專利名稱：海膽共附生菌株抑菌活性蛋白的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種細菌活性蛋白的制備方法，特別是一種操作簡單、成本低廉的海 膽共附生菌株抑菌活性蛋白的制備方法。
背景技術：
海膽為棘皮動物門(Echinoderma-to)海膽綱(Echinoidea)動物。目前世界上已 發(fā)現(xiàn)的海膽有850余種，常見的可食海膽有光棘球海膽(也稱大連紫海膽)、紫海膽以及馬糞 海膽，這些海膽除了食用價值之外，其所含有的糖類、蛋白質(zhì)、脂肪酸等成分具有很多生物 活性，海膽中還含有一些共附微生物，但這些微生物及其代謝產(chǎn)物迄今未止還沒有被充 分利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術存在的上述技術問題，提供一種操作簡單、成本低廉 的海膽共附生菌株抑菌活性蛋白的制備方法。本發(fā)明的技術解決方案是一種海膽共附生菌株抑菌活性蛋白的制備方法， 其特征在于依次按如下步驟進行
a.取干凈、新鮮的海膽卵研磨后，將200mL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng) 基上，37 °C恒溫培養(yǎng)2天；
b.挑取單菌落反復劃線培養(yǎng)至純菌株，用濾紙片法檢測純菌株的抑菌活性；
c.取抑菌圈直徑大于或等于10mm的菌株，在pH 9的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中 35°C發(fā)酵1天，所述牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中牛肉膏和蛋白胨的質(zhì)量百分比分別為3% 禾口 6% ；
d.4000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為60%，4°C 靜置過夜，10000 r/min離心30 min,將沉淀用PBS緩沖液溶解后，再用至少3500道爾頓的 透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥。本發(fā)明操作簡單、成本低廉，從海膽共附生菌株的發(fā)酵液中所提取的抑菌活性蛋 白抑菌活性強，有較好的清除超氧陰離子活性，并對海蝦無節(jié)幼體具有一定毒性，可應用于 抗腫瘤藥品、生物農(nóng)藥和食品保鮮、防腐劑和化妝品的添加劑等方面，具有產(chǎn)業(yè)價值。
具體實施例方式
本發(fā)明實施例依次按如下步驟進行 a.將剛打撈的新鮮海膽，在超凈工作臺內(nèi)用無菌水清洗5遍后，取干凈、新鮮的海膽 卵用研磨機充分研磨后，將200 mL研磨液均勻涂布于現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上， 37 °C恒溫培養(yǎng)2天。b.挑取單個形態(tài)各異的菌落反復劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株(82種)，用濾紙片法檢 測各純菌株的抑菌活性。
抑菌活性的檢測大腸桿coli(EC)、變形桿菌Proteus vulgaris(PV)、金Jtfe葡萄 求菌 Staphylococcus aureus (SA)、產(chǎn)氣！flif Enterobacter aerogenes (EA) 和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis (BS)均采用現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，上述菌種均 可購自上海坤肯生物化工有限公司。將各菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，振 蕩培養(yǎng)M h作指示菌。分別用移液槍取指示菌液100 μ L于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，用無菌三角涂 棒涂抹均勻，然后用記號筆在培養(yǎng)皿底部的外面將牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿分成六 個區(qū)，每個區(qū)分別放入一張濾紙片，再分別用移液槍移取海膽共附菌株(純菌株)發(fā)酵物樣 品10 PL滴到濾紙片中央，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。每個純菌株做3次重復處理，陽 性對照為75%酒精，陰性對照為無菌水。觀察指示菌的生長情況，測定抑菌圈的直徑大小。如其中一種菌株發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌、變形桿菌有抑菌作用，抑菌圈平均直徑 為11 mm，對該抑菌活性菌株利用16SRNA分子鑒定確定其為芽孢桿菌屬，通過耐鹽性試驗、 對溶菌酶抗性試驗、V. P實驗、苯丙氨酸、丙二酸鹽實驗、檸檬酸鹽利用、產(chǎn)糊精結(jié)晶、油脂水 解、淀粉水解、二羥丙酮的形成、過氧化氫酶、酪氨酸水解、產(chǎn)硫化氫、明膠水解、對溶菌酶抗 性、石蕊牛乳實驗、糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、產(chǎn)生吲哚、動力實驗、卵磷脂酶、甲基紅實驗、酪素 水解等生理生化試驗將其鑒定到種，該活性菌株為多粘芽孢桿菌(中國微生物菌種總目錄 中 CFCC103;34)。C.取抑菌圈平均直徑大于或等于10 mm的菌株，在pH 9的牛肉膏蛋白胨液體培 養(yǎng)基中35°C發(fā)酵1天，所述牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基與現(xiàn)有技術的區(qū)別是其中牛肉膏和 蛋白胨的質(zhì)量百分比分別為3%和6% ；
d. 4000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為60%，4°C 靜置過夜，10000 r/min離心30 min，將沉淀用PBS緩沖液溶解后，再用至少3500道爾頓的 透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，冷凍干燥的透析袋中物為抑菌活性蛋白質(zhì)。實驗及結(jié)果
1.抑制植物病原菌活性的檢測在無菌條件下，用移液槍移取上述多粘芽孢桿菌菌株 發(fā)酵液1.5 mL，加入到冷卻至40°C左右的沙氏培養(yǎng)基中搖勻，使其最終體積為15 ml，凝固 后分別用孔徑為0. 8 cm的打孔器取菌落邊緣生長旺盛的植物病原菌菌餅接種到含有多粘 芽孢桿菌菌株發(fā)酵液的沙氏培養(yǎng)基平板上，每個培養(yǎng)皿接種1個菌餅，每種植物病原菌做3 個重復。以與培養(yǎng)多粘芽孢桿菌菌株相同的空白培養(yǎng)基加入到沙氏培養(yǎng)基作為對照，置于 27 ！的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，拍照測量直徑，方法是按照十字交叉測量2次， 以其平均值代表菌落直徑的大小。根據(jù)抑制率的計算公式純生長量=菌落平均直徑-菌 餅直徑，抑制率=(對照純生長量-處理純生長量)/對照純生長量進行計算。結(jié)果表明本 發(fā)明實施例中的這株菌的發(fā)酵液對植物病原菌抑制率分別為棉花枯萎72%，串珠鐮刀菌 52%，毛霉菌81%，辣椒青枯88%，番茄灰霉89%，玉米早疫89%，蘋果粉紅92%，西瓜枯萎72%。 上述菌種均可購自上海坤肯生物化工有限公司。由此可見，該菌株發(fā)酵液具有很強的抑制 植物病原菌活性，可作為粉劑或液體制劑用于生物農(nóng)藥的制備。2.海蝦毒性實驗取本發(fā)明實施例蛋白樣品(8 mg/mL)0.05mL加到3個帶刻度 的試管中，再在每試管中加入約4 mL海水和10只健康的海蝦無節(jié)幼體，最后用海水加至 5 mL ；取3只試管，也加入10只健康的海蝦無節(jié)幼體，再用海水加至5 mL，作為空白對照。置日光燈下，24 h后計數(shù)存活海蝦。每個實驗重復三次。實驗結(jié)果表明小蝦存活率為 25.5%，而空白對照無一死亡，因此該蛋白具有一定的海蝦毒性活性。海蝦幼蟲曾被許多活 性測試系統(tǒng)應用，有研究發(fā)現(xiàn)海蝦毒性法和9KB (人鼻咽癌)細胞毒性實驗呈現(xiàn)很好的相關 性(P = 01036, kappa = 0156)。細胞毒的ED50 —般是海蝦毒LD50的1/ 10，可用海蝦 毒性法代替昂貴而繁雜的體內(nèi)體外抗腫瘤實驗，指導對具細胞毒和3PS ( P388，體內(nèi)老鼠 白血病)活性提取物的分離。海蝦毒性法具快速(24h)、便宜和簡單(如不需無菌操作)等 優(yōu)點，實驗結(jié)果表明本發(fā)明實施例所制備的蛋白質(zhì)有抗腫瘤活性，可應用于抗腫瘤藥物的 制備。 3.超氧陰離子自由基(02_)清除作用的測定取鄰苯三酚0.1 mL于試管中，加入 PH 8. 2的Tris-HCl緩沖溶液5 mL，加入本發(fā)明實施例制備的蛋白水溶液0. 25 mL，迅速混 勻。在25°C反應15 min。使用1 cm比色皿，以蒸餾水做空白對照，在320 nm處測吸光度 A ”并測定樣液本底的吸光度值~。酶解液對超氧陰離子自由基清除率的計算公式如下 清除率S (%) =Ao — (Ai — Aj)/AoX 100%。式中，Ao為試劑空白的吸光度值-A為樣液的 吸光度值；A^為樣液本底的吸光度值。雖然超氧陰離子自由基(O2—)不能直接誘導生物和食 品體系中的脂類氧化，但它會在金屬離子催化下發(fā)生i^enton反應產(chǎn)生有高活性的· 0H，因 此常用樣品對超氧陰離子自由基(02_)的清除能力來反映其抗氧化活性。試劑空白時的吸 光度值Ao為0. 361，經(jīng)清除率公式S(%)= Ao- (Ai-Aj)AoXlOO計算超氧陰離子自由基 清除率。結(jié)果表明本發(fā)明實施例所制備的蛋白超氧陰離子自由基清除率高達50.3%，因此 可用作抗氧化藥物的制備或食品及化妝品等抗氧化添加劑。
權利要求
1. 一種海膽共附生菌株抑菌活性蛋白的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進行a.取干凈、新鮮的海膽卵研磨后，將200mL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng) 基上，37 °C恒溫培養(yǎng)2天；b.挑取單菌落反復劃線培養(yǎng)至純菌株，用濾紙片法檢測純菌株的抑菌活性；c.取抑菌圈直徑大于或等于10mm的菌株，在pH 9的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中 35°C發(fā)酵1天，所述牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中牛肉膏和蛋白胨的質(zhì)量百分比分別為3% 禾口 6% ；d.4000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為60%，4°C 靜置過夜，10000 r/min離心30 min，將沉淀用PBS緩沖液溶解后，再用截留分子量為3500 道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開一種海膽共附生菌株抑菌活性蛋白的制備方法，依次按如下步驟進行取海膽卵研磨后，將200mL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)2天；挑取單菌落反復劃線培養(yǎng)至純菌株，檢測純菌株的抑菌活性；取抑菌圈直徑大于或等于10mm的菌株，在pH9的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中35℃發(fā)酵1天；4000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為60%，4℃靜置過夜，10000r/min離心30min，將沉淀用PBS緩沖液溶解后，再用截留分子量為3500道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥。
文檔編號C07K14/31GK102093472SQ201010592549
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權日2010年12月16日
發(fā)明者孫秋穎, 張付云, 張瑛, 李偉, 蒼桂璐 申請人:大連海洋大學