專利名稱：Neil3肽及包含它的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求2009年3月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/210，512的權(quán)益，通過(guò)述及將其全部?jī)?nèi)容收入本文。本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及新的肽(它們作為癌癥疫苗極其有效)和用于治療和預(yù)防腫瘤的藥物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證明，⑶8陽(yáng)性CTL能識(shí)別自主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類分子上的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細(xì)胞。從TAA的第一個(gè)例子——黑素瘤抗原(MAGE)家族被發(fā)現(xiàn)起，通過(guò)免疫學(xué)手段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA(NPL 1/Boon Τ, Int J Cancer 1993 May 8,54(2) :177-80 ;NPL2/Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1,183(3) :725-9)，而且這些TAA中的一些目前正處于作為免疫治療靶標(biāo)的臨床開(kāi)發(fā)過(guò)程中。能誘導(dǎo)強(qiáng)力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定保證了針對(duì)各種類型癌癥的肽疫苗接種策略的臨床應(yīng)用的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)(NPL 3/Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20) :1442-55 ；NPL 4/Butterfield LH et al. ,Cancer Res 1999 Jul 1， 59(13) :3134-42 ；NPL 5/Vissers JL et al. , Cancer Res 1999Nov 1,59(21) :5554-9; NPL 6/van der Burg SH et al.，J Immunol 1996 Mayl，156(9) :3308-14 ；NPL 7/Tanaka F et al.，Cancer Res 19970ct 15,57(20) :4465-8 ；NPL 8/Fujie T et al.，Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2) :169-72 ;NPL9/Kikuchi M et al. ，Int J Cancer 1999 May 5,81(3) 459-66 ；NPL 10/0iso M et al. ,Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :387-94)。迄今為止，已經(jīng)報(bào)告了數(shù)項(xiàng)使用這些腫瘤相關(guān)抗原衍生的肽進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。不幸的是，迄今為止在這些癌癥疫苗試驗(yàn)中只能觀察到較低的客觀響應(yīng)率(NPL 11/Belli F et al. ,J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20) :4169-80 ；NPL 12/Coulie PG et al.，Immunol Rev2002 Oct,188 33-42 ；NPL 13/Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep,10(9) :909-15)。癌細(xì)胞增殖和存活不可缺少的TAA適合作為免疫療法的靶標(biāo)，因?yàn)槭褂么祟怲AA 可使廣為記載的癌細(xì)胞免疫逃避的風(fēng)險(xiǎn)最小化，癌細(xì)胞的免疫逃避可歸于因治療驅(qū)動(dòng)的免疫選擇而發(fā)生的TAA刪除、突變、或下調(diào)。另一方面，Nei內(nèi)切核酸酶VIII樣3 (NEIL3)已經(jīng)作為屬于一類與細(xì)菌 Fpg/Nei家族同源的DNA糖基化酶的成員得到分離(NPL 14/Bandaru et al.，DNA Repair(Amst). 2002Jul 17 ；1(7) :517-29)。這些糖基化酶通過(guò)經(jīng)關(guān)聯(lián)裂合酶反應(yīng)切割受反應(yīng)性氧種類損害的堿基并引入DNA鏈斷裂來(lái)啟動(dòng)堿基切除修復(fù)中的第一步。NEIL3有可能在DNA修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮作用，然而，尚未闡明它與致癌作用的關(guān)系。引用表非專利文獻(xiàn)[NPL l]Boon T, Int J Cancer 1993 May 8,54(2) :177-80
[NPL 2]Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar 1,183(3) :725-9[NPL 3]Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20) :1442-55[NPL 4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999 Jul 1,59(13) :3134-42[NPL 5]Vissers JL et al. , Cancer Res 1999 Nov 1,59(21) :5554-9[NPL 6]van der Burg SH et al. ，J Immunol 1996 May 1,156(9) :3308-14[NPL 7]Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct 15,57(20) :4465-8[NPL 8]Fujie T et al. ， Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2) :169-72[NPL 9]Kikuchi M et al.，Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :459-66[NPL 10]Oiso M et al. ， Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :387-94[NPL IlJBelli F et al. , J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20) :4169-80[NPL 12]Coulie PG et al.，Immunol Rev 2002 Oct, 188 :33-42[NPL 13]Rosenberg SA et al. ，Nat Med 2004 Sep,10(9) :909-15[NPL 14]Bandaru et al.，DNA Repair (Amst). 2002 Jul 17 ； 1(7) :517-29發(fā)明概述本發(fā)明至少部分基于適用的免疫療法靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。由于TAA—般被免疫系統(tǒng)視為 “自身”，因此常常沒(méi)有免疫原性，所以發(fā)現(xiàn)適宜的靶標(biāo)是極其重要的。如上所述，NEIL3(由 GenBank登錄號(hào)NM_018M8(例如SEQ ID NO 44)的基因編碼的SEQ ID NO 45)已經(jīng)被鑒定為在癌癥，諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜異位癥、食道癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、小細(xì)胞肺癌(SCLC)、軟組織腫瘤、急性髓樣白血病(AML)和慢性髓樣白血病(CML)，中上調(diào)。因此，NEIL3是癌癥/ 腫瘤免疫療法的候選靶標(biāo)。本發(fā)明至少部分基于NEIL3的基因產(chǎn)物的擁有誘導(dǎo)對(duì)NEIL3特異性的CTL的能力的特定表位肽的鑒定。如下文詳細(xì)討論的，使用自NEIL3衍生的HLA-AM402或HLA-A*0201 結(jié)合候選肽刺激從健康供體獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。然后建立了具有針對(duì)經(jīng)每一種候選肽沖激的HLA-AM或HLA-A2陽(yáng)性靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性的的CTL系。這些結(jié)果證明，這些肽是能誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)NEIL3的細(xì)胞的強(qiáng)力且特異性的免疫應(yīng)答的HLA-AM或 HLA-A2限制表位肽。另外，它指明，NEIL3具有強(qiáng)免疫原性，而且它的表位是癌癥/腫瘤免疫療法的有效靶標(biāo)。因而，本發(fā)明提供了分離的能與HLA抗原結(jié)合的肽，該肽由NEIL3(SEQID NO :45) 或其免疫學(xué)活性片段組成。這些肽預(yù)期具有CTL誘導(dǎo)能力且可用于離體誘導(dǎo)CTL或用于施用給受試者以誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答，所述癌癥諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜異位癥、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、SCLC和AML。優(yōu)選地，那些肽是九肽或十肽，更優(yōu)選地，由選自SEQ ID NO :1至43的氨基酸序列組成。特別地，由選自SEQ ID N0: 3，4，5，6，11，15，17，21，22，24，33，35，41和43的氨基酸序列組成的肽顯示強(qiáng)CTL誘導(dǎo)能力。本發(fā)明的肽涵蓋如下的肽，其中替代、刪除或添加了 1個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，只要經(jīng)過(guò)修飾的肽保留原始的CTL誘導(dǎo)能力。另外，本發(fā)明的提供了編碼任何本發(fā)明肽的分離的多核苷酸。這些多核苷酸可用于誘導(dǎo)或制備具有CTL誘導(dǎo)能力的APC或用于施用給受試者以誘導(dǎo)針對(duì)本發(fā)明的肽以及癌癥的免疫應(yīng)答。
當(dāng)施用給受試者時(shí)，本發(fā)明的肽呈遞在APC的表面上，然后誘導(dǎo)靶向相應(yīng)肽的 CTL0因此，依照本發(fā)明的一個(gè)方面，還提供了用于誘導(dǎo)CTL的、包含任何本發(fā)明的肽或多核苷酸的組合物或物質(zhì)。另外，包含任何本發(fā)明肽或多核苷酸的組合物或物質(zhì)可用于治療和/ 或預(yù)防癌癥，諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜異位癥、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤、AML和CMLjP /或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明還提供用于治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物或藥用物質(zhì)，其包含任何本發(fā)明肽或多核苷酸。本發(fā)明的藥物組合物或藥用物質(zhì)可包含呈遞任何本發(fā)明肽的APC或外來(lái)體作為活性組分，作為本發(fā)明的肽或多核苷酸的替代或補(bǔ)充。本發(fā)明的肽或多核苷酸能誘導(dǎo)在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的APC，例如通過(guò)使源自受試者的APC接觸本發(fā)明的肽或?qū)⒕幋a本發(fā)明肽的多核苷酸導(dǎo)入APC來(lái)實(shí)現(xiàn)。此類APC具有針對(duì)靶肽的高CTL誘導(dǎo)能力，可用于癌癥免疫療法。因此，本發(fā)明涵蓋誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法和通過(guò)該方法獲得的APC。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)CTL的方法，其包括共培養(yǎng)⑶8陽(yáng)性細(xì)胞與在其表面上呈遞本發(fā)明肽的APC或外來(lái)體的步驟，或?qū)氚ň幋a能與本發(fā)明肽結(jié)合的T細(xì)胞受體(TCR) 亞單位多肽的多核苷酸的基因的步驟。通過(guò)該方法獲得的CTL可用于治療和/或預(yù)防癌癥，諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜異位癥、食道癌、肝癌、 NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤、AML和CML。因此，本發(fā)明涵蓋通過(guò)本發(fā)明方法獲得的CTL。此外，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答的方法，其包括施用包含該 NEIL3多肽或其免疫學(xué)活性片段、編碼NEIL3多肽的多核苷酸、呈遞NEIL3多肽的外來(lái)體或 APC的組合物或物質(zhì)的步驟。本發(fā)明還提供了診斷癌癥的方法，所述癌癥包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜異位癥、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤、AML和CML。本發(fā)明可用于任何涉及NEIL3過(guò)表達(dá)的疾病，諸如癌癥，例示性的癌癥包括膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜異位癥、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤、AML和CML。附圖簡(jiǎn)述

圖1描繪一系列照片，顯示了用NEIL3衍生肽誘導(dǎo)的CTL的IFN- y ELISPOT測(cè)定的結(jié)果。用 NEIL3-A2-9-585 (SEQ ID NO 3)刺激的 8 號(hào)孔(a)、用 NEIL3-A2-9-127 (SEQ ID NO 4)刺激的2號(hào)孔(b)、用NEIL3-A2-9-416 (SEQID NO 5)刺激的4號(hào)和5號(hào)孔 (c)、用 NEIL3-A2-9-71 (SEQ ID NO 6)刺激的 3 號(hào)孔(d)、用 NEIL3-A2-9-271 (SEQ ID NO 11)刺激的 1 號(hào)孔(e)、用 NEIL3-A2-10-198(SEQ ID NO :15)刺激的 3 號(hào)孔(f)、用 NEIL3-A2-10-340(SEQID NO :17)刺激的 1 號(hào)孔(g)、用 NEIL3-A2-10-590 (SEQ ID NO 21) 刺激的2號(hào)和3號(hào)孔(h)、用NEIL3-A2-10-378 (SEQ ID NO 22)刺激的6號(hào)孔⑴及用 NEIL3-A2-9-416(SEQ ID NO 5)刺激的 9 號(hào)、10 號(hào)、12 號(hào)和 13 號(hào)孔(用于 HLA-A0206) (j) 中的CTL分別顯示與對(duì)照相比強(qiáng)力的IFN-Y生成。這些圖片的孔上的方框指示來(lái)自相應(yīng)孔的細(xì)胞被擴(kuò)增以建立CTL系。在圖中，“+"指示針對(duì)經(jīng)過(guò)適宜的肽沖激過(guò)的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激過(guò)的細(xì)胞的IFN-Y生成。圖2-1描繪的線圖顯示通過(guò)IFN-γELISA測(cè)定法檢測(cè)的經(jīng)過(guò)NEIL3-A2-585(SEQ ID NO 3) (a)、NEIL3-A2-9-127(SEQ ID NO :4) (b)、NEIL3_A2-9_416(SEQ ID NO :5) (c) (d)、 和NEIL3-A2-9-71(SEQ ID NO :6) (e)刺激的CTL系的IFN-γ生成。證明了用每一種肽刺激而建立的CTL系顯示與對(duì)照相比強(qiáng)力的IFN-Y生成。在圖中，"+"指示針對(duì)經(jīng)過(guò)適宜的肽沖激過(guò)的靶細(xì)胞的IFN-γ生成，而〃-〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激過(guò)的細(xì)胞的IFN-γ 生成。圖2-2描繪的線圖顯示了通過(guò)IFN-YELISA測(cè)定法檢測(cè)的經(jīng)過(guò) NEIL3-A2-9-271 (SEQ ID NO 11)⑴、NEIL3-A2-10-198 (SEQ ID N0:15)(g)、 NEIL3-A2-10-590(SEQ ID NO 21) (h) (i)和 NEIL3-A2-9-416(SEQ ID NO :5)(用于 HLA-A0206) (j) (k)刺激的CTL系的IFN-γ生成。證明用每一種肽刺激建立的CTL系均顯示了與對(duì)照相比強(qiáng)力的IFN-Y生成。在圖中，"+"指示針對(duì)經(jīng)過(guò)適宜的肽沖激過(guò)的靶細(xì)胞的IFN-γ生成，而〃-〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激過(guò)的細(xì)胞的IFN-Y生成。圖 3 顯示自經(jīng)過(guò) NEIL3-A2-9-416 (SEQ ID NO 5) (a)、NEIL3-A2_9_71 (SEQ ID NO 6) (b)、NEIL3-A2-10-198 (SEQ ID NO :15) (c)、NEIL3-A2-10-590 (SEQ ID NO :21) (d)和 NEIL3-A2-9-416(SEQ ID NO :5) (e)(用于HLA-A0206)刺激的CTL系通過(guò)有限稀釋而建立的 CTL 克隆的 IFN-Y 生成。證明用 NEIL3-A2-9-416(SEQ ID NO 5) (a)、NEIL3-A2-9-71 (SEQ ID NO 6) (b)、NEIL3-A2-10-198(SEQ ID NO :15) (c)、NEIL3-A2-10-590 (SEQ ID NO :21)
(d)和NEIL3-A2-9-416(SEQ ID NO :5) (e)(用于 HLA-A0206)刺激而建立的 CTL 克隆顯示了與對(duì)照相比強(qiáng)力的IFN-Y生成。在圖中，“+〃指示針對(duì)經(jīng)過(guò)NEIL3-A2-9-416(SEQ ID NO 5) (a)、NEIL3-A2-9-71 (SEQ ID NO :6) (b)、NEIL3-A2—10-198 (SEQ ID NO :15) (c)、 NEIL3-A2-10-590 (SEQ ID NO :21) (d)和NEIL3-A2-9-416 (SEQ ID NO :5)(用于HLA-A0206)
(e)沖激過(guò)的靶細(xì)胞的IFN-γ生成，而〃-〃指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激過(guò)的細(xì)胞的IFN-Y 生成。圖4-1描繪的線圖顯示了針對(duì)外源表達(dá)NEIL3和HLA_A*0201或HLA_A*0206的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。制備用HLA-A*0201、用HLA_A*0206或用全長(zhǎng)NEIL3基因轉(zhuǎn)染的 C0S7 細(xì)胞作為對(duì)照。用 NEIL3-A2-9-416(SEQ ID NO :5) (a)、NEIL3-A2-9-71 (SEQ ID NO: 6) (b)、和 NEIL3-A2-10-198(SEQ ID NO :15) (c)建立的 CTL 克隆顯示了針對(duì)經(jīng) NEIL3 和 HLA-A*0201 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的特異性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，沒(méi)有檢測(cè)到顯著的針對(duì)表達(dá)HLA的靶細(xì)胞(三角形)或表達(dá)NEIL3的靶細(xì)胞(圓形)的特異性CTL活性。圖4-2描繪的線圖顯示了針對(duì)外源表達(dá)NEIL3和HLA_A*0201或HLA_A*0206的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。制備用HLA-A*0201、用HLA_A*0206或用全長(zhǎng)NEIL3基因轉(zhuǎn)染的 C0S7 細(xì)胞作為對(duì)照。用 NEIL3-A2-9-416(SEQ ID NO 5) (d)(用于 HLA-A0206)建立的 CTL 克隆顯示了針對(duì)經(jīng)NEIL3和HLA-A*0206 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的特異性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，沒(méi)有檢測(cè)到顯著的針對(duì)表達(dá)HLA的靶細(xì)胞(三角形)或NEIL3的靶細(xì)胞 (圓形)的特異性CTL活性。圖5 顯示NEIL3在肝癌中的表達(dá)的照片。A部分顯示了 NEIL3在臨床肝癌組織中的表達(dá)，通過(guò)半定量RT-PCR來(lái)檢查。B部分顯示了 NEIL3在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)，通過(guò)半定量RT-PCR來(lái)檢查。圖6 顯示用NEIL3衍生肽誘導(dǎo)的CTL的IFN- y ELISPOT測(cè)定的結(jié)果的照片。用 NEIL3-A24-9-545 (SEQ ID NO 24)刺激的 7 號(hào)孔(a)、用 NEIL3-A24-9-362 (SEQ ID NO: 33)刺激的6號(hào)孔(b)、用NEIL3-A24-10-320 (SEQ ID NO 35)刺激的2號(hào)和8號(hào)孔(c)、用 NEIL3-A24-10-544(SEQ ID NO :41)刺激的 8 號(hào)孔(d)、用 NEIL3-A24-10-87 (SEQ ID NO :43) 刺激的1號(hào)和4號(hào)孔(e)中的CTL分別顯示與對(duì)照相比強(qiáng)力的IFN-Y生成。這些圖片的孔上的方框指示擴(kuò)增來(lái)自相應(yīng)孔的細(xì)胞以建立CTL系。相反，作為陰性數(shù)據(jù)的一種典型情況，經(jīng)NEIL3-AM-9-364(SEQ ID NO 25) (f)刺激的CTL針對(duì)經(jīng)肽沖激的靶細(xì)胞沒(méi)有顯示特異性IFN-γ生成。在圖中，"+〃指示針對(duì)經(jīng)過(guò)適宜的肽沖激過(guò)的靶細(xì)胞的IFN-Y生成， 而〃-"指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激過(guò)的細(xì)胞的IFN-γ生成。圖7描繪的線圖顯示了通過(guò)IFN-YELISA測(cè)定法檢測(cè)的經(jīng)過(guò) NEIL3-A24-9-545 (SEQ ID NO 24) (a)、NEIL3-A24-9-362 (SEQ ID NO :33) (b)、 NEIL3-A24-10-320(SEQ ID NO :35) (c)、NEIL3-A24-10-544 (SEQ ID NO :41) (d)禾口 NEIL3-A24-10-87 (SEQ ID NO :43) (e)刺激的CTL系的IFN-γ生成。它證明了用每一種肽刺激而建立的CTL系均顯示與對(duì)照相比強(qiáng)力的IFN-Y生成。在圖中，“+"指示針對(duì)經(jīng)過(guò)適宜的肽沖激過(guò)的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而"-"指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激過(guò)的細(xì)胞的 IFN-Y生成。圖8描繪的線圖顯示通過(guò)有限稀釋自經(jīng)過(guò)NEIL3-AM-9-545(SEQ ID NO :24) (a)、 NEIL3-A24-10-320 (SEQ ID NO :35) (b)和NEIL3-A24-10-544 (SEQ IDNO :41) (c)刺激的 CTL 系建立的CTL克隆的IFN-Y生成。證明了用每一種肽刺激而建立的CTL克隆均顯示與對(duì)照相比強(qiáng)力的IFN-Y生成。在圖中，"+〃指示針對(duì)經(jīng)過(guò)適宜的肽沖激過(guò)的靶細(xì)胞的IFN-γ 生成，而"-"指示針對(duì)未經(jīng)任何肽沖激過(guò)的細(xì)胞的IFN-γ生成。圖9描繪的線圖顯示了針對(duì)外源表達(dá)NEIL3和HLA-AM402的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。制備用HLA-AM402或用全長(zhǎng)NEIL3基因轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對(duì)照。用 NEIL3-A24-9-545 (SEQ ID NO 24)建立的 CTL 克隆顯示了針對(duì)經(jīng) NEIL3 和 HLA_A*2402 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的特異性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，沒(méi)有檢測(cè)到顯著的針對(duì)表達(dá)HLA-AM402的靶細(xì)胞(三角形)或表達(dá)NEIL3的靶細(xì)胞(圓形)的特異性CTL活性。實(shí)施方案的描述現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料，不過(guò)在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)施方案時(shí)可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方法之前，要理解本發(fā)明不限于本文中描述的特定大小、形狀、尺度、材料、方法、方案等，因?yàn)樗鼈兛梢勒绽袑?shí)驗(yàn)和/或優(yōu)化而變化。還要理解，所述描述中使用的術(shù)語(yǔ)只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會(huì)由所附權(quán)利要求來(lái)限制。I.定義如本文中使用的，詞語(yǔ)“一個(gè)/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個(gè)/種”，除非
另有明確說(shuō)明。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以是經(jīng)過(guò)修飾的殘基或非天然存在型殘基(諸如相應(yīng)的天然存在型氨基酸的人工化學(xué)模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然存在型的和合成的氨基酸，以及與天然存在型氨基酸發(fā)揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。氨基酸可以是L-氨基酸或 D-氨基酸。天然存在型氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細(xì)胞中在翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和0-磷酸絲氨酸)。短語(yǔ)“氨基酸類似物”指與天然存在氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)(α碳與氫、羧基、氨基、和R基團(tuán)結(jié)合)但具有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的R基團(tuán)或經(jīng)過(guò)修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語(yǔ)“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學(xué)化合物。氨基酸在本文中可以通過(guò)它們公知的由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的三字母符號(hào)或單字母符號(hào)來(lái)指稱。術(shù)語(yǔ)“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說(shuō)明，與氨基酸類似，通過(guò)它們普遍接受的單字母符號(hào)來(lái)指稱。除非另有定義，術(shù)語(yǔ)“癌癥”指過(guò)表達(dá)NEIL3基因的癌癥，它的例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜異位癥、食道癌、肝癌、NSCLC、 骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤、AML和CML。除非另有定義，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞”、“細(xì)胞毒性T細(xì)胞”和“CTL”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說(shuō)明，指能夠識(shí)別非自身細(xì)胞(例如腫瘤/癌細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞)并誘導(dǎo)此類細(xì)胞死亡的T淋巴細(xì)胞亞群。除非另有定義，術(shù)語(yǔ)“HLA-AM”指包括亞型，諸如HUW^2402的HLA-AM型。除非另有定義，如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“HLA-A2”代表性地指HLA_A*0201和 HLA-A*0206 等亞型。除非另有定義，如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“試劑盒”用于指試劑和其它材料的組合。本文中考慮到試劑盒可包括微陣列、芯片、標(biāo)志物、等等。術(shù)語(yǔ)“試劑盒”并非意圖限于試劑和 /或材料的特定組合。除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的普遍理解相同的含義。II.肽為了證明NEIL3衍生的肽發(fā)揮被CTL所識(shí)別的抗原的功能，對(duì)NEIL3(SEQ ID NO: 45)衍生的肽進(jìn)行分析以確定它們是否為HLA-AM或A2 (它們是常見(jiàn)的HLA等位基因)限制性的抗原表位(Date Y et al.，Tissue Antigens 47 :93-101,1996 ；Kondo A et al.，J Immunol 155 :4307-12,1995 ；Kubo RT et al. , JImmunol 152:3913—24,1994)。利用它們對(duì)HLA-A2的結(jié)合親和力來(lái)鑒定NEIL3衍生的HLA-A02結(jié)合肽的候選者。 候選肽是選自SEQ ID NO :1至23的肽。此外，用經(jīng)這些肽沖激(加載)的樹(shù)突細(xì)胞(DC)體外刺激T細(xì)胞后，使用下述每一種肽成功地建立了 CTL NEIL3-A2-9-585(SEQ ID NO 3),NEIL3-A2-9-127(SEQ ID NO 4),
NEIL3-A2-9-416(SEQ ID NO 5),NEIL3-A2-9-71(SEQ ID NO 6),NEIL3-A2-9-271(SEQ ID NO 11),NEIL3-A2-10-198(SEQ ID NO :15)，NEIL3-A2-10-340 (SEQ ID NO: 17)，NEIL3-A2-10-590(SEQ ID NO :21)，和NEIL3-A2-10-378(SEQ ID NO :22)?；谒鼈儗?duì)HLA-AM的結(jié)合親和力來(lái)鑒定NEIL3衍生的HLA-AM結(jié)合肽的候選者。候選肽是選自SEQ ID NO 24至43的肽。此外，用經(jīng)這些肽沖激(加載)的樹(shù)突細(xì)胞(DC)體外刺激T細(xì)胞后，使用下述每一種肽成功地建立了 CTL NEIL3-A24-9-545(SEQ ID NO 24),NEIL3-A24-9-362(SEQ ID NO 33),NEIL3-A24-10-320(SEQ ID NO 35),NEIL3-A24-10-544(SEQ ID NO :41)，和NEIL3-A24-10-87(SEQ ID NO :43)。這些建立的CTL顯示針對(duì)經(jīng)相應(yīng)肽沖激的靶細(xì)胞的強(qiáng)力且特異性的CTL活性。這些結(jié)果證明NEIL3是被CTL識(shí)別的抗原，而且所測(cè)試的肽是受HLA-AM或HLA-A2限制的 NEIL3表位肽。由于NEIL3基因在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，諸如膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜異位癥、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤、AML和CML，而且在大多數(shù)正常器官中不表達(dá)，它是良好的癌癥免疫療法靶標(biāo)。因此，本發(fā)明提供了來(lái)自NEIL3的CTL識(shí)別表位九肽(由九個(gè)氨基酸殘基組成的肽)和十肽 (由十個(gè)氨基酸殘基組成的肽)?；蛘撸景l(fā)明提供了結(jié)合HLA抗原和誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的分離的肽，其中所述肽由SEQ ID NO :45的氨基酸序列組成或是它的免疫學(xué)活性片段。更具體地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由選自SEQ ID NO =3,4,5,6,11,15, 17，21，22，24，33，35，41和43的氨基酸序列組成的肽。一般而言，可使用當(dāng)前例如在互聯(lián)網(wǎng)上可得的軟件程序，諸如Parker KC et al.，J Immunol 1994 Jan 1,152(1) 163—75 和 Nielsen M et al. , Protein Sci 2003 ； 12 :1007-17中記載的軟件程序，在計(jì)算機(jī)上(in silico)計(jì)算各種肽與HLA抗原之間的結(jié)合親禾口力?？梢园凑绽?Lafuente EM et al. , Current Pharmaceutical Design, 2009,15,3209-3220 中總結(jié)的 Parker KC et al.，J Immunol 1994 Jan 1,152(1) 163-75 ；Kuzushima K et al. , Blood 2001,98(6) :1872-81 ；Larsen MV et al. , BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31 ；8 424 ；Buus S et al. , Tissue Antigens. ,62 :378-84, 2003 ；Nielsen M et al. , Protein Sci 2003，12 1007—17 ；禾口 Nielsen M et al.， PLoS ONE 2007，2 :e796中所述地那樣測(cè)量與HLA抗原的結(jié)合親和力。例如Journal of Immunological Methods, 1995,185 :181-190 ；Protein Science,2000,9 :1838-1846 中記載了用于測(cè)定結(jié)合親和力的方法。因此，可使用此類軟件程序來(lái)選擇對(duì)HLA抗原具有高結(jié)合親和力的NEIL3衍生片段。因此，本發(fā)明涵蓋由任何NEIL3衍生片段組成的、可被確定結(jié)合使用此類已知程序鑒定的HLA抗原的肽。另外，此類肽可包括由全長(zhǎng)NEIL3組成的肽。本發(fā)明的肽的側(cè)翼可以有額外的氨基酸殘基，只要該肽保留它們的CTL誘導(dǎo)能力。額外的氨基酸殘基可以由任何種類的氨基酸構(gòu)成，只要它們不妨礙原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。因此，本發(fā)明涵蓋對(duì)HLA抗原具有結(jié)合親和力的肽，包括NEIL3衍生肽。，此類肽例如小于約40個(gè)氨基酸，常常小于約20個(gè)氨基酸，通常小于約15個(gè)氨基酸。一般而言，已知肽中1個(gè)、2個(gè)、或數(shù)個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響肽的功能，或者在有些情況下甚至?xí)鰪?qiáng)原始蛋白質(zhì)的期望功能。事實(shí)上，已知有經(jīng)過(guò)修飾的肽(即由通過(guò)對(duì)原始參照序列替代、刪除或添加1個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基而修飾的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學(xué)活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1984,81 :5662-6 ； Zoller and Smith,Nucleic Acids Resl982,10 :6487-500 ；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的具有CTL誘導(dǎo)能力的肽可以由如下的肽構(gòu)成所述肽由選自SEQ ID NO =3,4,5,6,11,15, 17，21，22，24，33，35，41和43的氨基酸序列組成，其中添加、刪除和/或替代1個(gè)、2個(gè)或甚至數(shù)個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，改變氨基酸序列中的單個(gè)氨基酸或少數(shù)百分比氨基酸的對(duì)氨基酸序列的個(gè)別添加、刪除或替代導(dǎo)致原始氨基酸側(cè)鏈的特性得以保留；因此，它常常被稱作“保守替代”或“保守修飾”，其中對(duì)蛋白質(zhì)的改變導(dǎo)致具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能上相似的氨基酸的保守替代表是本領(lǐng)域公知的。氨基酸側(cè)鏈的特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W, Y，V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下述共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè)鏈(S，T，Y)；含硫原子側(cè)鏈 (C，M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含堿側(cè)鏈(R，K，H)；和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。 另外，下面的八組各自含有互為保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸⑴，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見(jiàn)例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，而且可包括非保守修飾，只要該肽保留CTL誘導(dǎo)能力。另外，經(jīng)過(guò)修飾的肽不排除NEIL3的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的可誘導(dǎo)CTL的肽。為了保留必需的CTL誘導(dǎo)能力，可修飾(添加或替代)少數(shù)(例如1個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè))或小百分比的氨基酸。在本文中，術(shù)語(yǔ)“數(shù)個(gè)”意味著5個(gè)或更少的氨基酸，例如3個(gè)或更少。要修飾的氨基酸的百分比可以是20%或更少，例如15%或更少，例如10%或或者 1 至 5%。此外，可在肽中替代或添加氨基酸殘基以實(shí)現(xiàn)更高的結(jié)合親和力。當(dāng)在癌癥免疫療法中使用時(shí)，本發(fā)明的肽作為與HLA抗原形成的復(fù)合物呈遞在細(xì)胞或外來(lái)體的表面上。在天然被展示的肽之外，由于已經(jīng)知道通過(guò)結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列規(guī)律(J Immunol 1994，152 :3913 ；Immunogeneticsl995,41 :178 ;J Immunol 1994，155 :4307)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的免疫原性肽。例如，在顯示高HLA-A2結(jié)合親和力的肽中，它們N端起第二個(gè)氨基酸已被亮氨酸或甲硫氨酸替代，而且也可以有利地使用C端氨基酸已被纈氨酸或亮氨酸替代的肽。因此， 本發(fā)明涵蓋如下的肽，其具有選自SEQ ID N0:3，4，5，6，ll，15，17，21和22的氨基酸序列， 其中該SEQ ID NO的氨基酸序列的N端起第二個(gè)氨基酸被亮氨酸或甲硫氨酸替代，和/或如下的肽，其中該SEQ IDNO的氨基酸序列的C端氨基酸被纈氨酸或亮氨酸替代。另一方面，在擁有高HLA-AM結(jié)合親和力的肽中，它們N端起第二個(gè)氨基酸已被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸替代，而且C端氨基酸已被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代。因此，本發(fā)明涵蓋如下的肽，其具有SEQ ID NO =24,33,35,41 和43的氨基酸序列，其中N端起第二個(gè)氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸替代，和/或其中C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代。不僅可以在肽的末端氨基酸處引入替代，而且可以在其潛在的T細(xì)胞受體(TCR) 識(shí)別位置處引入替代。數(shù)項(xiàng)研究證明了具有氨基酸替代的肽可具有等同于或好于原始的功能，例如。ΑΡ1、ρ53β64_272)、Ηθ:τ-2/ηΘ ι(369_377)或gplOOte09_217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577,1997 ；Τ.K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002)Feb 1 ; 168 (3) : 1338-47 ; S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52 199-206 禾口 S. 0. Dionne et al.Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53，307—314)。另外，也可向本發(fā)明肽的N和/或C端添加1個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。本發(fā)明也包括此類具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導(dǎo)能力的經(jīng)過(guò)修飾的肽。然而，當(dāng)肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時(shí)，可誘導(dǎo)副作用，諸如自身免疫性病癥或針對(duì)特定物質(zhì)的變應(yīng)性癥狀。因此，可使用可得的數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。當(dāng)根據(jù)同源性搜索清楚了即使與目標(biāo)肽相比差1個(gè)或2個(gè)氨基酸的肽亦不存在時(shí)，可以修飾目標(biāo)肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導(dǎo)能力，而沒(méi)有此類副作用的任何危險(xiǎn)。雖然預(yù)期如上所述對(duì)HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽是高度有效的，但還是對(duì)以高結(jié)合親和力的存在作為指標(biāo)而選出的候選肽進(jìn)一步檢查CTL誘導(dǎo)能力的存在。在本文中，短語(yǔ)“CTL誘導(dǎo)能力”指肽在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上呈遞時(shí)誘導(dǎo)CTL的能力。另外，“CTL 誘導(dǎo)能力”包括肽誘導(dǎo)CTL活化、CTL增殖、促進(jìn)CTL溶解靶細(xì)胞、和提高CTL IFN-γ生成的能力。CTL誘導(dǎo)能力的確認(rèn)通過(guò)如下方式來(lái)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的APC(例如B-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和樹(shù)突細(xì)胞(DC))，或更具體地，自人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞衍生的DC， 并在用肽進(jìn)行刺激后，與CD8陽(yáng)性細(xì)胞混合，然后測(cè)量由CTL針對(duì)靶細(xì)胞生成和釋放的 IFN-γ。作為反應(yīng)系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成的表達(dá)人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug,61(8) :764-79,Related Articles,Books,Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice dependent on MHC(HLA)class II restricted T(H)response中記載的那些)。例如，可以用51Cr等放射性標(biāo)記靶細(xì)胞，并且可以自靶細(xì)胞釋放的放射性計(jì)算細(xì)胞毒性活性?；蛘撸扇缦聛?lái)進(jìn)行檢驗(yàn)測(cè)量在攜帶固定化肽的APC存在下由CTL生成和釋放的IFN- γ，并使用抗IFN- γ單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。作為如上所述地對(duì)肽的CTL誘導(dǎo)能力進(jìn)行檢驗(yàn)的結(jié)果，選自由SEQ IDNO =3,4,5, 6，11，15，17，21，22，24，33，35，41和43所示氨基酸序列組成的肽的九肽或十肽顯示特別高的CTL誘導(dǎo)能力以及對(duì)HLA抗原的高結(jié)合親和力。因此，這些肽是本發(fā)明的例示性實(shí)施方案。另外，同源性分析的結(jié)果顯示了那些肽與自任何其它已知人基因產(chǎn)物衍生的肽沒(méi)有顯著同源性。這降低了在用于免疫療法時(shí)未知的或不期望的免疫應(yīng)答的可能性。因此， 同樣來(lái)自這個(gè)方面，這些肽可用于在癌癥患者中引發(fā)針對(duì)NEIL3的免疫力。因此，本發(fā)明的肽優(yōu)選由選自SEQ ID NO :3，4，5，6，11，15，17，21，22，24，33，35，41和43的氨基酸序列組成的肽。除了如上文所述的對(duì)本發(fā)明肽的修飾之外，還可將本發(fā)明的肽連接至其它肽，只要它們保留CTL誘導(dǎo)能力。其它肽的例子包括本發(fā)明的肽或自其它TAA衍生的CTL可誘導(dǎo)肽。肽之間的接頭是本領(lǐng)域公知的，例如MY (P.M. Daftarian et al.，J Trans Med 2007,5 26)、AAA、NKRK(R. P.M. Sut腿Iler et al. ,J Immunol. 2000，165 :7308-7315)或K(S. Ota et al.，Can Res. 62，1471-1476 ；K.S.Kawamura et al.，J Immunol. 2002，168 :5709-5715)。例如，還可基本上同時(shí)使用非NEIL3腫瘤相關(guān)抗原肽以提高藉由I類和/11類HLA 的免疫應(yīng)答。公認(rèn)癌細(xì)胞能表達(dá)超過(guò)一種腫瘤相關(guān)基因。確定特定受試者是否表達(dá)別的腫瘤相關(guān)基因，然后在依照本發(fā)明的NEIL3組合物或疫苗中包括自此類基因的表達(dá)產(chǎn)物衍生的I類HLA和/或II類HLA結(jié)合肽，均系本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的例行實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)知曉I類HLAI和II類HLA結(jié)合肽的例子(例如參見(jiàn) Coulie, Stem Cells 13 :393_403，1995)，而且可以以與本文公開(kāi)類似的方式用于本發(fā)明。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能依照分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來(lái)制備包括一種或多種NEIL3肽和一種或多種非NEIL3肽的多肽或編碼此類多肽的核酸。因此，此類“多表位”(polytope)為兩個(gè)或更多個(gè)潛在免疫原性或免疫應(yīng)答刺激性肽構(gòu)成的組，這些肽可以以各種排列方式(例如串聯(lián)、交疊)連接在一起。該多表位(或編碼該多表位的核酸)可以以標(biāo)準(zhǔn)免疫方案來(lái)施用，例如施用于動(dòng)物，以測(cè)試該多表位刺激、 增強(qiáng)和/或引起免疫應(yīng)答的有效性。該肽可直接地或經(jīng)使用側(cè)翼序列連接在一起以形成多表位，而且多表位作為疫苗的用途是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)例如Thomson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13) 5845-5849,1995 ；Gilbert et al. ,Nature Biotechnol. 15(12) : 1280-1284，1997 ；Thomson et al. , J Immunol. 157(2) :822-826,1996 ；Tarn et al. , J Exp. Med. 171(1) :299-306, 1990)。可制備含有不同數(shù)目和組合的表位的多表位并測(cè)試它們被CTL識(shí)別的情況及提高免疫應(yīng)答的功效。另外，可將本發(fā)明的肽連接至其它物質(zhì)，只要它們保留CTL誘導(dǎo)能力。此類物質(zhì)可包括肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙酰基、天然的和合成的聚合物、等。肽可含有修飾，諸如糖基化、 側(cè)鏈氧化、或磷酸化；只要該修飾不破壞本文所述肽的生物學(xué)活性。可實(shí)施這些種類的修飾以賦予額外的功能(例如靶向功能和投遞功能)或穩(wěn)定化多肽。例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明多肽。多肽的穩(wěn)定性可以以多種方式加以測(cè)定。例如，可使用肽酶和各種生物學(xué)介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來(lái)測(cè)試穩(wěn)定性(參見(jiàn)例如Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11 :291-302)。此外，如上所述，在替代、刪除或添加1個(gè)、2個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的經(jīng)修飾肽中， 可篩選或選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的修飾肽。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選或選擇具有與原始肽相比相同或更高的活性的修飾肽的方法。例如，該方法可包括下述步驟a 對(duì)本發(fā)明的肽替代、刪除或添加至少一個(gè)氨基酸殘基；b:測(cè)定該肽的活性；并c 選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的肽。在本文中，該活性可包括MHC結(jié)合活性、APC或CTL誘導(dǎo)能力和細(xì)胞毒性活性。在本文中，本發(fā)明的肽也可以稱為“NEIL3肽”或“NEIL3多肽，，。III.NEIL3 肽的制備本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來(lái)制備。例如，肽可以通過(guò)合成、通過(guò)重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成來(lái)制備。本發(fā)明的肽可個(gè)別地合成，或作為包括兩個(gè)或更多個(gè)肽的較長(zhǎng)多肽來(lái)合成。可以分離，即純化該肽，或使其基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其片段或任何其它化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化；只要該修飾不破壞本文所述的肽的生物學(xué)活性。其它修飾包括摻入D-氨基酸或其它氨基酸模擬物，其可用于例如延長(zhǎng)肽的血清半衰期。可以根據(jù)選定的氨基酸序列經(jīng)由化學(xué)合成來(lái)獲得本發(fā)明的肽。例如，可適用于合成的常規(guī)肽合成法包括(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；(ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；(iii)Peptide Synthesis(in Japanese), Maruzen Co. ,1975 ；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co. ，1985 ；(ν) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol.14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ；(vi)W099/67^8 ；禾口(vii) Barany G. &Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2, “ Solid Phase PeptideSynthesis" , Academic Press, New York，1980，100—118?；蛘撸刹捎萌魏我阎倪z傳工程肽生產(chǎn)方法來(lái)獲得本發(fā)明的肽(例如 Morrison J, J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark-Curtiss&Curtiss, Methodsin Enzymology (eds. Wu et al.) 1983，101 :347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達(dá)形式(例如處于相當(dāng)于啟動(dòng)子序列的調(diào)節(jié)序列的下游)的編碼目標(biāo)肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞。本發(fā)明也提供此類載體和宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn)肽。IV.多核苷酸本發(fā)明提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括自天然存在的NEIL3基因(GenBank登錄號(hào)NM_018M8(例如SEQ ID NO :44))衍生的多核苷酸及具有它們的經(jīng)過(guò)保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語(yǔ)“經(jīng)過(guò)保守修飾的核苷酸序列”指編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，對(duì)于任何給定蛋白質(zhì)都有極其多種功能上相同的核酸來(lái)編碼它。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成任何相應(yīng)所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。此類核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼肽的每一種核酸序列也涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，核酸中的每一個(gè)密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)都可以加以修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因而，每一種所公開(kāi)的序列均隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、或其衍生物構(gòu)成。正如本領(lǐng)域公知的，DNA分子由堿基諸如天然存在的堿基A、T、C、和G構(gòu)成，而T在RNA中被U替換。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，多核苷酸中也包括非天然存在的堿基。本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個(gè)本發(fā)明肽，其中有或無(wú)居間氨基酸序列。例如，居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(diǎn)(例如酶識(shí)別序列)。另外，多核苷酸除編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表達(dá)肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標(biāo)志基因等等的表達(dá)載體(質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過(guò)常規(guī)重組技術(shù)操作多核苷酸來(lái)制備，例如使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。重組和化學(xué)合成技術(shù)都可用來(lái)生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過(guò)插入在轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細(xì)胞后能表達(dá)的適宜載體來(lái)生成多核苷酸?；蛘?，可使用PCR技術(shù)或通過(guò)在合適宿主中的表達(dá)來(lái)擴(kuò)增多核苷酸(參見(jiàn)例如Sambrook et al.，Molecular Cloning =A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York, 1989)。或者，可使用固相技術(shù)來(lái)合成多核苷酸，如Beaucage SL&Iyer RP，Tetrahedron 1992,48 :2223-311 ；Matthes et al.，EMBO J 1984,3 :801-5 中記載的。V.夕卜來(lái)體(exosomes)本發(fā)明進(jìn)一步提供了稱作外來(lái)體的細(xì)胞內(nèi)囊泡，這些外來(lái)體在它們的表面上呈遞本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合物。外來(lái)體可以通過(guò)，例如使用在日本專利申請(qǐng)Kohyo
發(fā)明者中村佑輔, 古川洋一, 吉村祥子, 大澤龍司, 渡邊朝久, 角田卓也 申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司