專利名稱：：干酪乳桿菌Zhang中GroEL的蛋白序列的制作方法干酪乳桿菌Zhang中GroEL的蛋白序列
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種蛋白編碼序列，特別是一種干酪乳桿菌Zhang中GroEL的蛋白序列。
背景技術(shù)：
：益生菌是指通過攝入適當(dāng)量從而對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的活菌，乳桿菌亦是這一大家族中的主要成員。它們不僅可以加工成各種食品通過消化道發(fā)揮有益作用，還可以外用于同樣存在固有菌群的泌尿系統(tǒng)和皮膚。常見功能主要包括保持腸道正常菌群，對(duì)抗感染、緩解乳糖不耐癥、降低膽固醇、抑制癌癥和剌激免疫系統(tǒng)。最近幾年的臨床研究熱點(diǎn)集中于炎癥性胃腸病、過敏、外科感染、抗生素相關(guān)腹瀉、婦科感染、粘膜免疫、癌癥以及肥胖等相關(guān)癥狀上。由于益生菌與健康、營養(yǎng)、飲食的密切關(guān)系，越來越受到消費(fèi)者的重視。包含有功能性益生菌的食品與飲料消費(fèi)正成為全球的一項(xiàng)消費(fèi)趨勢(shì)。雖然有著很好的功能性，但其應(yīng)用范圍卻受到很大限制，由于對(duì)熱、濕度和其它苛刻的條件比較敏感。因此，能否適應(yīng)這些環(huán)境就成為篩選益生菌的首要條件之一。GroEL熱休克家族蛋白(又稱為分子伴侶，屬于Hsp60家族)，主要功能是幫助新合成的蛋白質(zhì)正確折疊和裝配，以保證蛋白質(zhì)有效地發(fā)揮功能，在乳桿菌適應(yīng)逆境過程中有著舉足輕重的作用。從結(jié)構(gòu)上來看，GroEL蛋白是同型寡聚復(fù)合物，由14個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量58Xl(f的亞基組成，形成兩層垛疊的背靠背雙環(huán)組成的中空?qǐng)A柱結(jié)構(gòu)，每個(gè)環(huán)由7個(gè)亞基組成。在GroEL的中央腔中可結(jié)合多種非天然的多肽，底物結(jié)合主要靠非天然多肽暴露的疏水側(cè)鏈和GroEL頂端結(jié)構(gòu)域的疏水殘基相互作用。早期基因突變的研究證明，GroEL在任何溫度下都是菌株細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的。它的突變會(huì)降低RNA和DNA合成速度，在非正常溫度下細(xì)胞不能進(jìn)行正常的分裂，和乳桿菌細(xì)胞的溫度脅迫反應(yīng)相關(guān)。新近的研究結(jié)果卻也表明，GroEL蛋白可能競(jìng)爭(zhēng)抑制約氏乳桿菌對(duì)于HT-29細(xì)胞的黏附，這也意味著該蛋白也分泌信號(hào)序列，有黏附功能和黏附關(guān)聯(lián)。本發(fā)明參考其它菌株GroEL基因序列，克隆測(cè)序獲得干酪乳桿菌Zhang(LactobacilluscaseiZhang)GroEL基因序歹lJ，并對(duì)不同物種GroEL基因核酸和氨基酸序列進(jìn)行相似性比較，為今后開展與干酪乳桿菌中GroEL蛋白的相關(guān)研究工作提供基礎(chǔ)資料。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白GroEL編碼序列，該序列是干酪乳桿菌Zhang應(yīng)激密切相關(guān)的基因，其核苷酸序列與已公布的干酪乳桿菌BL23的核酸序列FM177140和干酪乳桿菌ATCC334的核酸序列CP000423有99%的相似性。具體地，本發(fā)明提供了一種干酪乳桿菌Zhang中的熱休克蛋白GroEL的編碼序列，該序列的核苷酸序列為SEQIDN0:1，本發(fā)明還提供了一種分離出的干酪乳桿菌Zhang中的GroEL蛋白，該蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO:2。本發(fā)明還提供了SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。本發(fā)明還提供了一種干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白GroEL基因的克隆和測(cè)序方法。該方法包括步驟(l)PCR引物設(shè)計(jì)與合成；(2)干酪乳桿菌DNA的提?。?3)目的片斷的PCR擴(kuò)增；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(5)目的基因片斷回收與鑒定；(6)目的基因片斷的克隆與鑒定；(7)測(cè)序，其特征在于PCR引物為SEQIDN0:3(正向)和SEQIDN0:4(反向)，其序列信息如下SEQIDNO:3:5'-TGAAAAGCACACTATGTAA-3'SEQIDNO:4:5'-GAAGTATGAAGGTCAAGAC-3，具體地，各個(gè)步驟的詳細(xì)內(nèi)容如下(l)PCR引物設(shè)計(jì)與合成PCR引物對(duì)的正向引物和反向引物信息如下SEQIDNO:3(正向)5，-TGAAAAGCACACTATGTAA—3，；SEQIDNO:4(反向):5，-GAAGTATGAAGGTCAAGAC—3，;(2)干酪乳桿菌DNA的提取總DNA的提取參照QIAGEN的細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。具體操作步驟如下細(xì)菌培養(yǎng)液5ml，10，OOOrpm離心1分鐘，棄上清。加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37。C處理30-60分鐘。加入20蛋白酶K(20mg/ml)溶液，混勻。加220iU緩沖溶液GB，振蕩15秒。7(TC放置30分鐘。加入220無水乙醇，充分振蕩15秒。將溶液加入吸附柱中，12，OOOrpm離心30秒。加500去蛋白液GD，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。加700ii1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。加500y1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄掉廢液。再次12，OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加50-200ill洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘，12，OOOrpm離心30秒。離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌Zhang基因組DNA。(3)目的片斷的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系0.2iUTaq聚合酶(5U/ii1，TakaraTokyo,J即an)，2.5iiIIOXPCR緩沖液(withoutMg2+)，2ii1d證(2.5mMeach)，2ii1MgCl2(25mM)，0.2ii1正向引物(50pM)，0.2ii1反向引物(50pM)，liil基因組DNA和17.4ii1ddH20.PCR擴(kuò)增條件97。C變性5min;95。C30s，55.5°C30s，72。C30s，如此進(jìn)行35次循環(huán)；72。C延伸10min，4。C10min。(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)取PCR產(chǎn)物5iU，同1iU上樣緩沖液混合均勻，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5iUDL2000Marker，120V/cm電壓下電泳30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)GDS-8000System(UVPBiomagingSystems)上留取照片。(5)目的基因片斷回收與鑒定片段的回收按照QIAGEN瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說明進(jìn)行。具體操作步驟如下在紫外燈下迅速將含有目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1.5ml的離心管中。膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，置5(TC水浴放置10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化。將溶化后的瓊脂糖塊移入吸附柱CA1或CA2中，13，000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體。將吸附柱放入同一個(gè)收集管中，在吸附柱中加入700ill漂洗液PW，13，OOOrpm，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。在吸附柱中加入500iU漂洗液PW，13，OOOrpm離心30秒，倒掉廢液。將離心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13，OOOrpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，晾干。將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-70°C水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘。13，OOOrpm離心1分鐘收集DNA溶液。(6)目的基因片斷的克隆與鑒定(6.1)感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線。過夜培養(yǎng)后挑取新鮮單菌落，接種到100mlLB培養(yǎng)基中，37t:搖菌培養(yǎng)2-3小時(shí)(160轉(zhuǎn)/分鐘)，至0D6。。達(dá)到0.4-0.5時(shí)將菌液移至滅菌預(yù)冷的100ml離心管中，冰浴10-15分鐘。4，000rpm，4t:離心10分鐘，回收細(xì)菌沉淀。加入20ml經(jīng)過過濾除菌并經(jīng)預(yù)冷的0.lMCaCl2懸浮細(xì)菌沉淀。冰浴10-15分鐘后于4，000rpm，4。C離心IO分鐘，回收細(xì)菌沉淀。加入4ml0.1MCaCl2懸浮細(xì)菌沉淀。該細(xì)胞可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。加甘油至終濃度為15%_20%，混勻，每份分裝成lOOiU于1.5mlEP管中，凍存于_70°C冰箱中。(6.2)回收片段同T載體的連接連接用TaKaRapMD18-TVector試劑盒。具體操作過程如下首先在EP管中制備下列連接反應(yīng)液pMD18-TVector(50ng/ii1)0.5ii1DNA20_40ng溶液1(試劑盒中的溶液)5ill力口dH20至10ii1Total10ii1然后將上述反應(yīng)液在16t:反應(yīng)30分鐘，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。(6.3)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從-7(TC冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶。將lOOiU感受態(tài)細(xì)胞加入10ii1連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘后于42t:水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加入400ii1液體LB培養(yǎng)基，37。C復(fù)活50分鐘后取100yl鋪于LB平板上，平板含0.1(V/V)的氨節(jié)青霉Amp(100mg/ml)X-gal(100iig/ml)和IPTG(lmM)。最后于37。C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。白色菌斑應(yīng)含重組質(zhì)粒。(6.4)轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號(hào)筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動(dòng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物同Marker—起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。得到目的片段后，用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落，放入40ml含0.1%(V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)粒回收和測(cè)序。(7)測(cè)序經(jīng)過測(cè)序得到SEQIDNO:1所示的編碼熱休克蛋白GroEL的核苷酸序列。本發(fā)明提供的新的干酪乳桿菌Zhang中的熱休克蛋白GroEL編碼基因在乳桿菌處于應(yīng)激環(huán)境中有著非常重要的作用。對(duì)這個(gè)基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，有益于乳酸菌益生菌株的篩選、遺傳改造和應(yīng)用。具體實(shí)施方式下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白GroEL編碼基因的克隆和測(cè)序。本發(fā)明測(cè)序得到的片斷經(jīng)過相似性比較為熱休克蛋白GroEL編碼基因的全序列。1、實(shí)驗(yàn)方法1.IPCR引物設(shè)計(jì)與合成PCR引物根據(jù)GenBank提供的相關(guān)序列(AccessionNo:FM177140;CP000423)采用Primer5.0自行設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對(duì)的核苷酸序列分別為SEQIDNO:3(正向)和SEQIDNO:4(反向)，序列信息如下SEQIDNO:3(正向):5，-TGAAAAGCACACTATGTAA—3，;SEQIDNO:4(反向):5，-GAAGTATGAAGGTCAAGAC—3，;1.2干酪乳桿菌DNA的提取?？侱NA的提取參照QIAGEN的細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。具體操作步驟如下細(xì)菌培養(yǎng)液5ml，10，OOOrpm離心1分鐘，棄上清，加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37。C處理50分鐘，加入20蛋白酶K溶液(20mg/ml)，混勻。加220ii1緩沖溶液GB，振蕩15秒。7(TC放置30分鐘。加入220y1無水乙醇，充分振蕩15秒。將溶液加入吸附柱中，12，OOOrpm離心30秒。加500y1去蛋白液GD，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。加700ii1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。加500y1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄掉廢液。再次12，OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加2001洗脫緩沖液TE，室溫置4分鐘，12，OOOrpm離心30秒。離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌Zhang基因組DNA。1.3目的片斷的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系0.2iUTaq聚合酶(5U/ii1，TakaraTokyo,J即an)，2.5iiIIOXPCR緩沖液(withoutMg2+)，2ii1d證(2.5mMeach)，2ii1MgCl2(25mM)，0.2ii1正向引物(SEQIDNO:3)(50pM)，0.2iU反向引物(SEQIDNO:4)(50pM)，1基因組DNA禾口17.4ii1ddH20.PCR擴(kuò)增條件97。C變性5min;95。C30s，55.5°C30s，72。C30s，如此進(jìn)行35次循環(huán)；72。C延伸10min，4。C10min。1.4瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)取PCR產(chǎn)物5iU，同1上樣緩沖液混合均勻，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5iUDL2000Marker，120V/cm電壓下電泳30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)GDS-8000System(UVPBiomagingSystems)上留取照片。1.5目的基因片斷回收與鑒定片段的回收按照QIAGEN瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說明進(jìn)行。在紫外燈下迅速將含有目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1.5ml的離心管中。膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，置5(TC水浴放置10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化。將溶化后的瓊脂糖塊移入吸附柱CA1中，13，000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體。將吸附柱放入同一個(gè)收集管中，在吸附柱中加入700iil漂洗液PW，13，OOOrpm，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。在吸附柱中加入500iil漂洗液PW，13，000rpm離心30秒，倒掉廢液。將離心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13，OOOrpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，晾干。將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-7(TC水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘。13，OOOrpm離心1分鐘收集DNA溶液。1.6目的基因片斷的克隆與鑒定1.6.1感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線。過夜培養(yǎng)后挑取新鮮單菌落，接種到100mlLB培養(yǎng)基中，37t:搖菌培養(yǎng)3小時(shí)(160轉(zhuǎn)/分鐘)，至0D6。。達(dá)到0.4-0.5時(shí)將菌液移至滅菌預(yù)冷的100ml離心管中，冰浴15分鐘。4，000rpm，4t:離心10分鐘，回收細(xì)菌沉淀。加入20ml經(jīng)過過濾除菌并經(jīng)預(yù)冷的0.1MCaC12懸浮細(xì)菌沉淀。冰浴15分鐘后于4，000rpm，4。C離心10分鐘，回收細(xì)菌沉淀。加入4ml0.1MCaC12懸浮細(xì)菌沉淀。該細(xì)胞可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。加甘油至終濃度為15%_20%，混勻，每份分裝成100iU于1.5mlEP管中，凍存于_70°C冰箱中。1.6.2收片段同T載體的連接連接用TaKaRapMD18-TVector試劑盒。操作過程如下首先在EP管中制備下列連接反應(yīng)液pMD18-TVector(50ng/ii1)0.5ii1DNA20-40ng溶液1(試劑盒中的溶液)5iil力QdH20至10ii1Total10ii1將上述反應(yīng)液在16t:反應(yīng)30分鐘，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。1.6.3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從-7(TC冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶。將lOOiU感受態(tài)細(xì)胞加入10ii1連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘后于42t:水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加入400ii1液體LB培養(yǎng)基，37。C復(fù)活50分鐘后取100yl鋪于LB平板上，平板含0.1(V/V)的氨芐青霉Amp(100mg/ml)X-gal(100iig/ml)和IPTG(lmM)。最后于37。C恒溫培養(yǎng)15小時(shí)。白色菌斑應(yīng)含重組質(zhì)粒。1.6.4轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號(hào)筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動(dòng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物同Marker—起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。得到目的片段后，用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落，放入40ml含0.1%(V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)粒回收和測(cè)序。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過測(cè)序得到SEQIDNO:1所示編碼GroEL基因的核苷酸序列。3、結(jié)論克隆測(cè)序得到的GroEL基因的全長(zhǎng)核苷酸序列。實(shí)施例2:干酪乳桿菌Zhang中GroEL基因的序列信息與生物信息學(xué)分析。本發(fā)明新的干酪乳桿菌GroEL全長(zhǎng)CDS的長(zhǎng)度為1635bp，詳細(xì)序列見SEQIDNO:1。根據(jù)全長(zhǎng)CDS推導(dǎo)出干酪乳桿菌Zhang中GroEL的氨基酸序列，共387個(gè)氨基酸殘基，詳見SEQIDN0:2，在線預(yù)測(cè)(http:〃麗w.expasy.ch/tools/pi_tool.html)結(jié)果顯示，其分子量為57365道爾頓，等電點(diǎn)(pi)為4.89。將干酪乳桿菌GroEL相關(guān)的全長(zhǎng)CDS序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在GenBank的非冗余數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)相似性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與已公布序列的干酪乳桿菌GroEL在核苷酸水平和氨基酸水平上都具有99%的相似性。與其它乳桿菌如鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusHN001)、植物乳桿菌(Lactobacillusplanta進(jìn)WCSFl)、清酒乳桿菌(Lactobacillussakeisubsp.sakei23K)、腐酒乳桿菌(LactobacillushomohiochiiATCC15434)等編碼的GroEL基因也都有著較高的相似性(具體的相似度參見表1)。由此可見，GroEL基因在乳桿菌不同物種間有著較高的保守性。通過檢索由歐洲生物信息研究所(EMI)開發(fā)的Interpro數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)它有著GroEL蛋白典型的伴侶素蛋白Cpn60(PR00298)結(jié)構(gòu)域特征。在其它乳桿菌中GroEL已經(jīng)被證明在乳桿菌應(yīng)激過程中有著非常重要的作用，可以認(rèn)為GroEL在干酪乳桿菌應(yīng)激的過程中也具有相似的作用。3、結(jié)論通過上述操作，表明本發(fā)明得到了編碼干酪乳桿菌Zhang中的GroEL蛋白的基因序列及其氨基酸序列。表1:本發(fā)明得到與其它乳桿菌的編碼干酪乳桿菌Zhang中的GroEL基因序列具有很高的相似度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表〈110〉內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉干酪乳桿菌Zhang中GroEL的蛋白序列〈130〉〈160〉4〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1635〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉1atggcaaaagaaattaaattctctgaagac60cagttggcaaacacagttaagacaacctta120aagagctatggctcaccggaaattaccaat180ttggaagatcactacgaaaacatgggcgcc240aatgacattgctggtgatggtaccacaacc300gaaggcatgaagaacgttacagccggtgct360aaggcaactaaggctgccgttgacgaattg420aaagaaatcgcgcaggttgcgtccgtttct■gctgacgccatggaaaaagttggccacgat54010gcacgtgctgggacc^^ggacggtgtca■gttggttggcaacggtttaatcctgttgtcctcaaataggtgtgattecaatgctgcggccgcaacgtc^ttgcg^ccgaagttgctggC3C^3ggcattcgcacgCC3C^3gtc卿agttggcggcgttgattgttttggacgtccattgacttccaagacatattatccgctagtctgatt■gc^agggattgacactg600tacatggtta660720c^ggteagg780gttctgaaca840gatcggcgte900tctgaccttg960gteacggtte1020gctg咖ggg1080g^^gttgc1140gccgctactg1200acccgtgccg1260ttgcctgcag1320ctacgtgcgc1380gtcatcgttg14401500ttgc^^cg1560■gccagatc1620ggcggtetga1635〈210〉2aactctctgtccgateatgaagatttccaacactgttgat卿ttcgtggaggctcaactgcttggatctcc^ggac^■gagcgtttcggttga卿ttgctgcttt^cagctg^ccgcttccgttgtaatgttg卿ggtattcaggaccattgctgactaccttcaatte^gacacccaccacgattc^g^gc^ggcteagtteg^gg^cgcaggttacgttg^ag^g^tgttcgccagg^gg^^ggtcaggtatttgctgctttgtaataatgctatgcagtttggctgaccttgattttgccgcgacgttgctggttgttgcgggctaccttga■gcttg^cgttgatggcgattgatgacagctggcggtggctggcggcgggcgacgttcattgctgagac卿gcgttgattgacccaaatgctgacgagccgctggtgatcgcggctaacgatccttattaaggccccctggtggtec■ttgggtcgctggctctaaCg3CC3gtg3ttgcggttgttcg^gatgcgtacagctct■accgggat3CgCCggC33gttacaatgccc^agtgacctgaagccgtctaacccagctctgagccaatatcttgatcaatcgttcaagccaaccttatggctttggtcgtgatcagttgCCggC33gggatgccattcttcgaccgtc卿gttggttttgaatgcgggt卿tgttcaacatcgtgcgctactgatccgttctgcatgttgctgat3gC3ggC3tg〈211>387〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>2MetAlaLysLysSerAspAlaArgAlaAlaMetArgGlyValAspAla151015AsnThrValLysThrThrGlyLysGlyArgAsnValValAspLysSer202530TyrGlySerThrAsnAspGlyValThrAlaLysSerAspAspHisTyr354045AsnMetGlyAlaLysValAlaValAlaSerLysThrAsnAspAlaGly505560AspGlyThrThrThrAlaThrValAlaSerArgGlyMetLysAsnVal65707580ThrAlaGlyAlaAsnValGlyArgThrGlyLysAlaThrLysAlaAla859095ValAspHisLysSerHisLysValAsnGlyLysLysAlaValAlaSer100105110ValSerSerSerAsnThrValGlySerAlaAspAlaMetLysValGly115120125HisAspGlyValThrSerLysGlyAspThrSerValValGlyMetAsp130135140ArgGlyTyrSerTyrMetValThrAspAsnAspLysMetAlaAspAsp145150155160AspTyrThrAspLysLysSerAsnAspValGlyLysAlaAlaAspAsp165170175ValAlaGlyAlaThrValAsnLysArgGlyThrAsnValValAlaVal180185190LysAlaGlyGlyAspArgArgLysAlaAspAlaThrThrGlyGlyThr195200205ValSerSerAspGlyAspLysAspThrLysGlyArgAlaGlyLysVal210215220ThrValThrLysAspAsnThrThrValAspGlyAlaGlySerLysAsp225230235240AlaAlaArgValAsnLysLysAspAspThrThrSerAspAspArgLys245250255ArgAlaLysAlaGlyGlyValAlaValValLysValGlyAlaAlaThr12260265270ThrLysArgLysTyrArgAspAlaAsnAlaThrArgAlaAlaValGly275280285TyrValAlaGlyGlyGlyThrAlaValAspValAlaValAlaAlaLys290295300GlyAspValThrGlyAsnValArgAlaValArgAlaAsnAlaGlyLys305310315320GlySerValValLysLysLysGlyValGlyTyrAsnAlaAlaThrAsp325330335TrpAspMetAlaLysSerGlyAspThrLysValThrArgSerAlaAsn340345350AlaAlaSerValAlaAlaMetThrThrAlaValValAlaAspLysAsp355360365AsnAlaAsnAsnAsnAlaAlaAlaGlyAlaAsnAlaAlaGlyMetGly370375380GlyMetMet385〈210>3〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>3tgjmaagcacactetgtea19〈210〉4〈211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉4[0232:g肪gtatg朋ggtc肪gac[0233:19權(quán)利要求一種干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白GroEL編碼序列，其特征在于該序列是干酪乳桿菌Zhang應(yīng)激密切相關(guān)的基因，其核苷酸序列與干酪乳桿菌BL23的核酸序列FM177140和干酪乳桿菌ATCC334的核酸序列CP000423具有99％的相似性。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的序列，其特征在于核苷酸序列為SEQIDN0:1。3.—種分離出的干酪乳桿菌Zhang中的GroEL蛋白，其特征在于該蛋白為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。4.權(quán)利要求3所述的蛋白，其特征在于該蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO:2。5.—種干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白GroEL基因的克隆和測(cè)序方法，該方法包括步驟(l)PCR引物設(shè)計(jì)與合成；(2)干酪乳桿菌DNA的提??；(3)目的片斷的PCR擴(kuò)增；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(5)目的基因片斷回收與鑒定；(6)目的基因片斷的克隆與鑒定；(7)測(cè)序，其特征在于PCR引物的正向引物為SEQIDNO:3和反向引物為SEQIDN0:4，其序列信息如下SEQIDNO:3:5'-TGAAAAGCACACTATGTAA-3'SEQIDNO:4:5'-GAAGTATGAAGGTCAAGAC-3，。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于干酪乳桿菌DNA的提取步驟如下細(xì)菌培養(yǎng)液5ml，10，OOOrpm離心1分鐘，棄上清；加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37。C處理30-60分鐘；加入20蛋白酶K溶液，其濃度為20mg/ml，混勻；加220ii1緩沖溶液GB，振蕩15秒；7(TC放置30分鐘；加入220y1無水乙醇，充分振蕩15秒；將溶液加入吸附柱中，12，OOOrpm離心30秒；加500y1去蛋白液GD，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液；加700ii1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液；加500y1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄掉廢液；再次12，OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加50-200ii1洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘，12，OOOrpm離心30秒；離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌Zhang基因組DNA。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于目的片斷的PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為0.2iUTaq聚合酶，2.5ii110XPCR緩沖液，2ii1dNTP，2iilMgCl2，0.2ii1正向引物，0.2ii1反向引物，lP1基因組DNA和17.4ii1ddH20，擴(kuò)增條件為97。C變性5min;95°C30s，55.5°C30s，72。C30s，如此進(jìn)行35次循環(huán)；72。C延伸10min，4。C10min。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的步驟為取PCR產(chǎn)物5iU，同liU上樣緩沖液混合均勻，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5iUDL2000Marker,120V/cm電壓下電泳30min，電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)GDS-8000System上留取照片。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于目的基因片斷回收與鑒定的操作步驟如下在紫外燈下迅速將含有目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1.5ml的離心管中；膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，置5(TC水浴放置10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化；將溶化后的瓊脂糖塊移入吸附柱CA1或CA2中，13，000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體；將吸附柱放入同一個(gè)收集管中，在吸附柱中加入700ii1漂洗液PW，13，OOOrpm，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；在吸附柱中加入500iil漂洗液PW，13，000rpm離心30秒，倒掉廢液；將離心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13，000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液；將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，晾干；將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-7(TC水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘；13，OOOrpm離心1分鐘收集DNA溶液。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于目的基因片斷的克隆與鑒定的步驟如下感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線；過夜培養(yǎng)后挑取新鮮單菌落，接種到100mlLB培養(yǎng)基中，37t:搖菌培養(yǎng)2-3小時(shí)，至0D6。。達(dá)到0.4_0.5時(shí)將菌液移至滅菌預(yù)冷的100ml離心管中，冰浴10-15分鐘；4，000rpm，4。C離心10分鐘，回收細(xì)菌沉淀；加入20ml經(jīng)過過濾除菌并經(jīng)預(yù)冷的0.lMCaCl2懸浮細(xì)菌沉淀；冰浴10-15分鐘后于4，000rpm，4t:離心10分鐘，回收細(xì)菌沉淀；加入4ml0.1MCaCl2懸浮細(xì)菌沉淀；該細(xì)胞可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；加甘油至終濃度為15%-20%，混勻，每份分裝成100iil于1.5mlEP管中，凍存于-7(TC冰箱中；回收片段同T載體的連接首先在EP管中制備下列連接反應(yīng)液pMD18-TVector0.5ii1DNA20-40ng溶液15ill加dH20至10illTotal10ill然后將上述反應(yīng)液在16t:反應(yīng)30分鐘，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從_701:冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶；將1001感受態(tài)細(xì)胞加入lOiU連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘后于42t:水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘；加入400y1液體LB培養(yǎng)基，37t:復(fù)活50分鐘后取100yl鋪于LB平板上，平板含0.1的氨芐青霉AmpX-gal和IPTG;最后于37t:恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)；白色菌斑應(yīng)含重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號(hào)筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落；將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液的EP管中晃動(dòng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物同Marker—起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；得到目的片段后，用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落，放入40ml含0.1%的青霉素鈉LB液體培養(yǎng)基中，37t:過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)粒回收和測(cè)序。全文摘要本發(fā)明涉及一種干酪乳桿菌Zhang中GroEL的蛋白序列，提供了一種新的干酪乳桿菌熱休克蛋白GroEL的編碼核苷酸序列，該序列是干酪乳桿菌Zhang應(yīng)激密切相關(guān)的基因，該序列的核苷酸序列與已公布的干酪乳桿菌BL23的核酸序列FM177140和干酪乳桿菌ATCC334的核酸序列CP000423有99％的相似性。本發(fā)明還提供了干酪乳桿菌Zhang中的GroEL基因的核酸序列，該核酸序列為SEQIDNO1，本發(fā)明還提供了一種分離出的干酪乳桿菌Zhang熱休克蛋白GroEL的氨基酸序列，該序列的氨基酸序列為SEQIDNO2。文檔編號(hào)C07K14/195GK101705235SQ20091025067公開日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年12月14日優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日發(fā)明者孫志宏,孟和,張和平,張文羿申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)