專利名稱：用于制備多克隆蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備藥物產(chǎn)品的方法，所述藥物產(chǎn)品包含多克隆蛋白質(zhì)的至少兩 種獨特(distinct)成員。該發(fā)明至少牽涉表達多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員的細胞的初始分 開培養(yǎng)步驟。在上游加工以后的點或下游加工前或過程中組合細胞系或蛋白質(zhì)制備物，最 終結(jié)束于包含多克隆蛋白質(zhì)的至少兩種獨特成員的一種藥物產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
重組多克隆蛋白質(zhì)的制備是一項相對較新的技術(shù)。大多數(shù)重組藥物產(chǎn)品使用源自 表達想要產(chǎn)物的一種克隆細胞的選定細胞系制備為單克隆產(chǎn)品。在此情況中，上游和下游 制備方法可以針對特定的單克隆藥物產(chǎn)品進行優(yōu)化。最近多年中已經(jīng)開發(fā)出用于制備重組抗體和其它蛋白質(zhì)產(chǎn)物的節(jié)省成本的方法， 其在體內(nèi)使用在奶(哺乳動物)或蛋(雞)中表達重組產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因動物或者遍及整個植 物或者在不同器官(塊莖、種子、葉)中表達重組產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因植物來進行。然而，還沒有 改編這些方法來制備多克隆蛋白質(zhì)產(chǎn)物。WO 2004/009618中披露了一種用于制備多克隆藥物產(chǎn)品的方法，其關(guān)注表達具有 相同的輕鏈的抗體的單克隆細胞系的用途。根據(jù)此文件，抗體的混合物可以通過在編碼常 見的輕鏈的核酸序列和編碼至少兩種能夠與常見的輕鏈配對且具有不同可變區(qū)的不同重 鏈的核酸序列的重組宿主中表達來生成。WO 2004/061104提供了 WO 2004/009618中所述方法固有的使重和輕抗體鏈混雜 的問題的解決辦法，其通過使用定點特異整合來僅使一個表達構(gòu)建體整合在基因組的特定 位置來進行。這種解決辦法使得能夠生成多克隆制備細胞系，其能夠表達多克隆蛋白質(zhì)的 獨特成員，從而可以使用在一個生物反應(yīng)器中擴充的一種細胞庫在單一批次中制備多克隆 蛋白質(zhì)，例如多克隆抗體。隨后，使用一種下游純化方法來純化上清液，產(chǎn)生配制成一種藥 物產(chǎn)品的一種藥物物質(zhì)。使用這種方法制備的重組多克隆抗體的例子包括重組多克隆抗獼 猴D抗體(W0 2006/007850)和重組多克隆抗牛痘病毒抗體(W02007/065433)。WO 2008/145133披露了一種依靠隨機整合來制備重組多克隆蛋白質(zhì)組合物，特別 是重組多克隆抗體組合物的方法，其中在避免將表達載體定點整合入細胞的基因組中的條 件下各包含編碼多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員的至少一個拷貝的獨特核酸的一套表達載體分 開轉(zhuǎn)染宿主細胞。盡管在制備多克隆蛋白質(zhì)中的這些進展，仍然需要提供備選的制備方法，例如對 于多克隆蛋白質(zhì)的一個或多個成員需要用于表達和/或純化的特定條件的情況，或者對于 優(yōu)選不同上游加工的條件。發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明涉及一種用于制備藥物產(chǎn)品的方 法，所述藥物產(chǎn)品包含多克 隆蛋白質(zhì)的至少兩種獨特的蛋白質(zhì)成員，所述方法包括下列步驟a)提供至少兩個細胞群體(two populations of cells)，其中每個群體編碼所述 多克隆蛋白質(zhì)的一種獨特成員，并且裝入包含培養(yǎng)基和表達所述蛋白質(zhì)的細胞的物理上分開的容器中，其中所述方法包括上游部分，其包括下列步驟i)在分開的容器中在種子培養(yǎng)(seed train)的一個或多個步驟中擴充所述至少 兩個細胞群體；ii)在接種物培養(yǎng)的一個或多個步驟中從所述種子培養(yǎng)物擴增細胞；iii)在促進所述蛋白質(zhì)成員表達的條件下在生產(chǎn)期中從所述接種物培養(yǎng)物培養(yǎng) 細胞，從而表達所述至少兩種獨特的蛋白質(zhì)成員；其中至少在所述種子培養(yǎng)期間將所述至少兩個細胞群體保持分開；b)收獲所表達的蛋白質(zhì)；c)對所收獲的蛋白質(zhì)實施至少一個純化步驟；d)獲得純化的藥物物質(zhì)；并e)將純化的藥物物質(zhì)配制成多克隆藥物產(chǎn)品。方法的特征化特征在于至少在細胞擴充的初始階段過程中在物理上分開的容器 中將各編碼多克隆蛋白質(zhì)的一個獨特成員的所述至少兩個細胞群體保持分開。在如本文中 會描述的其它實施方案中，在較長的部分期間或者在上游加工的整個部分期間將表達多克 隆蛋白質(zhì)的獨特成員的細胞群體保持分開。在又一些實施方案中，在下游加工的部分或者 可能為整個下游加工期間將多克隆蛋白質(zhì)的表達的獨特成員保持分開，所述下游加工在獲 得純化的藥物物質(zhì)時完成。下文更為詳細地描述不同實施方案的優(yōu)點?？梢詫⑺鲋辽賰煞N不同細胞群體保持分開，至少直到和包括所述接種物培養(yǎng)， 并且在別的實施方案中，將所述至少兩種不同細胞群體保持分開，至少直到和包括所述生 產(chǎn)期?？梢赃M一步將由所述至少兩個細胞群體所表達的所述至少兩種獨特蛋白質(zhì)成員 保持分開，至少直到和包括所述蛋白質(zhì)收獲，使得可以分開收獲每種獨特的成員。在一些實施方案中，將由所述至少兩個細胞群體所表達的所述至少兩種獨特蛋白 質(zhì)成員保持分開，至少直到和包括至少一個純化步驟，容許不同獨特成員的不同初始純化 步驟。例如，可以將蛋白質(zhì)成員保持分開，至少直至和包括親和層析步驟。本發(fā)明還包括如下的實施方案，其中將由所述至少兩個細胞群體所表達的所述至 少兩種獨特蛋白質(zhì)成員保持分開，至少直到和包括獲得所述藥物物質(zhì)。作為在不同容器中在單細胞的生物體中生成多克隆蛋白質(zhì)的備選，可以在物理上 分開的單元中以多細胞生物體形式進行生成，每種多細胞生物體表達多克隆蛋白質(zhì)的一個 成員。這些多細胞生物體可以是植物，在此情況中物理上分開的單元是植物或植物器官。多 細胞生物體也可以是轉(zhuǎn)基因非人動物，諸如已經(jīng)進行過遺傳修飾以表達多克隆蛋白質(zhì)的獨 特成員并將其分泌到蛋(egg)的禽(bird)?；蛘撸D(zhuǎn)基因非人動物可以是哺乳動物，其中將 多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員分泌到奶。例如，哺乳動物可以是綿羊、山羊、母牛(cow)、駱駝或 水牛。定義哺乳動物細胞，例如CHO(中國倉鼠卵巢)細胞中的蛋白質(zhì)生成可以采用半連續(xù)方 法，由此在“種子培養(yǎng)”中培養(yǎng)細胞達多個時間期限，并且隨后將它們轉(zhuǎn)移到接種物發(fā)酵罐 (“接種物培養(yǎng)”)以啟動在感興趣的蛋白質(zhì)的較大規(guī)模生成途中的細胞擴增過程。如此， 用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細胞處于培養(yǎng)中達多個時間期限，直至最大的預先規(guī)定的細胞齡(cellage)。細胞培養(yǎng)方法的參數(shù)，諸如種子密度、pH、D02和溫度、生產(chǎn)培養(yǎng)的持續(xù)時間、收獲的操 作條件等是所使用的特定細胞系和培養(yǎng)基的函數(shù)，并且可以憑經(jīng)驗確定，而無需過度實驗。 為了本發(fā)明的目的，“種子培養(yǎng)”階段包括來自融化細胞的步驟和初始擴增步驟。這些步驟 通常在培養(yǎng)皿、搖瓶、T-燒瓶、塑料袋、旋轉(zhuǎn)器燒瓶、離心管、多 孔板、轉(zhuǎn)瓶、或其它瓶，即沒有 裝備有將樣品從一個容器轉(zhuǎn)移到另一個的管道的容器中進行。在用來自“種子培養(yǎng)”的細 胞接種第一生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐(鋼生物反應(yīng)器或一次性生物反應(yīng)器)時開發(fā)“接種物培 養(yǎng)”。一旦已經(jīng)將細胞轉(zhuǎn)移到接種物生物反應(yīng)器，向其它生物反應(yīng)器的后續(xù)轉(zhuǎn)移通常通過密 閉的管道系統(tǒng)發(fā)生，所述密閉的管道系統(tǒng)容許細胞從一個容器抽到另一個。“藥物產(chǎn)品”意為完成的劑量形式，例如片劑、膠囊、溶液或凍干的產(chǎn)物，其含有一 般但不必要與一種或多種其它成分聯(lián)合的“藥物物質(zhì)”?！八幬镂镔|(zhì)”通常以大批次制備，它 隨后通過將其與其它成分組合而被制備成“藥物產(chǎn)品”。在本發(fā)明的上下文中，藥物產(chǎn)品會 含有最終的多克隆蛋白質(zhì)混合物，其包含多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員。根據(jù)特定的制備方案 (scenario)，藥物物質(zhì)也可以是含有多克隆蛋白質(zhì)的所有獨特成員的多克隆混合物，或者 藥物物質(zhì)可以含有一種或僅僅一些多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員。在后一種情況中，會將兩種 或更多種藥物物質(zhì)配制成單一的藥物產(chǎn)品。術(shù)語“容器”或“器皿”指適合于體外培養(yǎng)細胞的器皿或容器。容器例子包括培養(yǎng) 皿、搖瓶、T-燒瓶、塑料袋、旋轉(zhuǎn)器燒瓶、離心管、多孔板、轉(zhuǎn)瓶(roller bottle)、其它瓶、鋼 的生物反應(yīng)器或其它非一次性生物反應(yīng)器、和塑料或其它一次性生物反應(yīng)器?！暗鞍踪|(zhì)”或“多肽”是指任何氨基酸鏈，不管長度或翻譯后修飾。蛋白質(zhì)可以單體 或多聚體形式存在，所述多聚體包含兩個或更多個裝配的多肽鏈、蛋白質(zhì)片段、多肽、寡肽 或肽。如本文中所使用的，術(shù)語“多克隆蛋白質(zhì)”或“多克隆性”是指包含不同但是同源 的蛋白質(zhì)分子的蛋白質(zhì)組合物，優(yōu)選地，選自免疫球蛋白超家族。如此，各蛋白質(zhì)分子與所 述組合物的其它分子同源，但也含有一段或多段可變多肽序列，其特征在于多克隆蛋白質(zhì) 的單獨(individual)成員之間的氨基酸序列的差異。已知的這類多克隆蛋白質(zhì)例子包括 抗體或免疫球蛋白分子、T細胞受體和B細胞受體。多克隆蛋白質(zhì)可能由確定的蛋白質(zhì)分 子亞類構(gòu)成，所述蛋白質(zhì)分子亞類通過共同特征諸如對想要的靶標共享的結(jié)合活性進行定 義，例如在針對想要的目的抗原的多克隆抗體的情況下。術(shù)語“重組多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員”指蛋白質(zhì)組合物中的一個蛋白質(zhì)分子，所述 蛋白質(zhì)組合物包含不同的但同源的蛋白質(zhì)分子，其中各蛋白質(zhì)分子與組合物的其它分子同 源，但也含有一段或多段可變多肽序列，其以所述多克隆蛋白質(zhì)的單一成員之間的氨基酸 序列差異為特征。編碼多克隆蛋白質(zhì)的一種獨特成員的每個“細胞群體”源自單個單克隆細胞庫或 單克隆細胞培養(yǎng)物，其中所述單克隆細胞庫或單克隆細胞培養(yǎng)物源自單細胞，如本文中在 別處描述的。如本文中所描述的，術(shù)語“收獲”指收獲含有所表達的蛋白質(zhì)的上清液，而一般認 為用于從所述上清液分離想要的蛋白質(zhì)的后續(xù)步驟(包括澄清)是純化步驟。術(shù)語“抗體”描述血清的功能性組分并且通常稱為分子(抗體或免疫球蛋白)集 合或一個分子(抗體分子或免疫球蛋白分子)?？贵w分子能夠結(jié)合到或與特定抗原決定簇(抗原或抗原表位)反應(yīng)，這反過來可以導致免疫效應(yīng)物機能的誘導。單個抗體分子通常被 認為是單特異性的，而抗體分子組合物可以是單克隆的(即，由相同的抗體分子構(gòu)成)或多 克隆的(即由不同的抗體分子構(gòu)成，所述不同抗體分子與同一抗原或甚至獨特的、不同抗 原上的相同或不同的表位起反應(yīng))。各抗體分子具有使其特異性結(jié)合到其相應(yīng)的抗原的獨 特結(jié)構(gòu)，并且所有天然抗體分子具有兩條一致的輕鏈和二條一致的重鏈的相同的總體基本 結(jié)構(gòu)?？贵w也統(tǒng)稱為免疫球蛋白。如本文中所使用的，術(shù)語抗體也意圖包括嵌合的和單鏈 抗體，以及抗體的結(jié)合片段，諸如Fab、Fv片段或scFv片段、和多聚體形式，諸如二聚體IgA 分子或五價IgM。術(shù)語“免疫球蛋白”通常用作在血液或血清中找到的抗體混合物的集合名稱，但也 可用于指明源自其它來源的抗體混合物。術(shù)語“多克隆抗體”描述了不同抗體分子的組合物，所述不同抗體分子能與幾種在 相同或不同抗原上的不同特異性抗原決定簇結(jié)合或反應(yīng)。通常地，多克隆抗體的可變性被 認為位于所謂的多克隆抗體可變區(qū)。然而，在本發(fā)明上下文中，要理解多克隆性也描述單一 抗體分子之間存在于所謂恒定區(qū)上的差異，例如在包含二個或更多個抗體同種型諸如人類 同種型 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2，或鼠同種型 IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3 和 IgA 的抗體混合物的情況中。如本文中所使用的，術(shù)語“多克隆抗體”也可以認為兩種或更多種 單克隆抗體的混合物。術(shù)語“感興趣的變體核酸分子的文庫”用于描述共同編碼“感興趣的重組多克隆蛋 白質(zhì)”的核酸分子集合。在用于轉(zhuǎn)染時，感興趣的變體核酸分子的文庫包含在表達載體的文 庫中。所述文庫通常具有至少3、5、10、20、50、1000、104、IO5或IO6個獨特的成員。如本文中所使用的，術(shù)語“可操作連接的”指當被置于與另一區(qū)段的功能關(guān)系時， 與該另一區(qū)段連接的區(qū)段。例如，若編碼信號序列的DNA被表達為參與多肽轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 的前導，則該編碼信號序列的DNA與編碼該多肽的DNA可操作連接。還有，若啟動子或增強 子刺激編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子或增強子與該編碼序列可操作連接。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”在本文中用作將外來DNA導入細胞的廣義術(shù)語。所述術(shù)語也想要涵 蓋其它將外來DNA導入細胞的功能等同的方法，諸如轉(zhuǎn)化、感染、轉(zhuǎn)導或供體細胞和受體細 胞的融合。 術(shù)語“可變多肽序列”和“可變區(qū)”可互換使用。術(shù)語“頭對頭啟動子(head-to-head promoters) ”指被置于非常近距離的啟動子 對，以使由所述啟動子驅(qū)動的兩個基因片段轉(zhuǎn)錄以相反的方向發(fā)生。頭對頭啟動子也可以 用由兩個啟動子之間不相關(guān)核酸構(gòu)成的填充物來構(gòu)建。此填充物片段可以容易地含有超過 500個核苷酸。頭對頭啟動子也可以稱作雙向啟動子。術(shù)語“植物”指作為植物界成員的生物體。為了本發(fā)明的目的，植物包括植物中植 物的獨立生長所需要的那些器官(例如根、莖、葉)。當術(shù)語植物意圖涵蓋分離的植物細胞 時，這被明確規(guī)定。附圖簡述

圖1 本發(fā)明的生產(chǎn)方案的示意圖(不同的種子/接種物培養(yǎng))。圖2:本發(fā)明的另一種生產(chǎn)方案的示意圖(不同的生產(chǎn)階段)。圖3 在混合群體中培養(yǎng)7天后六種抗牛痘抗體之每一種的相對區(qū)域(關(guān)于詳情，參見實施例1)。圖4 在混合群體中培養(yǎng)12天后六種不同抗RSV抗體的相對量(參見實施例3)。發(fā)明詳述可以以單批生產(chǎn)進行重組多克隆抗體的制備，所述重組多克隆抗體在通過表達構(gòu) 建體的整合生成的生產(chǎn)者細胞中表達。有利地，對各細胞系或細胞克隆適當?shù)剡x擇相似的 生長率，之后在一個培養(yǎng)容器中混合細胞系以避免一種或幾種細胞系的長出?？赡苡羞@樣的情況，其中證明難以或不可能以想要的方式比對各細胞系的生長 率，例如如果特別想要的重組蛋白/抗體的生成以反方向影響細胞系的生長率。還有，可能 有這樣的情況，其中多克隆蛋白質(zhì)的不同成員的非常獨特的比率是想要的。例如，此類情況 可以是其中組合物中非常不等量的多克隆蛋白質(zhì)成員是想要的，例如由于對靶物的不同親 和力。例如，如果以例如20 5 1 1 1 0.5的個體成員間比率含有六種蛋白質(zhì)成 員的多克隆組合物是想要的，那么通過在制備過程的至少一部分期間保持獨特的成員分開 來控制和獲得所述組合物會是更可行的。另一個例子可在如下的情況中，其中已經(jīng)使用兩 種或更多種不同親本細胞系來轉(zhuǎn)染和表達獨特的重組產(chǎn)物，在此情況中兩種或更多種細胞 系的細胞培養(yǎng)條件可以是不同的，例如對于擴增細胞和/或表達多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員 最佳的培養(yǎng)基成分。一種用于制備此類重組蛋白的備選方法是至少在上游過程的種子培養(yǎng)部分期間 將細胞系保持分開，所述方法可以有助于避開要求各表達細胞系的相似生長率。然后可以 在較晚的階段，例如接種物培養(yǎng)前或過程中，或者生產(chǎn)階段前或者過程中組合表達不同抗 體的細胞系。此方法的一個優(yōu)點在于混合細胞培養(yǎng)物的群體加倍數(shù)目可以得到顯著降低， 這使其更容易控制多克隆蛋白質(zhì)的各成員在最終的藥物產(chǎn)品中的比率，即使各細胞系展現(xiàn) 出不同的生長率?？梢栽谙掠渭庸さ囊粋€或多個步驟過程中繼續(xù)分開制備，并且甚至可以 將獨特的蛋白質(zhì)成員保持分開，直至藥物物質(zhì)已經(jīng)被純化到要求的程度的點。在后一種情 況中，然后組合藥物物質(zhì)以形成最終的藥物產(chǎn)品，其包含多克隆蛋白質(zhì)的至少兩種獨特成 員，諸如靶向相同或不同抗原的兩種或更多種不同抗體。本發(fā)明的一項重要要素在于組合是在細胞系生長過程中發(fā)生，還是在已經(jīng)從細胞 系分離出蛋白質(zhì)的點時發(fā)生，最終產(chǎn)物總是單一多克隆藥物產(chǎn)品，其包含多克隆蛋白質(zhì)的 至少兩種獨特成員，諸如靶向相同或不同抗原的兩種或更多種不同抗體。在一個實施方案中，將多克隆蛋白質(zhì)的各成員保持分開，直至收獲含有各重組蛋 白的上清液。然后混合這些產(chǎn)物，之后進行下游純化以簡化CMC過程并降低成本。在不能使用相同的方法來純化多克隆蛋白質(zhì)的各成員的情況中，也可以在下游純 化過程期間的較遲階段或者甚至在完成純化后混合它們，之后制備最終的藥物產(chǎn)品。會顯而易見的是，會在不遲于配制多克隆藥物產(chǎn)品過 程中將多克隆蛋白質(zhì)的各成 員(如果不在較早的階段混合或者不在混合兩種或更多種細胞群體后一起制備)混合在一 起。通過在低成本設(shè)備諸如一次性生物反應(yīng)器(例如Wave袋，其是在許多不同袋大小 上在商業(yè)上可獲得)中培養(yǎng)來優(yōu)先完成生成最終產(chǎn)品的成分之每種的各表達細胞系的制 備，但是在各生產(chǎn)運行的體積為低的，例如50L以下或者優(yōu)選20L或IOL以下的情況中運行 多個非一次性生物反應(yīng)器也是有可能的。優(yōu)先地，平行地完成從各細胞系之每種培養(yǎng)重組蛋白，但是也可以在兩個或更多個組中序貫進行。如下獲得每種制備容器(例如Wave袋或其它類型的生物反應(yīng)器)的接種材料，即 首先制備每種個別蛋白質(zhì)生產(chǎn)者細胞系或克隆的主細胞庫(Master Cell Bank，MCB)，潛在 地接著為工作細胞庫(Working Cell Bank，WCB)。使用來自WCB (或MCB)之每種的小瓶來 接種分開的培養(yǎng)容器。將種子培養(yǎng)設(shè)計用于擴增這些細胞系之每種，直至已經(jīng)獲得足以接 種接種物生物反應(yīng)器的細胞。當可行時，優(yōu)先地，使用相同條件來進行制備的不同部分以表達不同的蛋白質(zhì)成 員，例如包括相同的培養(yǎng)基成分和所添加的進料溶液(諸如葡萄糖、谷氨酰胺、潛在的選擇 劑，諸如G418、維生素、礦物、蛋白質(zhì)、水解產(chǎn)物等)以及培養(yǎng)過程參數(shù)諸如pH、D0T(溶解氧 張力)、C02壓力和溫度。這是重要的，以便促進質(zhì)量控制過程，其中需要解決諸如宿主細胞 蛋白質(zhì)降低、所添加選擇劑的除去和所添加生長因子的除去等因素。它也是高度重要的，以 便獲得對重組蛋白的類似的翻譯后修飾，諸如糖基化樣式。類似地，優(yōu)選地，使用類似的柱、緩沖液、洗脫譜(elution profile)等來以可能的 程度進行純化的任何不同部分。為了實現(xiàn)平穩(wěn)的、成本和時間有效的下游和分析過程，多克隆組合物中各種獨特 的蛋白質(zhì)成員的物理_化學特征盡可能地相似是優(yōu)選的。這通過將分子的恒定部分保持相 同來最好地確保。在抗體的情況中，優(yōu)先使用相同的表達載體來生成各種重組抗體分子之 每種，并且優(yōu)先地，這些的一級序列分別僅在重鏈和輕鏈的可變區(qū)上有所不同。在最優(yōu)選的 方案中，抗體分子的恒定部分(如由表達構(gòu)建體編碼的)對于多克隆抗體組合物的所有成 員(例如IgGl同種型分子)是完全相同的。另外，優(yōu)選地，輕鏈也是相同類型的，在人抗體 的情況中或是κ或是λ。將抗體分子的主要部分保持盡可能地相同使重組抗體能夠使用 一種方法來純化至高純度，而沒有喪失多樣性的風險。它還促進建立表征、質(zhì)量控制和所制 備藥物產(chǎn)品的推廣所需要的分析方法。蛋白質(zhì)純化過程(process)通常是一種多步驟過程，其基于抗體或其它蛋白質(zhì)分 子的物理_化學特征開發(fā)，并且對于每個步驟，有喪失多樣性的風險，即有喪失一種或多種 各產(chǎn)品成分的風險。該過程可以包括例如數(shù)個層析步驟，包括可以是蛋白A或者蛋白G結(jié) 合的捕捉步驟、陰離子交換層析步驟和基于疏水性相互作用的層析步驟。它可以進一步包 括于低PH的溫育以及數(shù)個過濾步驟。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，各分子間的這些中任 何的物理-化學特征的差異可以阻止純的且多種多樣的多克隆抗體產(chǎn)物的成功回收。關(guān)于分析質(zhì)量控制方法，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，獲得重組抗體產(chǎn)品的規(guī) 章批準所必需的所有表征測定法(例如肽作圖、大小排阻、SDS-PAGE、Western印跡、氨基酸 分析、二硫化物橋和游離的氫硫基基團的定位和單糖和寡糖表征)可以證明難以以令人滿 意的程度進行，如果恒定區(qū)在分子間不是相同的或相似的話。用于重組多克隆抗體和其它 多克隆蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征和用于表達此類多克隆蛋白質(zhì)的多克隆細胞系的表征的方法披 露于 WO 2006/007853。不同的制備方案培養(yǎng)容器中的重組體表達培養(yǎng)的哺乳動物細胞由于其正確折疊、裝配和翻譯后修飾的能力而已經(jīng)變?yōu)橛糜?制備供臨床應(yīng)用的重組蛋白的主要系統(tǒng)。已經(jīng)采用了兩種主要的形式來在哺乳動物細胞中生成重組蛋白貼壁細胞的培養(yǎng)物和懸浮培養(yǎng)物。后一種是到目前為止最常見的。在簡單批次或補料分批生產(chǎn)過程中，放大到非常大的體積可以通過將生物反應(yīng)器 的內(nèi)容物稀釋到較大反應(yīng)器中保持預熱的5-20個體積的新鮮培養(yǎng)基中來發(fā)生。從融化儲 存的細胞到實際的大規(guī)模生產(chǎn)的過程由三個分開的階段組成種子培養(yǎng)、接種物培養(yǎng)和生 產(chǎn)階段。通常在較小的細胞培養(yǎng)容器中進行種子培養(yǎng)，其從融化儲存的細胞后立即的幾 mL培養(yǎng)物的小體積開始，并且直至數(shù)升的細胞培養(yǎng)物，諸如5-100L培養(yǎng)物，以在選擇用于 生產(chǎn)的時期期間為放大提供新鮮的細胞。當將種子培養(yǎng)過程中生成的細胞懸液轉(zhuǎn)移到接 種物反應(yīng)器(也稱作種子反應(yīng)器)時開始接種物培養(yǎng)，并且擴充其體積，使得生成足夠的 細胞數(shù)目用于接種最終的生產(chǎn)生物反應(yīng)器(Wurm，2004，Nature Biotechnology, 22 (11) 1393-1398)。為了制備單克隆重組蛋白，在種子培養(yǎng)階段中或者在接種物反應(yīng)器中維持融化的 細胞達延長的群體加倍數(shù)目通常是有可能的。這提供了用自相同的安瓿融化的細胞接種超 過一個生產(chǎn)生物反應(yīng)器的可能性，而且它還為如下的情況提供了備份細胞(backup cell), 其中制備受到延遲，例如由于技術(shù)問題。然而，當制備重組多克隆蛋白質(zhì)時，對世代數(shù)目設(shè) 置嚴格的限制并對世代數(shù)目維持徹底的控制是必要的，并且將來自多克隆細胞庫的種子培 養(yǎng)維持延長的時間期限通常是沒有可能的。這是由于如下的實情，即即使在不同細胞系的 生長率盡可能接近地匹配時，多克隆細胞組合物中的各細胞系總會展現(xiàn)出略微不同的生長 和生產(chǎn)率，導致在延長的培養(yǎng)時期里組合物的漂移。這向制備過程添加比單克隆蛋白質(zhì)制 備過程更多的約束和更少的靈活性，而且可以導致制備失敗的風險更高，例如在導致延遲 的關(guān)于生產(chǎn)反應(yīng)器的技術(shù)問題的情況中。在批次或補料分批制備(其是用于制備重組抗體的優(yōu)選技術(shù))的情況中，大多數(shù) 群體加倍實際上在接種生產(chǎn)反應(yīng)器前發(fā)生。典型的上游過程就群體加倍而言可以像這樣 為了通過擴增來自PMCB的小瓶來生成pWCB，需要8-12個群體加倍。種子培養(yǎng)擴增通常會 需要10-20個加倍，這取決于最終的制備規(guī)模，而在接種物反應(yīng)器中發(fā)生的群體加倍的數(shù) 目通常會是2-5個世代。在補料分批生產(chǎn)反應(yīng)器中，細胞經(jīng)歷相對較低數(shù)目的世代，諸如 5-8。整個地，在使用起始于多克隆主細胞庫的單批制備過程時需要約25-43個世代來完成 上游過程。這些之中，約20-37個群體加倍在接種生產(chǎn)容器前發(fā)生。會顯而易見的是，混合 培養(yǎng)期間越短，控制和維持想要的組分比率越可行。如此，對于難以獲得類似的生長率或者 獲得非常窄的限度的組分比率是至關(guān)重要的多克隆產(chǎn)物，在制備過程的初始階段期間在分 開的容器中維持各種細胞系并在晚期點時及時混合細胞會是有利的。通常使用表達異源或內(nèi)源蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離的細胞通過在有利于蛋白質(zhì)產(chǎn)物表 達的條件下在液體或半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細胞來在體外表達重組蛋白產(chǎn)物。這些方法 對于表達分泌型蛋白質(zhì)產(chǎn)物是特別有利的，因為這些可以容易地從細胞分離，作為蛋白質(zhì) 純化的第一步。用于培養(yǎng)的容器可以例如選自下組搖瓶、轉(zhuǎn)瓶、T-燒瓶、和一次性或非一次性生 物反應(yīng)器。在優(yōu)選的實施方案中，容器包括一種或多種一次性容器。一次性容器可以包括 所謂的Wave袋，其在范圍為IOL和直至超過1000升的不同大小上可獲自許多制造商。合 適的一次性生物反應(yīng)器包括但不限于BIOSTAT CultiBag (Sartorius Stedim Biotech)、 Cell Maker Lite2 (Cellexus Biosystems) >Biowave (Wave Biotech AG)、Wave BiotechLLC(GE Healthcare)袋、一次性生物反應(yīng)器S. U. B. (Hyclone Thermo Fisher Scientific) 和FlexFact0ryTM(Xcellerex)。因為本發(fā)明牽涉對平行或系列制備中的多克隆蛋白質(zhì)的獨 特成員使用分開的生物反應(yīng)器，用于上游過程的至少一部分，使用相對便宜的一次性生物 反應(yīng)器替代昂貴的鋼罐是有利的。另外，一次性生物反應(yīng)器將靈活性添加到本發(fā)明的方法， 因為與使用多次使用的鋼罐相比，更容易且花費更少地增加生物反應(yīng)器的數(shù)量。雖然已經(jīng)開發(fā)出方法來表達多克隆蛋白質(zhì)的不同成員，在一些情況中，這些方法 是不適當?shù)摹＠缛绻嗫寺〉鞍踪|(zhì)包含不能使用相同的下游過程方法純化的不同蛋白質(zhì) 成員，那么在單一批次中表達獨特成員沒有優(yōu)點。還有，如果出于一些原因，希望在特定的 細胞類型中表達一種獨特的成員而在另一種細胞類型中表達其它成員，那么單一批次制備 是較不優(yōu)選的。最后，可以有如下的情況，其中表達多克隆蛋白質(zhì)的不同成員的不同細胞克隆的 表達水平和/或生長率的差異如此之大以至于在多克隆細胞庫中組合不同克隆是不利的。分開的種子培養(yǎng)本發(fā)明的一個實施方案依賴于具有分開的培養(yǎng)容器中融化的不同單克隆細胞庫， 從而可以對表達多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員的每個克隆使用最佳的融化和適應(yīng)條件。在融化 和適應(yīng)的這些初始步驟過程中，細胞的生存力在壓力下，并且即使這些早期步驟中各克隆 間存活率的次要差異也可以對最終產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)成員的相對分布具有顯著的影響。根據(jù)本發(fā)明的此實施方案，在融化、適應(yīng)和種子培養(yǎng)擴增過程中將表達多克隆蛋 白質(zhì)的不同成員的各生產(chǎn)者細胞系保持分開。然后可以根據(jù)想要的標準來混和克隆，并在 一個單一批次中培養(yǎng)，用于接種物培養(yǎng)、生產(chǎn)階段、收獲和下游加工。分開的接種物培養(yǎng)在別的實施方案中，將表達多克隆蛋白質(zhì)的不同獨特成員的不同克隆保持分開， 直至和包括接種物培養(yǎng)(圖1)。根據(jù)此實施方案，在生產(chǎn)階段開始時每個單獨的生產(chǎn)者細 胞系有可能具有相同的細胞數(shù)目。如上文所提及的，多克隆階段在此實施方案中是相對較 短的，具有有限數(shù)目的細胞分裂，從而細胞克隆間生長率的任何差異會對組合物具有有限 的影響。這樣，更容易組合不同的個體生產(chǎn)者細胞系以在生產(chǎn)階段結(jié)束時獲得多克隆蛋白 質(zhì)的獨特成員的預先確定的分布。使用分開的種子培養(yǎng)，并且特別是使用分開的種子培養(yǎng)和分開的接種物培養(yǎng)的一 項重要優(yōu)點在于從合并不同克隆的點直至生產(chǎn)階段結(jié)束的世代數(shù)目是降低的。因此，使將 不同細胞克隆合并并且培養(yǎng)在一起的世代的總數(shù)目最小化。這容許批次間在最終產(chǎn)物中更 大的總體穩(wěn)定性和一致性，并且如此對最終結(jié)果更大程度的控制，因為有更少的如下世代， 其中一個或多個克隆具有長得比不同細胞克隆的混合物中的其它克隆快或者在生產(chǎn)上超 過不同細胞克隆的混合物中的其它克隆的可能性。此辦法與例如使用多克隆主細胞庫相比的另一項優(yōu)點在于它容許根據(jù)需要在改 編多克隆混合物中更大的靈活性。例如，如果發(fā)現(xiàn)多克隆MCB中的細胞克隆之一是不穩(wěn)定 的或者在其它方面欠佳，那么會不得不再創(chuàng)建整個多克隆MCB。比較而言，本發(fā)明容許以較 少的時間和努力除去或者備選地用生成相同蛋白質(zhì)的新克隆替換單個欠佳的克隆。它還使 得有可能相對容易地將生成新蛋白質(zhì)的新克隆添加到生成已建立的多克隆蛋白質(zhì)的克隆 的現(xiàn)有混合物。另外，此辦法使得更容易提高生產(chǎn)階段，同時使最終的蛋白質(zhì)組合物中的變化風險最小化，例如使用Wave袋或其它一次性生物反應(yīng)器進行種子和接種物培養(yǎng)。又一項優(yōu)點在于一旦已經(jīng)鑒定出多克隆蛋白質(zhì)的想要的獨特成員便更快速地移 入多克隆抗體或其它治療性蛋白質(zhì)的臨床前開發(fā)的可能性。這是由于一旦已經(jīng)鑒定出合適 的個體蛋白質(zhì)成員，僅必需測試個體克隆的穩(wěn)定性，然后可以直接使用所述個體克隆來進 行生產(chǎn)目的，即也不必在多克隆主細胞庫和多克隆工作細胞庫的穩(wěn)定性研究上花費額外的 時間。此外，對于臨床前和臨床I/II期測試，基于MCB進行制備，而不必在WCB的生成和測 試上花費時間也可以是有可能的。分開的生產(chǎn)階段在又一個實施方案中，也分開對多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員實施生產(chǎn)階段(圖2)。 這容許在不同的細胞類型中和/或在不同的條件下表達不同成員，而且還容許如下的情 況，其中不能在一種且相同的方法中對多克隆蛋白質(zhì)的多有獨特成員實施完整的下游加 工。此方案還提供了關(guān)于對表達平臺選擇多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員的完全自由。如此，例如，可以在酵母細胞中表達一種成員，而可以在哺乳動物細胞中表達一 種。或者/另外，例如可以在分離的植物細胞中在體外表達一種蛋白質(zhì)成員，并且可以在細 菌中表達一種，若想要這樣的話。本領(lǐng)域中已知的是，不同物種導致對所表達蛋白質(zhì)的不同 的翻譯后修飾。這樣，可以制備具有此類不同翻譯后修飾的產(chǎn)物，并進行一種常見的或部分 常見的下游加工。此制備方案還使不同培養(yǎng)模式能夠用于多克隆蛋白質(zhì)的不同成員。可以使用批次 方法來制備一種成員，而可以使用補料_分批或者灌注方法來制備其它成員。多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員具有分開的生產(chǎn)階段的別的優(yōu)點在于可以以預先確定 的比率混合或組合獨特的蛋白質(zhì)成員，之后進行下游加工。這降低任何偏斜的分布，其可以 潛在地由增殖率和/或表達水平的差異引起。別的優(yōu)點在于可以進行獨特的蛋白質(zhì)成員的連續(xù)制備。這容許在一個或幾個生物 反應(yīng)器中制備具有許多獨特的蛋白質(zhì)成員的復雜的多克隆蛋白質(zhì)。表達后，可以相繼地或 者每次幾種地收獲所表達的獨特蛋白質(zhì)成員，并將其貯存，直至所有成員均已經(jīng)得到表達。 然后可以使用一種下游加工方法來純化多克隆蛋白質(zhì)。分開的收獲分開表達獨特的蛋白質(zhì)成員后，可以分開對多克隆蛋白質(zhì)的一種或多種成員進行 后續(xù)的收獲步驟，或者可以使用常見的方法來收獲兩種或更多種成員?？梢匀缦芦@得所表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，即從不同生物反應(yīng)器收獲上清液或細胞，或 者在植物或動物中生產(chǎn)的情況中，從所收獲的植物或者從例如轉(zhuǎn)基因動物的奶或蛋分離蛋 白質(zhì)。分開的第一純化步驟下游過程(DSP)的第一階段通常包括一個或多個步驟以從細胞和細胞碎片(細胞 壁、膜和片段)分離蛋白質(zhì)產(chǎn)物。這可以使用用于澄清的方法(包括但不限于離心和過濾) 來完成。當分開制備獨特的成員時，可以分開地對獨特的成員或者共同地對兩種或更多種 成員實施初始澄清，雖然在分開制備和收獲獨特蛋白質(zhì)的情況中，通常還會分開使分開收 獲的上清液澄清。澄清后，下一步可以包括親和層析步驟，諸如以結(jié)合和洗脫模式(捕捉模式)進行的蛋白A或蛋白G純化。所述純化步驟在除去大多數(shù)污染物(宿主細胞蛋白質(zhì)、DNA、病毒、 培養(yǎng)基成分)上通常是非常有效的。因為蛋白酶和其它酶可以構(gòu)成污染物的一部分，在早 期階段除去這些對于蛋白質(zhì)產(chǎn)物的穩(wěn)定性是重要的。另外，初始親和層析步驟通常導致體積的顯著降低，使得更容易且更便于貯存這 種純化步驟后的部分純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在連續(xù)生產(chǎn)的情況中，收獲蛋白質(zhì)后立即或馬上 進行體積降低步驟是一項優(yōu)點。還有，出于蛋白質(zhì)產(chǎn)物的穩(wěn)定性的原因，蛋白質(zhì)收獲后盡可 能快速地除去污染物的主要部分是一項優(yōu)點。隨后，可以將各包含多克隆蛋白質(zhì)的一種獨 特成員的冷凍的等分試樣融化、混合、并進行進一步的DSP。如果例如多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員包括具有不能在同一柱上捕獲的不同同種型 的抗體，或者如果及時分開個體成員的生產(chǎn)，那么還可以對獨特成員中至少一種應(yīng)用分開 的初始層析步驟。例如，多克隆蛋白質(zhì)可以是多克隆抗體，其包含可以在蛋白A柱上純化的 至少一種獨特的抗體成員和可以在蛋白G柱上純化的至少一種其它獨特的抗體成員?？梢?將下游加工的剩余部分作為一個過程實施。分開的進一步層析步驟 在其它實施方案中，還可以分開對獨特的蛋白質(zhì)成員實施進一步的下游加工。如 果對特定的純化步驟預期非常不同的回收率和/或如果獨特的成員在大小、電荷和/或疏 水性方面有如此大的差異以至于不能使用一種常見的純化方法，這可以是有利的。不同的 獨特蛋白質(zhì)成員存在非常不同的污染物也可以證明分開層析步驟的用途。此實施方案容許為每種獨特的蛋白質(zhì)成員優(yōu)化步驟以對所有蛋白質(zhì)成員維持高 回收率。這可以導致下游加工過程中的較少損失。藥物物質(zhì)的分開制備在本發(fā)明的又一個實施方案中，分開對獨特的蛋白質(zhì)成員進行直至獲得“藥物物質(zhì)”的所有步驟。在此方案中，可以平行地或連續(xù)地制備包含多克隆蛋白 質(zhì)的不同成員的藥物物質(zhì)。這使得有可能以精確的預先確定的比率組合獨特的蛋白質(zhì)成 員。如果精確的比率對于功能是重要的，那么這可以是一項優(yōu)點。完整的上游和下游加工是 分開的，并且可以針對每種獨特的蛋白質(zhì)成員進行優(yōu)化。這可以導致較高的表達水平和回 收率。使用本發(fā)明的此實施方案，有可能將蛋白質(zhì)產(chǎn)物的一種或多種成員衍生化，例如以將 毒素、聚合物、或另一非蛋白質(zhì)基團連接到一種或多種但不是所有的獨特蛋白質(zhì)成員。此類 衍生化要求在衍生化前已經(jīng)純化出蛋白質(zhì)。另外，衍生化具有如下的結(jié)果，即不能容易地與 其它獨特的非衍生化的蛋白質(zhì)成員一起純化衍生化的產(chǎn)物?？梢詡€別地對包含多克隆蛋白 質(zhì)的獨特成員的藥物物質(zhì)之每種進行針對多克隆蛋白質(zhì)的每種獨特成員的分開的表征和/ 或釋放測定法。如果將一種或多種獨特的成員衍生化，那么能夠單獨對此獨特的成員進行 特定的釋放或表征測定法可以是一項優(yōu)點。最后將所獲得的藥物物質(zhì)與所需要的藥物賦形劑、載體等一起配制成藥物產(chǎn)品。特定的制備方案在下文中，逐步描述了用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的抗體產(chǎn)物的不同制備方案。這些作 為非限制性例子提供。1)生產(chǎn)前部分分開的種子培養(yǎng)和混合此方案包括下列步驟(參閱圖1)
集合(in pool)中的轉(zhuǎn)染 選擇 篩選高生產(chǎn)克隆 分開生長到某階段的種子/接種物培養(yǎng) 混合 多克隆產(chǎn)物的單批次生產(chǎn)。方案最初包括提供一套編碼獨特的多克隆蛋白質(zhì)成員之每種的表達載體。將表達 載體之每種分開轉(zhuǎn)染入合適的宿主細胞的基因組中，使得一種細胞僅表達多克隆蛋白質(zhì)的 一種成員。例如，使用共表達的顯性遺傳標志諸如藥物抗性標志物來進行經(jīng)轉(zhuǎn)染的克隆的 選擇?？梢允褂糜糜诟咄亢Y選的方案來選擇高生產(chǎn)單細胞克隆。對克隆進一步篩選合 適的生物反應(yīng)器參數(shù)，并篩選細胞單位生產(chǎn)率和最大限度效價。隨后，可以使用關(guān)于生物反應(yīng)器參數(shù)、生產(chǎn)率和效價的數(shù)據(jù)根據(jù)針對多克隆生產(chǎn) 的算法將編碼獨特的多克隆蛋白質(zhì)成員之每種的克隆比對入組中。選擇最好的生產(chǎn)組(即 平衡生產(chǎn)率和成分穩(wěn)定性)?；蛘?，可以進行實驗來測試提供最好的共培養(yǎng)結(jié)果的克隆組合。對于每種獨特的多克隆蛋白質(zhì)成員，生成主細胞庫(MCB)。然后在分開的種子培養(yǎng) 中使用每種MCB。然后使用分開的種子培養(yǎng)物來接種生物反應(yīng)器，其根據(jù)基于來自表征步驟 的數(shù)據(jù)或者基于實驗結(jié)果的規(guī)定標準。然后在一個生物反應(yīng)器中在單批次生產(chǎn)中使用接種 物，并將所收獲的多克隆蛋白質(zhì)進行單一下游過程。2)各生產(chǎn)者細胞系中的分開生產(chǎn)、混合、之后純化。此方案包括下列步驟(參閱圖2) 集合中細胞的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染子的選擇 篩選高生產(chǎn)的細胞系/克隆 分開的生產(chǎn)、并混合，之后純化方案最初包括提供一套編碼獨特的多克隆蛋白質(zhì)成員之每種的表達載體。將表達 載體之每種分開轉(zhuǎn)染入合適的宿主細胞的基因組中，使得一種細胞僅表達多克隆蛋白質(zhì)的 一種成員。隨后，進行共表達的顯性遺傳標志，諸如藥物抗性標志物的選擇以選擇經(jīng)轉(zhuǎn)染的 克隆?？梢允褂糜糜诟咄亢Y選的方案來選擇高生產(chǎn)單細胞克隆。對克隆進一步篩選合 適的生物反應(yīng)器參數(shù)，并篩選細胞單位生產(chǎn)率和最大限度效價。選擇編碼獨特的多克隆蛋白質(zhì)成員之每種的最好克隆，并為每種獨特的多克隆蛋 白質(zhì)成員生成主細胞庫，即MCB。然后在傳統(tǒng)的上游生產(chǎn)中使用每種MCB。在貯存罐(hold tank)/容器中收集來自每種獨特的多克隆蛋白質(zhì)成員的所有生物反應(yīng)器運行的上清液，并 混合，然后純化混合的多克隆上清液。任選地，可以進行體積降低步驟，之后在貯存罐中收 集。體積降低步驟可以包括超濾或親和層析，例如蛋白A層析。分開對獨特的蛋白質(zhì)成員 進行體積降低步驟。3)分開的生產(chǎn)和純化、純化的蛋白質(zhì)的混合
此方案包括下列步驟 集合中的轉(zhuǎn)染 選擇 篩選高生產(chǎn)克隆 分開的生產(chǎn) 分開的純化 純化的抗體(藥物物質(zhì))的混合該方案到上游過程結(jié)束為止與方案2相同。然后將多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員進行 傳統(tǒng)的分開的下游加工。將來自每種獨特的多克隆蛋白質(zhì)成員的所有運行的純化的藥物物 質(zhì)收集，并且任選地貯存，并根據(jù)規(guī)定的標準混合以獲得最終的藥物產(chǎn)品。細胞和蛋白質(zhì)的混合在制備的上游加工部分過程中無論何時混合不同細胞群體，這會影響作為終產(chǎn)物 獲得的多克隆蛋白質(zhì)的組合物。一種用于混合細胞的辦法包括混合或組合至少兩種不同細胞群體的相等數(shù)目的 細胞。然而，如果不同細胞群體具有不同的表達水平或不同的生長率，那么這不可導致獨特 的蛋白質(zhì)成員在終產(chǎn)物中的相等分布。為了補償這點，可以組合至少兩種不同細胞群體的 不同數(shù)目的細胞。如此，可以組合來自不同群體的細胞以獲得如下的多克隆細胞群體，其能 夠表達近似相等量的多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員，諸如以預先確定的比率混合它們，所述預 先確定的比率可以以實驗方法測定。在其它實施方案中，以如下的比率組合來自至少兩種不同細胞群體的細胞，所述 比率給予藥物物質(zhì)或藥物產(chǎn)品中預先確定比率的獨特的蛋白質(zhì)成員。這可以如下完成，即 使用關(guān)于不同細胞群體的表達水平和/或生長率的知識和/或關(guān)于在至少一個純化步驟中 回收獨特成員的知識來計算比率，之后組合細胞。或者，可以基于實驗數(shù)據(jù)憑經(jīng)驗確定適合 于獲得想要的結(jié)果的混合比率。在上游加工結(jié)束時或者下游加工期間進行組合時，這可以僅通過組合來自多克隆 蛋白質(zhì)的獨特成員的細胞培養(yǎng)物的等體積來完成?；蛘撸绻呀?jīng)獲得此類信息，那么可以 組合等量的多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員。可以以如下的比率組合多克隆蛋白質(zhì)的至少兩種獨特的成員，所述比率給予藥物 物質(zhì)或藥物產(chǎn)品中預先確定比率的獨特的蛋白質(zhì)成員。這可以如下完成，即使用關(guān)于在至 少一個純化步驟中回收獨特成員的知識來計算比率，之后組合。多克隆蛋白質(zhì)在本發(fā)明的大多數(shù)實施方案中，多克隆蛋白質(zhì)與表達蛋白質(zhì)成員的細胞天然無 關(guān)，并且表達系統(tǒng)是重組的。本發(fā)明提供了用于一致的制備重組多克隆蛋白質(zhì)的方法，所述重組多克隆蛋白質(zhì) 優(yōu)選是分泌的，并且更優(yōu)選地選自免疫球蛋白超家族、具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì) 家族。免疫球蛋白超家族的大多數(shù)成員牽涉細胞表面識別事件。序列分析提示抗體、T細胞 受體、MHC分子、一些細胞粘著分子和細胞因子受體是高度同源的。特別地，此家族中含有 可變區(qū)的成員適合于生成根據(jù)本發(fā)明的重組多克隆蛋白質(zhì)。此類成員包括抗體、膜結(jié)合抗 體(B細胞受體)、Fab片段、Fv片段、單鏈Fv(SCFV)片段、T細胞受體(TcR)、可溶性TcR、TcR可變域片段、由多肽接頭連接的TcR可變域片段、和其它抗體或TcR衍生的片段。特別 地，涵蓋的是，本發(fā)明可以用于大規(guī)模制備和生產(chǎn)重組治療性多克隆抗體或抗體片段及TcR 和TcR片段。在一個優(yōu)選的實施方案中，多克隆蛋白質(zhì)是多克隆抗體或多克隆抗體片段。 本發(fā)明的重組多克隆蛋白質(zhì)指包含不同但同源的蛋白質(zhì)分子的蛋白質(zhì)組合物，其 中例如差異反映天然存在的多樣性。如此，每種蛋白質(zhì)分子與組合物的其它分子同源，但 是還含有一段或多段可變多肽序列，其特征在于多克隆蛋白質(zhì)的各成員間的氨基酸序列差 異。構(gòu)成可變多肽序列的氨基酸序列的差異可以少到一個氨基酸，但是通常會構(gòu)成超過一 個氨基酸。多克隆抗體或TcR的天然可變性一般位于多肽鏈中所謂的可變區(qū)或V區(qū)。在本發(fā)明的一個實施方案中，多克隆蛋白質(zhì)中的各成員包含長約80和120個氨基 酸之間的可變區(qū)?？勺儏^(qū)可以包含高變區(qū)，例如互補決定區(qū)(⑶R)。在天然存在的TcR中， 每個可變區(qū)中有四個CDR。在天然存在的抗體中，有重鏈中的三個CDR和輕鏈中的三個CDR。在本發(fā)明的別的實施方案中，多克隆蛋白質(zhì)的各成員的可變區(qū)包含長1-26個氨 基酸，優(yōu)選地長4-16個氨基酸的至少一個超變域。這種超變域可以對應(yīng)于⑶R3區(qū)。對于 抗體，每個可變區(qū)優(yōu)選包括三個超變域。這些可以對應(yīng)于⑶R1、⑶R2和⑶R3。對于TcR，每 個可變區(qū)優(yōu)選構(gòu)成四個超變域。這些可以對應(yīng)于⑶R1、⑶R2、⑶R3和⑶R4。超變域可以單 獨構(gòu)成本發(fā)明的重組多克隆蛋白質(zhì)的可變區(qū)內(nèi)的可變序列。在本發(fā)明的上下文中，多肽序列中的可變性(多克隆性)也可以理解為描述駐留 在抗體多肽鏈的所謂恒定區(qū)或C區(qū)中的各抗體分子間的差異，例如如在抗體混合物的情況 中，所述抗體含有兩種或更多種不同抗體同種型，諸如人同種型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl、IgA2、IgM、IgD、和 IgE，或者鼠同種型 IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgMjP IgA0 如此， 重組多克隆抗體可以包含如下的抗體分子，其特征在于可變區(qū)(V區(qū))中和/或恒定區(qū)(C 區(qū))中的各抗體分子間的序列差異。優(yōu)選地，抗體是相同同種型的，因為這使后續(xù)的純化和 表征變得相當容易。組合不同同種型或者優(yōu)選地不同亞類的抗體也是想得到的。例如，可 以組合同種型IgGl、IgG2和IgG4的抗體，因為這些可以使用蛋白A親和層析均一起純化。 在不同同種型或亞類的抗體的情況中，多克隆性可以存在于恒定部分中和/或可變域中。 在一個優(yōu)選的實施方案中，構(gòu)成多克隆抗體的所有抗體具有相同的恒定區(qū)以進一步便于純 化。更優(yōu)選地，抗體具有相同的重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)在獨特的抗體間也可以是相同的。 在一個實施方案中，如此，至少兩個細胞群體是相同的，只是編碼獨特蛋白質(zhì)成員的表達載 體序列上有差異。例如，至少兩個細胞群體可以是相同的，只是編碼獨特蛋白質(zhì)成員的可變 區(qū)的至少一種表達載體序列上有差異。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，重組多克隆蛋白質(zhì)是重組多克隆抗體或抗體 片段。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，重組多克隆蛋白質(zhì)是重組多克隆TcR或TcR 片段。在所謂的恒定區(qū)(特別是抗體重鏈)中的多克隆性在抗體的治療應(yīng)用方面是令人 感興趣的。多種免疫球蛋白同種型具有不同的生物學功能(表1中匯總的)，其在利用抗體 進行治療時可能期望組合，因為不同的免疫球蛋白同種型可牽涉天然免疫應(yīng)答的不同方面 (Canfield 禾Π Morrison 1991. J. Exp. Med. 173，1483-91 ；Rumpel 等 2002.Transfus. Clin. Biol. 9,45. -53 ；Stirnadel 等 2000. Epidemiol. Infect. 124，153-162)。表1 人免疫球蛋白同種型的生物學功能
權(quán)利要求
1. 一種用于制備藥物產(chǎn)品的方法，所述藥物產(chǎn)品包含多克隆蛋白質(zhì)的至少兩種獨特的 蛋白質(zhì)成員，所述方法包括下列步驟a)提供至少兩個細胞群體，其中每個群體編碼所述多克隆蛋白質(zhì)的一種獨特成員，并 且裝入包含培養(yǎng)基和表達所述蛋白質(zhì)的細胞的物理上分開的容器中，其中所述方法包括上 游部分，其包括下列步驟i)在分開的容器中在種子培養(yǎng)的一個或多個步驟中擴充所述至少兩個細胞群體； )在接種物培養(yǎng)的一個或多個步驟中從所述種子培養(yǎng)物擴增細胞； iii)在有利于所述蛋白質(zhì)成員表達的條件下在生產(chǎn)期中從所述接種物培養(yǎng)物培養(yǎng)細 胞，從而表達所述至少兩種獨特的蛋白質(zhì)成員；其中至少在所述種子培養(yǎng)期間將所述至少兩個細胞群體保持分開；b)收獲所表達的蛋白質(zhì)；c)對所收獲的蛋白質(zhì)實施至少一個純化步驟；d)獲得純化的藥物物質(zhì)；并e)將純化的藥物物質(zhì)配制成多克隆藥物產(chǎn)品。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將所述至少兩個細胞群體保持分開，至少直到和包括所述 接種物培養(yǎng)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中將所述至少兩個細胞群體保持分開，至少直到和包括所述生產(chǎn)期。
4.權(quán)利要求1的方法，其中將由所述至少兩個細胞群體所表達的所述至少兩種獨特蛋 白質(zhì)成員保持分開，至少直到和包括所述蛋白質(zhì)收獲。
5.權(quán)利要求1的方法，其中將由所述至少兩個細胞群體所表達的所述至少兩種獨特蛋 白質(zhì)成員保持分開，至少直到和包括至少一個純化步驟。
6.權(quán)利要求1的方法，其中將由所述至少兩個細胞群體所表達的所述至少兩種獨特蛋 白質(zhì)成員保持分開，至少直到和包括獲得所述藥物物質(zhì)。
7.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中組合所述至少兩個細胞群體的相等數(shù)目的細胞。
8.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中組合所述至少兩個細胞群體的不同數(shù)目的細胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中組合來自不同群體的細胞以獲得多克隆細胞群體，其能夠 表達近似相等量的所述多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員。
10.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中以預先規(guī)定的比率混合來自所述至少兩個細 胞群體的細胞。
11.權(quán)利要求10的方法，其中以如下的比率組合來自所述至少兩個細胞群體的細胞， 所述比率在所述藥物物質(zhì)或產(chǎn)品中給予預先規(guī)定比率的所述獨特的蛋白質(zhì)成員。
12.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中組合來自所述多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員的細 胞培養(yǎng)物的等體積。
13.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中組合等量的所述多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員。
14.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中以如下的比率組合所述多克隆蛋白質(zhì)的至少 兩種獨特成員，所述比率在所述藥物物質(zhì)或藥物產(chǎn)品中給予預先規(guī)定比率的所述獨特的蛋白質(zhì)成員。
15.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中在至少一個初始純化步驟期間將至少一種獨 特的蛋白質(zhì)成員與其它一種或多種成員保持分開。
16.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中對至少兩種獨特的細胞群體和/或由所述至 少兩個細胞群體所表達的至少兩種獨特的蛋白質(zhì)成員平行地進行制備方法的不同部分。
17.權(quán)利要求1-15中任一項的方法，其中對至少兩種獨特的細胞群體和/或由所述至 少兩個細胞群體所表達的至少兩種獨特的蛋白質(zhì)成員連續(xù)地進行制備方法的不同部分。
18.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中步驟a)期間進行培養(yǎng)所使用的容器選自下 組搖瓶、轉(zhuǎn)瓶、T-燒瓶、和非一次性和一次性生物反應(yīng)器。
19.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中使用對于表達不同蛋白質(zhì)成員相同的培養(yǎng)基 成分和方法參數(shù)來進行制備方法的不同部分。
20.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述至少兩個細胞群體是相同的，只是編碼所 述獨特的蛋白質(zhì)成員的表達載體序列有差異。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述至少兩個細胞群體是相同的，只是編碼所述獨特的 蛋白質(zhì)成員的可變區(qū)的至少一種表達載體序列有差異。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述多克隆蛋白質(zhì)的至少一種獨特成員包含一個恒定 區(qū)，而至少一種其它獨特成員包含不同的恒定區(qū)。
23.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述多克隆蛋白質(zhì)的至少一種獨特成員包含 一種糖基化樣式，而至少一種其它獨特的成員包含不同的糖基化樣式。
24.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述多克隆蛋白質(zhì)包含至少三種獨特成員。
25.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述多克隆蛋白質(zhì)是分泌的。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述多克隆蛋白質(zhì)是多克隆抗體或多克隆抗體片段。
27.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述多克隆蛋白質(zhì)是多聚體蛋白質(zhì)。
28.權(quán)利要求1-27中任一項的方法，其中所述細胞是原核的。
29.權(quán)利要求1-27中任一項的方法，其中所述細胞是真核的。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述真核細胞來自真核生物體，其選自下組植物、酵母、 真菌、脊椎動物和無脊椎動物。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述哺乳動物細胞選自下組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、 COS細胞、BHK細胞、骨髓瘤細胞、NIH 3T3細胞、成纖維細胞、羊膜細胞、永生化人細胞，諸如 HeLa細胞、HEK293細胞和PER. C6細胞。
33.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其進一步包括制備和/或其后純化期間的至少一 個步驟以驗證所述多克隆蛋白質(zhì)的每個成員的存在和/或量。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備藥物產(chǎn)品的方法，所述藥物產(chǎn)品包含多克隆蛋白質(zhì)(例如多克隆抗體)的至少兩種獨特成員，其中每種獨特成員是通過不同細胞群體表達的。該方法至少牽涉初始步驟，其中分開培養(yǎng)表達多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員的細胞群體。在上游或下游加工以后的點組合各細胞群體或由各細胞群體表達的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生包含多克隆蛋白質(zhì)的獨特成員的單一藥物產(chǎn)品。
文檔編號C07K16/00GK102007146SQ200980113197
公開日2011年4月6日 申請日期2009年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者喬納斯·H·格拉弗森, 克里斯琴·莫勒, 安妮·B·托爾斯特魯普, 拉斯·S·尼爾森, 芬恩·C·韋伯格, 迪特瑪·威爾古尼 申請人:西福根有限公司