專利名稱：分離Ⅲ型前膠原氨基末端肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離II I型前膠原氨基末端肽的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的提純方法是都采用了 DEAE-S印hacel離子交換柱及S印hacryl分子篩， 經(jīng)驗(yàn)證此法純化效率不高，雜蛋白與活性峰分不開(kāi)，而且純化的pIIIINP活性不高，活 性下降極快，純度無(wú)法滿足高精度實(shí)驗(yàn)要求。最主要是，得率太低，經(jīng)測(cè)算(RIA-Gnost Prokollagen-III-Peptid)，用此法提純95 %的PIIINPlmg需要PIIINP的有效含量達(dá) IOOmg以上。第一步加(NH4) 2S04沒(méi)有分級(jí)將大部雜質(zhì)帶入后續(xù)階段，而且這一步也僅能去掉 10%的雜蛋白。
純化前40%(NH4)2S04 1 20%~48%(NH4)
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孑iiinp 含量 ~Tmg一 0.826mg0.923m^~
、蛋白 —IOOOmg900mg850mg上述方法所用的DEAE-S印hacel離子交換柱及S印hacryl分子篩分辨率不高是造 成純度低、效率低的主要原因，長(zhǎng)時(shí)間采用pH4. 5和pH8. 5的緩沖液洗脫及未完全去除的雜 質(zhì)導(dǎo)致pIIIINP活性不高。采用(NH4) 2S04沉淀，二次不同pH的及S印hacel S-200分子篩柱層析從人癌性 腹水中分離并純化了 PIIINP，并制備了抗血清，經(jīng)取癌性腹水3L，加固體(NH4) 2S04到40% 飽和度，攪拌過(guò)夜，靜置4h，16000g離心20min，棄上清液，將沉淀溶于50mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA,2mmol/LNEM,2mmol/LPMB,lmmol/LPMSF, 2mmol/L ICH2C00Na,2mmol/ L(NH2)2C0的緩沖液中，pH8. 6。并與該緩沖液做充分透析，以除去樣品中的(NH4)2S04。 經(jīng)DEAE-S印hacel離子交換柱層析，用上述緩沖液做NaCl階段洗脫。洗脫后的活性峰部 分與lOmmol/L檸檬酸鹽緩沖液pH4. 5充分透析后，25000g離心60min。取上清液，再經(jīng)
DEAE-S印hacel離子交換柱，用0-0. 6mmol/LNaCl, 10mmol/L檸檬酸鹽緩沖液pH4. 5作
線性梯度洗脫，在232nm處檢測(cè)蛋白峰，用西德PIIIP藥盒檢測(cè)PIIIP活性峰，合并活性峰 部分，與10mmol/LNH4HC03充分透析后，冷凍干燥，經(jīng)S印hacryl S-200分子篩柱層析，收集 PIIIP活性峰，合并，與10mmol/LNH4HC03充分透，分裝，冷凍干燥，置-20C保存。全部提純 過(guò)程均在4-8C下進(jìn)行。上述方法的缺點(diǎn)1)純化效率、純度不高，雜蛋白與活性峰分不開(kāi)； 2)純化的pIIIINP活性不高，活性下降極快。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決III型前膠原氨基末端肽的提取方法、效率、純度、活性的問(wèn) 題。采用硫酸氨分級(jí)分離發(fā)法，第一步將雜質(zhì)減少了 5.5%，而得率增加了 11.7%。采用Qsepharose FF，上樣量大，流速快，分辯高，大大提高了效率。進(jìn)一步分離未采用pH4. 5和 PH8. 5的緩沖液變換洗脫，而采用對(duì)蛋白有保護(hù)作用的疏水層析，純度和活性顯著提高，用 高分辨率的Superdex200代替S印hacryl200，進(jìn)一步提高純度。經(jīng)SDS-PAGE分析純度達(dá) 98%，活性是現(xiàn)有技術(shù)的10倍。
具體實(shí)施例方式為了獲得免疫活性好的抗體，從人癌性腹水中提取PIIINP，免疫家兔。取癌性病 人腹水2升，10000RPM離心，目的是去掉組織塊和癌性細(xì)胞；這一步必須穿戴防護(hù)手套和眼 鏡， 因?yàn)闆Q大多數(shù)肝癌病人都攜帶肝炎病毒；俯■至"40 60% (ffi縣醜λ·靴)白側(cè)定，加 后要攪拌i寸夜，10000RPM離心，收集沉淀，棄卜.清由于腹水雜蛋白含量達(dá)80mg/ml，而有效含量60 600ng/ml，僅為百萬(wàn)分之一，所 以直接用柱層析方法是不可能將痕量的PlIINP分離出來(lái)。根據(jù)序列分析，PIIINP的等電 點(diǎn)為 5. 71。因此，用BufferA透析上述沉淀并使?jié)舛葹閘mg/ml，調(diào)溶液的pH為5. 6，攪拌 4個(gè)小時(shí)，10000RPM離心，收集沉淀，棄上清；用BufferA透析上述沉淀并使?jié)舛葹閘mg/ml，上陰離子交換柱去掉鹼性蛋白的同 時(shí)，收集40 60% (BufferB)部分；上述收集物用BufferC (0. Im HAC-NaAC, pH4. 4)透析，上陽(yáng)離子交換柱 CM-S印haroseFF，去掉酸性蛋白的同時(shí)，用BufferC和BufferA進(jìn)行梯度洗脫，收集20 50 餾分；濃縮成5mg/ml，取200ul上superdex200分子篩層析，收集45KD位置的峰，濃縮成 lmg/ml，加入疊氮鈉，PMSF，最后進(jìn)行純度鑒定和免疫學(xué)鑒定，將合格品保存；用法國(guó)CIS公司的三型前膠原肽免放藥盒0CFK07-PIIIP (國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理 局特殊藥品進(jìn)口準(zhǔn)許證P-04-05-27-03)檢驗(yàn)各峰中PIIINP的含量，獲得純度高的PIIINP 進(jìn)行免疫。用PIIINP-R和PIIINP-Ag分別標(biāo)記125I然后替代藥盒中的相同組份，檢驗(yàn)試劑盒 的各種組分。結(jié)果PIIINP-R組總有部分(且只有部分)組分完全符合免疫學(xué)檢驗(yàn)對(duì)藥盒 的各項(xiàng)指標(biāo)，但BO偏低。而PIIINP-Ag各項(xiàng)指標(biāo)BO達(dá)到70以上，但非特異稍高。本發(fā)明解決了 III型前膠原氨基末端肽的提取方法的問(wèn)題。首先在初提階段增加 20%硫酸氨分級(jí)沉淀為以后的進(jìn)一步分離奠定了基礎(chǔ)。選用高分辯率的Qsepharose FF(陰 離子交換柱)Superdex200 (分子蹄層析)。選用 Phenylsepharose Highperformence (疏 水層析柱)，避免用PH4. 5和pH8. 5的緩沖液變換洗脫。選用Qwpharose FF(陰離子交換 柱)Phenyls^harose Highperformence (疏水層析柱)，使分離效率大大提高。離子交換和 分子篩層析選用高分辯率的Qs印harose FF (陰離子交換柱)SuperdeUOO (分子篩層析)， 使得純度的提高。避免用PH4. 5和pH8. 5的緩沖液變換洗脫，通過(guò)提高純度提高活性。
權(quán)利要求
1. 一種分離III型前膠原氨基末端肽的方法離體腹水2升,提取PIIINP, 10000RPM離心，收集硫酸氨濃度汰到40 60%的餾分，方 法為加入硫酸氨后攪拌過(guò)夜，10000RPM離心，收集沉淀，棄上清；用BufferA透析上述沉淀 并使?jié)舛葹閘mg/ml，調(diào)溶液的pH為5. 6，攪拌4個(gè)小時(shí)，10000RPM離心，收集沉淀，棄上清； 用BufferA透析上述沉淀并使?jié)舛葹閘mg/ml，上陰離子交換柱去掉鹼性蛋白的同時(shí)，收集 40 60%即BufferB部分；上述收集物用BufferC 0. Im HAC-NaAC, pH4. 4透析，上陽(yáng)離子 交換柱CM-kpharoseFF，去掉酸性蛋白的同時(shí)，用BufferC和BufferA進(jìn)行梯度洗脫，收集 20 50餾分；濃縮成5mg/ml，取200ul上superdex200分子篩層析，收集45KD位置的峰， 濃縮成lmg/ml，加入疊氮鈉，PMSF。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離III型前膠原氨基末端肽的方法，解決了III型前膠原氨基末端肽的提取方法、效率、純度、活性的問(wèn)題，采用硫酸氨分級(jí)分離發(fā)法，第一步將雜質(zhì)減少了5.5％，而得率增加了11.7％，采用Qsepharose FF，上樣量大，流速快，進(jìn)一步分離未采用pH4.5和pH8.5的緩沖液變換洗脫，而采用對(duì)蛋白有保護(hù)作用的疏水層析，純度和活性大大提高，用高分辨率的Superdex200代替Sephacryl200，進(jìn)一步提高純度，經(jīng)SDS-PAGE分析純度達(dá)98％，活性是現(xiàn)有技術(shù)的10倍。
文檔編號(hào)C07K1/30GK102093465SQ200910250478
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者趙玉軍 申請(qǐng)人:北京北方生物技術(shù)研究所