專利名稱：穩(wěn)定性提高的生長激素共軛物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生長激素共軛物和制備它們的方法。本文所描述的共軛物是通過位點(diǎn) 特異性共軛作用與生長激素結(jié)合蛋白共軛的生長激素化合物。新的共軛物在循環(huán)中具有延 長的半衰期，這使得該蛋白容易在治療中使用。
背景技術(shù)：
人生長激素(hGH)是191個(gè)氨基酸長度的蛋白，其具有二硫橋和22 kDa的分子量。 二硫鍵連接53與165位和182與189位。hGH在促進(jìn)生長、保持正常身體成分、合成代 謝和脂類代謝中起到關(guān)鍵作用。它對(duì)中間代謝也有直接影響，例如降低葡萄糖吸收，提 高脂解，提高氨基酸吸收和蛋白質(zhì)合成。該激素還對(duì)其它組織產(chǎn)生影響，包括脂肪組織， 肝臟，腸管，腎臟，骨干，結(jié)締組織和肌肉。已經(jīng)制備出重組hGH，并且可以以下列形式商 購，例如Genotropin (Pharmacia Up john)，Nutropin 和 Protropin (Genentech)， Humatrope (Eli Lilly), Serostim (Serono)和 Norditropin (Novo Nordisk)。另外，還 以下列名稱銷售在N端具有額外甲硫氨酸殘基的類似物，例如Somatonorm (Wiarmacia Upjohn/Pfizer)。尤其是如果所述蛋白是治療性質(zhì)的蛋白，嘗試處理所給定的蛋白，以便提高其穩(wěn) 定性或半衰期。在這方面，通過使基團(tuán)與所述蛋白共軛來修飾蛋白，是改變?cè)摰鞍仔阅艿姆?式之一。hGH具有短的半衰期，由此在患有生長缺陷的孩子中需要至少三次注射，或在大多 數(shù)情況下每天注射。目前的hGH治療方案需要每天皮下注射。這已對(duì)患者產(chǎn)生許多困難， 包括成本；除了患者對(duì)每天注射的耐受性問題之外，還有給藥的容易程度問題。為了提高治療蛋白的穩(wěn)定性、降低清除率和降低抗原性，已經(jīng)建議了各種方法，包 括治療蛋白的化學(xué)修飾。產(chǎn)生持久生長激素的不同方法包括聚乙二醇化方法和形成持續(xù)釋 放制劑。已經(jīng)描述過，通過與生長激素結(jié)合蛋白(GHBP)共價(jià)結(jié)合，循環(huán)中的生長激 素(GH)的半衰期可以得到顯著地提高(G. Baumann等人，Metabolism-Clinical and Experimental 38(4), 330-333(1989))。令人遺憾的是，這種共軛物在臨床使用上是不 適宜的，這是因?yàn)槠鋬?nèi)在異質(zhì)性，并且還因?yàn)槠浜芸赡懿荒艽碳H受體。還已經(jīng)描述過， GH-連接基-GHBP融合蛋白在循環(huán)中的半衰期已經(jīng)提高(I. R. Wilkinson等人，Nat. Med. 13(9), 1108-1113(2007)) 0令人遺憾的是，這種方法也具有它的問題。所以，在人造融合 蛋白中，潛在的免疫原性“非自身”序列是在連接基和融合伴侶之間產(chǎn)生的。這種非自身序 列可以導(dǎo)致對(duì)藥物來說長期使用時(shí)高度不需要的免疫原性。先前已經(jīng)描述過，通過激素的翻譯后共軛作用聚乙二醇化生長激素而使用轉(zhuǎn)谷氨 酰胺酶(TCase)，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶用于在PEG選擇性連接的蛋白的特殊位置產(chǎn)生連結(jié)點(diǎn) (W0 06134148，WO 05070468，US 60/957732)。另外，EP950665 和 EP785276 描述了轉(zhuǎn)谷氨 酰胺酶介導(dǎo)的生理學(xué)活性蛋白的變化。本發(fā)明概述
本文公開的是生長激素的新的修飾形式，其具有經(jīng)過修飾并通過位點(diǎn)特異性共軛作用與GHBP結(jié)合的特定氨基酸殘基。本公開還包括制備這種化合物的方法以及這種化合物的 藥學(xué)用途。與相應(yīng)的非共軛的肽相比，通過本發(fā)明所公開方法由此獲得的共軛物具有改善 的藥理學(xué)性能。這種藥理學(xué)性能的例子包括功能性的體內(nèi)半衰期提高，免疫原性降低，改 善腎過濾和蛋白酶保護(hù)，以及白蛋白結(jié)合改善。在一方面，本發(fā)明提供了下式的組成物 A-B-C
其中
A是生長激素化合物的基團(tuán)； B是連接和間隔性二價(jià)殘基； C是生長激素受體單體化合物的胞外部分的基團(tuán)；和 -是共價(jià)鍵，
其中在A與B之間的連接基和/或在B與C之間的連接基不是通過核酸的重組表達(dá)來 提供的，該核酸包括編碼具有結(jié)構(gòu)A-B-C的融合蛋白的核酸序列。本發(fā)明還提供了獲得A-B-C的方法，包括下列步驟
(a)生長激素化合物的酶催衍生作用，和
(b)使酶修飾的生長激素化合物與生長激素受體單體化合物共軛。本發(fā)明還提供了治療哺乳動(dòng)物疾病狀態(tài)的方法，該方法通過給予有效量的按照本 發(fā)明所描述獲得的hGH-GHBP共軛物，使生長激素的活性提高，因而使所述患病哺乳動(dòng)物從 中受益。發(fā)明說明書
本發(fā)明涉及蛋白(尤其是人生長激素(hGH))和生長激素結(jié)合蛋白(GHBP)之間的蛋 白共軛物。本文所描述的制備這種共軛物的一種方法包括使hGH與GHBP通過位點(diǎn)特異 性共軛作用而進(jìn)行共軛。與hGH本身相比較，本發(fā)明提供的hGH-GHBP共軛物具有提高的 藥理學(xué)性能，例如穩(wěn)定性、在循環(huán)中延長的半衰期、腎清除率，并且與hGH和hGH-GHBP的 融合蛋白相比較，免疫原性降低，如下列所述Baumann等人，Metabolism-Clinical and Experimental 38(4), 330-333 (1989))和 I. R. Wilkinson et al. , Nat. Med. 13(9), 1108-1113(2007)。本文使用的“共軛物”意思是指稠合的或修飾的蛋白或肽，例如，與另一 個(gè)化學(xué)部分或另一種蛋白結(jié)合的蛋白。共軛作用或被共軛的是指形成共軛物的行為或方 法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了下式的化合物 A-B-C
其中
A是生長激素化合物的基團(tuán)； B是連接和間隔性二價(jià)殘基； C是生長激素結(jié)合蛋白化合物的基團(tuán)；和 -是共價(jià)鍵，
其中在A與B之間的連接基和/或在B與C之間的連接基不是通過核酸的重組表達(dá)來 提供的，該核酸包括編碼具有結(jié)構(gòu)A-B-C的融合蛋白的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了下式的化合物A-B-C
A是生長激素化合物的基團(tuán)； B是連接和間隔性二價(jià)殘基； C是生長激素結(jié)合蛋白化合物的基團(tuán)；和 -是共價(jià)鍵， 其中B不是純肽鏈。在本發(fā)明背景中，術(shù)語“化合物”還包括所述化合物的可藥用鹽、前體藥物和溶劑 化物。在本發(fā)明背景下，術(shù)語“可藥用鹽”表示對(duì)患者無害的鹽。這種鹽包括可藥用酸加成 鹽，可藥用金屬鹽，可藥用銨鹽和可藥用烷基化銨鹽。酸加成鹽包括無機(jī)酸以及有機(jī)酸的 鹽。合適無機(jī)酸的代表性例子包括鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，磷酸，硫酸，硝酸等等。合適有機(jī) 酸的代表性的例子包括甲酸，乙酸，三氯乙酸，三氟乙酸，丙酸，苯甲酸，肉桂酸，檸檬酸，富 馬酸，乙二醇酸，乳酸，馬來酸，蘋果酸，丙二酸，扁桃酸，草酸，苦味酸，丙酮酸，水楊酸，琥珀 酸，甲磺酸，乙磺酸，酒石酸，抗壞血酸，雙甲基雙羥萘酸，雙亞甲基水楊酸，乙二磺酸，葡糖 酸，檸康酸，天冬氨酸，硬脂酸，棕櫚酸，EDTA，乙二醇酸，對(duì)氨基苯甲酸，谷胺酸，苯磺酸，對(duì) 甲苯磺酸等等?？伤幱脽o機(jī)或有機(jī)酸加成鹽的進(jìn)一步例子包括列于J. Wiarm. Sci. 1977， 66，2中的可藥用鹽，將其結(jié)合到本文中作為參考。金屬鹽的例子包括鋰、鈉、鉀、鎂鹽，等等。 銨和烷基化銨鹽的例子包括銨、甲基銨、二甲基銨、三甲基銨、乙基銨、羥乙基銨、二乙銨、丁 基銨、四甲銨鹽等等。生長激素(GH)化合物是包括氨基酸序列的肽，該氨基酸序列與SEQ ID No. 1具 有至少80%的同一性，并且這種肽在實(shí)施例7所描述的試驗(yàn)中具有hGH的至少10%的活性 (換言之，GH化合物的EC5tl值小于IOOxhGH的EC5tl)。在一個(gè)實(shí)施方案中，GH化合物的活性 至少是hGH活性的20%，例如至少30%，例如至少40%，例如至少50%，例如至少60%，例如至少 70%，例如至少80%，例如至少90%，例如，基本上與hGH的活性相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長激素化合物是包括氨基酸序列的肽，該氨基酸序列與SEQ ID No. 1具有至少85%的同一性，例如至少90%,例如至少95%，例如至少96%，例如至少 97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本生長激素化合物是這種 肽的片段，該片段保留了大量的上述生長激素活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長激素化合物是包括氨基酸序列的肽，該序列至少與SEQ ID No. 1相似90%,例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少 99%。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長激素化合物是W02006048777、W02004022593、 W02005018659、W02005074524, W02005074546, W02005074650、US5849535、US6136563、 US6022711或US6143523所描述的生長激素類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長激素化合物是hGH。術(shù)語“肽”表示通過肽鍵連接的兩種或多種氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是 天然或非天然的氨基酸。該術(shù)語包括術(shù)語多肽和蛋白，其可以由通過共價(jià)相互作用(例如 半胱氨酸橋)或非共價(jià)相互作用結(jié)合在一起的兩種或多種多肽組成。應(yīng)該理解，該術(shù)語還 包括例如通過親脂性基團(tuán)、PEG或修復(fù)基團(tuán)的連接而已經(jīng)衍生的肽。術(shù)語肽包括任何合適 的肽，并且可以與術(shù)語多肽和蛋白同義使用，除非另有說明，或同上下文相矛盾；條件是，讀者可以認(rèn)識(shí)到，各種含有相應(yīng)氨基酸聚合物的分子可以帶有顯著差別而相關(guān)聯(lián)，并由此形 成本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案(例如，由許多多肽鏈組成的肽(例如抗體)顯著地不同于例如 單鏈抗體、肽免疫粘附素或單鏈免疫原性的肽)。因此，通常應(yīng)該將本文的術(shù)語肽理解為任 何合適大小和組成(相關(guān)于蛋白質(zhì)分子中的氨基酸的數(shù)目和相關(guān)聯(lián)的鏈的數(shù)目)的任何合 適的肽。此外，本文所描述的肽可以包括非天然存在的和/或非L氨基酸的殘基，除非另有 說明或同上下文相矛盾。除非另有說明或同上下文相矛盾，否則，術(shù)語肽(和如果作為術(shù)語多肽和/或蛋白 的各個(gè)實(shí)施方案所討論的肽)還包括被衍生的肽分子。簡要地說，在本發(fā)明的上下文中， 衍生物是其中肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被化學(xué)修飾的肽(例如被烷基化，?；?的形成，或形成酰胺)，或所述氨基酸殘基已經(jīng)與一或多種非氨基酸的有機(jī)和/或無機(jī)原子 或分子取代基(例如聚乙二醇(PEG)基團(tuán)，親脂性的取代基(其任選可以通過間隔殘基或 基團(tuán)例如β-丙氨酸、Y-氨基丁酸(GABA)、L/D-谷氨酸、琥珀酸等等與該肽的氨基酸序 列連接)，熒光團(tuán)，生物素，放射性核素，等等)相關(guān)聯(lián)的肽，并且可以還包括或替代性地包 括非必要的、非天然存在的和/或非-L氨基酸殘基，除非另有說明或同上下文相矛盾(然 而，還應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可以認(rèn)為這種衍生物本身構(gòu)成本發(fā)明的獨(dú)立特征，并且在肽的含義內(nèi)的 這種分子的內(nèi)容是為了方便描述本發(fā)明起見，而不是暗示在裸肽和這種衍生物之間具有任 何同等物種類)。這種氨基酸殘基的非限制性例子包括例如2-氨基己二酸，3-氨基己二 酸，β-丙氨酸，β-氨基丙酸，2-氨基丁酸，4-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基庚酸，2-氨基 異丁酸，3-氨基異丁酸，2-氨基-庚二酸，2，4- 二氨基丁酸，鎖鏈素，2，2’ - 二氨基庚二酸， 2，3-二氨基丙酸，N-乙基甘氨酸，N-乙基天冬酰胺，羥基賴氨酸，別羥基賴氨酸，3-羥基脯 氨酸，4-羥基脯氨酸，異鎖鏈素，別異亮氨酸，N-甲基甘氨酸，N-甲基異亮氨酸，6-Ν-甲基賴 氨酸，N-甲基纈氨酸，戊氨酸，正亮氨酸，鳥氨酸和抑胃酶氨酸鹵代氨基酸。應(yīng)該理解，這種 衍生作用不是本發(fā)明的衍生作用，而是這種衍生作用在本發(fā)明的共軛作用之前已經(jīng)存在于 生長激素化合物中，或在本發(fā)明的共軛作用之后進(jìn)行的衍生作用。本領(lǐng)域已知的術(shù)語“同一性”是指在兩種或多種肽的序列之間的關(guān)系，通過比較 該序列來測定。在本領(lǐng)域，“同一性”還指在肽之間的序列相關(guān)的程度(通過兩個(gè)或多個(gè)氨 基酸殘基串之間的匹配數(shù)目來測定)?！巴恍浴睖y定兩個(gè)或多個(gè)序列和其它序列之間相 同匹配的百分比，具有通過具體數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序(即“算法”)闡明的空位排列(gap alignment)(如果有的話)。相關(guān)肽的同一性可以容易地利用已知的方法來計(jì)算。這種方法 包括但不局限于描述在下列中的那些方法Computational Molecular Biology, Lesk, Α. Μ. , ed. , Oxford University Press, New York, 1988； Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. , ed. , Academic Press, New York, 1993； Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, Α. Μ.,禾口 Griffin, H. G. , eds., Humana Press, New Jersey, 1994； Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987； Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds. , M. Stockton Press, New York, 1991；禾口 Carillo et al. , SIAM J. Applied Math. 48, 1073(1988)。設(shè)計(jì)測定同一性的優(yōu)選方法，以便在試驗(yàn)的序列之間得到最大的匹配程度。測 定同一性的方法描述在可公開獲得的計(jì)算機(jī)程序中。測定兩個(gè)序列之間的同一性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl. Acid. Res. 12’ 387(1984) ；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, Muscle(Edgar, Robert C. , Nucleic Acids Research 32(5), 1792-97((2004)), clustal X and clustal ff(Larkin MA 等人，Bioinformatics 23, 2947-2948(2007)禾口 tcoffee(Notredame, C. , Journal of Molecular Biology 302, 205-217 U000)。BLASTX 程序可公開地得自于 the National Center for Biotechnology Information (NCBI)及其它渠道(BLAST Manual, Altschul 等人 NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul等人，上文)。眾所周知的Smith Waterman算法也可以用于測定同 一性。例如，使用計(jì)算機(jī)算法GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)，將測定百分比序列同一性的兩個(gè)肽進(jìn)行調(diào)整，使它們的相應(yīng)氨 基酸達(dá)到最佳匹配(通過該算法測定的“匹配范圍”)?？瘴婚_放罰分(其是以平均對(duì)角 線的3倍來計(jì)算的；“平均對(duì)角線”是所使用的比較矩陣的對(duì)角線的平均值；“對(duì)角線”是 歸屬于每個(gè)理想氨基酸匹配的評(píng)分或數(shù)目(利用具體比較矩陣))和空位延伸罰分(其 通常是空位開放罰分的{分?jǐn)?shù)(1/10)}倍({fraction (1/10)} times the gap opening penalty))以及比較矩陣?yán)鏟AM 250或BLOSUM 62與該算法結(jié)合使用。該算法還使用標(biāo) 準(zhǔn)的比較失巨陣(參見 Dayhoff 等人，Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5， supp. 3 (1978) for the PAM 250 comparison matrix ;Henikoff 等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 89,10915-10919(1992)for the BLOSUM 62 comparison matrix)。肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括下列
算法Needleman 等人，J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)；比較矩陣BLOSUM 62， 得自于Henikoff等人，PNAS USA 89, 10915-10919(1992)；空位罰分12，空位長度罰 分4，相似性閾值0。GAP程序使用上述參數(shù)。上述參數(shù)是使用GAP算法的肽比較的缺省參數(shù)(以及終 端空位不罰分)。術(shù)語“相似性”是與同一性有關(guān)的概念，但與“同一性”相反，其是指包括相同匹配 和保守置換匹配兩者的序列關(guān)系。如果兩個(gè)多肽序列具有例如(分?jǐn)?shù)(10/20))相同的氨 基酸，其余的都是非保守置換的氨基酸，則同一性和相似性兩者的百分比都是50%。在相同 的實(shí)施例中，如果有5個(gè)另外的位置存在保守置換，則同一性百分比仍然是50%，但相似性 百分比是75%(分?jǐn)?shù)(15/20))。因此，如果有保守置換，則在兩個(gè)多肽之間的相似度比在那 兩個(gè)多肽之間的同一性百分比高。保守性修飾包括SEQ ID No. 1的氨基酸序列的肽(和對(duì)編碼核苷酸的相應(yīng)修飾) 將會(huì)產(chǎn)生具有與包括SEQ ID No. 1的氨基酸序列的肽的功能和化學(xué)特性相似的肽。與此相 反，與包括SEQ ID No. 1的氨基酸序列的肽相比較，對(duì)按照本發(fā)明的肽的功能和/或化學(xué) 特性方面顯著修飾可以通過在氨基酸序列中選擇取代來實(shí)現(xiàn)，它們?cè)谄鋵?duì)保持下列的效果 方面具有顯著差別(a)在取代的區(qū)域內(nèi)的分子骨架的結(jié)構(gòu)，例如，薄片或螺旋構(gòu)造形式， (b)分子在靶向位點(diǎn)的帶電性或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積(bulk)。例如，“保守的氨基酸取代”可以包括帶有非天然殘基的天然氨基酸殘基的取代， 使得對(duì)該位置的氨基酸殘基的極性或帶電性有很小的效果或沒有效果。此外，多肽中的任何天然殘基還可以被丙氨酸取代，正如先前所描述的“丙氨酸掃描誘變”那樣(參見，例如， MacLennan et al. , Acta Physiol. Scand. Supp 1. 643’ 55-67(1998); Sasaki 等人， Adv. Biophys. 35, 1-24(1998)，其討論了丙氨酸掃描誘變)。當(dāng)希望進(jìn)行這種取代的時(shí)候，目標(biāo)氨基酸取代(不論是保守的或非保守的取代) 可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。例如，氨基酸取代可用于鑒定按照本發(fā)明的肽的重要的殘 基，或提高或降低本文所描述肽對(duì)受體的親合性，還有已經(jīng)描述的突變?；诔Ｒ姷膫?cè)鏈性能，可以將天然存在的殘基分類
1)疏水性的正亮氨酸，Met,Ala, Val, Leu, lie ；
2)中性親水性的半胱氨酸，Ser,Thr，Asn, Gln ；
3)酸性的Asp，Glu；
4)堿性的His,Lys, Arg ；
5)影響鏈取向的殘基Gly，Pro；和
6)芳香化的Trp，Tyr，Phe。在產(chǎn)生這種變化的過程中，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)?；诎被岬氖杷?和帶電特征，可以賦予每個(gè)氨基酸親水指數(shù)，這些是異亮氨酸(+4. ；纈氨酸(+4.2)； 亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸 (+1. 8)；甘氨酸(-0. 4)；蘇氨酸(-0. 7)；絲氨酸(-0. 8)；色氨酸(-0. 9)；酪氨酸(-1. 3)；脯 氨酸(-1.6)；組氨酸(-3. 2)；谷氨酸(-3. 5)；谷氨酰胺(-3. 5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰 胺("3. 5)；賴氨酸(-3. 9)；和精氨酸(-4. 5)。本領(lǐng)域了解親水氨基酸指數(shù)在對(duì)蛋白賦予交互性生物功能的重要性。Kyte等人， J. Mol. Biol., 157，105-131(1982)。眾所周知，某些氨基酸可以代替具有類似親水指數(shù) 或評(píng)分的其它氨基酸，并且還保留類似的生物活性。在基于親水指數(shù)產(chǎn)生的變化中，優(yōu)選親 水指數(shù)在士2范圍之內(nèi)的氨基酸的取代，尤其優(yōu)選在士 1范圍之內(nèi)，更尤其優(yōu)選在士0. 5范 圍之內(nèi)。蛋白的最大局部平均親水性(取決于它的相鄰氨基酸的親水性)與它的免疫原性 和抗原性有關(guān)，即與蛋白的生物學(xué)性質(zhì)有關(guān)。下列親水值賦予下列氨基酸殘基精氨酸(+3.0)；賴氨酸(’ 3.0)；天冬氨酸 (+3. 0 士 1)；谷氨酸(+3. 0 士 1)；絲氨酸(+0. 3)；天冬酰胺(+0. 2)；谷氨酰胺(+0. 2)；甘氨酸 (0)；蘇氨酸(-0. 4)；脯氨酸(-0. 5 士 1)；丙氨酸(-0. 5)；組氨酸(-0. 5)；半胱氨酸(-1. 0)； 甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙 氨酸(-2. 5)；色氨酸(-3. 4)。在基于類似的親水性值所產(chǎn)生的變化中，優(yōu)選親水性值在士2 范圍之內(nèi)的氨基酸的取代，尤其優(yōu)選在士 1范圍之內(nèi)，更尤其優(yōu)選在士0. 5范圍之內(nèi)。本發(fā)明的肽還可以包括非天然存在的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，B不包括肽鏈。應(yīng)該將本發(fā)明上下文中的肽鏈理解為連續(xù)肽 鍵，其是由通過酰胺鍵連接的氨基酸殘基組成的鏈。應(yīng)該理解，B的實(shí)際結(jié)構(gòu)不是本發(fā)明的主要特征。當(dāng)使本發(fā)明共軛物的生物學(xué)特 性最佳化時(shí)，連接基的長度和性質(zhì)由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。B可以例如包括至少10個(gè)共價(jià)鍵，B還可以由重復(fù)的C-S-C、C-O-C或C_C_C單元 組成，例如，聚乙二醇分子(PEG)形式。術(shù)語“聚乙二醇”、“Peg”或“PEG”(聚(乙二醇)) 是指下列結(jié)構(gòu)的多分散或單分散的雙自由基
權(quán)利要求
1.具有下式的化合物 A-B-CA是生長激素化合物的基團(tuán)； B是連接和間隔性二價(jià)殘基； C是生長激素結(jié)合蛋白化合物的基團(tuán)；和 -是共價(jià)鍵，其中在A與B之間的連接基和/或在B與C之間的連接基不是通過核酸的重組表達(dá)來 提供的，該核酸包括編碼具有結(jié)構(gòu)A-B-C的融合蛋白的核酸序列。
2.具有下式的化合物 A-B-CA是生長激素化合物的基團(tuán)； B是連接和間隔性二價(jià)殘基； C是生長激素結(jié)合蛋白化合物的基團(tuán)；和 -是共價(jià)鍵， 其中B不是純肽鏈。
3.按照權(quán)利要求1至2的任一項(xiàng)的化合物，其中共價(jià)鍵A-C或B-C中的至少一個(gè)是通 過酶形成的。
4.按照權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的化合物，其中B包括至少10個(gè)共價(jià)鍵。
5.按照權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的化合物，其中B包括PEG單元，其中B任選包括下列 結(jié)構(gòu)
6.按照權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)的化合物，其中B選自 -CH2-CH2-,
7.按照權(quán)利要求3的下式化合物
8.按照權(quán)利要求3的式(I)化合物
9.藥物組合物，其包含按照權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的化合物和可藥用載體。
10.治療哺乳動(dòng)物疾病狀態(tài)的方法，對(duì)于這種疾病狀態(tài)哺乳動(dòng)物可以從生長激素的活 性提高而受益，該方法包括給予該哺乳動(dòng)物有效量的按照權(quán)利要求9的藥物組合物。
11.制備按照權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的化合物的方法，所述方法包括(a)生長激素化合物的酶催衍生化，和(b)使步驟(a)的酶催衍生的生長激素化合物與生長激素結(jié)合蛋白化合物共軛。
12.制備按照權(quán)利要求3的化合物的方法，該方法包括i) 在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的存在下，使生長激素化合物與具有下式的第一個(gè)化合物接 觸R7GlnGlyR8,其中R7和R8是適合于進(jìn)一步修飾的基團(tuán)，和 )在一個(gè)或多個(gè)步驟中，使步驟i)的產(chǎn)物與包含一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的第二個(gè)化合 物反應(yīng)，其中所述官能團(tuán)不與構(gòu)成所述肽的氨基酸殘基中易受影響(accessible)的官能團(tuán) 反應(yīng)，且其中在所述第二個(gè)化合物中的所述官能團(tuán)能夠與R7和/或R8反應(yīng)，使得在步驟i) 的產(chǎn)物和所述第二個(gè)化合物之間形成共價(jià)鍵，和其中所述第二個(gè)化合物包含生長激素結(jié)合 蛋白化合物的基團(tuán)。
13.制備按照權(quán)利要求7的化合物的方法，其中所述方法包括下列步驟i) 在一個(gè)或多個(gè)步驟中，在能夠?qū)⑺龅谝粋€(gè)化合物催化結(jié)合到所述生長激素化合 物中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的存在下，使生長激素化合物與包含一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)或潛在官能團(tuán) 的第一個(gè)化合物反應(yīng)，形成官能化的生長激素化合物，其中所述官能團(tuán)或潛在官能團(tuán)在構(gòu) 成所述生長激素化合物的任何氨基酸殘基中不是易受影響的(not accessible)；和 )任選將潛在的官能團(tuán)活化；和iii) 在一個(gè)或多個(gè)步驟中，使所述官能化的生長激素化合物與包含一個(gè)或多個(gè) 官能團(tuán)的第二個(gè)化合物反應(yīng)，其中所述官能團(tuán)不與構(gòu)成所述肽的氨基酸殘基中易受影響 (accessible)的官能團(tuán)反應(yīng)，且其中在所述第二個(gè)化合物中的所述官能團(tuán)能夠與在所述第 一個(gè)化合物中的所述官能團(tuán)反應(yīng)，使得在所述官能化的肽和所述第二個(gè)化合物之間形成共 價(jià)鍵，和其中所述第二個(gè)化合物包含生長激素結(jié)合蛋白化合物的基團(tuán)。
14.制備按照權(quán)利要求8的化合物的方法，所述方法包括下列步驟(a)用改變性能的基團(tuán)衍生的苯胺或雜芳基胺來處理衍生自生長激素化合物的醛或 酮，得到亞胺或α “氨基醇(hemiaminal )，其中所述改變性能的基團(tuán)包括生長激素結(jié)合蛋 白或其片段，(b)用合適還原劑例如NaCNBH3處理這種亞胺或α-氨基醇(hemiaminal )，得到仲胺。
15.式(III)的化合物，
全文摘要
公開了新的生長激素共軛物，其包括生長激素化合物(GH)和生長激素結(jié)合蛋白(GHBP)。本發(fā)明還包括通過位點(diǎn)特異性共軛作用來制備穩(wěn)定、持久共軛物(hGH-GHBP)的新衍生化方法。新的GH-GHBP共軛物在促進(jìn)蛋白的治療應(yīng)用的循環(huán)中具有延長的半衰期。GH-GHBP共軛物顯示出藥理學(xué)性能，例如，功能性的體內(nèi)半衰期提高，腎過濾增加，蛋白酶保護(hù)作用提高和白蛋白結(jié)合增加。
文檔編號(hào)C07K14/475GK102149726SQ200980135017
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日
發(fā)明者N·L·約翰森 申請(qǐng)人:諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司