具有降低的效應(yīng)子功能的Fc變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生產(chǎn)包含F(xiàn)c區(qū)的親本多肽的變體的方法,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與蛋白質(zhì)C1q和與至少一種受體FcgγR的結(jié)合。
【專利說明】具有降低的效應(yīng)子功能的Fe變體
發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及制備展示降低的效應(yīng)子活性的Fe變體的方法。
_2] 相關(guān)領(lǐng)域的描述
[0003]衍生自抗體的療法在多種病理學(xué)病況,例如癌癥、自身免疫疾病、移植排斥和傳染病的治療中使用得越來越多。在2010年,超過37種抗體和衍生的蛋白質(zhì)被批準(zhǔn)用于臨床使用和超過1137種處于臨床開發(fā)中,其中71%是完全的IgG。它們中的大多數(shù)(91% )含有來自IgG的Fe區(qū)并對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)單克隆抗體(mAb)或又稱免疫粘附素的融合蛋白(ThompsonPharma2010 年 8 月)。
[0004]多個(gè)研究顯示,抗體的效應(yīng)子功能對(duì)免疫療法,特別是癌癥的治療的效力至關(guān)重要,所述癌癥的治療中尋求破壞細(xì)胞靶。能夠消滅細(xì)胞靶的效應(yīng)子功能主要涵蓋抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(ADCP)。⑶C主要通過Fe結(jié)構(gòu)域與第一補(bǔ)體成分Clq的直接結(jié)合觸發(fā),而ADCP和ADCC則通過Fe結(jié)構(gòu)域與Fe Y受體(FcyR)的結(jié)合觸發(fā)??贵w的Fe結(jié)構(gòu)域也通過與新生Fe受體(FcRn)的相互作用涉及血清持久性。因此在過去十年中已有大量研究集中在通過提高對(duì)FcRn的親和力增強(qiáng)抗體誘導(dǎo)ADCC和CDC應(yīng)答的能力和增加其血清半壽期上。
[0005]然而,在一些特定病況的治療中,ADCCADC和/或ADCP的誘導(dǎo)不是實(shí)現(xiàn)治療效果所必需的。在有些情況下必須避免這些誘導(dǎo)以降低副作用和避免IgG細(xì)胞毒性,例如在用抗CD3單克隆抗體orthoclone 0KT3治療進(jìn)行的移植排斥的情況下。據(jù)顯示,orthoclone0KT3的施用誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的大量全身性釋放,這是orthoclone 0KT3與Fe Y受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)。還顯示Fe Y R的活化可能對(duì)例如EGFR祀向抗體,西妥昔單抗(cetuximab)的治療具有負(fù)面影響,其被提示活化促腫瘤的M2巨噬細(xì)胞和降低患者的無惡化存活(progression-free survival) (Pander J.等人,2011)。
[0006]一般認(rèn)為,當(dāng)抗體或免疫粘附素僅當(dāng)作針對(duì)內(nèi)源或傳染性靶的阻斷劑或中和劑或作為細(xì)胞受體的激動(dòng)劑或拮抗劑使用時(shí),通過所述抗體或免疫粘附素的Fe區(qū)與Fe YR和Clq的結(jié)合的免疫系統(tǒng)的募集對(duì)免疫療法的治療效力不是關(guān)鍵的,甚至因而應(yīng)避免。
[0007]在這方面,據(jù)顯示4種人IgG亞類表現(xiàn)出不同的效應(yīng)子功能。一方面,IgGl和IgG3觸發(fā)ADCC和⑶C 二者的活性。另一方面,IgG2引起⑶C活性但不引起ADCC,而由于對(duì)Clq和Fe Y受體的低親和力,IgG4展示了極差的誘導(dǎo)補(bǔ)體和細(xì)胞活化的能力。因此,IgG4已成為不希望募集宿主效應(yīng)子功能的免疫療法的優(yōu)選亞類。中和性IgG4抗體已被批準(zhǔn)用于特定病況的治療。例如,那他珠單抗(natalizumab)是用于治療多發(fā)性硬化的抗α 4整合素mAb。盡管如此,有關(guān)IgG4在免疫療法中的使用仍然存在一些阻礙,因?yàn)槠潴w內(nèi)不穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)。
[0008]作為備選方案,設(shè)想了包含氨基酸修飾S228P的IgG4Fc變體。據(jù)顯示,所述修飾穩(wěn)定重鏈二聚體形成 ,伴隨低比例(〈8,3%)的仍然可能的Fab臂交換(Labri jn等人,NatureBiotech,2009,27,767-771)。也改造了 IgG雜種以產(chǎn)生具有低效應(yīng)子功能和改進(jìn)的藥理學(xué)譜的新的治療 mAb (Reddy 等人,The journal of Immunology, 2000,164,1925-1933)。Alexion Pharmaceuticals公司已開發(fā)了針對(duì)補(bǔ)體組分C5的人源化IgG2 / 4 κ抗體,名為依庫麗單抗(Eculizumab)。依庫麗單抗的重鏈在恒定區(qū)I (CHl)、鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)2 (CH2)的相鄰部分中包含人IgG2序列,在CH2的其余部分和恒定區(qū)3(CH3)中包含人IgG4序列。依庫麗單抗已被歐洲藥品管理局批準(zhǔn)用于治療陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿和溶血性尿毒綜合癥。
[0009]基于IgG2和IgG4之間的結(jié)構(gòu)差異,An等人通過在IgG2骨架的對(duì)應(yīng)位置中引入來自IgG4的4個(gè)氨基酸(即268Q / 309L1330S / 331S)設(shè)想了具有改變的效應(yīng)子功能的IgG2變體。得到的IgG沒有展示出與Clq,F(xiàn)c YRI和Fe YRIIIa的可檢測(cè)到的結(jié)合并展示出對(duì)FcYRIIb / c的弱親和力,但仍然具有和野生型IgG2相似的血清半壽期(An等人,mAbs,2009, I:6,572-579)。
[0010]此外,對(duì)IgGl的Fe區(qū)的多個(gè)位點(diǎn)特異性和隨機(jī)誘變研究已導(dǎo)致鑒定了參與IgGl與Clq和多種促ADCC受體的結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸(綜述見Strohl, Current opinion inBiotechnol,2009,20,685-691)。據(jù)顯示,在下游鉸鏈結(jié)構(gòu)域中的氨基酸,并且特別是第234和235位的亮氨酸殘基對(duì)于IgGlFc區(qū)對(duì)Clq, FcyRLFcy RII和Fe y RIII的親和力至關(guān)重要。在CH2結(jié)構(gòu)域中也發(fā)現(xiàn)了決定簇位置,例如氨基酸位置327,330和331,其突變可大大降低誘導(dǎo)ADCC和CDC應(yīng)答的能力。
[0011]因此,Xu等人指出,在基于人IgGl的0KT3抗體中引入突變234A / 235A顯著降低了與Fe Y RI,F(xiàn)cyRII和Clq的結(jié)合,這避免了使用未修飾的0KT3抗體觀察到的細(xì)胞因子釋放綜合癥,而同時(shí)保留了逆轉(zhuǎn)進(jìn)行的移植排斥的能力(Xu等人,Cell Immunol, 2000,1:16-26)。
[0012]Hezareh等人在包含突變234A / 235A的抗HIV-1IgGl變體中進(jìn)行了有關(guān)對(duì)效應(yīng)分子的親和力的 相同的觀察(Hezareh 等人,Journal of virology, 2001,12161-12168)。
[0013]同樣地,Oganesyan等人描述了在抗CD19IgGl中引入三突變234F / 235E /331S導(dǎo)致與若干效應(yīng)分子,即FcyRI,F(xiàn)e Y RIIa和FcyRIII和Clq的結(jié)合的完全喪失(Oganesyan 等人 Acta cryst.,2008, D64, 700-704)。
[0014]相似地,InvivoGen公司出售編碼包含突變233P / 234V / 235A / 236Del /327G / 330S / 331S的人的改造的IgGlFc變體的質(zhì)粒。這些突變大大降低了 IgGl Fe變體誘導(dǎo)ADCC和⑶C的能力。
[0015]上述所有這些發(fā)明暗示將人氨基酸替換為不預(yù)期出現(xiàn)在這些位置上的殘基,當(dāng)在對(duì)患者施用的mAb中使用這些殘基時(shí)將可能引起免疫反應(yīng)。
[0016]也顯示在Fe區(qū)第297位的天冬酰胺處的糖基化對(duì)單克隆抗體結(jié)合Fe Y R和觸發(fā)ADCC的能力具有直接影響(綜述見AbSs等人,Pharmaceuticals, 2010, 3,146-157)。
[0017]盡管在現(xiàn)有技術(shù)中描述了展示低ADCC和CDC活性的Fe變體,仍然需要制備展示對(duì)Clq和Fe Y受體的降低的親和力的新的Fe變體的方法。
[0018]發(fā)明概沭
[0019]本發(fā)明涉及生產(chǎn)包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體的方法,相比所述親本多肽,所述變體展示與蛋白質(zhì)Clq和與至少一種受體Fe YR的降低的結(jié)合,其中在親本多肽的Fe區(qū)中引入選自294Del,293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾,F(xiàn)e區(qū)的編號(hào)指根據(jù)EU索引(如在Kabat中),或其在Kabat (Kabat編號(hào))中的等同物的編號(hào)。
[0020]本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體,相比所述親本多肽,所述變體展示與蛋白質(zhì)Clq和與至少一種受體Fe Y R的降低的結(jié)合,并在其Fe區(qū)中包含選自294Del,293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾,F(xiàn)e區(qū)中的氨基酸編號(hào)指根據(jù)EU索引,或其在Kabat中的等同物的編號(hào)。本發(fā)明也涉及包含所述變體的藥物組合物和所述變體用于預(yù)防或治療病理病況的用途,所述病理病況中不希望誘導(dǎo)ADCC和/或⑶C應(yīng)答。
[0021]附圖簡(jiǎn)沭
[0022]圖1顯示了天然的人IgGl序列的第216-447位(根據(jù)EU索引)與人IgG2(SEQID NO:7),人 IgG3(SEQ ID NO:8)和人 IgG4(SEQ ID NO:9)的相應(yīng)序列的比對(duì)。IgGl 序列是Glml,17同種異型(SEQ ID NO:5)和Glm3同種異型(SEQ ID NO:6)。IgGl的“下游鉸鏈-CH2-CH3”結(jié)構(gòu)域從第226位開始(見箭頭)。
[0023]圖2顯示了質(zhì)粒載體PMGM05-R603,其中將編碼源自人IgGl重鏈的氨基酸殘基226-447 (根據(jù)EU索引)的人Fe基因(Fc226, SEQ NO:1)克隆進(jìn)2個(gè)限制性位點(diǎn)BamHI和NotI之間。
[0024]發(fā)明詳沭
[0025]a.定義
[0026]為了能更完全地理解本申請(qǐng),下面示出若干定義。這些定義旨在涵蓋語法等同物。
[0027]在本說明書和權(quán)利要求書通篇,在Fe區(qū)中的殘基的編號(hào)是根據(jù)在Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中描述的 EU 索引的免疫球蛋白重鏈編號(hào),將上述文獻(xiàn)明確引入本文作為參考。本文中的“EU索引”或“如Kabat中的EU索引”指人IgGlEU抗體的殘基編號(hào)。在Kabat中的等同物指在Kabat編號(hào)中的數(shù)字。
[0028]本文中使用的“多肽”或“蛋白質(zhì)”表示至少2個(gè)共價(jià)連接的氨基酸,其包括蛋白質(zhì)、多肽、寡肽和肽。
[0029]本文中使用的“氨基酸”表示20個(gè)天然存在的氨基酸或可能在特定的定義的位置上存在的任意非天然類似物之一。
[0030]本文中的“氨基酸修飾”表示多肽的氨基酸序列中的改變。也可將“氨基酸修飾”稱為“氨基酸改變”,本文中包括在多肽序列中的氨基酸突變,例如替換、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸替換”或“替換”表示將親本多肽序列中的特別的位置上的氨基酸替代為另一種氨基酸。例如,替換N434S指變體多肽,在此情況下指Fe變體,其中第434位的天冬酰胺被替代為絲氨酸。本文中使用的“氨基酸插入”或“插入”表示在親本多肽序列中的特別位置上的氨基酸的添加。例如插入G>235-236指在第235和236位之間的甘氨酸的插入。本文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”表示在親本多肽序列中的特別位置上的氨基酸的去除。E294Del或294Del指刪除了在第294位上的氨基酸(此處為谷氨酸)。氨基酸修飾可指點(diǎn)突變或突變的組合。
[0031]在氨基酸突變的組合的情況下,優(yōu)選的形式如下:294Del / 2591 / 315D / 434Y或E294Del / V259I / N315D / N434Y。這表示與其親本多肽相比,在變體的Fe區(qū)中有4個(gè)氨基酸突變:一個(gè)在第294位,一個(gè)在第259位,一個(gè)在第315位,一個(gè)在第434位,第294位的氨基酸,即谷氨酸被刪除,親本多肽的第259位氨基酸,即纈氨酸被替代為異亮氨酸,親本多肽的第315位氨基酸,即天冬酰胺被替代為天冬氨酸,親本多肽的第434位氨基酸,即纈氨酸被替代為酪氨酸。同樣地,氨基酸修飾293Del / 294Del表示相比多肽親本,在第293和294位上的氨基酸被刪除。
[0032]術(shù)語“抗體”在本文中在最廣泛的意義上使用?!翱贵w”指至少包含(i)Fc區(qū)和(ii)源自免疫球蛋白可變區(qū)的結(jié)合多肽結(jié)構(gòu)域的任意多肽。因此抗體包括但不限于,全長(zhǎng)免疫球蛋白,多特異性抗體,包含至少一個(gè)可變區(qū)的Fe融合蛋白,合成抗體(本文中有時(shí)稱為“抗體模擬物”),包含多于一個(gè)Fe區(qū)的改造的抗體,嵌合抗體,人源化的抗體,全人抗體,抗體融合蛋白,抗體綴合物和分別地各自的片段。
[0033]本文中使用的“全長(zhǎng)抗體”或“免疫球蛋白”表示構(gòu)成抗體的天然生物學(xué)形式的結(jié)構(gòu),包括可變區(qū)和恒定區(qū)。“全長(zhǎng)抗體”包括單克隆全長(zhǎng)抗體、野生型全長(zhǎng)抗體、嵌合全長(zhǎng)抗體、人源化的全長(zhǎng)抗體、全人全長(zhǎng)抗體,此列表不是限制性的。
[0034]在包括人和小鼠的大多數(shù)哺乳動(dòng)物中,全長(zhǎng)抗體的結(jié)構(gòu)一般是四聚體。所述四聚體由相同的2對(duì)多肽鏈組成,每一對(duì)具有一條“輕”鏈(一般具有約25kDa的分子量)和一條“重”鏈(一般具有約50-70kDa的分子量)。在有些哺乳動(dòng)物中,例如在駱駝和美洲駝中,全長(zhǎng)抗體可僅由2條重鏈組成,每條重鏈包含與Fe區(qū)連接的可變結(jié)構(gòu)域。
[0035]每條鏈的氨基端部分包括約100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū),其主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別并包含所謂的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。
[0036]每條鏈的羧基端部分定義恒定區(qū),其主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能。
[0037]在人免疫球蛋白的情況下,輕鏈分類為K和λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、GAMMA 、α或ε,并分別定義抗體同種型IgM, IgD, IgG, IgA,和IgE0
[0038]本文中使用的“IgG”表示屬于基本由公認(rèn)的免疫球蛋白Y基因編碼的抗體類別的多肽。在人中,IgG包含IgGl, IgG2,IgG3,和IgG4亞類或同種型。在小鼠中,IgG包含IgGl,IgG2a,IgG2b,IgG3。全長(zhǎng)IgG由相同的2對(duì)兩條免疫球蛋白鏈組成,每一對(duì)具有一條輕鏈和一條重鏈,每條輕鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域VL和CL,每條重鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域VH,C Y I (又稱CHI),C Y 2 (又稱CH2)和C Y 3 (又稱CH3)。在人IgGl的情況下,“CH1 ”指根據(jù)EU索引的第118-215位,CH2結(jié)構(gòu)域指第231-340位而CH3結(jié)構(gòu)域指第341-447位,或分別在Kabat編號(hào)中的第114-223,244-360和361-478位。IgGl也包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域,其在IgGl的情況下指根據(jù)EU索引的第216-230位,或Kabat中的226-243。
[0039]本文中使用的“Fe”或“Fe”區(qū)表示排除第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)免疫球蛋白的恒定區(qū)。因此Fe指IgA,IgD,和IgG的后兩個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域,IgE和IgM的后三個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域,和這些結(jié)構(gòu)域N-端的靈活鉸鏈。對(duì)于IgA和IgM,F(xiàn)e可包括J鏈。對(duì)于IgG,F(xiàn)c包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域CH2,CH3和在CHl和CH2之間的下游鉸鏈區(qū)。換句話說,IgGl的Fe區(qū)由“下游鉸鏈-CH2-CH3”結(jié)構(gòu)域組成,即從氨基酸C226至羧基末端的結(jié)構(gòu)域,其中的編號(hào)根據(jù)EU索引或是在Kabat中的等同物的編號(hào)。通過所述IgG亞類和人IgGl的重鏈或重鏈片段的氨基酸序列比對(duì)可測(cè)定其他IgG亞類的類似結(jié)構(gòu)域。
[0040]本文中使用的“Fe多肽”表示包含所有或部分Fe區(qū)的多肽。Fe多肽包括但不限于,抗體、Fe融合物、分離的Fe、Fe綴合物和Fe片段。
[0041]本文中使用的“親本多肽”或“多肽親本”表示未修飾的多肽,其隨后被修飾以生產(chǎn)變體。所述多肽可包含一個(gè)單條多肽鏈或未共價(jià)連接在一起的若干條多肽鏈。所述親本多肽可為天然存在的多肽(野生型多肽),天然存在多肽的變體或改造的形式,或合成的多肽。天然存在多肽的改造的或變體形式是不由天然存在的基因編碼的多肽。例如,改造的多肽可為嵌合抗體或人源化的抗體。
[0042]親本多肽可指多肽自身,或編碼其的氨基酸序列。在本發(fā)明的上下文中,親本多肽包含選自野生型Fe區(qū)、其片段及其突變體的Fe區(qū)。因此,親本多肽可任選地包含與野生型Fe區(qū)相比在其Fe區(qū)中先已存在的氨基酸修飾(即Fe突變體)。有利地,親本多肽為抗體、免疫球蛋白、Fe融合多肽、Fe綴合物,此列表不是限制性的。
[0043]本文中使用的“變體多肽”、“多肽變體”或“變體”表示由于在Fe區(qū)中的至少一個(gè)氨基酸修飾與親本多肽序列的多肽序列不同的多肽序列。
[0044]本文中的“野生型或WT”表示在自然界發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列或核苷酸序列,即其是天然存在的,包括等位變異。WT蛋白質(zhì)、多肽、抗體、免疫球蛋白、IgG等具有未經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)例如誘變有意修飾的氨基酸序列或核苷酸序列。例如,“野生型Fe區(qū)”包括但不限于,具有序列SEQ ID NO:1的IgGl的Fe區(qū),具有序列SEQ ID NO:2的IgG2的Fe區(qū),具有序列SEQ ID NO:3的IgG3的Fe區(qū),和具有序列SEQ ID NO:4的IgG4的Fe區(qū)。
[0045]使用術(shù)語“Fe受體”或“FcR”描述結(jié)合Fe區(qū)(例如,抗體的Fe區(qū))的受體。
[0046]術(shù)語“Fcy受體”或“FcyR”指結(jié)合IgG抗體的Fe區(qū)的人受體。本文中使用的FcyR 包括 Fe Y RI (CD64),F(xiàn)e y RII (CD32),F(xiàn)e y RIII (CD16)亞類,包括其等位變體和這些受體的可變剪切形式。
[0047]這些Fe Y R也被定義為激活受體(FcyRLFcyRIIa / c,FcyRIIIa / b)或抑制性受體(Fe Y RIIb),因?yàn)槠湟鸹蛞种泼庖吖δ堋?br>
[0048]Fe y RI家族由3種基因(FCGRIA,F(xiàn)CGRIB和FCGRIC)組成,但只有FCGRIA的產(chǎn)物已被鑒定為全長(zhǎng)表面受體。所述產(chǎn)`物,即Fe Y RI,由樹突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞以及活化的嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)。
[0049]Fe Y RII家族由3種基因(FCGR2A,F(xiàn)CGR2B和FCGR2C)組成,所述基因編碼FcyRIIa, Fe Y RIIb和Fe Y RIIc蛋白。Fe Y RIIa在單核細(xì)胞、某些樹突狀細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)。Fe Y RIIc在自然殺傷(NK)細(xì)胞上表達(dá)。Fe Y RIIb是廣泛表達(dá)的Fcy R。Fe Y RIIb幾乎存在于除了 NK細(xì)胞和T細(xì)胞以外的所有白細(xì)胞上。
[0050]Fe y RIII由2個(gè)基因FCGR3A和FCGR3B組成,所述基因編碼Fe Y RIIIa和Fe Y Rlllb。Fe Y RIIIa蛋白在單核細(xì)胞、組織特異性巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、δ / Y T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞上作為跨膜蛋白表達(dá)。Fe Y RIIIb是在嗜中性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面上表達(dá)的GPI錨定的受體。
[0051]編碼Fe Y RIIa的基因的2個(gè)等位基因產(chǎn)生在第131位不同的2種變體(低效應(yīng)器FcyRIIaR131和高效應(yīng)器Fe Y RIIaH131)。類似地,編碼Fe Y RIIIa基因的2個(gè)等位基因產(chǎn)生在第158位不同的2種變體(低效應(yīng)器?(^1?111&?158和高效應(yīng)器?(^1?111&¥158)。
[0052]引人注意地是,被認(rèn)為是抗體依賴性細(xì)胞毒性的關(guān)鍵介體的NK細(xì)胞僅表達(dá)Fe Y RIIIa和Fe Y RIIc而不表達(dá)其他Fe y R,特別是抑制性的Fe Y RIIb。
[0053]每種Fe Y R蛋白具有對(duì)IgG亞類的差異的配體結(jié)合偏好和對(duì)IgG亞類的不同的親和力。
[0054]激活的Fe Y R觸發(fā)多種免疫反應(yīng),例如吞噬作用,呼吸爆發(fā)和抗原呈遞細(xì)胞(APC)的細(xì)胞因子產(chǎn)生(TNF-α,IL-6),抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)和嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的脫粒。激活的Fe Y R也在免疫復(fù)合物的清除中起重要作用。另一方面,抑制性受體Fe Y RIIb是B細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)元素。其控制細(xì)胞激活的閾值和程度。
[0055]本文中使用的“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或ADCC指細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機(jī)制,藉此免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞主動(dòng)地裂解已被特異性抗體結(jié)合的靶細(xì)胞。ADCC主要由NK細(xì)胞介導(dǎo),但也可由其他免疫細(xì)胞,例如嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)。一般ADCC由NK細(xì)胞的激活引起。NK細(xì)胞的激活涉及其Fe受體與IgG的Fe區(qū)的結(jié)合,所述IgG與靶細(xì)胞表面上呈現(xiàn)的抗原結(jié)合。這樣的相互作用包括NK細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性顆粒。為了評(píng)估抗體誘導(dǎo)ADCC的能力,可進(jìn)行在de Romeuf等人Br J Haematol.2008Mar ;140 (6):635-43中描述的測(cè)定。
[0056]本文中使用的Clq是具有約460,OOOkDa分子量和被比作郁金香束的結(jié)構(gòu)的六價(jià)分子,其中6個(gè)膠原“桿”連接6個(gè)球狀頭部區(qū)域。Clq與2個(gè)絲氨酸蛋白酶Clr和Cls形成復(fù)合物Cl,其是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)途徑的第一組分。
[0057]“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或CDC指在補(bǔ)體存在下裂解靶細(xì)胞。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活通過Clq與抗體的結(jié)合起始,所述抗體與其關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合。為了激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián),Clq必須結(jié)合至少2分子的IgGl、IgG2或IgG3,但僅結(jié)合I分子IgM。為了評(píng)估抗體誘導(dǎo)⑶C的能力,可進(jìn)行在 Romeuf 等人,Br J Haematol.2008Mar ;140 (6):635-43 中描述的測(cè)定。
[0058]在Nimmer jahn 和 Ravetch, Nature reviews Immunology, 2OO8,8, !B4-47 中綜述了Fcy受體及其功能。
[0059]在例如Kishore 等人,Immunopharmacology, 2000,49:159-170 和等人Trends Immunol.200930(2):83-90 中綜述了 Clq 及其功能。
[0060]本文中使用的“FcRn”或“新生Fe受體”表示結(jié)合IgG抗體Fe區(qū)且至少部分由FCRN基因編碼的蛋白質(zhì)。如本領(lǐng)域公知的,功能性FcRn蛋白包含2條多肽,通常被稱為重鏈和輕鏈。輕鏈?zhǔn)铅?2-微球蛋白,重鏈由FCRN基因編碼。FcRn或FcRn蛋白指α -鏈與β -2-微球蛋白的復(fù)合物。 在人中,編碼FcRn的基因被稱為FCGRT。FcRn涉及母親至其胎兒的被動(dòng)體液免疫的轉(zhuǎn)移以及對(duì)IgG清除的控制。
[0061]在例如Roopenian, Nature Reviews Immunology, 2007, 7, 715-725 中綜述了 FcRn及其功能。
[0062]b.降低Fe結(jié)合Clg和Fe Y R的方法
[0063]本發(fā)明涉及制備Fe變體的方法,所述Fe變體展示出相比其親本多肽降低的對(duì)Clq和/或?qū)χ辽僖环NFe Y受體的親和力。
[0064]本 申請(qǐng)人:顯示,在野生型和改造的IgG 二者的Fe區(qū)中引入單個(gè)氨基酸突變能夠顯著降低所述IgG與蛋白質(zhì)Clq和Fe Y受體的結(jié)合。所述單個(gè)突變對(duì)應(yīng)于第294位氨基酸的缺失(下文中稱294Del),氨基酸編號(hào)指根據(jù)EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0065]更準(zhǔn)確地說,本 申請(qǐng)人:顯示,通過在包含野生型Fe區(qū)(即具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fe區(qū))的IgGl的氨基酸序列中引入294Del得到的IgGl變體在ELISA測(cè)定中不能結(jié)合 Clq 蛋白,F(xiàn)e Y RIIb (又稱 CD32b),F(xiàn)e Y RIIa(又稱 CD32a),F(xiàn)e Y RIIIa(又稱⑶16a)和Fe Y RI (又稱⑶64),或相比對(duì)應(yīng)的野生型IgGl變體展示降低的結(jié)合(見實(shí)施例中的II1.2.1和II1.2.2)。引人注目地是,在IgGl多肽中引入294Del突變也能夠消除或限制與Clq和Fe Y受體的結(jié)合親和力,所述IgGl多肽初始被改造相比野生型IgGl展示對(duì)FcRn提高的親和力。[0066]例如,相比野生型IgGl,具有突變 294Del/256N / 378V / 383N / 434Y 的 IgGl 變體不能結(jié)合Clq和Fe Y R受體。
[0067]相反地,因此具有突變256N / 378V / 383N / 434Y的其IgGl親本相比野生型IgGl具有提高的結(jié)合Clq和Fe YRIIIa的能力。
[0068]相比其包含氨基酸修飾2591 / 315D / 434Y的親本多肽,變體294Del / 2591 /315D / 434Y得到類似的結(jié)果。所述親本多肽相比IgGl野生型具有類似的結(jié)合Clq和FcyRIIIa的能力。
[0069]類似地,294Del,293Del,293Del/ 294Del, 294Del / 256N / 378V / 383N /434Y,294Del / 2591 / 315D / 434Y,294Del / 397M,294Del / 302A,294Del / 434S,294Del / 315D,294Del / 230S,294Del / 307A,294Del/228R, 230S / 315D / 428L / 434Y,294Del / 378V和294Del / 434Y變體相比其對(duì)應(yīng)的親本多肽展示了降低的與選自Clq和Fe Y受體的至少一種蛋白質(zhì)的結(jié)合。相反地,所述親本多肽相比野生型IgGl具有提高的結(jié)合選自Clq和Fe Y受體的至少一種蛋白質(zhì)的能力。 申請(qǐng)人:還顯示,通過在包含野生型Fe區(qū)的IgGl的氨基酸序列中引入294Del得到的IgGl變體展示出相比其對(duì)應(yīng)的親本IgGl類似的與FcRn的結(jié)合。類似的結(jié)合旨在指,引入294Del氨基酸修飾,所述突變,僅導(dǎo)致相比其親本IgGl,變體與FcRn結(jié)合的小于35%的改變。小于35%旨在指,小于30%,小于25%,小于20%,小于15%,小于10%和小于5% ο
[0070]期望通過結(jié)合Clq和Fe Y R的能力降低,突變294Del的引入可分別影響IgGl變體相比親本IgGl的⑶C和ADCC活性。
[0071]第293位的氨基酸也是谷氨酸。其缺失導(dǎo)致與第294位的谷氨酸缺失相同的核苷酸和氨基酸序列。因此,變體293Del和294Del是相同的多肽。因此,本發(fā)明的第一目的是提供制備包含F(xiàn)e區(qū)的親本多`肽的變體的方法,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與選自Clq和Fe Y受體的至少一種蛋白質(zhì)的結(jié)合,其中在親本多肽的Fe區(qū)中引入選自294Del或293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾,在Fe區(qū)中的氨基酸的編號(hào)指根據(jù)EU索引,或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0072]在優(yōu)選的實(shí)施方案中,變體展示出相比所述親本多肽降低的與Clq和與至少一種Fcy受體的結(jié)合。
[0073]如在標(biāo)題為“定義”的上文部分中所解釋的,親本多肽指包含F(xiàn)e區(qū)的多肽。所述親本多肽可為天然存在的多肽(野生型多肽),天然存在多肽的變體或改造的形式,或合成的多肽。親本多肽包括但不限于,抗體、Fe融合蛋白、Fe綴合物、Fe衍生的多肽、分離的Fe及其片段。例如,改造的多肽可為嵌合抗體或人源化的抗體。
[0074]親本多肽的Fe區(qū)優(yōu)選地選自人IgG亞類的野生型Fe區(qū),其片段和其突變體。在本文中,人IgG的Fe區(qū)對(duì)應(yīng)“下游鉸鏈”-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域。野生型人IgGl的“下游鉸鏈”-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域指根據(jù)EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)第226位至第447位的氨基酸。通過所述IgG亞類與人IgGl的重鏈的氨基酸序列比對(duì)可測(cè)定其他人IgG亞類的類似結(jié)構(gòu)域,如圖1中顯示。
[0075]人IgG 亞類包含 IgGl,IgG2,IgG3,IgG4,包括其多種同種異型。IgGl, IgG2, IgG3和 IgG4 的 Fe 區(qū)的序列分別對(duì)應(yīng) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4的序列。[0076]將Fe區(qū)片段定義為包含一個(gè)或多個(gè)源自野生型Fe區(qū)的多肽的多肽。所述Fe區(qū)的片段優(yōu)選地包含來自野生型Fe區(qū)的至少100個(gè)連續(xù)的殘基。來自野生型Fe區(qū)的至少100個(gè)連續(xù)的殘基涵蓋所述野生型Fe區(qū)的至少140,至少160,至少200,至少210個(gè)連續(xù)的殘基。[0077]如上所述,親本多肽可包含野生型Fe突變體,即相比野生型Fe區(qū)已包含已有的氨基酸突變(例如添加、插入和/或替換)的Fe區(qū)。
[0078]如前所述,本文中使用的“變體多肽”或“變體”表示與親本多肽的多肽序列相差至少一個(gè)氨基酸修飾的多肽序列。在目前的情況下,所述至少一個(gè)氨基酸修飾必然涵蓋選自突變294Del,突變293Del和突變293Del / 294Del的組合的氨基酸修飾。
[0079]根據(jù)本發(fā)明的變體多肽可展示出相比其親本多肽降低的與第一補(bǔ)體組分Clq的結(jié)合。換句話說,變體對(duì)Clq的親和力比親本多肽對(duì)Clq的親和力低。
[0080]根據(jù)本發(fā)明的變體多肽也可展示對(duì)至少一種Fe Y受體的親和力,所述親和力比其親本多肽對(duì)至少一種Fe Y受體的親和力低。本文中使用的Fe Y受體包括Fe Y RI,F(xiàn)e Y RIII 和 Fe Y RH 受體。優(yōu)選地,至少一種 Fe Y R 選自 Fe y RIIIa, Fe y RIIa, Fe y RI 和Fe Y RIIb0
[0081]在一些實(shí)施方案中,變體多肽展示出相比其多肽親本降低的與Clq和Fe YRIIIa的結(jié)合。
[0082]在某些實(shí)施方案中,變體多肽展示出相比其多肽親本降低的與Clq,F(xiàn)e YRIIa和FcyRIIIa的結(jié)合。
[0083]在其他實(shí)施方案中,變體多肽展示出相比其多肽親本降低的與Clq,F(xiàn)cyRIIIa,Fe Y RIIa 和 Fe Y RI 的結(jié)合。
[0084]在其他實(shí)施方案中,變體多肽展示出相比其多肽親本降低的與Clq,F(xiàn)cyRIIIa,Fe Y RIIa, Fe y RI 和 Fe y RIIb 的結(jié)合。
[0085]可通過現(xiàn)有技術(shù)熟知的方法例如ELISA測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)和表面等離子共振(SPR)評(píng)估與Clq或與任一 Fe Y受體的結(jié)合。
[0086]例如,如在實(shí)施例的章節(jié)III中描述的,通過計(jì)算由ELISA測(cè)定得到的其特異性信號(hào)的比例,可比較本發(fā)明的變體與目的蛋白質(zhì)(例如Clq或FcyR)的結(jié)合強(qiáng)度與其親本多肽與目的蛋白質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度。如本文使用的,如果通過變體的特異性信號(hào)除以親本多肽的特異性信號(hào)得到的比例小于0.50,則變體展示出相比其親本多肽降低的與目的蛋白質(zhì)例如Clq或Fe Y R的結(jié)合,所述特異性信號(hào)由ELISA測(cè)定法測(cè)定。換句話說,變體的特異性信號(hào)比其親本多肽的特異性信號(hào)低0.50倍。低于0.50的比例包括低于0.45,低于0.40,低于0.35,低于0.30,低于0.25,低于0.20,低于0.15,低于0.10,低于0.05,低于0.01的比例。
[0087]在優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述比例低于0.20。
[0088]ELISA測(cè)定的優(yōu)選形式包括包被目的蛋白質(zhì)。
[0089]作為替代方案,可通過合適的ELISA測(cè)定經(jīng)測(cè)定EC50比較變體及其多肽親本與目的蛋白質(zhì)的結(jié)合。EC50指提供信號(hào)的變體濃度,所述信號(hào)代表關(guān)于結(jié)合的目的蛋白質(zhì)百分比對(duì)變體濃度的log值的曲線的50%飽和。一般認(rèn)為,變體多肽展示出相比其多肽親本降低的與目的蛋白質(zhì)的結(jié)合如果其EC50比其多肽親本的EC50高至少1.5倍,。
[0090]也可通過SPR測(cè)定解離常數(shù)(Kd)評(píng)估變體與目的蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力。一般認(rèn)為,變體多肽展示出相比其多肽親本降低的與目的蛋白質(zhì)的降低如果其Kd比其多肽親本的Kd高至少1.5倍。
[0091]變體對(duì)Clq或?qū)e Y R的親和力可能太弱以致于無法通過ELISA測(cè)定的特異性信號(hào),甚至SPR的Kd或ELISA測(cè)定的EC50準(zhǔn)確測(cè)定,因?yàn)榻Y(jié)合信號(hào)處于背景噪音中或在檢測(cè)閾值以下。在這樣的情況下,認(rèn)為變體不結(jié)合目的蛋白質(zhì)。
[0092]例如,根據(jù)本發(fā)明的方法得到的變體可能不結(jié)合至少一種Fe YR并展示出降低的與Clq的結(jié)合。在本申請(qǐng)的實(shí)施例中清楚地說明了這樣的變體。
[0093]在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的變體不結(jié)合選自Clq和Fe Y受體的至少一種蛋白質(zhì)。
[0094] 申請(qǐng)人:顯示,引入294Del足以顯著削弱變體與Clq和與Fe Y受體的結(jié)合。換句話說,為了得到具有適當(dāng)降低的與Clq和/或Fe Y受體的結(jié)合的變體,不需要引入除了294Del以外的突變。
[0095]這樣的結(jié)果特別驚人,因?yàn)閾?jù) 申請(qǐng)人:所知,現(xiàn)有技術(shù)主要描述的展示出降低的與Clq和Fe Y受體的結(jié)合的Fe變體相比其多肽親本在其Fe區(qū)中具有至少2個(gè)氨基酸修飾。
[0096]在一些實(shí)施方案中,突變294Del因此是為了得到所述變體引入親本多肽的Fe區(qū)中的唯一氨基酸修飾。
[0097]在一些其他實(shí)施方案中,突變293Del是為了得到所述變體引入親本多肽的Fe區(qū)中的唯一氨基酸修飾。
[0098]在一些另外的實(shí)施方案中,氨基酸修飾del293 / del294是為了得到所述變體引入親本多肽的Fe區(qū)中的唯一氨基酸修飾。
[0099]因此,本發(fā)明的某些實(shí)施方案涵蓋生產(chǎn)包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體的方法,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與蛋白質(zhì)Clq和/或與至少一種受體Fe Y R的結(jié)合,其中在親本多肽的Fe區(qū)中引入選自下述的氨基酸修飾:
[0100](i)294del,其中所述氨基酸修飾294del是引入親本多肽的Fe區(qū)中的唯一氨基酸修飾,
[0101](ii)293del,和
[0102](iii)293del/294del,
[0103]Fe區(qū)中的氨基酸的編號(hào)指根據(jù)EU索引,或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0104]本發(fā)明的其他實(shí)施方案涵蓋生產(chǎn)包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體的方法,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與蛋白質(zhì)Clq和/或與至少一種受體Fe Y R的結(jié)合,其中在親本多肽的Fe區(qū)中引入選自下述的氨基酸修飾:
[0105](i)294del,其中所述氨基酸修飾294del是引入親本多肽的Fe區(qū)中的唯一氨基酸修飾,
[0106](ii)293del,其中所述氨基酸修飾293del是引入親本多肽的Fe區(qū)中的唯一氨基酸修飾和
[0107](iii)293del/294del,
[0108]Fe區(qū)中的氨 基酸的編號(hào)指根據(jù)EU索引,或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0109]在特別的實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法提供了與包含E294Del / T307P / N434 Y的變體不同的變體。[0110]不與任何理論結(jié)合, 申請(qǐng)人:認(rèn)為本發(fā)明提供的方法不顯著導(dǎo)致Fe區(qū)中的主要結(jié)構(gòu)重排使得在一些情況下,不由與Clq和Fe Y R結(jié)合介導(dǎo)的其他功能相比多肽親本沒有顯著改變。引人注目地是, 申請(qǐng)人:顯示對(duì)多種不同的親本多肽,在其Fe區(qū)中引入突變294Del沒有顯著削弱其對(duì)新生Fe受體(FcRn)的親和力。例如,IgGl變體256N / 294Del / 378V /383N / 434Y的特異性信號(hào)等于其多肽親本256N / 378V / 383N / 434Y的特異性信號(hào)的0.75倍,而IgGl變體307A / 294Del的特異性信號(hào)等于其多肽親本307A的特異性信號(hào)的0.97倍。引人注目地是,所述變體展示出相比野生型IgGl提高的與FcRn的結(jié)合(見實(shí)施例中的表1-4)。換句話說,在一些情況下,F(xiàn)e多肽親本和通過本發(fā)明的方法得到的變體可顯示接近的對(duì)FcRn的結(jié)合性能。
[0111]如本文使用的,當(dāng)變體的特異性信號(hào)至少等于其親本多肽的特異性信號(hào)的0.6倍時(shí),通過本發(fā)明的方法得到的變體具有與其多肽親本接近的與FcRn的結(jié)合,所述特異性信號(hào)通過ELISA測(cè)定法測(cè)定,其中如在實(shí)施例的章節(jié)III中描述的優(yōu)選地固定FcRn分子。至少等于0.6倍在本文中旨在指0.6倍,0.65倍,0.70倍,0.75倍,0.80倍,0.85倍,0.90倍和0.95倍。
[0112]如上所述,親本多肽的Fe區(qū)可選自人IgG的野生型Fe區(qū),其片段及其突變體。
[0113]人IgG的野生型Fe區(qū)涵蓋SEQ ID NO:1的多肽,SEQ ID NO:2的多肽,SEQ ID NO:3的多肽,SEQ ID NO:4的多肽,SEQ ID NO:5的多肽。
[0114]在優(yōu)選的實(shí)施方案中,親本多肽的Fe區(qū)選自來自IgGl和IgG2的野生型Fe區(qū),其片段及其突變體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中,多肽親本的Fe區(qū)是野生型人IgGl的Fe區(qū),其片段及其突變體。
[0115]如上所示,親本多肽的Fe區(qū)可包含已有的選自一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入和替換的氨基酸修飾。換句話說,`親本多肽的Fe區(qū)可為野生型Fe區(qū)的突變體,優(yōu)選人IgG,即IgGl, IgG2,IgG3和IgG4的野生型Fe區(qū)的突變體。
[0116]在一些實(shí)施方案中,多肽親本的Fe區(qū)相比其對(duì)應(yīng)的野生型Fe區(qū)包含約I至約20個(gè)氨基酸突變,優(yōu)選地約I至約10個(gè)氨基酸突變。
[0117]約I 至約 20 個(gè)氨基酸突變涵蓋 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,
18,19和20個(gè)氨基酸突變。
[0118]多肽親本的Fe區(qū)與其對(duì)應(yīng)的野生型Fe區(qū)一般具有至少約90%的氨基酸同一性。至少90 %的氨基酸同一性涵蓋至少約90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98%,99%和 99.5%o
[0119]為了測(cè)定第一多肽㈧和第二多肽⑶之間的同一性百分比,使用現(xiàn)有技術(shù)熟知的方法比對(duì)其序列,例如考慮最終缺口(即相比多肽⑶在多肽㈧的序列中存在的最終缺失和插入)的Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法??墒褂肊MBL-EBI網(wǎng)站上可獲得的比對(duì)工具《EMBOSS成對(duì)比對(duì)算法》,使用以下參數(shù):(i)方法:EMBOSS:Needle (全局);(ii)缺口延伸:0.5 ; (iii)缺口開放:10.0 ; (iv)分子:蛋白質(zhì);(v)矩陣:Blosum62。
[0120]一旦得到全局比對(duì),可通過常規(guī)方法測(cè)定同一性百分比,優(yōu)選地用從(A)和(B)的比對(duì)中得到的匹配殘基數(shù)除以在㈧和⑶之間較長(zhǎng)的多肽序列中的氨基酸數(shù)。
[0121]當(dāng)親本多肽包含已有的氨基酸突變時(shí),所述親本多肽可展示出相比其參考多肽,即包含野生型Fe區(qū)的類似多肽一種或多種降低或提高的效應(yīng)子功能。本文中使用的效應(yīng)子功能包括但不限于ADCC,ADCP, CDC和與FcRn的結(jié)合。
[0122]本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考以前的研究以根據(jù)尋找的效應(yīng)子功能譜測(cè)定可能存在于親本多肽中的已有的氨基酸突變。例如,親本多肽可包含在選自Fe區(qū)的氨基酸位置227,228,230,231,233,234,239,241,243,246,250,252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,301,302,303,305,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,438,439,440,443,444,445,446和447上的至少一個(gè)氨基酸突變,其中在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)為EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0123]親本多肽也可包含在選自Fe區(qū)的氨基酸位置227,228,230,231,233,234,239,241,243,246,250,252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,434,438,439,440,443,444,445,446和447上的僅一個(gè)氨基酸突變,其中在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)為EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)?!皟H一個(gè)氨基酸突變”表示親本多肽在上述位置上不含有多于一個(gè)修飾。例如,親本多肽在Fe區(qū)的第307和434位上不都包含氨基酸修飾。因此,在多肽親本的Fe區(qū)中引入的唯一突變是294Del或293Del的方法的實(shí)施方案中,得到的變體在上述氨基酸位置上不能包含多于一個(gè)氨基酸突變,特別地變體在Fe區(qū)的第307和434位上不都包含氨基酸修飾,在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)為EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0124]因此本發(fā)明的某些實(shí)施方案涵蓋生產(chǎn)包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體的方法,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與選自Clq和Fe Y受體的至少一種蛋白質(zhì)的結(jié)合,其中在親本多肽的Fe區(qū)中引入選 自294Del或293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾,附帶條件是得到的變體不包含294Del / T307P / N434Y或293Del / T307P / N434Y突變。
[0125]在其他實(shí)施方案中,本發(fā)明涵蓋生產(chǎn)包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體的方法,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與選自Clq和Fe Y受體的至少一種蛋白質(zhì)的結(jié)合,其中在親本多肽的Fe區(qū)中引入選自294Del或293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾,附帶條件是得到的變體不在于294Del / T307P / N434Y或293Del / T307P / N434Y變體。
[0126]本發(fā)明的其他實(shí)施方案涵蓋生產(chǎn)包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體的方法,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與選自Clq和Fe Y受體的至少一種蛋白質(zhì)的結(jié)合,其中在親本多肽的Fe區(qū)中引入選自294Del或293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾,附帶條件是親本多肽的所述變體不包含在于294Del或293Del與在第307和434位上的突變的組合的氨基酸修飾,在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)指根據(jù)EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。同樣地,多肽親本可包含或可不包含在從Fe區(qū)的第290至292位和從第295至300位上的至少一個(gè)氨基酸修飾,其中在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)為EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0127]因此,在一些實(shí)施方案中,多肽親本不包含在從Fe區(qū)的第290至292位和從第295至300位的任意氨基酸位置上的氨基酸修飾,其中在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)為EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0128]從第290至292位和從第295至300位的氨基酸位置涵蓋第290,291,292,295,296,297,298,299 和 300 位。
[0129]在其他實(shí)施方案中,相比野生型Fe區(qū)多肽親本在其Fe區(qū)中不包含任何突變。在這樣的實(shí)施方案中,親本多肽包含選自人IgG及其片段的野生型Fe區(qū)。
[0130]提醒一下,人IgG的野生型Fe區(qū)涵蓋SEQ ID NO:1的Fe區(qū),SEQ ID NO:2的Fe區(qū),SEQ ID NO:3 的 Fe 區(qū)和 SEQ ID NO:4 的 Fe 區(qū)。
[0131]在一些其他實(shí)施方案中,親本多肽的Fe區(qū)是包含選自434Y,378V,397M,302A,434S, 315D, 230S, 307A, 228R, 230S / 315D / 428L / 434Y, ,2591 / 315D / 434Y 和 256N /378V / 383N / 434Y的至少一個(gè)氨基酸修飾的野生型IgG Fe區(qū)的變體。
[0132]在某些實(shí)施方案中,親本多肽的Fe區(qū)是選自434Y,378V,397M,302A,434S,315D,230S,307A,228R,230S / 315D / 428L / 434Y,259I / 315D / 434Y 和 256N / 378V /383N / 434Y的野生型IgG Fe區(qū)的變體。
[0133]在特別的實(shí)施方案中,生產(chǎn)包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體的方法的特征如下,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與蛋白質(zhì)Clq和與至少一種受體Fe Y R的結(jié)合:
[0134](i)在親本多肽的Fe區(qū)中引入選自294Del,293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾,
[0135](ii)選自294 Del,293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾是為了得到所述變體在親本多肽的Fe區(qū)中引入的唯一氨基酸修飾,和
[0136](iii)親本多肽的Fe區(qū)選自IgG及其片段的野生型Fe區(qū);
[0137]在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)指根據(jù)EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0138]在一些實(shí)施方案中,在親本多肽的Fe區(qū)中引入選自294Del,293Del和293Del /294Del的氨基酸修飾的步驟包括以下步驟:
[0139](a)提供編碼親本多肽的核酸,
[0140](b)修飾在步驟⑴中提供的核酸以得到編碼所述變體的核酸,和
[0141](C)在宿主細(xì)胞中表達(dá)在步驟(ii)中得到的核酸并回收所述變體。
[0142]在根據(jù)本發(fā)明的方法的一些實(shí)施方案中,在親本多肽的Fe區(qū)中引入的氨基酸修飾是294Del。在其他實(shí)施方案中,所述修飾是293Del。
[0143]這樣的方法可通過分子生物學(xué)常規(guī)作法進(jìn)行。為了實(shí)施本發(fā)明的方法,本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考在現(xiàn)有技術(shù)中描述的熟知程序,其可見于例如Molecular Cloning-ALaboratory Manual,第三版(Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,2001), The condensed protocols from Molecular cloning:a laboratorymanual(Sambrook, Russell, CSHL Press,2006),和 Current Protocols in MolecularBiology (John ffiley&Sons,2004)?
[0144]親本多肽的核酸可為市售的或可通過分子生物學(xué)或化學(xué)合成的經(jīng)典程序得到。可通過使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的多種方法修飾親本多肽的核酸取得如在步驟(b)中提到的編碼變體的核酸。這些方法包括但不限于定點(diǎn)誘變、隨機(jī)誘變、PCR誘變和盒式誘變。
[0145]考慮到其在宿主細(xì)胞中的表達(dá),可將編碼所述變體的核酸摻入表達(dá)載體中。
[0146]表達(dá)載體一般包括有效連接的,即置于與控制或調(diào)控序列、可選擇標(biāo)簽、任意融合伙伴,和/或額外的元件的功能關(guān)系中的蛋白質(zhì)??赏ㄟ^在合適的條件下,培養(yǎng)用核酸,優(yōu)選含有編碼變體的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以誘導(dǎo)或?qū)е碌鞍踪|(zhì)的表達(dá),產(chǎn)生本發(fā)明的變體。可使用多種合適的宿主細(xì)胞系,包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞和酵母。也可在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)體外合成,所述無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)包括但不限于來自兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、小麥胚芽和大腸桿菌的提取物。
[0147]例如,在可從美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection)獲得的ATCC細(xì)胞系目錄中描述了可使用的多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。宿主細(xì)胞可為,但不限于,YB2 / 0(YB2 / 3HL.P2.GI1.1GAg.20細(xì)胞,保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所,ATCCnOCRL-1662), SP2 / O, YE2 / 0,1R983F, Namalwa, PERC6, CHO 細(xì)胞系,特別是 CH0-K-1,CHO-LeclO, CHO-Lecl, CH0Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, ffil-2, Jurkat, Vero, Molt-4,COS-7, 293-HEK, BHK, KGH6, NSO, SP2 / 0_Agl4,P3X63Ag8.653,C127, JC, LA7, ZR-45-30,hTERT,NM2C5,UACC-812等等。將外源核酸引入宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的,并將根據(jù)使用的宿主細(xì)胞而變化。
[0148]宿主細(xì)胞可屬于轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物自身。在這種情況下,因此從轉(zhuǎn)基因生物得到變體。
[0149]可通過將想要的基因直接注射進(jìn)受精卵得到轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(Gordon等人,1980Proc Natl Acad Sci USA.;77:7380-4)。轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物包括小鼠、兔、大鼠、山羊、母牛、牛或家禽等等??赏ㄟ^將想要的基因引入胚胎干細(xì)胞并通過聚集嵌合體法或注射嵌合體法制備動(dòng)物得到具有想要的基因的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) ;GeneTargeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993))。胚胎干細(xì)胞的例子包括小鼠(Evans和Kaufman,1981 ,Nature ;292:154-156)、大鼠、山羊、兔、猴、家禽、家畜等等的胚胎干細(xì)胞。此外,也可使用克隆技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物,其中將引入想要的基因的細(xì)胞核移植入無核的卵(Ryan等人,1997Science ;278:873-876 ;Cibelli等人,1998Science,280:12`56-1258)??赏ㄟ^將編碼變體分子的DNA引入通過上述方法制備的動(dòng)物,由此在動(dòng)物中形成和積累變體分子,然后收集動(dòng)物中的多肽變體來生產(chǎn)多肽變體??墒苟嚯淖凅w在動(dòng)物的乳、卵等中形成和積累。
[0150]在所有上述實(shí)施方案中,親本多肽可為天然存在的多肽(野生型多肽),天然存在多肽的變體或改造的形式,或合成的多肽。
[0151]在一些實(shí)施方案中,親本多肽選自Fe融合蛋白、Fe綴合物和抗體。
[0152]如本文中所使用的,F(xiàn)e融合蛋白的Fe綴合物由與伙伴連接的Fe區(qū)組成。Fe區(qū)與伙伴的連接可具有或不具有間隔子區(qū)。
[0153]根據(jù)本發(fā)明,F(xiàn)e融合蛋白是由單個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì),并包含與Fe區(qū)連接的蛋白質(zhì)、多肽或小肽。Fe融合蛋白任選地包含肽間隔子區(qū)。幾乎任意蛋白質(zhì)或小肽可與Fe區(qū)連接生成Fe融合物。蛋白質(zhì)融合伙伴可包括但不限于,受體的靶結(jié)合區(qū)、粘附分子、配體、酶、細(xì)胞因子、趨化因子或一些其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
[0154]特別地,F(xiàn)e融合蛋白可為免疫粘附素,即組合了異源“粘附”蛋白質(zhì)(即受體、配體或酶)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的片段(即Fe區(qū))的抗體樣蛋白質(zhì)(有關(guān)免疫粘附素的綜述見 Ashkenazi A, Chamow SM.1997, Curr Opin Immunol.;9 (2):195-200)。[0155]小肽可包括但不限于將Fe融合物引導(dǎo)至治療靶的任意治療劑。
[0156]根據(jù)本發(fā)明,F(xiàn)e綴合物由Fe區(qū)與綴合伙伴的化學(xué)偶聯(lián)形成,并任選地包含連接Fe區(qū)和綴合伙伴的間隔子區(qū)。綴合伙伴可為蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)。偶聯(lián)反應(yīng)一般使用Fe區(qū)上的和綴合伙伴上的官能團(tuán)。
[0157]合適的綴合伙伴包括但不限于,治療多肽、標(biāo)簽(標(biāo)簽的例子見下文)、藥物、細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞毒性藥物(例如化學(xué)治療劑)、毒素和這些毒素的活性片段。合適的毒素及其相應(yīng)片段包括但不限于,白喉A鏈、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈等等。細(xì)胞毒性劑可為能夠直接與Fe變體綴合或通過與Fe變體共價(jià)附著的螯合劑螯合的任意放射性核素,其。在額外的實(shí)施方案中,綴合伙伴可選自卡里奇霉素,auristatin,格爾德霉素,美登素,和倍癌霉素和類似物。
[0158]如上所述,本文中在最廣泛的意義上使用術(shù)語“抗體”。根據(jù)本發(fā)明,“抗體”指至少包含(i)Fc區(qū)和(ii)源自免疫球蛋白的可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合多肽結(jié)構(gòu)域的任意多肽。所述結(jié)合多肽結(jié)構(gòu)域能夠特異性地結(jié)合一種給定的靶抗原或一組靶抗原。源自免疫球蛋白的可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合多肽結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)或多個(gè)⑶R。在本文中,抗體包括但不限于全長(zhǎng)抗體、多特異性抗體、包含至少一個(gè)可變區(qū)的Fe融合蛋白或合成抗體(本文中有時(shí)稱為“抗體模擬物”)、抗體融合蛋白、抗體綴合物和分別各自的片段。
[0159]包含至少一個(gè)可變區(qū)的Fe融合蛋白意為包含⑴Fe區(qū)和(ii)源自免疫球蛋白的可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)合多肽結(jié)構(gòu)域的經(jīng)改造的蛋白質(zhì)。特別感興趣的是這樣的抗體,所述抗體包含(a)本發(fā)明的Fe變體,和(b)以下源自免疫球蛋白可變區(qū)的結(jié)合多肽結(jié)構(gòu)域中的一種(即其包含至少一個(gè)CDR):⑴由VL, VH, CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段,(ii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段,(iii)由單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段;(iv)分離的⑶R區(qū),(v)F(ab' ) 2片段,包含2個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段,(vi)單鏈Fv分子(seFv),其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽接頭連接,所述肽接頭允許2個(gè)結(jié)構(gòu)域締合形成抗原結(jié)合位點(diǎn),(vii)雙特異 性單鏈Fv和(viii)通過基因融合構(gòu)建的“雙抗體”或“三抗體”,多價(jià)或多特異性片段,此列表不是限制性的。
[0160]本文中的“全長(zhǎng)抗體”意為具有抗體的天然存在的生物學(xué)形式的抗體,包括可變和恒定區(qū)。全長(zhǎng)抗體可為野生型抗體,野生型抗體的突變體(例如包含已有的修飾),野生型抗體的經(jīng)改造的形式(例如嵌合的,人源化的抗體或全人抗體,見下文),此列表不是限制性的。眾所周知,全長(zhǎng)抗體的結(jié)構(gòu)一般是四聚體,一些哺乳動(dòng)物例外,例如美洲駝和駱駝,其中一些免疫球蛋白是二聚體。
[0161]全長(zhǎng)抗體的腳手架組分可為來自不同物種的混合物。這樣的抗體變體可為嵌合抗體和/或人源化的抗體。一般地,“嵌合抗體”和“人源化的抗體”都指組合了來自多于一種物種的區(qū)域的抗體。例如,“嵌合抗體”傳統(tǒng)上包含來自非人動(dòng)物,一般是小鼠(或有時(shí)是大鼠)的可變區(qū)和來自人的恒定區(qū)。多數(shù)情況下,人源化的抗體是含有最少的源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。通常在人源化的抗體中,除了 CDR以外,整個(gè)抗體由人來源的多核苷酸編碼,或除了其CDR中以外與人抗體相同。由來源于非人生物的核酸編碼的一些或全部CDR被移植進(jìn)人抗體可變區(qū)的β -片層框架中以產(chǎn)生抗體,所述抗體的特異性由植入的CDR決定。制備這樣的抗體的方法是周所周知的并在例如W092 /11018 ;Jones,1986,Nature321:522-525 ;Verhoeyen 等人,1988,Science239:1534-1536,Tsurushita&Vasquez,2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, MolecularBiology of B Cells,533-545,Elsevier Science (USA))中描述。
[0162]如本文中使用的,“全人抗體”或“完全的人抗體”指完全包含來源于人基因的序列的抗體。有些情況下,這可為人抗體,所述人抗體具有源自人染色體的具有上述修飾的抗體基因序列??蛇x地,抗體的組分可為人的,但不來源于單個(gè)基因。因此,例如,來自一種抗體的人CDR可與來自一種或多種人抗體的序列,例如腳手架序列組合。例如,可組合多個(gè)種系序列以形成人抗體或人腳手架。
[0163]在本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括包含共價(jià)修飾的全長(zhǎng)抗體。這樣的修飾包括但不限于糖基化、標(biāo)記和綴合。
[0164]標(biāo)記指可檢測(cè)的標(biāo)簽和全長(zhǎng)抗體的偶聯(lián)。如本文中使用的,標(biāo)簽包括但不限于:a)同位素標(biāo)簽,其可為放射性的或?yàn)橹赝凰?;b)磁性標(biāo)簽(例如磁性顆粒);c)氧化還原活性部分;d)光學(xué)染料,例如發(fā)色團(tuán)、磷光體和熒光團(tuán);酶基團(tuán)(例如辣根過氧化物酶、β_半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶);e)生物素化的基團(tuán)jPf)由第二報(bào)告物識(shí)別的預(yù)先確定的多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對(duì)序列,第二抗體的結(jié)合位點(diǎn),金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域,表位標(biāo)簽
坐坐^
寸寸/ ο
[0165]綴合指全長(zhǎng)抗體與多肽或非肽分子,例如受體的靶結(jié)合區(qū)、粘附分子、配體、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、藥物、細(xì)胞毒性劑(例如化學(xué)治療劑)或毒素的偶聯(lián)。
[0166]在某些實(shí)施方案中,多肽親本選自嵌合免疫球蛋白、人源化的免疫球蛋白、全人免疫球蛋白,免疫球蛋白優(yōu)選`地選自IgG并且任選地是被綴合或被標(biāo)記的。
_7] c.發(fā)明的變體
[0168]本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與選自蛋白質(zhì)Clq和受體Fe Y R的至少一種蛋白質(zhì)的結(jié)合,并相比其多肽親本的Fe區(qū)在其Fe區(qū)中包含選自294Del,293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾。所述變體可通過本發(fā)明的方法得到。
[0169]所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與選自蛋白質(zhì)Clq和受體Fe Y R的至少一種蛋白質(zhì)的結(jié)合,并相比其多肽親本的Fe區(qū)在其Fe區(qū)中包含選自294Del,293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾。
[0170]在一些實(shí)施方案中,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與Clq和至少一種Fcy受體的結(jié)合。
[0171]在一些實(shí)施方案中,相比親本多肽的Fe區(qū),突變294Del是變體的Fe區(qū)含有的唯
一突變。
[0172]在其他實(shí)施方案中,相比親本多肽的Fe區(qū),突變293Del是變體的Fe區(qū)含有的唯
一突變。
[0173]在一些其他實(shí)施方案中,相比親本多肽的Fe區(qū),氨基酸修飾293Del / 294Del是變體的Fe區(qū)含有的唯一修飾。
[0174]所述變體的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)直接來自用于制備其的方法的特征,所述方法在標(biāo)題為“降低Fe與Clq和Fe Y R的結(jié)合的方法”的部分b.中完整地描述。
[0175]應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào),一般可從親本多肽的性質(zhì)推斷出變體的性質(zhì),除了關(guān)于與Clq和Fe Y受體的結(jié)合以外,因?yàn)樽凅w與Clq和Fe YR的結(jié)合是由第294位和/或第293位上的氨基酸修飾控制的。
[0176]因此,在一些實(shí)施方案中,變體多肽展示出相比其多肽親本降低的與Clq和與選自 Fe Y RIIIa, Fe y RIIa, Fe y RI 和 Fe y RIIb 的至少一種 Fe Y 受體的結(jié)合。
[0177]如本文使用的,如果通過用變體的特異性信號(hào)除以親本多肽的特異性信號(hào)得到的比例小于0.5,則所述變體展示出相比其親本多肽降低的與目的蛋白質(zhì)例如Clq或Fe Y R的結(jié)合,所述特異性信號(hào)通過ELISA測(cè)定法測(cè)定。換句話說,變體的特異性信號(hào)至多等于其親本多肽的特異性信號(hào)的0.5倍。
[0178]相比野生型Fe區(qū),變體的Fe區(qū)可包含除了 294Del和293Del以外的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾。通常,相比其對(duì)應(yīng)的野生型Fe區(qū),變體的Fe區(qū)包含從約I至約21個(gè)氨基酸修飾,優(yōu)選地從約I至約11個(gè)氨基酸修飾,所述修飾包括294061,293061或293061 / 294Del。
[0179]與親本多肽類似,相比野生型Fe區(qū),變體可還包含在選自Fe區(qū)的氨基酸位置227,228,230,231,233,234,239,241,243,246,250,252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,301,302,303,305,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,438,439,440,443,444,445,446和447上的至少一個(gè)氨基酸修飾,其中在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)為EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0180]相比野生型Fe區(qū),變體可還包含在選自Fe區(qū)的氨基酸位置227,228,230,231,233,234,239,241,243,246,250,252,256,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,301,302,303,305,307,308,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,380,382,383 ,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,428,433,434,438,439,440,443,444,445,446和447上的僅一個(gè)氨基酸修飾,其中在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)為EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)?!皟H一個(gè)氨基酸突變”意為變體在上述位置上不含有多于一個(gè)修飾。例如,相比野生型Fe區(qū),變體在Fe區(qū)的第307和434位上不都含有氨基酸修飾。因此,在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中,變體不含有在于294Del / T307P/N434Y或293Del / T307P / N434Y的氨基酸修飾。在本發(fā)明的特別的實(shí)施方案中,變體不在于294Del / T307P / N434Y20 或 293Del / T307P / N434Y 變體。
[0181 ] 在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中,變體不包含在于294del或293del和第307和434位的突變的組合的氨基酸修飾。因此本發(fā)明的實(shí)施方案在于包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體,其相比所述親本多肽與蛋白質(zhì)Clq和與至少一種受體Fe Y R,且相比其多肽親本的Fe區(qū)在其Fe區(qū)中包含選自294Del,293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾,附帶條件是所述親本多肽的變體不包含在于294del或293del和第307和434位的突變的組合的氨基酸修飾。
[0182]在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的變體在Fe區(qū)中還至少包含選自378V,434Y,397M,302A, 434S, 315D, 230S, 307A, 228R, 230S / 315D / 428L / 434Y,259I / 315D / 434Y 的氨基酸修飾和氨基酸修飾256N / 378V / 383N / 434Y。
[0183]在一些特別的實(shí)施方案中,本發(fā)明的變體的Fe區(qū)是野生型IgG Fe區(qū)的變體,其包含選自 Fe 區(qū)的 294Del,293Del,293Del / 294Del, 294Del / 256N / 378V / 383N /434Y,294Del / 2591 / 315D / 434Y,294Del / 397M,294Del / 302A,294Del / 434S,294Del/315D,294Del / 230S,294Del / 307A,294Del / 228R, 230S / 315D / 428L / 434Y,294Del / 378V和294Del / 434Y的至少一個(gè)突變,其中在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)為EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0184]同樣地,相比野生型Fe區(qū),變體可包含或可不包含在從Fe區(qū)的第290至292位和從第295至300位的任一位置上的一個(gè)氨基酸修飾,其中在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)為EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0185]在某些實(shí)施方案中,相比野生型Fe區(qū),變體在其Fe區(qū)中不包含除了 294Del或293Del以外的可降低與Clq和與至少一種Fe Y R的結(jié)合的任意突變。
[0186]在其他實(shí)施方案中,相比野生型Fe區(qū),變體在其Fe區(qū)中不包含除了 294Del或293Del以外的任意突變。
[0187]在一些實(shí)施方案中,變體的Fe區(qū)源自IgG的野生型Fe區(qū)。
[0188]在一些其他實(shí)施方案中,變體的Fe區(qū)選自IgG野生型Fe區(qū)的變體的組,所述組由 293Del,294Del,293Del / 294Del,378V / 294Del,434Y / 294Del,294Del / 397M,294Del/302A,294Del/434S,294Del / 315D,294Del / 230S,294Del / 307A,294Del /228R,230S / 315D / 428L / 434Y,259I / 315D / 434Y / 294Del 和 256N / 378V /383N / 434Y / 294Del組成,其中氨基酸編號(hào)指EU索引或在Kabat中的等同物的Fe氨基酸編號(hào)。
[0189]在其他實(shí)施方案中,變體選自Fe融合蛋白、Fe綴合物和抗體。
`[0190]在一些實(shí)施方案中,變體是選自嵌合免疫球蛋白、人源化的免疫球蛋白和全人免疫球蛋白的抗體,免疫球蛋白優(yōu)選地在IgG中選擇。
[0191]本發(fā)明的另外的目的是編碼如上定義的變體的分離的核酸。本發(fā)明也涉及包含編碼所述變體的核酸的載體和包含所述載體的宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,編碼所述載體的核酸已被穩(wěn)定地整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中。本發(fā)明也涉及非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其包含穩(wěn)定整合在其基因組中的所述核酸或所述載體。
[0192]d.根據(jù)本發(fā)明的方法和變體的用途
[0193]本 申請(qǐng)人:顯示,F(xiàn)e區(qū)的突變294Del大大削弱了 Fe變體對(duì)Clq和對(duì)Fe Y受體例如Fe Y RI,F(xiàn)e Y RIIa,F(xiàn)e Y RIIb和Fe Y RIIIa的親和力。對(duì)這些效應(yīng)分子的親和力的降低如此重大,以致于在某些情況下,通過常規(guī)ELISA測(cè)定法在體外無法觀察到Fe變體與Clq和/或與某些Fe Y R的結(jié)合。Fe區(qū)與Clq的結(jié)合對(duì)體內(nèi)誘導(dǎo)⑶C是基本的。同樣地,F(xiàn)e區(qū)與Fe Y RIIa和Fe Y RIIIa的結(jié)合是體內(nèi)誘導(dǎo)ADCC和ADCP的關(guān)鍵步驟。
[0194]因此,由于其對(duì)Clq的低親和力,預(yù)期本發(fā)明的變體沒有⑶C活性或相比其親本多肽和一般地相比包含沒有突變294Del或突變293Del的Fe區(qū)的多肽,所述變體誘導(dǎo)顯著較低的體內(nèi)⑶C應(yīng)答。同樣地,由于其對(duì)某些Fe Y R(特別是Fe Y RIIa和Fe Y RIIIa)的低親和力,預(yù)期本發(fā)明的變體相比其親本多肽和一般地相比包含沒有突變294Del或突變293Del的Fe區(qū)的多肽沒有ADCC活性或誘導(dǎo)顯著較低的體內(nèi)ADCC應(yīng)答。預(yù)期在體外⑶C和ADCC測(cè)定中也有相同的結(jié)果。
[0195] 申請(qǐng)人:確實(shí)已經(jīng)顯示,通過在包含野生型Fe區(qū)(即具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的Fe區(qū))的IgGl的氨基酸序列中引入294Del得到的IgGl變體不展示,或展示降低的ADCC和/或CDC活性。
[0196]引人注目地,在最初改造的相比野生型IgGl展示對(duì)FcRn提高的親和力的IgGl多肽中引入突變294Del也使得能夠限制或消除ADCC和/或⑶C活性,同時(shí)優(yōu)先地保留對(duì)FcRn的親和力。
[0197]例如,具有突變294Del / 256N / 378V / 383N / 434Y 的 IgGl 變體不展示 ADCC和CDC活性,但展示至少與其IgGl親本類似的對(duì)FcRn的親和力(見實(shí)施例章節(jié)III和IV中的ELISA和SPR結(jié)果)。
[0198]變體294Del / 2591 / 315D / 434Y 相比其包含氨基酸修飾 2591 / 315D / 434Y的親本多肽得到類似的結(jié)果。
[0199]由于其效應(yīng)子活性譜,本發(fā)明的變體可用于廣泛的科學(xué)領(lǐng)域。特別地,本發(fā)明的變體可用作研究試劑、診斷劑或治療劑。
[0200]例如可用熒光團(tuán)或用同位素例如銦-111或锝-99m標(biāo)記變體并用于體內(nèi)影像,因?yàn)樵谶@樣的應(yīng)用中不需要激活A(yù)DCC或CDC。
[0201]當(dāng)用作治療劑時(shí),可使用變體運(yùn)送治療劑例如放射性核素、毒素、細(xì)胞因子或酶至靶細(xì)胞,例如癌細(xì)胞。在此情況下,變體可為抗體和細(xì)胞毒性劑之間的綴合物,并且其治療活性依賴于細(xì)胞毒性劑(例如Gilliland等人,PNAS,1980,77,4539-4543)。
[0202]多肽變體也可作為靶分子的阻斷劑或中和劑發(fā)揮作用,但不殺死具有靶抗原的細(xì)胞。其也可激動(dòng)、拮抗或抑制靶分子。
[0203]在這些情況下,靶細(xì)胞的消耗是不理想的并可被認(rèn)為是副作用。例如,抗⑶4抗體阻斷T細(xì)胞上的CD4受體的能力使其成為有效的抗炎劑,但其募集Fe Y R的能力也導(dǎo)致針對(duì)靶細(xì)胞的免疫攻擊,導(dǎo)致T細(xì)胞消耗。效應(yīng)子功能對(duì)經(jīng)放射性標(biāo)記的抗體(被稱為放射性綴合物)和與毒素綴合的抗體(被稱為免疫毒素)也可以是問題。這些藥物可用于破壞癌細(xì)胞,但是通過Fe與Fe Y R的相互作用募集免疫細(xì)胞將健康的免疫細(xì)胞帶到致命的有效負(fù)荷(放射物或毒素)附近,導(dǎo)致正常淋巴組織連同被靶向的癌細(xì)胞一起消耗。 申請(qǐng)人:顯示,根據(jù)本發(fā)明的變體盡管展示了改變的與Clq和與至少Fe Y受體的結(jié)合,其顯示了類似的其他功能特征,例如抗原識(shí)別或FcRn親和力。因此不干擾其他重要的抗體性能,例如抗體穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)完整性或與其他重要的Fe配體例如FcRn和蛋白質(zhì)A和G相互作用的能力。
[0204]靶分子可為任意類型,并且包括外源和內(nèi)源分子。靶分子(當(dāng)多肽變體是抗體時(shí)也稱抗原)包括但不限于,病毒、細(xì)菌和真菌蛋白,朊病毒,毒素,酶,膜受體,藥物和可溶性蛋白質(zhì)。
[0205]膜受體包括但不限于,RhD抗原,CD3,CD4,CD19,CD20,CD22,CD25,CD28,CD32B,CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD71 (轉(zhuǎn)鐵蛋白受體),CD80, CD86, CTLA-4,CD147, CD160,CD224,生長(zhǎng)因子受體,如屬于 ErbB 家族的受體 ErbBl,ErbB2, ErbB3, ErbB4 (EGFR, HER2 /neu,HER3,HER4),VEGF-Rl,VEGF-R2,IGF-Rl,PIGF_R,MHCI 型和 MHCII 型分子,例如 HLA-DR,I型干擾素受體,白介素受體如IL-1R,IL-2Ra,IL-2R0和IL_2Ry,IL-6R,激素受體如MUllerian抑制物質(zhì)II型受體,LDL受體,NKp44L,趨化因子受體如CXCR4,CCR5, TNFR,⑶137,整合素 。粘附分子如⑶2,ICAM,EpCAM,,G蛋白偶聯(lián)受體。
[0206]膜蛋白也包括腫瘤標(biāo)記物如0)2,0)3,0六125,1^(:-1,1^(:-16,癌胚抗原(CEA),Tn,糖蛋白72,PSMA, HMW-MAA其他蛋白質(zhì)例如DC細(xì)胞特異性的BDCA-2,胰高血糖素樣肽(例如,GLP-1,等等),酶(例如,葡糖腦苷脂酶,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,α-半乳糖苷酶-A,agalsidase α和β , a-L-艾杜糖醒酸酶,丁酰膽堿酯酶,幾丁質(zhì)酶,谷氨酸脫羧酶,伊米苷酶,脂肪酶,尿酸酶,血小板激活因子乙?;饷?,中性內(nèi)肽酶,髓過氧化物酶,等等),白介素和細(xì)胞因子結(jié)合蛋白(例如,IL-lSbp, TNF結(jié)合蛋白,等等),巨噬細(xì)胞激活因子,巨噬細(xì)胞肽,B細(xì)胞因子,T細(xì)胞因子,蛋白質(zhì)Α,變態(tài)反應(yīng)抑制劑,細(xì)胞壞死糖蛋白,免疫毒素,淋巴毒素,腫瘤壞死因子,腫瘤抑制劑。
[0207]可溶性蛋白質(zhì)包括但不限于,細(xì)胞因子例如IL-1 β,IL-2,IL_6,IL-12,IL-23,TGF β , TNF a , IFN Y ,趨化因子,生長(zhǎng)因子如 VEGF, G-CSF, GM-CSF, EGF,PIGF,PDGF,IGF,激素和抑制性抗體例如FVIII抑制性抗體,轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子,α-l抗胰蛋白酶,白蛋白,α-乳白蛋白,載脂蛋白Ε,紅細(xì)胞生成素,聞度糖基化的紅細(xì)胞生成素,血管生成素,血紅蛋白,凝血酶,抗凝血酶III,凝血酶受體激活肽,血栓調(diào)節(jié)蛋白,因子VII,因子Vila,因子VIII,因子IX,因子XIII,血纖維蛋白溶酶原激活因子,纖維蛋白結(jié)合肽,尿激酶,鏈激酶,水蛭素,蛋白質(zhì)C,C反應(yīng)蛋白,B細(xì)胞激活因子受體,受體拮抗劑(例如,ILl-Ra),補(bǔ)體蛋白,Cl,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,因子H,因子I,因子P,其他蛋白質(zhì)例如CSAP,⑶137配體,凝集素,唾液酸化的蛋白質(zhì)。
[0208]根據(jù)本發(fā)明的變體可用于微生物毒素中和(例如破傷風(fēng)毒素或炭疽)或預(yù)防病毒感染例如肝炎,由乳頭瘤病毒或呼吸道合胞體病毒介導(dǎo)的感染。根據(jù)本發(fā)明的中和變體也可用在中毒的情況下使用。最后,根據(jù)本發(fā)明的中和變體也可針對(duì)自身抗原例如VEGF用于治療癌癥或其他病理學(xué),例如由于年齡的黃斑變性。
[0209]根據(jù)本發(fā)明的變體也可用于拮抗膜受體例如細(xì)胞因子受體、生長(zhǎng)因子受體、整合素。例如所述變體可用作移植中的免疫抑制劑,例如可抑制T淋巴細(xì)胞增殖的抗IL-2R(⑶25)。所述變體 也可用于限制炎性過程(炎性腸病、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎),例如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的情況下針對(duì)IL-6受體α鏈的抗體。本發(fā)明的變體也可用于抑制腫瘤生長(zhǎng),例如抗EGFR抗體或抗HER-2受體抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗整合素變體也可用于限制血栓形成,例如急性冠脈綜合癥,或用于治療銀屑病。在其他實(shí)施方案中,根據(jù)本發(fā)明的變體也可用于治療多發(fā)性硬化。
[0210]因此本發(fā)明的變體可用作靶分子的中和劑、拮抗劑或激動(dòng)劑,用于治療或預(yù)防癌癥、炎性病癥、傳染病、自身免疫疾病或中毒。
[0211]本文中的“自身免疫疾病”包括同種異體胰島移植排斥、斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合癥、自身免疫性阿狄森氏病、抗嗜中性粒細(xì)胞胞質(zhì)自身抗體(ANCA)、腎上腺的自身免疫疾病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、自身免疫性嗜中性粒細(xì)胞減少、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、自身免疫性血小板減少、自身免疫性蕁麻疹、白塞氏病(Behcet’ s disease)、大皰性類天皰瘡、心肌癥、卡斯?fàn)柭C合癥(Castleman’ ssyndrome)、celiac spruce、皮炎、慢性疲勞免疫功能紊亂綜合癥、慢性炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)病、Churg-strauss綜合癥、瘢痕性類天皰瘡、CREST綜合癥、冷凝集素病、克羅恩氏病、皮肌炎、盤狀狼瘡、特發(fā)性混合性冷球蛋白血癥、因子VIII缺陷、纖維肌痛-纖維肌炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯病(Grave’ s disease)、Guillain-Barre、古德帕斯丘綜合癥(Goodpasture’s syndrome)、移植物抗宿主病(GVHD)、橋本氏甲狀腺炎、A型血友病、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA神經(jīng)病、IgM多發(fā)性神經(jīng)病、免疫介導(dǎo)的血小板減少、青少年關(guān)節(jié)炎、)11崎病、扁平苔蘚、紅斑狼瘡、美尼爾氏病、混合性結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、I型糖尿病、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、多軟骨炎、多腺體綜合癥、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、銀屑病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、Reynauld現(xiàn)象、萊特爾氏綜合癥(Reiter’ s syndrome)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、Siorgen綜合癥、實(shí)體器官移植排斥、僵人綜合癥、全身性紅斑狼瘡、大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、血栓性血小板減少性紫癜、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、血管炎例如皰疹樣皮炎、血管炎、白癜風(fēng)、和韋格納肉芽腫病(Wegner’ sgranulomatosis)。
[0212]本文中的“炎性病癥”包括急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、急性膿毒性關(guān)節(jié)炎、佐劑性關(guān)節(jié)炎、變應(yīng)性腦脊髓炎、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性血管炎、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、由慢性細(xì)菌或病毒感染的慢性炎癥、慢性阻塞性肺病(COPD)、冠狀動(dòng)脈疾病、腦炎、炎性腸病、炎性骨質(zhì)溶解、與急性和延遲的超敏反應(yīng)相關(guān)的炎癥、與腫瘤相關(guān)的炎癥、外周神經(jīng)損傷或脫髓鞘病、與組織創(chuàng)傷例如燒傷和局部缺血有關(guān)的炎癥、由腦膜炎引起的炎癥、多器官損傷綜合癥、肺纖維化、敗血癥和敗血性休克、Stevens-Johnson綜合癥、未分化關(guān)節(jié)病和未分化脊柱關(guān)節(jié)病。
[0213]本文中的“傳染病”包括由病原體例如病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和寄生蟲引起的疾病。傳染病可由包括腺病毒、巨細(xì)胞病毒、登革熱病毒、Epstein-Barr病毒、漢坦病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、I型單純性皰疹病毒、II型單純性皰疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、乳多空病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、呼吸道合胞體病毒、牛瘟病毒、鼻病毒、輪狀病毒、風(fēng)疹病毒、SARS病毒、天花病毒、病毒性腦膜炎病毒等病毒導(dǎo)致。傳染病也可由包括炭疽桿菌(Bacillusantracis)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)、破傷風(fēng)桿菌(Clostridium `tetani)、白喉、大腸桿菌(E.Coli)、軍團(tuán)桿菌屬、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、立克次式體分支桿菌(Mycobacterium rickettsia)、支原體奈瑟氏菌(Mycoplasma nesisseria)、百日咳(Pertussis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、肺炎鏈球菌(S.Pneumonia)、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、霍亂弧菌(Vibriacholerae)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)等的細(xì)菌導(dǎo)致。傳染病還可由例如煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色假絲酵母(Candida albicans)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)、新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)、夾膜組織胞衆(zhòng)菌(Histoplasma capsulatum)、馬爾尼菲青霉(Penicilliummarneffei)等的真菌導(dǎo)致。傳染病還可由原生動(dòng)物和寄生蟲引起,例如衣原體、kokzidioa、利什曼原蟲、瘧原蟲、立克次氏體、錐蟲屬等等。
[0214]此外,本發(fā)明的變體可用于預(yù)防或治療另外的病況,包括但不限于心臟病況例如充血性心力衰竭(CHF)、心肌炎和其它心肌病況;皮膚病況例如薔薇疹(rosecea)、痤瘡和濕疹;骨和牙病況例如骨損失、骨質(zhì)疏松、佩吉特(Paget)氏病、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、牙周病、廢用性骨量減少、骨軟化癥、單骨纖維性骨發(fā)育不良、多發(fā)性骨纖維性發(fā)育不良、骨轉(zhuǎn)移、骨痛管理、體液惡性高鈣血癥、牙周重建、脊髓損傷和骨折;代謝病況例如高歇(Gaucher)氏??;內(nèi)分泌病況例如庫欣(Cushing)氏綜合癥;和神經(jīng)學(xué)病況。
[0215]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,根據(jù)本發(fā)明的抗RhD變體可用于治療或預(yù)防Rh不相容。
[0216]在其他實(shí)施方案中,根據(jù)本發(fā)明的抗CD20變體可用于治療淋巴性白血病。
[0217]在其他實(shí)施方案中,根據(jù)本發(fā)明的變體可用于治療和/或預(yù)防自身免疫疾病,例如免疫性血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、類風(fēng)濕性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡。
[0218]在一些實(shí)施方案中,親本多肽可選自商業(yè)抗體,例如抗RhD抗體(見在FR0951412中描述的EMAB2?或 ZLB,Zurich 的MoiloRho? )或抗 CD20 (見 W02006064121)。
[0219]親本多肽也可為Avastin? (抗 vegf) , Rimicade? (抗 TNF- a ), Erbitux?(抗 EGFR),Veetlbi;!⑩(抗 egfr),Tysabrl? (抗整合素的 α 4 鏈),Hereeptiu? (抗HER2 / neu),此列表不是限制性的。
[0220]在一些實(shí)施方案中,變體是針對(duì)選自膜受體、人可溶性蛋白質(zhì)、毒素、病毒、細(xì)菌和真菌蛋白質(zhì)的靶分子的中和抗體。
[0221]由于其與Clq和一些Fe Y R的低結(jié)合,本發(fā)明的變體特別適合用于治療下述病況,所述病況中通過ADCC或CDC的免疫系統(tǒng)的募集對(duì)治療效力不是關(guān)鍵的。
[0222]預(yù)期本發(fā)明的多肽變體的施用比大多數(shù)在其Fe區(qū)中不包含294Del或293Del的抗體和免疫粘附素引起較少的副作用和較少的IgG介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
[0223]因此本發(fā)明的另外 的目的是本發(fā)明的變體用于預(yù)防或治療病理學(xué)病況的用途,其中不希望誘導(dǎo)ADCC和/或⑶C應(yīng)答。
[0224]因此本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及親本多肽的變體用于預(yù)防或治療病理學(xué)病況,其中不希望誘導(dǎo)ADCC和/或⑶C應(yīng)答,包含F(xiàn)e區(qū)的所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與蛋白質(zhì)Clq和與至少一種受體Fe Y R的結(jié)合,且相比其多肽親本的Fe區(qū)在其Fe區(qū)中包含選自294Del,293Del和293Del/294Del的氨基酸修飾,附帶條件是親本多肽的所述變體不包含在于294Del或293Del與在第307和434位上的突變的組合的氨基酸修飾,在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)指根據(jù)EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0225]其他實(shí)施方案涉及親本多肽變體用于預(yù)防或治療病理學(xué)病況,其中不希望誘導(dǎo)ADCC和/或CDC應(yīng)答,包含F(xiàn)e區(qū)的所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與蛋白質(zhì)Clq和與至少一種受體Fe Y R的結(jié)合,且相比其多肽親本的Fe區(qū)在其Fe區(qū)中包含選自294Del,293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾,附帶條件是親本多肽的所述變體不在于294Del / T307P / N434Y 或 293Del / T307P / N434Y 變體。
[0226]當(dāng)變體的治療效力不需要效應(yīng)細(xì)胞激活或CDC激活時(shí),不希望誘導(dǎo)ADCC和CDC應(yīng)答。這樣的變體包括例如阻斷或中和抗體。
[0227]治療或預(yù)防不需要誘導(dǎo)⑶C和ADCC的病理學(xué)病況包括但不限于,移植排斥、自身免疫疾病、炎性病癥、傳染病或癌癥。本發(fā)明的另一個(gè)目的是本發(fā)明的變體在制備藥物組合物中的用途。
[0228]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中,待如上所述使用的變體是這樣的變體,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與選自蛋白質(zhì)Clq和受體Fe Y R的至少一種蛋白質(zhì)的結(jié)合,且相比其多肽親本的Fe區(qū)在其Fe區(qū)中包含選自294Del,293Del和293Del / 294Del的氨
基酸修飾。
[0229]在本發(fā)明的特別的實(shí)施方案中,變體不在于294Del / T307P / N434Y或293Del /T307P / N434Y 變體。
[0230]在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的變體在Fe區(qū)中還至少包含選自378V,434Y,397M,302A, 434S, 315D, 230S, 307A, 228R, 230S / 315D / 428L / 434Y,259I / 315D / 434Y 的氨基酸修飾和氨基酸修飾256N / 378V / 383N / 434Y。
[0231]在一些特別的實(shí)施方案中,本發(fā)明的變體的Fe區(qū)是包含選自Fe區(qū)的294Del,293Del,293Del / 294Del,294Del / 256N / 378V / 383N / 434Y,294Del / 2591 / 315D /434Y,294Del / 397M,294Del / 302A,294Del / 434S,294Del / 315D,294Del / 230S,294Del / 307A,294Del / 228R,230S / 315D / 428L / 434Y,294Del/378V 和 294Del /434Y的至少一個(gè)突變的野生型IgG Fe區(qū)的變體,其中Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)是EU索引或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
[0232]在一些其他實(shí)施方案中,變體的Fe區(qū)選自IgG野生型Fe區(qū)的變體的組,所述組由 294Del,293Del,293Del / 294Del,378V / 294Del,434Y / 294Del,294Del / 397M,294Del / 302A,294Del / 434S,294Del / 315D,294Del / 230S,294Del / 307A,294Del /228R,230S / 315D / 428L / 434Y,259I / 315D / 434Y / 294Del 和 256N / 378V /383N / 434Y / 294Del組成,其中氨基酸編號(hào)指EU索引或在Kabat中的等同物的Fe氨基酸編號(hào)。
[0233]本發(fā)明的另外的目的是提供包含所述變體的藥物組合物。當(dāng)所述變體是抗體時(shí),變體可以單克隆或多克隆抗體的形式存在。通過混合具有期望的純度的多肽變體和任選的生理上可接受的載體、賦形劑`或穩(wěn)定劑以凍干的制劑或水溶液的形式制備藥物組合物。
[0234]可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法,例如在Remington:The Science and Practice ofPharmacy (Lippincott ffilliams&ffilkins ;第21版,2005)中描述的方法配制本發(fā)明的藥物組合物。
[0235]可使用的可藥用的賦形劑特別地在Handbook of Pharmaceuticals Excipients,American Pharmaceutical Association (Pharmaceutical Press ;第 6 次修訂版,2009)中描述。
[0236]為了治療有需要的患者,可施用治療有效劑量的變體。本文中“治療有效劑量”指所施用的產(chǎn)生效力的劑量。準(zhǔn)確的劑量將取決于治療目的,并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用公知技術(shù)來確定。劑量范圍可從0.001至IOOmg / kg體重或更大,例如0.l、1.0、10*50mg /kg體重,優(yōu)選1-1Omg / kg ο本領(lǐng)域公知,可能必須對(duì)蛋白質(zhì)降解、全身對(duì)局部遞送、和新蛋白酶合成速率,以及年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用時(shí)間、藥物相互作用和病況的嚴(yán)重程度進(jìn)行調(diào)整,并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法來確定。
[0237]可以多種方式進(jìn)行包含變體的藥物組合物的施用,包括但不限于口服、皮下、靜脈內(nèi)、胃腸外、鼻內(nèi)、intraortically、眼內(nèi)、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、經(jīng)皮、局部(如凝膠劑)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)。
[0238]本文描述的變體可與其他治療劑相伴施用,即本文描述的治療劑可與其他療法或治療劑,包括例如小分子、其他生物制劑、放射療法、手術(shù)等共同施用。[0239]下面的實(shí)施例進(jìn)一步說明,但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0240]實(shí)施例:基于Fe變體的IgG變體生產(chǎn)和所述IgG的表征
[0241]I在293-F哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)IgG變體
[0242]1.1載體構(gòu)建
[0243]使用標(biāo)準(zhǔn)PCR方案,將源自人IgGl重鏈的編碼氨基酸殘基226-447 (EU索引,或在Kabat中的等同物)即Fe片段(Fc226,SEQ ID NO:1)的人Fe基因(Poul MA等人,Eur.J.1mmunol.25(7) =2005-20091995)作為 BamHI / NotI 片段克隆進(jìn)真核表達(dá)載體PMGM05-R603 (圖 2)中。pMGM05-R603 載體源自 pCEP4 (Invitrogen)并含有 R603 嵌合抗 CD20抗體(LFB-R603)的重鏈。將此抗體的輕鏈插入源自PCEP4的類似載體中(pMGM01_R603)。通過重疊PCR將Fe片段中的所有突變插入pMGM05-R603載體。例如,使用2組引物得到變體 294Del。為了進(jìn)行第一個(gè) PCR,使用 5'引物 MG_6195' -AGTACTGACTCTACCTAGGATCCTGCCCACCGTGC-3' (SEQ ID NO:10)和 3'引物MG_9345' -GCTGTTGTACTGCTCCCGCGGCTT-3'(SEQ ID NO:11),對(duì)于第二個(gè) PCR,使用 5'引物 MG_9335' -AAGCCGCGGGAGCAGTACAACAGC-3'(SEQ ID NO:12)和 3'引物 MG_6215' -ACTGCTCGA TGTCCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-3'(SEQ ID NO:13)(其中用下劃線標(biāo)示BamHI和NotI限制位點(diǎn),斜體字符對(duì)應(yīng)在克隆步驟期間去除的非特異性尾巴)。然后締合每種PCR片段的一部分,并使用引物MG_619和MG_621使用標(biāo)準(zhǔn)方案通過PCR擴(kuò)增得到的延長(zhǎng)的片段。在1% (w / V)瓊脂糖凝膠上純化PCR產(chǎn)物,用BamHI和NotI限制酶消化并克隆進(jìn)pMGM05_R603載體中??蛇x地,可使用相同的引物(MG_933 和 MG_934)使用 Quick change Multi 試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA)進(jìn)行誘變。
[0244]1.2細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)
`[0245]用FreeStyle? MAX 試劑(I μ I / ml)使用標(biāo)準(zhǔn)方案(Invitrogen),用等摩爾量(250ng / ml)的 pMGM01_R603 和 pMGM05_R603 載體共轉(zhuǎn)染 FreeStyle?293-F 細(xì)胞(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染后在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)細(xì)胞7天,并在以100g離心細(xì)胞10分鐘后收獲含有IgG的上清。然后滴定(1.3)上清(1ml),并在通過ELISAdI1.1.1)表征結(jié)合前冷凍在_20°C。
[0246]1.3生產(chǎn)的IgG變體的滴定
[0247]使用ELISA測(cè)定對(duì)重組蛋白L(Pierce)定量分泌在之前收獲的上清中的IgG變體,使用純化的R603抗體作為標(biāo)準(zhǔn)物。在Maxisorp免疫板(Nunc)上檢測(cè)在PBS / 0.05%Tween-20中連續(xù)稀釋的上清和標(biāo)準(zhǔn)抗體,所述免疫板之前用0.25 / μ g蛋白質(zhì)L /孔包被并用在PBS中的5%脫脂奶粉封閉。在37°C孵育I小時(shí)后,用I3BS / 0.05% Tween-20洗3次孔。用HRP山羊抗人IgGU鏈特異性)F(ab' )2片段(Sigma)檢測(cè)結(jié)合的IgG變體。使用用純化的R603抗體得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量生產(chǎn)的IgG變體(Hyg / ml)。
[0248]II在Y2B / O細(xì)胞中生產(chǎn)IgG變體
[0249]I1.1載體構(gòu)建
[0250]在YB2 / O細(xì)胞系中以IgG形式制備具有抗CD20 (R603)或抗RhD+(R593)特異性的 Fe 變體 2591 / 315D / 434Y259I / 315D / 434Y_294Del, 256N / 378V / 383N / 434Y和256N / 378V / 383N / 434Y_Del294。為了最大化在YB2 / O細(xì)胞系中的生產(chǎn)力,新合成(neosynthesize)全長(zhǎng)重和輕鏈 cDNA 以及編碼 2591 / 315D / 434Y 和 256N / 378V /383N / 434Y變體的Fc片段并針對(duì)褐家鼠(Rattus norvegicus)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。去除 不想要的特征,例如隱藏的剪接位點(diǎn)或限制位點(diǎn)。僅在連接可變/恒定區(qū)處存在限制位點(diǎn) (Apal)。
[0251]需要時(shí),通過在PCR1 中使用 DEL1294P1 (5 '引物 5 ' -CAACGCCAAGACCAAG CCCCGGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGG-3 ' , SEQ ID N014)+HCH20GA_AscI(3 ' 引物 5 ' -AGCGGCGCGCCTCATCA-3 ',SEQ ID NO 15)導(dǎo)致 501bp 的擴(kuò)增子,在 PCR2 中使用 DEL294P2 (5 '引物 5' ACCAAGGGCCCAAGCGTGT-3 ',SEQ ID N017)+HCH20GA_ApaI (3 '引 物 5' -5CCCTGTAGGTGCTGTTGTACTGCTCCCGGGGCTTGGTCTTGGCGTTG-3',SEQ ID N016)導(dǎo)致 541bp的擴(kuò)增子,和最后在PCR3中使用HCH20GA-AscI和HCH20GA_ApaI導(dǎo)致998bp的PCR 產(chǎn)物,通過組裝PCR引入294Del突變。用AscI和Apal消化PCR產(chǎn)物并將純化的979bp片 段插入表達(dá)構(gòu)建體,替換親本DNA序列。
[0252]II. 2細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)
[0253]在YB2 / 0穩(wěn)定合并物(pool)中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染。用每種線性化的表達(dá)載體電穿孔 來自YB2 / 0細(xì)胞系的細(xì)胞,然后以25,000細(xì)胞/ mL在EMS培養(yǎng)基+5 % v / v經(jīng)透析 的FCS(InvitroGen)中稀釋,并以lml /孔分配在24孔板中。在細(xì)胞恢復(fù)3天后,通過在 EMS+5% FCS培養(yǎng)基中加入終濃度2g / 1的G418和終濃度1 %的酚紅施加選擇壓力。孵育 10天后,制備8個(gè)P24孔的3份合并物,并在F25中以2. 105cv / ml分散細(xì)胞。在滾動(dòng)細(xì)胞 培養(yǎng)瓶中在具有0. 5g / 1 G418的EMS+5% FCS中以在2-8105cv / ml之間的起始濃度進(jìn) 行抗體的生產(chǎn),在第5天得到最大的細(xì)胞生產(chǎn),然后收集上清并在FastElysa(RD Biotech) 中滴定。
[0254]在蛋白質(zhì)A瓊脂糖型HiTrap蛋白質(zhì)A FF(GE Helthcare)上純化抗體,然后在 25mM, pH3. 0的檸檬酸鈉緩沖液中洗脫,級(jí)分被中和,在4°C透析進(jìn)入PBS,pH6. 0過夜。
[0255]通過在非還原和還原條件下的SDS-PAGE表征純化的IgG,并使用凝膠過濾以估計(jì) 聚集物含量。無論是何種突變,IgG被純化至超過85%并常常超過95%,并展示每種IgG 的特征重和輕鏈帶。還使用LAL內(nèi)毒素測(cè)試(鱟變形細(xì)胞溶解物(Limulus Amebocyte Lysate))膠凝法(gel clot method)檢測(cè)純化的IgG是否存在內(nèi)毒素。低內(nèi)毒素水平以及 低聚集物含量證明生產(chǎn)的抗體因此適用于功能性測(cè)試。
[0256]III.通過ELISA的IgG變體的結(jié)合表征
[0257]III. 1材料與方法
[0258]III. 1. 1在293-F細(xì)胞上清中生產(chǎn)的IgG變體的ELISA測(cè)試
[0259]通過ELISA測(cè)試IgG變體與若干受體的結(jié)合:Clq補(bǔ)體(Calbiochem), Fc y RIIIaV158(R&D system),F(xiàn)cRn_p3 (FcRn_p3 指包含與噬菌體蛋白 p3 和 CVDE 蛋白融 合的@2微球蛋白鏈和a鏈的融合蛋白,并在如Popov等人,Mol. Immunol. , 1996,33 : 521-530 中描述的桿狀病毒系統(tǒng)中生產(chǎn)),F(xiàn)cyRIIaR131(R & D system), Fc y RI (R&D system)和Fc y Rllb (R&D system)。在PBS中進(jìn)行所有受體的ELISA測(cè)試,除了 FcRn以 外,所述FcRn的ELISA測(cè)試在P6 (磷酸鈉100mM,氯化鈉50mM pH6. 0)中實(shí)現(xiàn),因?yàn)镕cRn / IgG結(jié)合是pH依賴的,在pH6.0最優(yōu)。用PBS中的0.5iig Clq補(bǔ)體/孔,PBS中的0. 25 u g Fc y RIIIaV158 / 孔或 PBS 中的 0. 1 y g Fc y RI / 孔或 P6 中的 0. 1 y g FcRn_p3 / 孔包被 Maxisorp 免疫板。用在 0.01M KC1 中的 0. lug Fc y RIIaR131 / 孔或 0. 4 y g Fc y Rllb /孔包被Immobilizer鎳螯合板(Nunc)。在4°C包被過夜后,用PBS / 0.05% Tween-20 (或P6 / 0.05% Tween-20,用于 FcRn)洗 2 次板并用 PBS / 4%BSA(*P6 / 4%BSA,用于FcRn)在37°C飽和2小時(shí)。平行地,在PBS中將上清稀釋為0.5 μ g / ml的最終IgG濃度(或在P6中稀釋為0.3yg / ml,用于FcRn結(jié)合檢測(cè))并與相同濃度的HRP F(ab' )2山羊抗人F(ab' )2在室溫混合2小時(shí)。然后在溫和攪拌下,在飽和的ELISA板上孵育F(ab' )2聚集的 IgGl 小時(shí),對(duì)于 Clq7Fc Y RIIaR131 和 FcyRIIb 未稀釋(即 0.5 μ g / ml 的 IgG),對(duì)于Fe Y RIIIaV158和Fe Y RI在PBS中稀釋為0.25 μ g / ml,或?qū)τ贔cRn_p3在P6中稀釋為0.03751^ / ml。然后用TMB(Pierce)使板顯色并讀取450nm處的吸光度。[0260]II1.1.2純化的IgG變體的ELISA測(cè)試
[0261]通過ELISA檢測(cè)了在Y2B / O中生產(chǎn)的IgG變體對(duì)若干受體的結(jié)合:FcRn_p3 (如I1.1.1 中),F(xiàn)e Y RI (R & D system),F(xiàn)e y RIIIaV158 (R&D system),F(xiàn)e y RIIIaF158 (作為His標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過PX Therapeutics在HEK293F細(xì)胞中瞬時(shí)生產(chǎn)),F(xiàn)c Y RIIaR131 (R&Dsystem), Fe y RIIaH131 (作為 His 標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過 PX Therapeutics 在 HEK293F 細(xì)胞中瞬時(shí)生產(chǎn))和FcyRIIb(R&D system)。在PBS中進(jìn)行所有受體的ELISA檢測(cè),除了FcRn以外,所述FcRn的ELISA測(cè)試在P6 (磷酸鈉IOOmM,氯化鈉50mM ρΗ6.0)中實(shí)現(xiàn)。對(duì)T Fe Y RI, Fe Y RIIIaV158, Fe y RIIIaF158 和 Fe Y RIIaH131,用在 PBS 中的 IOOng 重組蛋白質(zhì)/孔包被Maxisorp免疫板(Nunc),或用P6中的200ng FcRn_p3 /孔包被板。用在0.01M KCl 中的 IOOng Fe y RIIaR131 / 孔或 400ng Fe y RIIb / 孔包被 Immobilizer 鎳螯合板(Nunc)。在 4 °C 包被過夜后,用 PBS / 0.05% Tween-20 (或 P6 / 0.05% Tween-20,用于FcRn)洗2次板并用PBS / 4% BSA(或PBS / 4%脫脂奶粉用于Fe Y RI,或P6 / 4%脫脂奶粉用于FcRn)在37°C飽和2小時(shí)。
[0262]對(duì)于Fe y RIIIaV158, Fe y RIIIaF158, Fe y RIIaR131, Fe y RIIaH131 和 Fe y RIIb結(jié)合檢測(cè)測(cè)試,在PBS中將純化的IgG稀釋為2-4μ g / ml的終濃度并與相同濃度的HRPF(ab' )2山羊抗人F(ab' )2室溫混合2小時(shí)。在PBS中系列稀釋后,然后在溫和攬祥下在30°C在飽和的ELISA板上孵育I小時(shí)F(ab' )2聚集的IgG。然后用TMB(Pierce)顯色板并在450nm處讀取吸光度。對(duì)Fe y RI和FcRn進(jìn)行直接的ELISA。在補(bǔ)充4%脫脂奶粉和0.01 % Tween20的PBS中(或在P6中,對(duì)于FcRn)稀釋純化的IgG并在板上孵育2小時(shí)。然后用在相同的緩沖液中稀釋的HRP F(ab' )2山羊抗人F(ab' )2(1 / 2500)檢測(cè)結(jié)合的抗體。在37°C孵育2小時(shí)后,用TMB(Pierce)使板顯色并讀取450nm處的吸光度。
[0263]II1.2 結(jié)果
[0264]II1.2.1在293-F細(xì)胞的上清中生產(chǎn)的IgG
[0265]對(duì)每種IgG變體,進(jìn)行2次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)(生產(chǎn)、上清滴定和5個(gè)受體上的ELISA)。將ELISA結(jié)果表示為IgG變體得到的特異性信號(hào)(0D450nm)相對(duì)IgG-WT的信號(hào)的比例。這些ELISA測(cè)試顯示突變294De I大大削弱了變體相比其分別的親本多肽結(jié)合CI q (比例/ IgG-WIX0.50)和Fe Y R(比例/ IgG_WT〈0.25)的能力。相反地,所述突變僅導(dǎo)致組合294Del和至少另一個(gè)突變的變體約0-35%的FcRn結(jié)合的損失。下面以表1和2顯示結(jié)果。
[0266]表1:在對(duì)于靶蛋白 <:19,卩(^1?11&1?131,卩(^1?1113,卩(^1?111&¥158,卩(^1?1和卩^?11的ELISA測(cè)定中,IgGl變體的特異性信號(hào)與野生型IgGl得到的特異性信號(hào)的比例
[0267]
【權(quán)利要求】
1.生產(chǎn)包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體的方法,所述變體展示出相比所述親本多肽降低的與蛋白質(zhì)Clq和/或與至少一種受體Fe Y R的結(jié)合,其中在親本多肽的Fe區(qū)中引入氨基酸修飾,所述氨基酸修飾選自由下述組成的組: (i)294Del,其中所述氨基酸修飾294del是引入親本多肽的Fe區(qū)中的唯一氨基酸修飾,
(ii)293Del,和
(iii)293Del/ 294Del, Fe區(qū)中的氨基酸的編號(hào)指根據(jù)EU索引,或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中氨基酸修飾293Del是引入親本多肽的Fe區(qū)中的唯一氨基酸修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中氨基酸修飾del293/ del294是引入親本多肽的Fe區(qū)中的唯一氨基酸修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中親本多肽的Fe區(qū)是IgGFe區(qū),所述IgGFe 區(qū)選自由 SEQ ID NO:1 的 Fe 區(qū),SEQ ID NO:2 的 Fe 區(qū),SEQ ID NO:3 的 Fe 區(qū)和 SEQ IDNO:4的Fe區(qū)及其片段組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法,其中親本多肽的Fe區(qū)是包含氨基酸修飾的野生型IgG Fe區(qū)的變體,所述氨基酸修飾選自由434Y,378V,259I / 315D / 434Y和256N /378V / 383N / 434Y 組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法,其中變體選自由Fe融合蛋白、Fe綴合物和抗體組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法,其中在親本多肽的Fe區(qū)中引入所述氨基酸修飾的步驟包括: (i)提供編碼親本多肽的核酸, (?)修飾在步驟(i)中提供的核酸以得到編碼所述變體的核酸,和 (iii)在宿主細(xì)胞中表達(dá)在步驟(ii)中得到的核酸并回收所述變體。
8.包含F(xiàn)e區(qū)的親本多肽的變體,所述變體由如在權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)中定義的方法得到,且展示出相比所述親本多肽降低的與蛋白質(zhì)Clq和與至少一種受體Fe Y R的結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的變體,其中變體是針對(duì)靶分子的中和抗體,所述靶分子選自由膜受體,人可溶性蛋白質(zhì),毒素,病毒、細(xì)菌和真菌蛋白質(zhì)組成的組。
10.分離的核酸,其編碼如在權(quán)利要求8至9的任一項(xiàng)中定義的變體。
11.載體,其包含權(quán)利要求10的核酸。
12.宿主細(xì)胞,其含有權(quán)利要求11的載體。
13.親本多肽變體,其用于預(yù)防或治療病理學(xué)病況,所述病理學(xué)病況中不希望誘導(dǎo)ADCC和/或⑶C應(yīng)答,所述變體包含F(xiàn)e區(qū),展示出相比所述親本多肽降低的與蛋白質(zhì)Clq和與至少一種受體Fe Y R的結(jié)合,且相比其多肽親本的Fe區(qū)在其Fe區(qū)中包含選自294Del,293Del和293Del / 294Del的氨基酸修飾,附帶條件是親本多肽的所述變體不在于294Del / T307P / N434Y或293Del / T307P / N434Y變體,在Fe區(qū)中的氨基酸編號(hào)指根據(jù)EU索引,或在Kabat中的等同物的編號(hào)。
14.藥物組合物,其包含如在權(quán)利要求8,9或13的任一項(xiàng)中定義的變體。
【文檔編號(hào)】C07K16/00GK103827142SQ201280031137
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月24日
【發(fā)明者】A·豐泰納, S·若里約克斯, C·莫內(nèi)-馬爾斯, P·蒙東, A·卡拉特, K·布阿亞迪 申請(qǐng)人:法國血液分割暨生化制品實(shí)驗(yàn)室