求40所述的穩(wěn)定多肽，其中所述配體的受體結(jié)合部分源自抑制性配體。
51.根據(jù)權(quán)利要求40所述的穩(wěn)定多肽，其中所述配體的受體結(jié)合部分源自活化配體。
52.根據(jù)權(quán)利要求50或51所述的結(jié)合多肽，其中所述配體結(jié)合選自以下各項(xiàng)的受體 免疫球蛋白(Ig)超家族的受體、TNF受體超家族的受體、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCI )超家族的受體、酪氨酸激酶(TK)受體超家族的受體、配體門控(LG)超家族的受體、趨化因子受體超家族的受體、IL-1/Toll樣受體(TLI )超家族和細(xì)胞因子受體超家族。
53.一種包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定多肽的組合物和一種藥學(xué)上可接受的載體。
54.一種包含編碼前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的穩(wěn)定結(jié)合多肽的核苷酸序列的核酸分子。
55.一種包含編碼權(quán)利要求25所述的穩(wěn)定結(jié)合多肽的多肽鏈的核苷酸序列的核酸分子。
56.一種包含權(quán)利要求M或55所述的核酸分子的載體。
57.一種表達(dá)權(quán)利要求56所述的載體的宿主細(xì)胞。
58.一種生成本發(fā)明的穩(wěn)定Fc多肽的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求57 所述的宿主細(xì)胞以便生成所述穩(wěn)定Fc多肽。
59.一種穩(wěn)定包含無(wú)糖基化嵌合Fc區(qū)或其部分的親本Fc多肽的方法，所述方法包括用穩(wěn)定氨基酸取代Fc區(qū)的至少一個(gè)Fc部分中的所選氨基酸從而生成相對(duì)于所述原多肽穩(wěn)定性增強(qiáng)的穩(wěn)定Fc多肽，其中對(duì)選自297、299、307、309、399、409和427(歐盟編號(hào)規(guī)定)的 Fc部分的氨基酸位置進(jìn)行所述取代。
60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述嵌合Fc區(qū)包含來(lái)自IgG4同種型的IgG抗體的CH2域和來(lái)自IgGl同種型的IgG抗體的CH3域。
61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中存在于所述穩(wěn)定Fc多肽的氨基酸位置和氨基酸選自 297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399E、399S、409K、409M 和 427F。
62.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述穩(wěn)定Fc多肽包含位于位置297(歐盟編號(hào)) 的谷氨酰胺。
63.一種大批生產(chǎn)包含穩(wěn)定Fc區(qū)的多肽的方法，所述方法包括(a)將至少一個(gè)穩(wěn)定Fc部分基因融合至多肽以形成穩(wěn)定的融合蛋白；(b)用編碼所述穩(wěn)定的融合蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞；(c)在使得穩(wěn)定的融合蛋白表達(dá)的條件下，在IOL或更多的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(f)的宿主細(xì)胞；從而生成穩(wěn)定的融合蛋白。
64.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述穩(wěn)定的Fc區(qū)為包含來(lái)自IgG4同種型的IgG 抗體的CH2域和來(lái)自IgGl同種型的IgG抗體的CH3域的嵌合Fe。
65.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述穩(wěn)定的Fc區(qū)包含位于氨基酸位置四7(歐盟編號(hào))的谷氨酰胺。
66.一種治療或預(yù)防受試者疾病或病癥的方法，所述方法包括對(duì)患有所述疾病或病癥的受試者施用權(quán)利要求53所述的組合物從而治療或預(yù)防疾病或病癥。
67.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述疾病或病癥選自炎癥性疾病、神經(jīng)障礙、自身免疫性疾病和腫瘤性疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生成含F(xiàn)c的多肽的方法，如具有穩(wěn)定的Fc區(qū)的抗體。本發(fā)明還提供了根據(jù)這些方法生成的穩(wěn)定Fc多肽以及將此類抗體用作治療劑的方法。
文檔編號(hào)C07K16/00GK102369291SQ201080013454
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者B.R.米勒, C.L.雷耶斯, E.加伯, E.錢, F.R.泰勒, S.德馬雷斯特, S.格拉澤 申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司