專利名稱：有機(jī)銅絡(luò)合物及其作為抗癌劑和用于保護(hù)正常組織免受電離輻射的用途的制作方法
有機(jī)銅絡(luò)合物及其作為抗癌劑和用于保護(hù)正常組織免受電
離輻射的用途本發(fā)明涉及有機(jī)銅絡(luò)合物以及包含該有機(jī)銅絡(luò)合物的藥用組合物。它們尤其可 用于治療由過度增生細(xì)胞引起的疾病，且可保護(hù)正常組織免受電離輻射。它們是通過使 丙烯酸銅(copper (II)acyIate)與有機(jī)化合物在氯仿/甲醇混合物中在酸性至中性pH條 件下反應(yīng)制得的，該有機(jī)化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(溶肉瘤素)、 其氫氯化物、N-(2-furanidil)-5-氟尿嘧啶(tegafur，替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶 (Ieacadin)0過度增生細(xì)胞是引起各種疾病的原因，特別是由術(shù)語“癌”概述的臨床型疾病，這 些疾病通常具有致命結(jié)果。過度增生在組織結(jié)構(gòu)中造成組織新生與細(xì)胞可控死亡之間的不 平衡。天然的體內(nèi)平衡發(fā)生紊亂。在組織形成與退化之間的微妙平衡是由細(xì)胞凋亡過程調(diào) 節(jié)的。細(xì)胞凋亡是指可由任何細(xì)胞進(jìn)行的程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞受到特定信號的反應(yīng)刺激 后，激活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程，該進(jìn)程在未引起炎性過程的情況下造成細(xì)胞的自衰變。這樣，可避免 細(xì)胞和組織的過度增生。對于治療由過度增生細(xì)胞引起的疾病，除了外科切除可定域的腫瘤之外，在臨床 實(shí)踐中還正嘗試通過諸如化學(xué)療法、放射療法和高熱療法的細(xì)胞毒素方法摧毀腫瘤細(xì)胞和 重建平衡。然而，已發(fā)現(xiàn)有部分惡性腫瘤在相當(dāng)早的階段逐漸具有輻射或化學(xué)抗性，甚至起 初難以醫(yī)治。腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移在其對特殊治療的響應(yīng)性能方面有時(shí)相當(dāng)不同。由于這 樣的抗性，很多癌的治療效果始終不能令人滿意。對于治療兒童期急性成淋巴細(xì)胞性白血 病(acute lymphoblasticleukemia,ALL)的復(fù)發(fā)尤其如此。盡管使用具有攻擊性的細(xì)胞毒 素療法，仍有約60%身患ALL復(fù)發(fā)的孩子死亡。其他難以醫(yī)治的腫瘤疾病例如還有乳腺腫 瘤、支氣管腫瘤、甲狀腺腫瘤、前列腺腫瘤、以及黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、星 細(xì)胞瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。同樣地，使用細(xì)胞生長抑制藥物可治療由過度增生細(xì)胞引起的良 性狀況，但仍需顯著提高這些細(xì)胞生長抑制藥物的療效。在WO 03/004014A1中已描述美法侖(Melphalan，苯丙氨酸氮芥)、替加氟和 leacadin的單晶二酮銅絡(luò)合物，這些絡(luò)合物可用作抗癌劑。此外，美法侖(Melphalan，苯丙 氨酸氮芥)、替加氟和leacadin本身就是細(xì)胞生長抑制劑。然而，人們對開發(fā)出其他能夠有助于提高治療成功率和提高生存可能性的活性物 質(zhì)具有濃厚興趣和強(qiáng)烈需求。因此，本發(fā)明旨在發(fā)現(xiàn)某些化合物，這些化合物對于過度增生 的耐藥細(xì)胞具有高度選擇性，且適用于治療腫瘤疾病和白血病，而不會對正常細(xì)胞造成過 度傷害。本發(fā)明的另一目的是提供一些在對人體進(jìn)行電離輻射的治療期間可保護(hù)正常組織 的化合物，以治療疾病或延緩病情發(fā)展?？赏ㄟ^新的有機(jī)銅絡(luò)合物實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，該新有機(jī)銅絡(luò)合物可通過由丙烯酸 銅與有機(jī)化合物在氯仿/甲醇混合物中在酸性至中性的PH條件下反應(yīng)獲得。根據(jù)本發(fā)明， 所述有機(jī)化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(D，L-苯丙氨酸氮芥，溶肉瘤素) 及其氫氯化物、N-(2-fUranidil)-5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶(2-氨基甲 酰氮丙啶，leacadin) 0在一優(yōu)選方式中，丙烯酸銅優(yōu)選采用醋酸銅(II)或丙酸銅(II)。
人們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的有機(jī)銅絡(luò)合物對于過度增生的耐藥細(xì)胞具有高度選擇 性，適用于治療腫瘤疾病和白血病。令人驚奇的是，它們也能夠例如在腫瘤切除后的放射治 療期間或在腫瘤照射治療中保護(hù)正常組織免受輻射損害，因此可用于放射療法。此外，人們 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)本發(fā)明所述的有機(jī)銅絡(luò)合物與已知的細(xì)胞生長抑制劑結(jié)合時(shí)，還能在癌的治療中 顯示出協(xié)同效應(yīng)。此外，本發(fā)明所述的有機(jī)銅絡(luò)合物顯示出顯著的抗氧化活性，因此也可在 例如與腫瘤疾病有關(guān)的炎性疾病的治療中用作抗氧化劑。本發(fā)明所述的銅絡(luò)合物優(yōu)選通過混合和加熱起始物料的溶液的方式制得。絡(luò)合物 在冷卻時(shí)沉淀析出，可使用由氯仿/甲醇混合物作為溶劑的洗液反復(fù)對其清洗凈化，并隨 后使之干燥。為使反應(yīng)順利進(jìn)行，必須保持從酸性至中性環(huán)境的PH值范圍。這些絡(luò)合物是 微晶結(jié)構(gòu)的化合物，其中銅處于四面體中，且有機(jī)化合物通過氧和/或氮原子與銅鍵合。本發(fā)明所述的方法具有以下優(yōu)選特點(diǎn)，即將丙烯酸銅和有機(jī)化合物均溶于氯仿/ 甲醇混合物中，且該有機(jī)化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(溶肉瘤素)、 其氫氯化物、N-(2-furanidil)-5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶(leacadin)。 在反應(yīng)結(jié)合后，必要時(shí)使溶液酸化，且優(yōu)選加熱至50°C，可選加熱至沸騰。必要時(shí)清洗在冷 卻之后生成的沉淀物，且優(yōu)選在空氣中使之干燥。氯仿/甲醇混合物的比例優(yōu)選為1 1 至 3 1。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選提供下列有機(jī)銅絡(luò)合物a)銅-溶肉瘤素氫氯化物絡(luò)合物(絡(luò)合物A)，熔點(diǎn)為147°C，包含15.0% Cu、 37. 3% C、4. 43% H、24. 4% Cl,6. 74% N、以及0，如通過溶肉瘤素氫氯化物與醋酸銅(II)在 PH約為2至3的條件下反應(yīng)制得。b)銅-溶肉瘤素絡(luò)合物(絡(luò)合物B)，熔點(diǎn)為177°C，包含9. 2% Cu、45. 3% C、5. 4% H、20. 6% Cl,8. 1% N、以及0，如通過溶肉瘤素與醋酸銅(II)在pH約為6至7的條件下反
應(yīng)制得。c)銅-替加氟絡(luò)合物(絡(luò)合物C)，熔點(diǎn)為127 °C，包含26. 8% Cu、18. 16 % C, 3. 08% H、25. 3% Cl,3. 39% N、以及0和F，如通過替加氟與醋酸銅(II)在pH約為1的條 件下反應(yīng)制得。這些碳、氮和氯的元素分析值的偏差平均小于3%，且所引述的氫和銅的分析值的 偏差平均最高達(dá)4.5%。本發(fā)明也旨在提供一種藥用組合物，該藥用組合物包含至少一種新的有機(jī)銅絡(luò)合 物、以及可選藥用助劑和/或輔料。采用已知的方法制備所述藥用組合物，且本發(fā)明所述的絡(luò)合物優(yōu)選與適當(dāng)?shù)乃幬?輔料結(jié)合。該組合物中活性物質(zhì)的含量通常為0. 1%至99.5% (以重量百分比計(jì))，優(yōu)選為 總混合物的0. 5%至95% (以重量百分比計(jì))。本發(fā)明所述的藥用組合物可具有不同的給藥形式。它通常包含至少一種本發(fā)明所 述的絡(luò)合物以及無毒的藥用耐受輔料，這些無毒的藥用耐受輔料例如以固體、半固體或液 體的形式呈現(xiàn)為混合物或稀釋液，或者例如以容納治療性活性成分的膠囊外囊、片劑包衣、 包袋或其他容器形式的涂層劑。輔料例如可以是為體內(nèi)藥物吸收的介質(zhì)，或者制劑助劑、甜 味劑、矯味劑、染料或防腐劑。本發(fā)明所述的藥用組合物的給藥途經(jīng)主要有口服、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、腹內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)過皮膚或肌肉內(nèi)，或使用微灌腸劑的給藥形式。也可能采取肺部給藥形式。所述藥用組合物的腸胃外給藥可使用無菌注射水溶液、等滲鹽溶液或其他溶液。水性懸浮液中可包含諸如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基纖維素、藻酸鈉、 聚乙烯吡咯烷酮、黃芪膠或阿拉伯樹膠的助懸劑、諸如聚氧乙烯硬脂酸酯、十七乙烯基氧化 十六烷醇(h印tadecaethyleneoxycetanol)、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯或卵磷脂的分散 劑和潤濕劑、諸如羥基苯甲酸甲酯或羥基苯甲酸丙酯的防腐劑、以及諸如蔗糖、環(huán)拉酸鈉、 葡萄糖、轉(zhuǎn)化糖漿的調(diào)味劑和甜味劑。油性懸浮液中例如可包含花生油、橄欖油、芝麻油、椰子油或石蠟油，還可包含諸 如蜂臘、固體石蠟或十六烷醇的增稠劑，以及甜味劑、調(diào)味劑和抗氧化劑。水分散性粉末和顆粒中可包含本發(fā)明所述的絡(luò)合物，它們與分散劑、潤濕劑和助 懸劑構(gòu)成混合物，例如如上所述，可選還混合有甜味劑、調(diào)味劑和染料。除了諸如黃芪膠、阿拉伯樹膠、聚氧乙烯山梨坦單油酸酯的乳化劑之外，乳狀液中 例如還可包含花生油、橄欖油或石蠟油、以及調(diào)味劑和甜味劑。水溶液中可包含諸如羥基苯甲酸甲酯或羥基苯甲酸丙酯的防腐劑、以及增稠劑和 調(diào)味劑，還可包含諸如蔗糖、甜蜜素、葡萄糖、轉(zhuǎn)化糖漿的甜味劑、以及著色劑。優(yōu)選將橄欖油、DMS0、吐溫(TWEEN) 60或80或生理鹽水用作稀釋液和溶劑。例如，容納諸如明膠、分散性粉末、顆粒、水性和油性懸浮液、乳狀液、溶液或糖漿 的片劑、包衣片劑、膠囊可用于口服。片劑中可包含諸如淀粉、乳糖、微晶纖維素、葡萄糖、碳 酸鈣或氯化鈉的惰性填充劑、諸如淀粉PEG、PVP、明膠、纖維素衍生物、藻酸鹽或阿拉伯樹膠 的粘合劑、諸如硬脂酸鎂、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、硅油或滑石粉的潤滑劑、以及崩解劑、 矯味劑或著色劑。對于口服，所述藥用組合物優(yōu)選以在油中微細(xì)分散的形式存在，或作為靜脈注射 液或輸液，或使用片劑形式。令人驚奇的是，所述有機(jī)銅絡(luò)合物即使在口服中也仍能發(fā)揮它 們的全部療效，這意味著它對于治療和減輕病人的病情具有相當(dāng)大的優(yōu)勢。有利地，可將活性物質(zhì)的藥物制劑調(diào)整至所需給藥的單位劑量形式。例如，單位劑 量可以是片劑、膠囊、栓劑或適當(dāng)體積的粉末、顆粒、溶液、乳狀液或懸浮液或分散體。本發(fā)明所述絡(luò)合物的每日劑量大體上為0. 01至10mg/kg體重，可選使用多個(gè)單劑 量形式，以獲得所需效果。單劑量中包含數(shù)量在0. 01至10mg/kg體重之間的絡(luò)合物。人們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的銅絡(luò)合物幾乎只在腫瘤組織中累積，此外還能穿越血腦 屏障。因此，新的有機(jī)銅絡(luò)合物優(yōu)選用于若干腫瘤疾病的治療中。本發(fā)明所述的化合物可用 于各種不同疾病的治療中，尤其是由高度增生細(xì)胞引起的疾病，例如可用于骨髓和其他造 血器官、白血病、固體腫瘤、上皮腫瘤、肉瘤以及惡性和半惡性皮膚病的惡性疾病治療中。本 發(fā)明所述的絡(luò)合物可強(qiáng)烈誘發(fā)癌細(xì)胞的凋亡，即使這些細(xì)胞對于傳統(tǒng)治療劑具有抗性。它 們在惡性細(xì)胞中可誘導(dǎo)P53蛋白質(zhì)的表達(dá)、以及環(huán)孢菌素A孔的開啟。例如，在對道諾霉素和阿霉素具有抗性的白血病細(xì)胞中，本發(fā)明所述的有機(jī)銅絡(luò) 合物與傳統(tǒng)細(xì)胞毒素劑相比可使對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效果增加二至六倍(參見例5和圖12)。另一優(yōu)選用途是用于放射療法中，主要用于保護(hù)正常組織免受電離輻射。放射療 法(也稱為放射法、放射線療法、放射腫瘤法)是一種將電離輻射在人體和動物體上進(jìn)行醫(yī) 學(xué)應(yīng)用、以治療疾病或延緩病情發(fā)展的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。放射療法的目的是直接摧毀腫瘤細(xì)胞。放射療法領(lǐng)域也包括為實(shí)現(xiàn)放射敏化作用和加強(qiáng)對腫瘤的輻射效果而采用的藥物性和物理 性方法(化、放療)，同時(shí)考慮到對正常組織的保護(hù)措施。伽瑪射線、X射線軔致輻射和電子 主要用于高能電離輻射。此外，近幾年已研制出使用中子、質(zhì)子和重離子治療的儀器。根據(jù) 本發(fā)明，所述有機(jī)銅絡(luò)合物用于保護(hù)正常組織，且可選與眾所周知的放射療法措施和方法 結(jié)合。為此，可根據(jù)上述給藥形式和劑量使用本發(fā)明所述的絡(luò)合物。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述有機(jī)銅絡(luò)合物可與至少一種另外的細(xì)胞生長抑制 劑結(jié)合使用(腫瘤治療劑)。更明確地，本發(fā)明所述的有機(jī)銅絡(luò)合物適用于治療下列腫瘤疾病，為此它們可單 獨(dú)使用、或與放射療法措施/方法結(jié)合使用、以及/或與傳統(tǒng)腫瘤劑結(jié)合使用腸癌、腦部腫 瘤、眼部腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、卵巢腫瘤、子宮頸腫瘤、皮膚癌、睪丸癌、腎腫瘤、 生殖細(xì)胞腫瘤、肝癌、白血病、惡性淋巴瘤、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、前列腺癌、軟組織腫瘤、 食道癌、以及未知的原發(fā)性腫瘤。在一優(yōu)選方式中，使身患腫瘤疾病的病人服用劑量足以治療各個(gè)腫瘤的所述藥用 組合物。所述藥用組合物的服用劑量取決于許多因素，例如特定銅絡(luò)合物和可選其他絡(luò)合 物的選擇、同時(shí)服用的藥物、給藥方式(口服、輸液、注射等)、腫瘤疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、 以及病人的年齡、重量和一般狀況。腫瘤疾病領(lǐng)域的醫(yī)務(wù)人員在考慮上述因素的情況下容 易確定劑量。通常優(yōu)選在單劑量治療期間服用所述銅絡(luò)合物，該單劑量在0. 01至10mg/kg 病人體重的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0. 5至5mg/kg病人體重的范圍，尤其優(yōu)選在0. 5至1. 5mg/kg 病人體重的范圍。在此所用的術(shù)語“腫瘤”包括任何組織體積的局部增大，且包括生長調(diào)節(jié)不再正 常、并發(fā)生不受控制的細(xì)胞分裂的細(xì)胞，即以同體組織的自發(fā)的、各種不受抑制的、自主的 和不可逆性過度生長的形式形成的組織新生物(例如腫大、胚細(xì)胞瘤、瘤形成)，通常與特 定細(xì)胞和組織功能的不同顯著性喪失有關(guān)。在此使用的術(shù)語“腫瘤治療”至少包括下列特征之一減輕與腫瘤疾病有關(guān)的癥 狀、降低腫瘤疾病的嚴(yán)重程度(例如減緩腫瘤的生長)、穩(wěn)定腫瘤疾病的狀況(例如阻止腫 瘤的生長)、進(jìn)一步避免腫瘤疾病的擴(kuò)散(例如轉(zhuǎn)移)、避免腫瘤疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減慢腫 瘤疾病的病情發(fā)展(例如減緩腫瘤的生長)、或改善腫瘤疾病的狀況(例如減小腫瘤的大 小)?？赏ㄟ^制備方法、元素分析、熔點(diǎn)、以及UV/VIS、IR、EPR和NMR光譜清楚地表征本 發(fā)明所述物質(zhì)的特性。本發(fā)明所述的絡(luò)合物許多重要性能具有顯著優(yōu)勢，由此明顯優(yōu)于傳 統(tǒng)的化療劑。本發(fā)明所述的銅絡(luò)合物幾乎只在腫瘤組織中累積，從而使本發(fā)明所述絡(luò)合物的治 療副作用較低。此外，這使得有可能使用本發(fā)明所述的絡(luò)合物檢測惡性細(xì)胞。因此，當(dāng)使用 本發(fā)明所述的絡(luò)合物和諸如熒光顯微鏡技術(shù)的傳統(tǒng)方法時(shí)，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的適當(dāng)熒光染料標(biāo)記本發(fā)明所述的絡(luò)合物，可檢測出組織中的惡性細(xì)胞。同樣地，可使用本 發(fā)明所述的絡(luò)合物在體外檢測出分離組織中的惡性細(xì)胞。本發(fā)明所述的絡(luò)合物能夠穿越血腦屏障，因此也可用于治療腦部腫瘤。此外，本發(fā) 明所述的有機(jī)銅絡(luò)合物可用于包被腫瘤，從而有助于對該腫瘤的外科切除。本發(fā)明也旨在提供組合制劑，該組合制劑中包含本發(fā)明所述的銅絡(luò)合物、以及就其本身而言已知的細(xì)胞生長抑制劑，例如阿糖胞苷、克拉屈濱、依托泊苷、氟達(dá)拉濱或伊達(dá) 比星。本發(fā)明所述的有機(jī)銅絡(luò)合物當(dāng)與其他傳統(tǒng)的細(xì)胞生長抑制劑結(jié)合使用時(shí)具有以下優(yōu) 點(diǎn)，即與使用單制劑相比可顯著增強(qiáng)協(xié)同效應(yīng)。因此，根據(jù)本發(fā)明，將有機(jī)銅絡(luò)合物與傳統(tǒng) 的細(xì)胞生長抑制劑結(jié)合使用?？赏瑫r(shí)或連續(xù)服用兩個(gè)成分的組合制劑。傳統(tǒng)細(xì)胞毒素劑優(yōu) 選選自諸如氮芥衍生物、N-亞硝基化合物、環(huán)乙亞胺(氮丙啶)衍生物、鉬絡(luò)合物的烷基化 和交聯(lián)化合物、諸如蒽環(huán)類、博來霉素和絲裂霉素的細(xì)胞生長抑制性抗生素、諸如葉酸拮抗 劑、嘧啶和嘌呤類似物的抗代謝物、諸如長春花生物堿和紫杉烷的抗有絲分裂物質(zhì)、以及荷 爾蒙和荷爾蒙拮抗劑。因此，例如，人們發(fā)現(xiàn)，銅-溶肉瘤素氫氯化物(絡(luò)合物A)與抗代謝物即阿糖胞苷 (AraC)的組合可使療效提高129%。值得注意的是，低于治療劑量的本發(fā)明所述絡(luò)合物A 已顯示出協(xié)同效應(yīng)(參見例7和圖14)。因此，本發(fā)明所述的組合制劑理想地適用于對腫瘤疾病的治療。由于在制劑中存 在本發(fā)明所述的絡(luò)合物，該組合制劑也可在放射治療期間用于保護(hù)正常組織。與附圖結(jié)合的下列例子旨在更詳細(xì)地說明本發(fā)明。


圖1 絡(luò)合物A的衍射分析
圖2:絡(luò)合物A的UV/VIS光譜
圖3:絡(luò)合物A的IR光譜
圖4 絡(luò)合物A的Era光譜
圖5:絡(luò)合物B的UV/VIS光譜
圖6 絡(luò)合物B的IR光譜
圖7:絡(luò)合物B的Era光譜
圖8 絡(luò)合物C的UV/VIS光譜
圖9 絡(luò)合物C的IR光譜
圖10絡(luò)合物C的Era光譜
圖11在BJAB模型組上使用絡(luò)合物A發(fā)生的DNA片段
圖12絡(luò)合物A與其他細(xì)胞生長抑制劑之間在初級成淋巴細(xì)胞中DNA片段方面的比較
圖13在使用絡(luò)合物A治療后BJAB細(xì)胞中線粒體膜電勢的變化
圖14在淋巴瘤細(xì)胞中絡(luò)合物A與阿糖胞苷的協(xié)同效應(yīng)
圖15在對小鼠的口服給藥中絡(luò)合物A對人類淋巴瘤細(xì)胞(BJAB)的效應(yīng)
圖16當(dāng)使用絡(luò)合物A治療時(shí)Walker癌肉瘤的ETO光譜
圖17絡(luò)合物A和C對患Ehrlich腹水癌的大鼠的胸腺細(xì)胞的NADH狀態(tài)和鈣體內(nèi)平衡的影響
圖18以小鼠的脾為例說明絡(luò)合物A和C對電離輻射效應(yīng)的影響
圖19絡(luò)合物A和C的抗氧化劑性能
圖20與溶肉瘤素相比絡(luò)合物A對環(huán)孢菌素A傳感孔的誘導(dǎo)
圖21絡(luò)合物A對人體喉癌Hep-2的細(xì)胞培養(yǎng)的影響(核磁共振)
圖22 絡(luò)合物A對人體乳腺癌細(xì)胞的體外影響(照片1 在4分鐘培育之后；照片 4 在18分鐘培育之后；照片9 在43分鐘培育之后)
實(shí)施例例 1制備4_[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸氫氯化物(即溶肉瘤素氫氯化物)的 有機(jī)銅絡(luò)合物(絡(luò)合物A)將0. 0125mol的溶肉瘤素氫氯化物溶于50ml的由1份甲醇與3份氯仿構(gòu)成的混 合物中(溶液A)。將0. Olmol的醋酸銅(II)同樣溶于50ml的上述混合溶劑中(溶液B)。將溶液B加入到溶液A中，并連續(xù)攪拌和加熱至沸騰溫度。將該混合物繼續(xù)保持 在沸騰溫度達(dá)30分鐘，同時(shí)攪拌，并隨后冷卻至室溫?；旌衔锏膒H值為2至3。在幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)沉淀析出綠色微晶沉淀物，隨后使用玻璃粉過濾分離該沉淀物， 再使用上述混合溶劑清洗幾次，并在空氣中在65°C至70°C下干燥。生成的銅絡(luò)合物(絡(luò)合物A)是微晶粉末，熔點(diǎn)為147°C。由元素分析顯示出下列 成分:Cu 15. 0%, C 37. 3%, H 4. 43%, CI 24. 4%, N 6. 74%, 0 10. 3%0圖1至圖4中顯示絡(luò)合物A的其他物理性能。絡(luò)合物A不溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑中。它溶于二甲基亞砜 (dimethylsulfoxide,DMSO)中，可在植物油中乳化，且可借助于適當(dāng)乳化劑(吐溫60和吐 溫80)在水介質(zhì)中乳化。即使暴露在氧氣中，它在室溫下也是穩(wěn)定的。M 2制備4_[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(=溶肉瘤素)的有機(jī)銅絡(luò)合物(絡(luò) 合物B)將0. 0125mol的溶肉瘤素溶于50ml的由3份氯仿與1份甲醇構(gòu)成的混合物中(溶 液A)。將0. Olmol的醋酸銅(II)溶于50ml的上述混合溶劑中(溶液B)。將溶液B加入到溶液A中，并連續(xù)攪拌和加熱。將該混合物保持在50°C達(dá)約20分 鐘，同時(shí)攪拌，并隨后冷卻至室溫。混合物的PH值為6至7。在幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)沉淀析出藍(lán)色微晶沉淀物，使用玻璃粉過濾該沉淀物，并使用溶 劑清洗幾次，且在空氣中在65°C至70°C下干燥。生成的銅絡(luò)合物(絡(luò)合物B)是微晶粉末，熔點(diǎn)為177°C。由元素分析顯示出下列 成分:Cu 9. 2%, C 45. 3%, H :5. 4%, CI -.20. 6%, N :8. 1%, 0 :11. 6%0圖5至圖7中顯示絡(luò)合物B的其他物理性能。絡(luò)合物B不溶于水和許多有機(jī)溶劑中。它溶于DMS0中，可分散在油中，且可借助 于適當(dāng)乳化劑(Tween 60和吐溫80)在水介質(zhì)中乳化。例 3銅絡(luò)合物(絡(luò)合物C)5-氟_1-(四氫-2-呋喃)尿嘧啶(=替加氟)的制備變異體1將0. Olmol的醋酸銅(II)溶于50ml的氯仿中(溶液A)。
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將0. 02mol的替加氟溶于50ml的由氯仿與甲醇按體積比1 1構(gòu)成的混合物中 (溶液B)。在水浴中將溶液A和溶液B加熱至沸騰，同時(shí)連續(xù)攪拌和使用鹽酸酸化。允許將 該混合物置于開口容器中，且置于黑暗中，直到溶劑已蒸發(fā)完。通過使用氯仿清洗除去起始 物料中的殘?jiān)?，且在空氣中干燥剩余的綠色晶體。生成的銅絡(luò)合物(絡(luò)合物C)是微晶粉末，熔點(diǎn)為127°C。變異體2將0. Olmol的醋酸銅(II)溶于50ml的按體積比1 1構(gòu)成的氯仿/甲醇溶液中 (溶液A)。將0. 02mol的替加氟溶于50ml的上述溶劑中(溶液B)。將這兩種溶液加熱至沸騰，且將溶液A加入到溶液B中并連續(xù)攪拌。繼續(xù)將該混 合物保持在沸騰溫度達(dá)30分鐘，同時(shí)通過計(jì)量方式加入濃縮的HC1將pH值保持在1。在室 溫下蒸發(fā)反應(yīng)混合物，且使用_18°C的甲醇通過玻璃粉清洗干燥的殘?jiān)_(dá)3至4次。清液中 包含本發(fā)明所述的絡(luò)合物C，該絡(luò)合物C在甲醇蒸發(fā)之后成為殘?jiān)?。對絡(luò)合物C的元素分析顯示出下列成分:Cu 26. 8%, C 18. 16%, H 3. 08%, CI 25. 3%,N:3. 39%。氧和氟分別被確定為18. 2%和2. 09%。不過，氟的分析值波動范圍大， 且氧的分析值可失真為較低值。圖8至圖10中顯示絡(luò)合物C的其他物理性能。絡(luò)合物C易于溶于水、生理鹽水、甲醇、乙醇、DMS0和吐溫80中。它不溶于醚和氯 仿中。它在室溫下在干燥的空氣中是穩(wěn)定的。使用下列程序確定在例1、例2和例3中列出的分析值使用FlashEA 1112CHNS/0自動元素分析儀同時(shí)分析C、H和N。在相同的儀器上 單獨(dú)確定氧值，在該確定過程中，使樣品在高溫且無氧氣存在的條件下分解，且測量生成的 CO。由于生成氧化物，大量銅的存在可造成氧值的失真。對于Cu的確定，可使用硝酸分解樣品，且使用由Perkin Elmer提供的ICP Optima 2100DV發(fā)射光譜儀通過發(fā)射光譜法確定溶液中的Cu。根據(jù)SchrSdinger分解得到的溶液進(jìn)行電勢滴定，從而確定氯。對于氟的確定，同樣根據(jù)SchrSdinger使所述物質(zhì)分解，且隨后使用由Metrohm 提供的761 Compact IC Autosampler離子色譜儀通過陰離子色譜法對溶液進(jìn)行分析。每個(gè)引述的分析值代表多次測量的平均值。C、N和C1的各個(gè)值的偏差平均小于 測量值的3%，H和Cu的偏差平均最高達(dá)測量值的4. 5%。F的分析值顯示出明顯的變化， 且難以確定其可靠的變化范圍。M 4絡(luò)合物A對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的影響使用溶于DMS0的濃度逐漸增加的絡(luò)合物A處理濃度為1 X 105/ml的BJAB細(xì)胞 (淋巴瘤細(xì)胞系)，且將其在37°C下在5% C02中培育達(dá)72小時(shí)。在使用碘化丙啶染色之 后，使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FACS分析)檢測DNA片段。K0 (未經(jīng)處理的細(xì)胞懸液)和DMS0 經(jīng)受等效處理。結(jié)果如圖11中所示?？煽闯觯j(luò)合物A引起濃度依賴性細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)，在 0. lmmol絡(luò)合物A的作用下細(xì)胞值達(dá)到43. 5%。
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Ml絡(luò)合物A在初級成淋巴細(xì)胞內(nèi)的體內(nèi)效應(yīng)在從ALL病人身上提取成淋巴細(xì)胞之后，使用市場上的細(xì)胞生長抑制劑和絡(luò)合物 A最初隔離并隨后處理該成淋巴細(xì)胞。選擇濃度，以使當(dāng)使用NALM-6白血病細(xì)胞系時(shí)該濃 度在LC50范圍內(nèi)不變。此后，將細(xì)胞在37°C下在5% C02中培育達(dá)60小時(shí)，隨后使用碘化 丙啶染色，且使用FACS流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)確定數(shù)量。結(jié)果如圖12中所示。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)， 在白血病細(xì)胞中存在對道諾霉素(daimo)和阿霉素(doxo)具有抗性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。使 用絡(luò)合物A在成淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)約為26%，顯著高于傳統(tǒng)的細(xì)胞生長 抑制劑阿糖胞苷(ARA-C)、克拉屈濱(Cla)、依托泊苷(Etop)、氟達(dá)拉濱(Flu)和伊達(dá)比星 (Ida)。#il 6檢測由使用絡(luò)合物A產(chǎn)生的凋亡信號級聯(lián)的線粒體調(diào)停作用在使用不同濃度的絡(luò)合物A處理BJAB細(xì)胞之后，在進(jìn)行零對照和溶劑對照的條件 下，細(xì)胞在37°C下在5% C02中培育達(dá)48小時(shí)。圖13顯示使用線粒體特異性染料JC-1染 色得到的測試評估結(jié)果、以及對顏色變化的流式細(xì)胞計(jì)量檢測。人們發(fā)現(xiàn)，在30%以上的細(xì) 胞中存在由絡(luò)合物A誘導(dǎo)的線粒體膜電勢的濃度依賴性變化。Ml絡(luò)合物A與阿糖胞苷細(xì)胞生長抑制劑的聯(lián)合給藥組合制劑顯示出在淋巴瘤細(xì)胞(BJAB)中使用傳統(tǒng)的阿糖胞苷細(xì)胞生長抑制劑具 有明顯的體外協(xié)同效應(yīng)。在37°C下在5% C02中培育達(dá)48小時(shí)，且進(jìn)行零對照和溶劑對 照。在使用碘化丙啶對細(xì)胞染色之后，通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)確定DNA片段。圖14中顯示三 次測量的平均值?？煽闯?，絡(luò)合物A與阿糖胞苷具有顯著的協(xié)同效應(yīng)，其細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)為 +129%。M 8使用絡(luò)合物A對小鼠體內(nèi)腫瘤生長的體內(nèi)抑制在六只SCID小鼠身上植入人類淋巴瘤細(xì)胞(BJAB)。在生成直徑為5mm的腫瘤之 后，使小鼠口服劑量為10mg/kg的懸浮于橄欖油中的絡(luò)合物A。對照組由10只只食用橄欖 油的動物組成。在服用絡(luò)合物A后觀察到對腫瘤生長的顯著抑制效果。結(jié)果如圖15中所不。*表示在Mann-Whitney U測試方面的顯著性(p彡0. 05)。M 9絡(luò)合物A對小鼠體內(nèi)B16黑素瘤的效應(yīng)通過向右大腿進(jìn)行皮下注射將黑素瘤B16植入到20只C 57B1系小鼠體內(nèi)。動物 被分成四組，每組有五只小鼠。小組I中絡(luò)合物A的劑量為7mg/kg，溶于DMS0中，以4%生 理鹽水懸浮液的形式通過腹內(nèi)給藥。在腫瘤植入之后的第3、5、7和9天進(jìn)行一次給藥。小組II與小組I的給藥方式相同，但使用的劑量為5mg/kg。小組III與小組I的給藥給藥方式相同，但使用的是5mg/kg的苯丙氨酸氮芥氫氯 化物，而不是絡(luò)合物A。小組IV未經(jīng)處理。
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表1中顯示在各個(gè)小組中每個(gè)腫瘤的平均重量和體積、腫瘤生長抑制、平均有絲 分裂和凋亡指標(biāo)、以及骨髓有絲分裂指標(biāo)。表1中清楚顯示出絡(luò)合物A具有優(yōu)良的抗癌效應(yīng)、以及對骨髓生成具有顯著更低 的抑制效應(yīng)。表權(quán)利要求
1.一種有機(jī)銅絡(luò)合物，它是通過使丙烯酸銅與有機(jī)化合物在氯仿/甲醇混合物中在酸 性至中性PH條件下反應(yīng)制得的，該有機(jī)化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸 (溶肉瘤素)、其氫氯化物、N- (2-furanidil) -5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶 (Ieacadin)0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機(jī)銅絡(luò)合物，其特征在于所述丙烯酸銅選用醋酸銅(II) 或丙酸銅(II)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的有機(jī)銅絡(luò)合物，其特征在于所述氯仿/甲醇混合物的 比例為1 1至3 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任何一個(gè)所述的有機(jī)銅絡(luò)合物，其特征在于它是一種熔 點(diǎn)% 1470C的銅-溶肉瘤素氫氯化物絡(luò)合物，包含15. 0% Cu、37. 3% C、4. 43% H、24. 4% Cl、 6. 74% N、以及氧，且由溶肉瘤素氫氯化物與醋酸銅(II)在pH約為2至3的條件下反應(yīng)制 得，上述碳、氮和氯的元素分析結(jié)果的偏差平均小于3%，且上述氫和銅的元素分析結(jié)果的 偏差平均最高達(dá)4.5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任何一個(gè)所述的有機(jī)銅絡(luò)合物，其特征在于它是一種熔 點(diǎn)為177°C的銅-溶肉瘤素絡(luò)合物，包含9. 2% Cu、45. 3% C、5. 4% H、20. 6% Cl、8. N、以 及0，且由溶肉瘤素與醋酸銅(II)在pH約為6至7的條件下反應(yīng)制得，上述碳、氮和氯的元 素分析結(jié)果的偏差平均小于3%，且上述氫和銅的元素分析結(jié)果的偏差平均最高達(dá)4. 5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任何一個(gè)所述的有機(jī)銅絡(luò)合物，其特征在于它是一種熔 點(diǎn)為 127°C的銅-替加氟絡(luò)合物，包含 26. 8% Cu、18. 16% C、3. 08% Η、25· 3% Cl,3. 39% N、 0和F，且由替加氟與醋酸銅(II)在pH值約為1的條件下反應(yīng)制得，上述碳、氮和氯的元素 分析結(jié)果的偏差平均小于3%，且上述氫和銅的元素分析結(jié)果的偏差平均最高達(dá)4. 5%。
7.一種藥用組合物，包含至少一種權(quán)利要求1至6中的任何一個(gè)所述的有機(jī)銅絡(luò)合物、 以及藥學(xué)上可用的助劑和/或輔料。
8.一種組合制劑，包含至少一種權(quán)利要求1至6中的任何一個(gè)所述的有機(jī)銅絡(luò)合物、以 及至少一種就其本身而言已知的細(xì)胞生長抑制劑、以及藥學(xué)上可用的助劑和/或輔料。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任何一個(gè)所述的用于治療腫瘤疾病和/或保護(hù)正常組織免 受電離輻射的有機(jī)銅絡(luò)合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于放射療法的有機(jī)銅絡(luò)合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任何一個(gè)所述的用于惡性細(xì)胞體內(nèi)檢測的有機(jī)銅絡(luò)合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于治療腫瘤疾病和/或保護(hù)正常組織免受電離輻射的藥 用組合物。
13.一種制備有機(jī)銅絡(luò)合物的方法，其特征在于使丙烯酸銅與有機(jī)化合物在氯仿/甲 醇混合物中在酸性至中性PH條件下反應(yīng)，該有機(jī)化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯 丙氨酸(溶肉瘤素)、其氫氯化物、N-(2-fUranidil)-5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳 酰氮丙啶(Ieacadin)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于使所述丙烯酸銅與所述有機(jī)化合物各 自溶于氯仿/甲醇混合物中，該有機(jī)化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(溶 肉瘤素)、其氫氯化物、N-(2-furanidil)-5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶 (Ieacadin)；反應(yīng)結(jié)合后酸化，并至少加熱到50°C，且必要時(shí)洗滌并干燥在冷卻之后生成的沉淀物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于所述氯仿/甲醇混合物的比例為 1 1 至 3 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及有機(jī)銅復(fù)合物以及包含該有機(jī)銅復(fù)合物的藥用組合物。它們尤其可用于治療由過度增生細(xì)胞引起的疾病，且可保護(hù)正常組織免受電離輻射。它們是通過使丙烯酸銅與有機(jī)化合物在氯仿/甲醇混合物中在酸性至中性pH條件下反應(yīng)制得的，該有機(jī)化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(溶肉瘤素)、其氫氯化物、N-(2-furanidil)-5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶(leacadin)。
文檔編號C07F1/00GK102007134SQ200980113936
公開日2011年4月6日 申請日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月22日
發(fā)明者瓦列里·塔甘斯基, 阿蘭姆·布羅克普 申請人:柏林夏瑞蒂醫(yī)科大學(xué), 瓦列里·塔甘斯基