專利名稱：利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生化技術領域的方法，具體是一種利用分子印跡聚合物凈化 和檢測抗蚜威的方法。
背景技術：
抗蚜威是一種氨基甲酸酯(carbamate)類殺蟲劑，英文名primicarb，化學名稱為 5，6- 二甲基-2- 二甲胺基-4-嘧啶基-二甲基氨基甲酸酯。該藥能防治對有機磷殺蟲劑 產生抗性的、除棉蚜蟲外的所有蚜蟲，常用于果蔬中蚜蟲的防治。由于抗蚜威的超限量和超 范圍使用，使得由此引發(fā)的對環(huán)境和食品安全的壓力變得日益突出。氨基甲酸酯類農藥毒 作用機理與有機磷農藥相似，主要是抑制膽堿酯酶活性，使酶活性中心絲氨酸的羥基被氨 基甲?；蚨ッ笇σ阴Ｄ憠A的水解能力。為了保障人民的身體健康，世界各國對氨基 甲酸酯類農藥的使用和殘留都做了嚴格的規(guī)定并制定了相應的標準，其中我國對無公害蔬 菜中抗蚜威的限量標準為1.0mg/kg。對于測定果蔬中抗蚜威，一般多采用氣相色譜法(GB/ T5009. 104-2003)、液相色譜法等方法。由于果蔬的基質復雜，而抗蚜威往往痕量存在，所以 有必要對抗蚜威進行前處理，從而提高檢測的靈敏度。目前采用的前處理方法有液液分配、 固相萃取等，其中固相萃取技術因其操作簡單，節(jié)約試劑，可同時處理多個樣品而得到廣泛 應用。但是由于目前常用的固相萃取填料與吸附目標物的作用都是非特異性的，固定相的 選擇性低，易受復雜基質的干擾，限制了該項技術的應用。分子印跡技術是基于分子識別基 礎上的一種功能聚合物制備技術，該聚合物在合成時采用目的分子或類似物作為模板，合 成后將模板洗脫，聚合物保留了和目的分子互補的空間結構和基團，具有“記憶”功能，可特 異的和模板分子作用，并通過相應的方式洗脫，以達到純化和富集目的分子的作用。分子印 跡聚合物具有抵抗酸堿等惡劣環(huán)境的優(yōu)點，可重復使用，具有廣泛的應用前景。經現有技術文獻的檢索發(fā)現，Fung等在《Analytica Chimica Acta》2006，576， 67—76 上發(fā) @ 白勺文章 “Piezoelectric quartz crystal sensor for rapid analysis of pirimicarb residues using molecularly imprinted polymers as recognition elements”(采用分子印跡聚合物作為識別材料的壓電石英晶體傳感器用于快速檢測抗 蚜威殘留)中合成了抗蚜威分子印跡聚合物，這項研究首次嘗試將分子印跡聚合物用 于蔬菜中抗蚜威殘留的檢測。但是該文章所采用的聚合方法為原位聚合法，存在將結 合在聚合物上的抗蚜威洗脫困難的問題。Pingarr0n等在《Analytica Chimica Acta)) 2002，451，297-304 上發(fā)表的文章 “Molecularly imprinted polymers for on-line preconcentration by solid phase extraction of pirimicarb in water samples，，(使用 分子印跡聚合物固相萃取的方法在線富集水中的抗蚜威)中首次將抗蚜威分子印跡聚合 物應用于固相萃取柱填料，但是該文章所也是采用原位聚合法制備聚合物，存在抗蚜威洗 脫困難的問題。Gao等在其論文《Polymer》2008，49，1230 1238上發(fā)表的文章“Molecular imprinted material prepared by novel surface imprinting technique for selective adsorption of pirimicarb”(新穎的表面聚合技術制備對抗蚜威具有選擇性吸附作用的
3分子印跡聚合物)中采用表面接枝的方法合成了抗蚜威分子印跡聚合物，與原位聚合法制 備的分子印跡聚合物相比具有易洗脫目標分子的優(yōu)點。但是該文章只是停留在聚合物物理 特征和吸附性能的評價階段，并沒有實際應用。到目前為止，還沒有采用表面聚合法制備的 抗蚜威分子印跡聚合物固相萃取柱應用于果蔬樣品的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種利用分子印跡聚合物凈化和 檢測抗蚜威的方法，本發(fā)明采用表面聚合法制備抗蚜威分子印跡聚合物，并將該分子印跡 聚合物應用于固相萃取柱填料，從而彌補現有果蔬中、環(huán)境中抗蚜威檢測前處理的弊端，簡 單、快速、特異、高效的富集和純化痕量抗蚜威，提高現有檢測的靈敏度。本發(fā)明是通過以下技術方案實現的，本發(fā)明包括如下步驟(1)將模板分子抗蚜威、功能單體三氟甲基丙烯酸和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸 酯，按模板分子功能單體交聯(lián)劑摩爾比=1 4 20，混合溶解在庚烷中，加入引發(fā)劑 4，4’ -偶氮-二(4-氰基戊酸)-硅膠；(2)充入氮氣5-10分鐘，在氮氣保護下將安培瓶封口，65°C 70°C水浴保溫反應 20 30小時；(3)通過索氏萃取，除去模板分子；(4)將除去模板分子的聚合物60°C干燥過夜，獲得抗蚜威的分子印跡聚合物；(5)將抗蚜威分子印跡聚合物填充到固相萃取柱管中；(6)對固相萃取柱活化，加入果蔬樣品提取液，經過淋洗固相萃取柱，之后洗脫、凈 化和收集抗蚜威。所述的填充到固相萃取柱管，在抽真空狀態(tài)下，將勻漿液裝入聚丙烯固相萃取小 柱，填料的頂端和底端分別裝上聚乙烯篩板。所述的填充到固相萃取柱管，是指用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和篩板，稱量 抗蚜威分子印跡聚合物，用甲醇勻漿后，填充到商品化的Iml 6ml聚丙烯固相萃取小柱 內。所述的篩板，篩板的孔徑是20 μ m。所述的稱量抗蚜威分子印跡聚合物，其質量為20mg 200mg。所述的固相萃取柱活化，是指用2倍柱體積的去離子水活化固相萃取柱。所述的果蔬樣品提取液，其制備方法為將果蔬去掉非食部分后，精確稱量，加人等 體積的去離子水，搗碎，置于具塞錐形瓶中，于電動振蕩器上振蕩lOmin，以3000r/min離心 5min，吸取上清液。所述的加入樣品，為2ml。所述的淋洗，是指用2倍柱體積的庚烷淋洗固相萃取柱。所述的洗脫，是指用2倍柱體積的混合液(甲醇水乙酸=7:2: 1，體積比) 洗脫抗蚜威。本發(fā)明中，在硅膠表面合成的抗蚜威分子印跡聚合物具有和模板分子相互補的基 團和構象，具有“記憶”功能，所以對模板分子具有很高的特異性和選擇性。采用本發(fā)明制 備的分子印跡聚合物作為固相萃取柱的填料可以用于果蔬樣品和水樣品的前處理實踐，從而實現對干擾檢測的果蔬基質的去除，富集痕量殘留的抗蚜威，提高檢測的靈敏度。而且， 本發(fā)明制備的分子印跡聚合物為硅膠表面聚合物，具有易將模板分子洗脫得優(yōu)點。本發(fā)明 所述的方法比較普通的固相萃取小柱，具有特異性好、容量高的特點。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行 實施，給出了具體的實施方式和詳細的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。實施例1 一、抗蚜威分子印跡聚合物的制備將抗蚜威(模板分子)0. 2mmol、功能單體三氟甲基丙烯酸(TFMAA)和交聯(lián)劑乙二 醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，按照1 4 20的摩爾比混勻，溶解在20mL制孔劑(庚烷)中， 置入安培瓶中，預聚合2小時。加入引發(fā)劑4，4’_偶氮-二(4-氰基戊酸)-硅膠(ACPA-硅 膠)0. OSmmol，充入氮氣5分鐘，真空封口，65°C油浴熱聚合24小時。通過索氏萃取12小 時除去模板分子，萃取劑的組成為甲醇-水-乙酸混合液(7 2 1，V/V/V)。取洗脫液 20 μ 1, HPLC檢測洗脫完全后，將聚合物60°C干燥24小時。二、抗蚜威分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板，將合成的分子印跡聚合物IOOmg用甲醇勻 漿，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱體積為3ml，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后加上聚乙 烯篩板。三、抗蚜威分子印跡聚合物固相萃取小柱純化、富集菜豆中的抗蚜威殘留先后用2倍柱體積的甲醇、2倍柱體積的去離子水活化固相萃取柱，注意不能使之 用2倍柱體積庚烷洗滌柱子，之后用2倍柱體積緩沖液(甲醇水乙酸=7 2 1，體 積比)將吸附在MIP-SPE柱上的抗蚜威洗脫下來。抽干。加入2ml水提取后的樣品，用2 倍柱體積庚烷洗滌小柱，抽干，之后用2倍柱體積緩沖液(甲醇水乙酸=7 2 1，體 積比)將吸附在MIP-SPE柱上的抗蚜威洗脫下來。將樣品用0. 22 μ m濾膜過率后，取20 μ 1上樣，用HPLC分離樣品并通過紫外檢測 器檢測樣品中抗蚜威的濃度。本實施例合成的分子印跡聚合物可 特異的識別抗蚜威，采用本實施例的方法可 以用于菜豆中抗蚜威的分離、凈化和富集。對菜豆中添加lOyg/g標準樣品的回收率為 90. 3%，對其他類藥品無特異性吸附。實施例2 一、抗蚜威分子印跡聚合物的制備將抗蚜威(模板分子)0. 2mmol、功能單體三氟甲基丙烯酸(TFMAA)和交聯(lián)劑乙二 醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，按照1 4 20的摩爾比混勻，溶解在20mL制孔劑(庚烷)中， 置入安培瓶中，預聚合2小時。加入引發(fā)劑4，4’_偶氮-二(4-氰基戊酸)-硅膠(ACPA-硅 膠)0. OSmmol，充入氮氣5分鐘，真空封口，70°C油浴熱聚合20小時。通過索氏萃取12小 時除去模板分子，萃取劑的組成為甲醇-水-乙酸混合液(7 2 1，V/V/V)。取洗脫液 20 μ 1, HPLC檢測洗脫完全后，將聚合物60°C干燥24小時。
二、抗蚜威分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板，將合成的分子印跡聚合物200mg用甲醇勻 漿，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱體積為6ml，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后加上聚乙 烯篩板。三、抗蚜威分子印跡聚合物固相萃取小柱純化、富集油菜中的抗蚜威殘留先后用2倍柱體積的甲醇、2倍柱體積的去離子水活化固相萃取柱，注意不能使之 用2倍柱體積庚烷洗滌柱子，之后用2倍柱體積緩沖液(甲醇水乙酸=7 2 1，體 積比)將吸附在MIP-SPE柱上的抗蚜威洗脫下來。抽干。加入2ml水提取后的樣品，用2 倍柱體積庚烷洗滌小柱，抽干，之后用2倍柱體積緩沖液(甲醇水乙酸=7 2 1，體 積比)將吸附在MIP-SPE柱上的抗蚜威洗脫下來。將樣品用0. 22 μ m濾膜過率后，取20 μ 1上樣，用HPLC分離樣品并通過紫外檢測 器檢測樣品中抗蚜威的濃度。本實施例合成的分子印跡聚合物可以特異的識別抗蚜威，采用本實施例的方法可 以用于油菜中抗蚜威的分離、凈化和富集。對油菜中添加100yg/g標準樣品的回收率為 92. 5%，對其他類藥品無特異性吸附。實施例3:一、抗蚜威分子印跡聚合物的制備將抗蚜威(模板分子)0. 2mmol、功能單體三氟甲基丙烯酸(TFMAA)和交聯(lián)劑乙二 醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，按照1 4 20的摩爾比混勻，溶解在20mL制孔劑(庚烷)中， 置入安培瓶中，預聚合2小時。加入引發(fā)劑4，4’_偶氮-二(4-氰基戊酸)-硅膠(ACPA-硅 膠)0. OSmmol，充入氮氣5分鐘，真空封口，70°C油浴熱聚合30小時。通過索氏萃取12小 時除去模板分子，萃取劑的組成為甲醇-水-乙酸混合液(7 2 1，V/V/V)。取洗脫液 20 μ 1，HPLC檢測洗脫完全后，將聚合物60°C干燥24小時。二、抗蚜威分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板，將合成的分子印跡聚合物20mg用甲醇勻 漿，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱體積為1ml，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后加上聚乙 烯篩板。三、抗蚜威分子印跡聚合物固相萃取小柱純化、富集蘋果中的抗蚜威殘留先后用2倍柱體積的甲醇、2倍柱體積的去離子水活化固相萃取柱，注意不能使之 用2倍柱體積庚烷洗滌柱子，之后用2倍柱體積緩沖液(甲醇水乙酸=7 2 1，體 積比)將吸附在MIP-SPE柱上的抗蚜威洗脫下來。抽干。加入2ml水提取后的樣品，用2 倍柱體積庚烷洗滌小柱，抽干，之后用2倍柱體積緩沖液(甲醇水乙酸=7 2 1，體 積比)將吸附在MIP-SPE柱上的抗蚜威洗脫下來。將樣品用0. 22 μ m濾膜過率后，取20 μ 1上樣，用HPLC分離樣品并通過紫外檢測 器檢測樣品中抗蚜威的濃度。本實施例合成的分子印跡聚合物可以特異的識別抗蚜威，采用本實施例的方法 可以用于蘋果中抗蚜威的分離、凈化和富集。對蘋果中添加ι μ g/g標準樣品的回收率為 88. 7%，對其他類藥品無特異性吸附。實施例4
一、抗蚜威分子印跡聚合物的制備將抗蚜威(模板分子)0. 2mmol、功能單體三氟甲基丙烯酸(TFMAA)和交聯(lián)劑乙二 醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，按照1 4 20的摩爾比混勻，溶解在20mL制孔劑(庚烷)中， 置入安培瓶中，預聚合2小時。加入引發(fā)劑4，4’_偶氮-二(4-氰基戊酸)-硅膠(ACPA-硅 膠)0. OSmmol，充入氮氣5分鐘，真空封口，65°C油浴熱聚合30小時。通過索氏萃取12小 時除去模板分子，萃取劑的組成為甲醇-水-乙酸混合液(7 2 1，V/V/V)。取洗脫液 20 μ 1，HPLC檢測洗脫完全后，將聚合物60°C干燥24小時。二、抗蚜威分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板，將合成的分子印跡聚合物IOOmg用甲醇勻 漿，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱體積為3ml，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后加上聚乙 烯篩板。三、抗蚜威分子印跡聚合物固相萃取小柱純化、富集自來水中的抗蚜威殘留先后用2倍柱體積的甲醇、2倍柱體積的去離子水活化固相萃取柱，注意不能使之 用2倍柱體積庚烷洗滌柱子，之后用2倍柱體積緩沖液(甲醇水乙酸=7 2 1，體 積比)將吸附在MIP-SPE柱上的抗蚜威洗脫下來。抽干。加入500ml自來水樣品，用2倍 柱體積庚烷洗滌小柱，抽干，之后用2倍柱體積緩沖液(甲醇水乙酸=7:2: 1，體積 比)將吸附在MIP-SPE柱上的抗蚜威洗脫下來。將樣品用0. 22 μ m濾膜過率后，取20 μ 1上樣，用HPLC分離樣品并通過紫外檢測 器檢測樣品中抗蚜威的濃度。本實施例合成的分子印跡聚合物可以特異的識別抗蚜威，采用本實施例的方法可 以用于自來水中抗蚜威的分離、凈化和富集。對自來水中添加ι μ g/g標準樣品的回收率為 103. 2%，對其他類藥品無特異性吸附。
權利要求
一種利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將模板分子抗蚜威、功能單體三氟甲基丙烯酸和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，按模板分子∶功能單體∶交聯(lián)劑摩爾比＝1∶4∶20，混合溶解在庚烷中，加入引發(fā)劑4，4’ 偶氮 二(4 氰基戊酸) 硅膠；(2)充入氮氣5 10分鐘，在氮氣保護下將安培瓶封口，65℃～70℃水浴保溫反應20～30小時；(3)通過索氏萃取，除去模板分子；(4)將除去模板分子的聚合物60℃干燥過夜，獲得抗蚜威的分子印跡聚合物；(5)將抗蚜威分子印跡聚合物填充到固相萃取柱管中；(6)對固相萃取柱活化，加入果蔬樣品提取液，經過淋洗固相萃取柱，之后洗脫、凈化和收集抗蚜威。
2.根據權利要求1所述的利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法，其特征是， 所述的填充到固相萃取柱管，在抽真空狀態(tài)下，將勻漿液裝入聚丙烯固相萃取小柱，填料的 頂端和底端分別裝上聚乙烯篩板。
3.根據權利要求1或者2所述的利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法，其特 征是，所述的填充到固相萃取柱管，是指用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和篩板，稱量抗蚜 威分子印跡聚合物，用甲醇勻漿后，填充到商品化的Iml 6ml聚丙烯固相萃取小柱內。
4.根據權利要求3所述的利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法，其特征是， 所述的篩板，篩板的孔徑是20 μ m。
5.根據權利要求3所述的利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法，其特征是， 所述的稱量抗蚜威分子印跡聚合物，其質量為20mg 200mg。
6.根據權利要求1所述的利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法，其特征是， 所述的固相萃取柱活化，是指用2倍柱體積的去離子水活化固相萃取柱。
7.根據權利要求1所述的利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法，其特征是， 所述的果蔬樣品提取液，其制備方法為將果蔬去掉非食部分后，精確稱量，加人等體積的去 離子水，搗碎，置于具塞錐形瓶中，于電動振蕩器上振蕩lOmin，以3000r/min離心5min，吸 取上清液。
8.根據權利要求1或者7所述的利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法，其特 征是，所述的加入樣品，為2ml。
9.根據權利要求1所述的利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法，其特征是， 所述的淋洗，是指用2倍柱體積的庚烷淋洗固相萃取柱。
10.根據權利要求1所述的利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法，其特征是， 所述的洗脫，是指用2倍柱體積的混合液，甲醇水乙酸體積比=7:2: 1，洗脫抗蚜 威。
全文摘要
一種生化技術領域的利用分子印跡聚合物凈化和檢測抗蚜威的方法。將模板分子抗蚜威、功能單體三氟甲基丙烯酸和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯混合溶解在庚烷中，加入引發(fā)劑4，4’-偶氮-二(4-氰基戊酸)-硅膠；充入氮氣5-10分鐘，在氮氣保護下將安培瓶封口，65℃～70℃水浴保溫反應20～30小時通過索氏萃取，除去模板分子；將除去模板分子的聚合物60℃干燥過夜，獲得抗蚜威的分子印跡聚合物；將抗蚜威分子印跡聚合物填充到固相萃取柱管中；對固相萃取柱活化，加入果蔬樣品提取液，經過淋洗固相萃取柱，之后洗脫、凈化和收集抗蚜威。本發(fā)明彌補現有果蔬中、環(huán)境中抗蚜威檢測前處理的弊端，簡單、快速、特異、高效的富集和純化痕量抗蚜威，提高現有檢測的靈敏度。
文檔編號C07D239/47GK101914066SQ20101024618
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權日2010年8月6日
發(fā)明者唐波, 孫向軍, 陳秋宇 申請人:上海交通大學