專利名稱：原膠原c端蛋白酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制原膠原C端蛋白酶的化合物，含有它們的藥物組合物，它們的使用方法，和用于制備這些化合物的方法。
膠原為結(jié)締組織的組成部分。目前已有19種類型的膠原被鑒定。間質(zhì)膠原型I、II、III是主要的組織膠原組成。這些膠原由含氨基和羧基末端的肽延伸鏈的原膠原前體分子合成。含氨基和羧基末端肽鏈也稱為前體區(qū)(pro-regions)。這些前體區(qū)的斷裂是基于原膠原分泌產(chǎn)生成熟的膠原分子，能夠參與膠原纖維高級結(jié)構(gòu)的建立。(見如Fesslcr和Fcssler，Anna.Rev.Biochem.47，129，(1978)；Kivirikko等，Extrawellular MatrixBiochemistry(1984)及Kuhn，膠原類型的結(jié)構(gòu)與功能(eds Mayne，R和Burgeson，R.E.)，Academic Press，Inc.，Orlando，F(xiàn)lorida pp 1-42(1987)。
過量的膠原沉積與多種纖維變性疾病有關(guān)，如間質(zhì)性肺纖維變性、中樞周圍纖維化、Symmers’纖維變性、外周肌肉纖維變性，腎纖維變性，心內(nèi)膜硬化、肝炎、急性呼吸窘迫綜合癥、關(guān)節(jié)炎、膀胱纖維變性、外科手術(shù)粘連、腱外科、角膜疤痕形成、硬皮病、慢性同種移植排斥反應(yīng)、血液透析分流纖維變性和再狹窄。這些疾病特征在于對抗蛋白分解的原纖維間質(zhì)膠原的過度沉積從而導(dǎo)致纖維變性癥狀。因此，抑制這些膠原沉積的病理變化將有助于治療這些疾病。
最近研究表明原膠原C端蛋白酶是催化I、II、III型膠原C-原肽斷裂的主要酶，從而有助于功能膠原纖維的形成。(見Fertala等，J.Biol.Chem.，269，11584，(1994))。因此，有必要提供原膠原C端蛋白酶抑制劑從而提供通過調(diào)節(jié)膠原過度沉積而戰(zhàn)勝這些疾病的方法。因此，在第一個方面，本發(fā)明提供了選自下組由式(I)表示的化合物 其中，R1和R4相互獨(dú)立，為氫或烷基；R2為(i)環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，雜芳基，雜芳烷基，雜芳烯基，雜環(huán)或雜環(huán)烷基；或(ii)-(亞烷基)-B-X其中B為-O-、-NR8-、-S(O)n-(其中n為0、1或2)、-C＝O-、-CONR8-、-NR8CO2-、-NR8SO2-或-C(＝NR8)NR8SO2-(其中R8為H或烷基)，X為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基雜芳基，或雜芳烷基；或(iii)-(亞烷基)-B-X其中B為NR8CO(其中R8為H或烷基)，X為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，或雜芳烷基；或(iv)R2和R3形成亞烷基或雜亞烷基鏈；R3為氫或烷基；R6為氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基或雜芳烷基；R5為(i)氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，雜芳基，雜芳烷基，雜芳烯基，雜環(huán)烷基，雜烷基，或-(亞烷基)-C(O)-X1，其中X1為烷基，羥基，烷氧基，芳基，芳烷基，芳氧基，芳烷氧基、雜芳基，雜芳氧基，雜芳烷氧基，或NR’R”(R’和R”相互獨(dú)立為H或烷基，或R’和R”形成亞烷基鏈)；或(ii)R4和R5形成一條亞烷基鏈；或(iii)R5和R6形成一條亞烷基鏈；n為0或1；A為-C(＝O)-CH(R9)-(CH2)m-N(R10)-，其中，m為0-5的整數(shù)；R9為氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，雜芳烷基，雜環(huán)烷基，雜烷基，或-(亞烷基)-C(O)-X1，其中X1為烷基，羥基，烷氧基，芳基，芳烷基，芳氧基，芳烷氧基、雜芳基，雜芳氧基，雜芳烷氧基，或NR’R”(R’和R”相互獨(dú)立，為H或烷基，或R’和R”形成亞烷基鏈)；和R10為氫，烷基，芳烷基，或雜芳烷基；Z為Y-B其中，Y為亞烷基或單鍵；和B為-CO-，-C(O)O-，-CONR8-，-SO2-，或SO2NR8-(其中R8為氫或烷基)，亞烷基(任選被羥基、烷氧基、氨基、單烷基氨基或二烷基氨基取代)或單鍵；R7為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，或雜芳烷基；條件是當(dāng)n＝0和Z為SO2時，那么R2不含有咪唑基；和它們藥物可接受的鹽、前體藥物、單獨(dú)的異構(gòu)體、異構(gòu)體的混合物。
在第二個方面，本發(fā)明提供了通過服用選自式(I)表示化合物的原膠原C端蛋白酶抑制劑治療哺乳動物可治療疾病的方法在第三個方面，本發(fā)明提供了包括給藥治療有效量的式(I)化合物或其藥物可接受的鹽和藥物可接受賦形劑的藥物組合物。
在第四方面，本發(fā)明提供了通過給病人服用一種原膠原C端蛋白酶的選擇性抑制劑而治療疾病的方法。
在第五個方面，本發(fā)明提供了用于制備式(I)化合物的方法。
除非另有說明，用于本說明書和權(quán)利要求的下列術(shù)語具有下面給出的含義“烷基”指1-6個碳原子的直鏈飽和一價烴基，或3-6個碳原子的支鏈飽和一價烴基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、戊基等。
“亞烷基”指1-6個碳原子的直鏈飽和二價烴基，或3-6個碳原子的支鏈飽和二價烴基，例如亞甲基、亞乙基、亞丙基、2-甲基亞丙基、亞戊基等。
“雜亞烷基”指一個亞烷基鏈中亞甲基被O，S或NR’取代(其中R’為氫或烷基)。
“烯基”指含有至少一個雙鍵的2-6個碳原子的直鏈一價烴基，或3-6個碳原子的支鏈一價烴基，含有至少一個雙鍵，例如乙烯基、丙烯基等。
“亞烯基”指含有至少一個雙鍵的2-6個碳原子的直鏈二價烴基，或3-6個碳原子的支鏈二價烴基，例如亞乙烯基、2-亞丙烯基等。
“?；敝富鶊F(tuán)-C(O)R，其中R為氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，鹵代烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，雜芳基，雜芳烷基，雜芳烯基，或雜環(huán)，例如乙?；?，苯甲酰基，噻吩甲?；?。
“酰氧基”指基團(tuán)-OC(O)R，其中R為氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，或鹵烷基，例如乙酰氧基，3，3，3-三氟乙酰氧基等。
“酰氨基”指基團(tuán)-NRC(O)R’，其中R為氫或烷基，并且R’為氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，雜烷基，鹵烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，雜芳基，雜芳烯基，或雜芳烷基，例如乙酰氨基，三氟乙酰氨基，苯甲酰氨基，甲基乙酰氨基等。
“磺酰氨基”指基團(tuán)-NRSO2R’其中R為氫或烷基，并且R’為烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，雜烷基，鹵烷基，氨基，單取代氨基，雙取代氨基，芳基，芳烷基，雜芳基，雜芳烯基，或雜芳烷基，例如甲基磺酰氨基，苯甲基磺酰氨基，N-甲基氨基磺酰氨基等。
“鹵代”指氟代、氯代、溴代或碘代，優(yōu)選氟代和氯代。
“鹵代烷基”指被一個或更多的相同的或不同的鹵素原子取代的烷基，例如-CH2Cl，-CF3，-CH2CF3，-CH2CCl3等。
“環(huán)烷基”指3-6個環(huán)原子的飽和單價環(huán)烴基，例如環(huán)丙基，環(huán)己基，環(huán)戊烷基等。
“碳環(huán)”指3-8個環(huán)原子的飽和環(huán)基，所有環(huán)原子為碳，如環(huán)戊基、環(huán)己基等。
“芳基”指6-10個環(huán)原子的單價單環(huán)或雙環(huán)芳烴。該芳基任選稠合到碳環(huán)或雜環(huán)上，任選被一個或更多的取代基取代，優(yōu)選一個或兩個取代基，其中取代基選自烷基，雜烷基，鹵代烷基，鹵素，硝基，酰氧基，氰基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯基烷基，任選取代的雜芳基，任選取代的雜芳烷基，-OR(其中R為氫，烷基，鹵代烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基，雜芳基，任選取代的苯基烷基，或任選取代的雜芳烷基)，-NRR’(其中R和R’相互獨(dú)立為氫，烷基，烯基，鹵烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯基烷基，任選取代的苯烯基，雜芳基或雜芳烷基)，-C(O)R(其中R為氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，鹵代烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯烷基，任選取代的苯烯基，雜芳基，雜芳烷基或雜芳烯基)，-S(O)nR(其中n為0-2的整數(shù)，R為氫，(條件是n為0)，烷基，鹵代烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基，雜芳基，任選取代的苯基烷基，或雜芳烷基)，-SO2NRR’(其中R和R’獨(dú)立選自氫，烷基，烯基，鹵烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯基烷基，任選取代的苯烯基，雜芳基或雜芳烷基，或R和R’同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))，-COOH-(亞烷基)-COOH，-(亞烯基)-COOH，-COORa，-(亞烯基)-COORa，-(亞烷基)COORa(其中Ra為烷基，任選取代的苯烷基或雜芳烷基)，-CONR’R”，-(亞烷基)-CONR’R”(其中R’和R”獨(dú)立選自氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代苯烷基，雜芳基和雜芳烷基，或R和R’同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))，-NRC(O)R’(其中R為氫或烷基，R’為氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，鹵代烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯烷基，任選取代的苯烯基，雜芳基，雜芳烯基，雜芳烷基)，-NRSO2R’(其中R為氫或烷基，R’為烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，鹵代烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯烷基，任選取代的苯烯基，雜芳基，雜芳烯基，雜芳烷基)，或-NRSONR’R(其中R為氫或烷基，R’和R”相互獨(dú)立，為氫，烷基，烯基，鹵代烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，鹵代烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯烷基，任選取代的苯烯基，或R’和R”同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))。更具體的術(shù)語芳基包括但不限于苯基，1-萘基，2-萘基，四氫萘基，亞甲二氧基苯基，2，3-二氫化茚基，四氫萘基，二氫吲哚基，苯并二氫吡喃基，異苯并二氫吡喃基等。
“雜芳基”指含有一、二或三個選自N、O或S的環(huán)雜原子并且其余環(huán)原子為碳的5-10個環(huán)原子的單價單環(huán)或雙環(huán)芳基。雜芳環(huán)任選獨(dú)立被一個或更多的取代基取代，優(yōu)選一個或兩個取代基，其中取代基選自烷基，鹵代烷基，鹵素，硝基，氰基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯基烷基，-OR(其中R為氫，烷基，鹵代烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基或任選取代的苯基烷基)，-NRR’(其中R和R’分別獨(dú)立為氫，烷基，烯基，鹵烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯基烷基，或任選取代的苯烯基，或R和R’同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))，-C(O)R(其中R為氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，鹵代烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯烷基，任選取代的苯烯基)，-S(O)nR(其中n為0-2的整數(shù)，R為氫(條件是n為0)，烷基，鹵代烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基，或任選取代的苯基烷基)，-SO2NRR’(其中R和R’分別獨(dú)立為氫，烷基，烯基，鹵代烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯烷基，或任選取代的苯烯基，或R和R’同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))，-COOH，-(亞烷基)-COOH，-(亞烯基)-COOH，-COORa，-(亞烯基)-COORa，-(亞烷基)COORa(其中Ra為烷基，或任選取代的苯基烷基)，-CONR’R”或-(亞烷基)-CONR’R”(其中R’和R”獨(dú)立選自氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代苯基，任選取代的苯基烷基，或R和R”同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))，-NRC(O)R’(其中R為氫或烷基，R’為氫，烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，鹵代烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯基烷基，或任選取代的苯烯基)，-NRSO2R’(其中R為氫或烷基，R’為烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，鹵代烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯基烷基，或任選取代的苯基烯基)，-NRSONR’R(其中R為氫或烷基，R’和R”分別獨(dú)立為氫，烷基，烯基，鹵代烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，任選取代的苯基，任選取代的苯基烷基，或任選取代的苯烯基，或R’和R”同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))，或氨基保護(hù)基團(tuán)。更具體的術(shù)語雜芳基包括但不限于呋喃基，噻吩基，吡咯基，吡啶基，嘌呤基，嘧啶基，吡唑基，噻唑基，咪唑基，噻唑基，噻二唑基，吲哚基，氮雜吲哚基，苯并呋喃基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，喹啉基，異喹啉基，苯并三唑基，苯并吡喃基，和它們的衍生物。
“任選取代的苯基”指獨(dú)立被一個或更多的取代基任選取代的苯環(huán)，優(yōu)選一個或兩個取代基，其中取代基選自烷基，鹵代烷基，鹵素，氰基，硝基，-NRR’(其中R和R’分別獨(dú)立選自氫或烷基，或R’和R同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))，-OR(其中R為氫，烷基或鹵烷基)，-COORa(其中R為氫或烷基)，或-CONR’R”(其中R’和R”分別獨(dú)立選自氫和烷基，或R’和R”同時與氮原子相連，形成環(huán)氨基環(huán))。具代表性的例子包括但不限于4-氟苯基，3，4-二溴苯基，4-氯-2，5-二甲基苯基，2，4，5-三氯苯基，4-溴-2-三氟甲氧苯基，2-氯-4-三氟甲基，4-四丁基苯基，4-甲氧苯基，3-硝基苯基等。
“雜環(huán)”或“雜環(huán)基”指具有3-8個環(huán)原子的飽和或不飽和環(huán)基，其中一個或兩個環(huán)原子選自N、O或S(O)n(n為0到2的整數(shù))的雜原子并且其余環(huán)原子為碳，其中一個或兩個碳原子可以任選被羰基取代。雜環(huán)可以任選獨(dú)立被一個、兩個或三個取代基取代，其中取代基選自烷基，鹵代烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，雜芳烷基，鹵素，氰基，?；被被?，一取代氨基，二取代氨基，-OR(其中R為氫，烷基，鹵代烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，雜芳基，雜芳基烷基，雜芳基烯基)，S(O)nR[其中n為0到2的整數(shù)，R為氫(條件是n為0)，烷基，鹵代烷基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，氨基，一取代氨基，二取代氨基，芳基，雜芳基，芳基烷基，或雜芳基烷基]，-COOH，-(亞烷基)-COOH，-COORa，-(亞烷基)-COORa，(其中Ra為烷基，雜烷基，芳基烷基，或雜芳基烷基)，-CONR’R”，-(亞烷基)-CONR’R”(其中R’和R”獨(dú)立選自氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳基烷基，雜芳基，雜芳基烷基，或R和R’同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))，或一個氨基保護(hù)基團(tuán)。更具體的術(shù)語雜芳基包括但不限于四氫吡喃基，哌啶酮，哌嗪酮，嗎啉代和硫代嗎啉代，硫代嗎啉代-1-氧化物，硫代嗎啉代-1，1-二氧化物，以及他們的衍生物。
“環(huán)氨基”指一個雜環(huán)基團(tuán)，其中至少一個環(huán)原子為氮原子。具體的例子包括哌啶，哌嗪，嗎啉代，硫代嗎啉，硫代嗎啉亞砜，硫代嗎啉砜。
“雜烷基”指如上所定義的烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，帶有含有選自-NRaRb、-ORc或-S(O)nRd，其中n為0-2的整數(shù)，Ra為氫，烷基，鹵代烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳基烷基，芳基烯基，雜芳基，雜芳基烷基，雜芳基烯基，或?；?；Rb為氫，烷基，芳基烷基，?；?，-SO2R(其中R為烷基，鹵代烷基，氨基，一取代氨基或二取代氨基)，-COOR(其中R為烷基，芳基烷基，或雜芳基烷基)，-CONR’R”，-(亞烷基)CONR’R’(其中R’和R”分別獨(dú)立選自氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳基烷基，雜芳基及雜芳基烷基，或R和R’同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))；或Ra和Rb同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán)。
Rc為氫，烷基，鹵代烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳基烷基，芳基烯基，雜芳基，雜芳基烷基，乙?；?，-CONR’R”(其中R’和R”分別獨(dú)立選自氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳基烷基，雜芳基及雜芳基烷基，或R和R’同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))。一為氫，烷基，鹵代烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳基烷基，芳基烯基，雜芳基，雜芳基烷基，雜芳基烯基，?；?，并另外當(dāng)n＝0時，-CONR’R”(其中R’和R”分別獨(dú)立選自氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳基烷基，雜芳基及雜芳基烷基，或R’和R”同時與其相連的氮原子，形成環(huán)氨基環(huán))，及當(dāng)n＝2時，NR’R”，其中R和R’與以上剛括號中陳述的內(nèi)容相同。
雜烷基有代表性的例子包括但不僅限于2-甲氧基乙基，苯甲氧基甲基，硫代苯基-2-基-硫代甲基等。
“環(huán)烷基烷基”指基團(tuán)-RaRb，其中Ra為亞烷基，Rb為如前所述的環(huán)烷基，如環(huán)丙基甲基，環(huán)己基丙基，3-環(huán)己烷-2-甲基丙基等。
“芳烷基”指-RaRb，其中Ra為烯基，Rb為如上所定義的芳基，例如苯甲基，苯基乙基，3-(3-氯苯基)-2-甲基苯基等。
“芳烯基”指-RaRb，其中Ra為烯基，Rb為如上所定義的芳基，例如3-苯基-2-丙烯基等。
“雜芳基烷基”指-RaRb，其中Ra為烯基，Rb為如上所定義的雜芳基，例如吡啶-3-基甲基，3-(苯并呋喃-2-基)-丙基等。
“雜芳基烯基”指-RaRb，其中Ra為烯基，Rb為如上所定義的雜芳基，例如3-吡啶-3-基丙烯基-2-基等。
“雜環(huán)烷基”指-RaRb，其中Ra為亞烷基，Rb為如上所定義的雜環(huán)基，例如四氫吡喃-2-基甲基，4-甲基哌嗪-1-基乙基等。
“烷氧基”，“芳氧基”，“雜芳氧基”，“芳烷基氧基”，或“雜芳基烷基氧基”指-OR，其中R分別為上所定義的烷基，芳基，雜芳基，芳基烷基，或雜芳基烷基，例如甲氧基，苯氧基，吡啶-2-基氧基，苯甲氧基等。
“任選的”或“任選地”指隨后描述的事件或情況可以但不是必須發(fā)生，該描述包括事件或情況發(fā)生的情形與其不發(fā)生的情形。例如，“任選被烷基一或二取代的雜環(huán)基”指烷基可以但不是必須存在，該描述包括雜環(huán)基被烷基一或二取代的情況，和雜環(huán)基不被烷基取代的情況。
術(shù)語“保護(hù)基團(tuán)”指一組原子，當(dāng)以分子遮蓋物形式連接到一個活性基團(tuán)上，減少或阻止反應(yīng)活性。這些保護(hù)基團(tuán)可在T.W.Greene和P.G.Futs，有機(jī)化學(xué)保護(hù)基團(tuán)(Wiley，第二版，1991)，以及Harrison和Harrison等，有機(jī)合成方法概述，1-8卷(John Wiley and Sons.1971-1996)中查到。具代表性的氨基保護(hù)基團(tuán)包括甲?；?，乙酰基，三氟乙酰基，苯甲?；郊谆?，苯甲氧基羰基(CBZ)，叔-丁氧基羰基(Boc)，三甲基甲硅烷基(TMS)，2-三甲基甲硅烷基-乙磺?；?SES)，三苯甲基和取代的三苯甲基，烯苯氧基羰基，9-芴甲氧基羰基(FMOC)，硝基-3，4二甲氧苯甲基氧基羰基(NVOC)等。具代表性的羥基保護(hù)基可將羥基乙?；蛲榛?，例如苯甲基和三苯甲基醚及烷基醚，四氫吡喃醚，三烷基硅烷基醚和烯丙基醚。
術(shù)語“可被保護(hù)的羥氨基衍生物”指改性的羥氨基，其中氮和/或羥基可被保護(hù)，例如氮可被選擇性的單?；?。
具有相同的分子式、但其原子結(jié)合的性質(zhì)或順序、或其原子空間排列不同的化合物被定義為“異構(gòu)體”。其原子空間排列不同的異構(gòu)體被定義為“立體異構(gòu)體”。
不互為鏡像的立體異構(gòu)體被定義為“非對映異構(gòu)體”，互為非可疊加的鏡像的立體異構(gòu)體被定義為“對映異構(gòu)體”。當(dāng)化合物具有不對稱中心，例如碳原子被四個不同的基團(tuán)結(jié)合，可成為一對對映異構(gòu)體。對映異構(gòu)體的特征在于其不對稱中心的絕對構(gòu)型，其被描述為Cahn和Prelog的R-和S-順序規(guī)則，或者特征在于分子旋轉(zhuǎn)偏振光平面的方式，其被定義為右旋或左旋(即分別為(+)或(-)-異構(gòu)體)。手性化合物可以以單獨(dú)的對映異構(gòu)體存在，或以它們的混合物形式存在。含有對映異構(gòu)體相等比例的混合物被稱為“外消旋混合物”。
本發(fā)明的化合物可以具有一個或更多的不對稱中心；因此這些化合物可以作為單獨(dú)的(R)-或(S)-立體異構(gòu)體或作為它們的混合物制備。例如式(I)化合物中的R1和R2取代基不同，那么它連接的碳原子為不對稱中心，因此，式(I)化合物可以以(R)-或(S)-立體異構(gòu)體形式存在。除非另有說明，在說明書和權(quán)利要求書中具體化合物的描述和命名包括單獨(dú)的對映異構(gòu)體和混合物，外消旋體或其它們的混合物。立體化學(xué)的測定和立體異構(gòu)體的分離方法為本領(lǐng)域公知技術(shù)(參見J.March，John Wiley和Sons的“高級有機(jī)化學(xué)”(第4版)第4章的討論，紐約，1992)。
“藥物可接受的賦型劑”指用于制備藥物組合物的賦型劑，即通常為安全、無毒，不在生理、或其它方面引起不必要的作用，包括獸用藥及人用藥可接受的賦型劑。用于本說明書和權(quán)利要求書的“藥物可接受的賦型劑”包括一種和超過一種的這些賦型劑。
化合物的“藥物可接受的鹽”指藥物可接受的并具有母體化合物所需藥理活性的鹽。這些鹽包括(1)酸加成鹽，與無機(jī)酸形成的鹽，無機(jī)酸例如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；或與有機(jī)酸形成的鹽，有機(jī)酸例如乙酸，丙酸，己酸，環(huán)戊丙酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，丁二酸，羥基丁二酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，安息香酸，3-(4-羥基苯甲酰)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1，2-乙烷-二磺酸，2-羥基乙烷磺酸，苯磺酸，4-氯苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲苯亞磺酸，樟腦磺酸，4-甲基雙環(huán)[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4，4’-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)，3-苯丙酸，三甲基乙酸，叔丁基乙酸，十二烷醇硫酸，葡萄糖酸，谷氨酸，羥萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，已二烯二酸等；或(2)當(dāng)母體化合物中存在酸質(zhì)子時可形成鹽，其或被金屬離子取代，例如堿金屬離子、堿土堿金屬離子或鋁離子；或與有機(jī)堿配位，如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨基丁三醇(tromethamine)，N-甲基葡糖胺等。
“前體藥物”指當(dāng)這些前體藥物給藥哺乳動物受試者，在體內(nèi)能釋放按照式(I)的活性母體藥物的化合物。式(I)化合物的前體藥物的制備是通過以某種方式修飾式(I)化合物存在的官能團(tuán)，以使該修飾在體內(nèi)斷裂，釋放母體化合物。前體藥物包括式(I)化合物的羥基、氨基或巰基結(jié)合到任何基團(tuán)上的式(I)化合物，其在體內(nèi)斷裂，重新分別生成游離羥基、氨基或巰基。前體藥物的例子包括但不限于式(I)化合物中羥基官能團(tuán)的酯(例如乙酸酯，甲酸酯，苯甲酸酯衍生物)，氨基甲酸酯(例如N，N-二甲基氨基羰基)等。
疾病的“治療”包括(1)預(yù)防疾病，即哺乳動物中未發(fā)展到引起疾病的臨床癥狀，疾病可以被暴露或預(yù)先處理，但還沒出現(xiàn)或顯示出疾病的癥狀，(2)抑制阻止或減少疾病或其臨床癥狀的發(fā)展，或(3)減輕疾病，即使疾病或其臨床癥狀減弱。
“治療有效量”指當(dāng)給哺乳動物治療疾病給藥的化合物的量，足以有效治療疾病。該“治療有效量”會根據(jù)化合物、疾病及其嚴(yán)重程度、治療哺乳動物的年齡、體重等而改變。
本發(fā)明的化合物引用的氨基酸組成可按照肽領(lǐng)域傳統(tǒng)命名法則命名。
例如一個二肽，其中n＝0，R1＝R3＝R4＝R6＝H，R2為4-噻唑甲基，R5為(S，S)-1-甲基丙基，ZR7為苯甲氧基羰基，可命名為CBz-Ile-4-Taz-NHOH。關(guān)于后述的合成方案A和B，4-Taz(4-噻唑丙氨酸)表示AA1，Ile表示AA2。
一個三肽，n＝1，m＝0，R1＝R3＝R4＝R6＝R9＝H，R2為4-噻唑甲基，R5為(S，S)-1-甲基丙基，ZR7為4-氯苯甲?；琑10為4-氟苯甲基，被命名為4-氯苯甲?；?(4-氟苯甲基)Gly-Ile-Taz-NHOH.關(guān)于后述的合成方案A和B，4-Taz(4-噻唑丙氨酸)表示AA1，Ile表示AA2，(4-氟苯甲基)Gly表示AA3本發(fā)明最廣的限定在本發(fā)明第一方面給出，優(yōu)選某些式(I)的化合物。
化合物的一類為二肽異羥肟酸，相應(yīng)的式(I)為n＝0。另外一類為三肽異羥肟酸，相應(yīng)的式(I)為n＝1，對于本發(fā)明的二肽和三肽異羥肟酸，尤其首選R2為雜芳烷基，尤其為4-噻唑甲基，R5為(S，S)-1-甲基丙基。R2，R5和R9優(yōu)選氨基酸的天然構(gòu)象，例如(L)氨基酸。
式(I)的另一類首選化合物為Z為C(O)O。另一類首選化合物為Z為S(O)2。每一類化合物首選R7為烷基，芳基烷基，或雜烷基，尤其為鹵代苯基(例如3，4-二溴苯基，2，5-二氯苯基，2，4，5-三氯苯基)，芐基(任選被取代)(例如芐基或3，4-二氯芐基)，或鹵代噻吩基(例如4，5-二溴mothien-2-基)。當(dāng)Z為C＝O，也首選R7為芳基烷基或雜烷基，尤其為被鹵代(優(yōu)選一個或兩個氯)的芐基或雜芳基甲基。
另一類首選化合物為R2為芳基烷基或雜芳基烷基，在這一類中更優(yōu)選R2為3-吲哚基甲基，2-噻吩基甲基，4-咪唑基甲基或4-噻唑基甲基，尤其為4-噻唑基甲基。
另一類首選化合物為R2為(亞烷基)-B-X，其中B為-O-，NR8-，-S-，-C＝O，-CONR8-，NR8SO2或C(＝NR8)NR8SO2(其中R8獨(dú)立為H或烷基)，X為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基雜芳基或雜芳基烷基。尤其優(yōu)選的化合物為亞烷基為亞甲基，B為-NR8CO2，X為芳基烷基。
第四類優(yōu)選化合物為R5為烷基或苯基，尤其為丙基，1-甲基乙基，或(S，S)-1-甲基丙基。在這一組化合物中尤其優(yōu)選R1和R4為氫，并且R2為雜芳基烷基，尤其為4-噻唑基甲基。
進(jìn)一步首選的化合物為基團(tuán)B，即本發(fā)明第一方面定義的式(I)，其中n＝0，或(1)化合物B，其中R3和R6為氫。
(2)化合物(1)，其中R2為芳基烷基或雜芳基烷基。
(3)化合物(2)，其中Z為-C(O)O-或-S(O)2。
(4)化合物(3)，其中R2任選被芐基或雜芳基烷基取代。
(5)化合物(4)，其中R2為4-叔-丁氧基苯基，3-氯芐基，3-吲哚甲基，2-噻吩甲基，4-咪唑基甲基，4-噻唑基甲基。
(6)化合物(5)，其中R2為4-噻唑基甲基。
(7)化合物(6)，其中R7為芳基，芳基烷基，雜芳基，雜芳基烷基。
(8)化合物(6)，其中Z為-C(O)O-，R7為任選取代的芐基。
(9)化合物(7)，其中Z為-S(O)2-，R7為芳基或雜芳基。
(10)化合物(8)或(9)，其中R1和R4為氫，R5為烷基。
(11)化合物(10)，其中R5為(S，S)-1-甲基丙基。
(12)化合物(11)，其中R2為(亞烷基)-B-X，其中B為-O-，NR8，-S(O)n-(其中n為0，1或2)，-C＝O，-CONR8-，-NR8CO2，-NR8SO2-，或-C(＝NR8)NSO2-(其中R8為H或烷基)，X為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳基烷基，雜芳基或雜芳烷基。
(13)化合物(12)，其中Z為-C(O)O-或-S(O)2-。
(14)化合物(13)，其中R2為-CH2-B-X，B為-NHCO2-，X為芐基。
(15)化合物(14)，其中R7為芳基或芳基烷基。
(16)化合物(15)，其中R1和R4為氫，R5為烷基。
(17)化合物(16)，其中R5為(S，S)-1-甲基丙基。
進(jìn)一步首選的化合物為基團(tuán)C的那些，即本發(fā)明第一方面定義的式(I)，其中n＝1。
(1)化合物C，其中m為0，R3和R6為氫。
(2)化合物(1)，其中R2為芳基烷基或雜芳基烷基。
(3)化合物(2)，其中Z為-C(O)O-或-S(O)2。
(4)化合物(3)，其中R2任選取代的芐基或雜芳基烷基。
(5)化合物(4)，其中R2為4-叔-丁氧基芐基，3-氯代芐基，3-吲哚甲基，2-噻吩甲基，4-咪唑基甲基，或4-噻唑基甲基。
(6)化合物(5)，其中R2為4-噻唑基甲基。
(7)化合物(6)，其中R7為芳基，芳基烷基，雜芳基，雜芳基烷基。
(8)化合物(7)，其中Z為-C(O)O-，R7為任選取代的芐基。
(9)化合物(7)，其中Z為-S(O)2-，R7為芳基或雜芳基。
(10)化合物(8)或(9)，其中R1和R4為氫，R5為烷基。
(11)化合物(10)，其中R5為(S，S)-1-甲基丙基。
(12)化合物(11)，其中R2為(亞烷基)-B-X，其中B為-O-，NR8-，S(O)n-(其中n為0，1或2)，-C＝O，-CONR8-，-NR8CO2-，-NR8SO2-或-C(＝NR8)NSO2-(其中R8為H或烷基)，X為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳基烷基，雜芳基或雜芳烷基。
(13)化合物(12)，其中Z為-C(O)O-或-S(O)2-。
(14)化合物(13)，其中R2為-CH2-B-X，B為-NHCO2-，X為芐基。
(15)化合物(14)，其中R7為芳基或芳基烷基。
(16)化合物(15)，其中R1和R4為氫，R5為烷基。
(17)化合物(16)，其中R5為(S，S)-1-甲基丙基。
本發(fā)明已制備的具代表性的化合物如下I.式(I)中二肽異羥肟酸化合物，其中n＝0，R1＝R3＝R4＝R6＝H和ZR7為苯甲氧基羰基和其他基團(tuán)詳細(xì)限定如下表I
St*-連接R2碳的立體化學(xué)和R2的取代(如果有獨(dú)立的手性中心)St**-連接R5碳的立體化學(xué)和R5的取代(如果有獨(dú)立的手性中心)II，式(I)中二肽異羥肟酸化合物，其中n＝0，R1＝R3＝R4＝R6＝H和R4為(S，S)-1-甲基丙基和其他基團(tuán)詳細(xì)限定如下表II
St*-連接R2碳的立體化學(xué)III式(I)中二肽異羥肟酸化合物，其中n＝0，R1＝R3＝R6＝H和ZR7為苯甲氧基羰基和其他基團(tuán)詳細(xì)說明如下表III
St*-連接R5碳的立體化學(xué)IV式(I)中二肽異羥肟酸化合物，其中n＝0，R1＝R3＝R4＝H，R2為(S)-3-吲哚甲基，和ZR7為苯甲氧基羰基和其他基團(tuán)詳細(xì)說明如下表IV
St*-連接R5碳的立體化學(xué)V式(I)中三肽異羥肟酸化合物，其中n＝0，R1＝R3＝R4＝R6＝H和R2為(S)4-噻唑甲基，R5為(S，S)-1-甲基丙基和其他基團(tuán)詳細(xì)說明如下
St*-連接R9碳的立體化學(xué)和R9的取代基(如果有獨(dú)立的手性中心)VI本發(fā)明的各種三肽異羥肟酸化合物，其中n＝1，m＝1，R1＝R3＝R4＝R6＝H和R2為(S)4-噻唑甲基，R5為(S，S)-1-甲基丙基，以及其他基團(tuán)詳細(xì)說明如下表VI
其它R2和R3形成亞烷基或雜亞烷基鏈的各種化合物包括CBz-Ile-Pro-NHOH(m/e＝378)和CBz-Ile-Thz-NHOH(m/e＝396)。Thz為4-噻唑烷-羧基。
其它R5和R6形成亞烷基鏈的各種化合物包括CBz-Pro-Trp-NHOH(m/e＝451)。
本發(fā)明的化合物由幾種合成方法制得，將在如下敘述。
用于制備這些化合物的起始材料和試劑或者可由供應(yīng)商提供，AldrichChemica]Co.，(Milwaukee，Wisconsin，USA)，Bachem(Torrance，California，USA)，Emka-Chemie，或Sigma(St.Louis，Missouri，USA)，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知方法制備，參考書籍中提出下列方法，如Fieser和Fieser的有機(jī)合成試劑，1-15卷(John Wiley and Sons，1991)；Rodd的碳化合物化學(xué)，1-5卷及附錄(Elsevier Science Publishers；1989)，有機(jī)反應(yīng)，1-40卷(JohnWiley and Sons，1991)，March的高級有機(jī)化學(xué)，(John Wiley and Sons，第四版)，和Larock的綜合有機(jī)轉(zhuǎn)化(VCH Publishers Inc.，1989)。尤其，以各種被保護(hù)形式存在的天然氨基酸或非天然氨基酸由特殊化學(xué)商提供，例如NovabiochemInc.(La Jolla，CA)，Advanced Chemtech Inc.(Louisville，KY)，Svnthetech Inc.(Albany，OR)，Bachem Inc.(Torrance，15 CA)。這些方案僅僅舉例說明了本發(fā)明合成的化合物的一些方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員對這些方案可進(jìn)行各種修改。
如果需要，起始材料和反應(yīng)中間產(chǎn)物可以應(yīng)用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行分離和純化，包括但不限于過濾、蒸餾、結(jié)晶和色譜等。
本發(fā)明的化合物為的天然和非天然的二肽和三肽的C末端異羥肟酸衍生物，在N末端進(jìn)一步功能化。它們由起始的肽前體制得并進(jìn)一步去保護(hù)(如有必要)形成有功能的N末端和C末端。肽前體是由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知方法制得，包括液相化學(xué)和固相合成，見E.Atherton和R.C.Sheppard的固相肽合成實(shí)踐方法(Oxford University Press，1989)。
總之，如方案A和B中所述，一個C末端保護(hù)的氨基酸P1-AA1與一個N末端保護(hù)的氨基酸P2-AA2偶合產(chǎn)生P1-AA1-P2-AA2。偶合是通過活化P2-AA2的C末端濃縮P1-AA1的N末端而完成?；罨噭┖团己蠗l件為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些，包括碳化二亞胺調(diào)節(jié)的偶合，或其后通過乙酰化N-羥基丁二酰亞胺酯形成及其后的。為合成二肽異羥肟酸，典型通過羥胺處理，除去保護(hù)基團(tuán)和用R7-Z-L使N末端具有功能(以任一順序)，得到二肽前體，其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的異羥肟酸化合物。為合成三肽異羥肟酸，化合物P1-AA1-AA2-P2N被選擇性的N去保護(hù)，形成P1-AA1-AA2，然后其偶合到N保護(hù)的氨基酸AA3-P3。去保護(hù)、N末端功能化和羥胺處理如方案B中所闡明，然后得到式(I)的三肽異羥肟酸。
方案A二肽異羥肟酸合成路線 式I.其中n＝0方案B三肽異羥肟酸合成路線 參考式I的命名，AA2對應(yīng)于-C(＝O)-CR1R2-NR3-，AA2對應(yīng)于-C(＝O)-CR4R5-NR6-，AA3對應(yīng)于-C(＝O)-CH(R9)-(CH2)mNR10.P1、P2、P3代表保護(hù)基團(tuán)。
具體地，本發(fā)明的化合物由固相合成制得。最初，N保護(hù)的氨基酸P1-AA2通過它的C末端連接到樹脂上。典型的固相合成樹脂包括氯甲基化和羥甲基化的樹脂，例如4-羥基甲基-苯基乙酰氨基甲基樹脂(Pam樹脂)，和4-苯甲氧基苯甲基乙醇樹脂(Wang樹脂)購自Advanced Chemtech，Louisville，Kentucky，U.S.A.Pegylated聚乙烯樹脂，Argogel-OhTM，樹脂購自Argonaut echnologies Inc.(Belmont，CA)。優(yōu)選的氯甲基樹脂包括苯乙烯/二乙烯苯樹脂，如Merrifield樹脂購自Aldrich Chemical Company，Milawaukee，Wisconsin，U.S.A。
氨基酸結(jié)構(gòu)單元、AA2和AA3應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重復(fù)偶合和去保護(hù)步驟有順序的連接。偶合反應(yīng)在常規(guī)的二肽偶合條件下進(jìn)行，典型在無水、惰性、質(zhì)子惰性極性溶劑中(如二甲基甲酰氨，乙酰腈，四氫呋喃，二氯甲烷)中進(jìn)行，應(yīng)用輔助偶合試劑，如碳化二亞胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDAC)，二異丙基碳化二亞胺(DIC)，二咪唑如羰基二咪唑，三唑如羥基苯并三唑(HOBT)，或其它羧基活性基團(tuán)，例如N-羥基丁二酰亞胺，連三個碳原子的有機(jī)堿，例如4-二甲基氨基吡啶，N-甲基嗎啉或三乙基氨基。
采用的保護(hù)基團(tuán)取決于被保護(hù)基團(tuán)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些，有代表性的保護(hù)基團(tuán)可在有機(jī)化學(xué)保護(hù)基團(tuán)，J.F.W.McOmie(London，Plenum Press，(1973))、和有機(jī)化學(xué)保護(hù)基團(tuán)，T.W.Greene and P.G.Wuts(John Wiley and Sons，(1991))中查得。一種優(yōu)選的N保護(hù)基團(tuán)是芴基甲氧羰基(FMOC)。
裝配好完整的肽骨架后，除去N末端的保護(hù)基團(tuán)。在某些情況下，N末端保護(hù)基團(tuán)可以對應(yīng)于ZR7，消除對去除保護(hù)基團(tuán)的需要。N末端的功能化通過后來的用R7-Z-L處理而實(shí)現(xiàn)，其中L為在親核取代條件下的離去基團(tuán)。去除保護(hù)基團(tuán)的條件因保護(hù)基團(tuán)的不同而不同。酸敏感的保護(hù)基團(tuán)例如叔-丁氧基羰基(t-BOC)在溫和的酸環(huán)境下被去除(例如三氟乙酸)，而堿敏感保護(hù)基團(tuán)例如9-芴基甲氧羰基在溫和的堿環(huán)境下被去除。典型的離去基團(tuán)L包括鹵素，甲苯磺酰鹽，甲磺酰鹽。
最后的固相斷裂通過羥氨處理而完成，產(chǎn)生式I的化合物。
如前所述，天然和非天然的氨基酸均可用于制備本發(fā)明化合物。天然氨基酸和它們的縮寫形式已眾所周知，此處不在重復(fù)。一些非天然氨基酸及其縮寫包括高絲氨酸(hSer)，高絲氨酸內(nèi)酯(hSerlac)，高半胱氨酸(Hcy)，高精氨酸(hArg)，高瓜氨酸(Hci)，青霉胺(Pen)，Ná-甲基精氨酸(N-MeArg)，正亮氨酸(Nle)，正纈氨酸(Nval)，正異亮氨酸(NIle)，N-甲基異亮氨酸(NMeIle)，苯基甘氨酸(PhG)，t-丁基甘氨酸(Tle)，羥哺氨酸(Hyp)，3，4-去氫羥哺氨酸(Δ-Pro)，焦谷氨酸(Pyr，Glp)，鳥氨酸(Orn)，2，3-二氨丙酸(2，3-DAP)，1-氨基異丁酸(1-Aib)，2-氨基異丁酸(2-Aib)，2-氨基丁酸(2-Abu)，4-氨基丁酸(4-Abu)，2，4-二氨基丁酸(A2bu)，α-氨基辛二酸(Asu)，albizzin(Abz)，-環(huán)己丙氨酸(Cha)，3-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)，3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nal)，瓜氨酸(Cit)，2-哌啶酸(Pip)，4-氯苯基丙氨酸(4-GlPhe)，4-氟苯基丙氨酸(4-FPhe)，肌氨酸(Sar)，4-噻唑丙氨酸(4-Taz)，高苯基丙氨酸(Hpa或hPhe)，2-噻吩丙氨酸(2-Thi)，3-苯并噻吩丙氨酸(3-Bal)，和1-氨基丙烷羧酸(1-NCPC).各種非天然氨基酸可由供應(yīng)商提供。
本發(fā)明的化合物用于治療過量間質(zhì)膠原沉積的疾病，例如纖維增生疾病如間質(zhì)非纖維變性，外周中樞纖維化、Symmers’纖維變性、外周肌肉纖維變性，腎纖維變性，心內(nèi)膜硬化、肝炎、急性呼吸窘迫綜合癥、關(guān)節(jié)炎、膀胱纖維變性、外科手術(shù)粘連、腱外科、角膜結(jié)疤、硬皮病、慢性同種移植排斥反應(yīng)、血液透析分流纖維變性和再狹窄。
本發(fā)明的化合物原膠原C端蛋白酶抑制劑，從而抑制可形成膠原纖維的膠原型I、II、III的C-末端處理。而且，本發(fā)明選擇的化合物選擇性抑制原膠原C端蛋白酶超過其它降解酶如膠原酶-1、膠原酶-2和膠原酶-3。因此，本發(fā)明的化合物主要留下由膠原酶-1、膠原酶-2和膠原酶-3介導(dǎo)的膠原的天然再吸收。由于這種選擇性，這些化合物的療效大于非選擇性的化合物。尤其，本發(fā)明優(yōu)選的化合物抑制原膠原C端蛋白酶的選擇性優(yōu)于膠原酶-1和膠原酶-2一百倍，選擇性更強(qiáng)的化合物超過一千倍。對原膠原C端蛋白酶超過膠原酶-1和膠原酶-2的選擇性抑制在實(shí)施例中描述的檢測法中說明。因此本發(fā)明允許病人服用一劑，其選擇性抑制原膠原C端蛋白酶超過膠原酶-1、膠原酶-2和膠原酶-3，而治療纖維變性疾病。這種抑制的選擇性超過10倍，優(yōu)選超過100倍，最優(yōu)選超過1000倍。
式I中化合物抑制原膠原C端蛋白酶的活性的能力，可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的體外檢測方法加以說明，如在實(shí)施例XIII中更詳細(xì)描述的檢測方法。對膠原酶的選擇性抑制可以通過實(shí)施例XIV中描述的試驗(yàn)方法測定。
式I中化合物治療纖維變性和膠原過量產(chǎn)生和沉積的體內(nèi)療效可用多種動物模型說明，這些動物模型包括博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型(S.H.Phan等“博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化”，Am.Rev.Respir.Dis.，124428-434(1981)，和P.F.Piguet等“Effective Treatment ofthe PulmonaryFibrosis Elicited in Mice by Bleomycin or Silica with anti-CD-1l Antibodies”，Am.Rev.Resp.Dis.，147435-441(1993))，海綿體植入(sponge implant)模型(E.N.Unemori等“Human Reiaxin Decreases Collagen Accumulation In Vivoin Two Rodent Models of Fibrosis，”J.Invest.Dermatol.，101280-285(1993)，四氯化碳或NDMU誘導(dǎo)的腎纖維化模型，以及在WO97/05865中提到的其它動物模型(“用于治療與膠原過量相關(guān)疾病的C端蛋白酶抑制劑”)。
通常，本發(fā)明的化合物可以以產(chǎn)生類似的效用藥物的任何可接受的服用方式給予治療有效量。本發(fā)明化合物的實(shí)際劑量，即活性成分，取決于許多因素，如治療疾病的嚴(yán)重性，受試者的年齡和健康程度，使用化合物的效果強(qiáng)度，給藥途徑和類型等以及其它因素。藥物可服用一天一次以上，優(yōu)選一天一次或兩次。
式I中化合物的治療有效量在大約在每天每公斤體重0.05-35mg之間；優(yōu)選大約0.3-20mg/kg/day.這樣，一個70Kg的人，優(yōu)選劑量范圍大約是21mg到1.4g每天。
通常，本發(fā)明的化合物以制劑組成方式按如下任一途徑給藥口服，全身的(systemic，如透皮、鼻、肺、或通過栓劑)，或非腸道給藥(例如肌肉注射、靜脈給藥或皮下給藥)。優(yōu)選的給藥方式是應(yīng)用常規(guī)的每日劑量方案全身性的給藥，其劑量可以根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度調(diào)節(jié)。
典型的通過鼻給藥是用適于霧化或有氣霧推進(jìn)物的干燥的粉劑、溶液或混懸劑或者應(yīng)用適于用于測量劑量的吸入器。另一種方法，藥物與微滴結(jié)合，這些微滴由材料如凝膠、右旋糖苷、膠原質(zhì)或白蛋白制成。微滴可方便地以冷凍干燥的方式，用鼻吸入器或壓縮的氣霧器。滲透吸收增強(qiáng)劑例如親脂性的類固醇也可作為添加劑，以增強(qiáng)藥物進(jìn)入組織。
有效的服用方式可通過肺或呼吸道傳遞，因?yàn)槎嚯目芍苯油ㄟ^哺乳動物肺泡細(xì)胞吸收。有利地，這種服用方式常常并不需要滲透吸收增強(qiáng)劑。肺傳遞進(jìn)入肺深層的給藥方法和設(shè)備在美國專利第5780014和5814607中有描述。
最后，化合物可通過透皮吸收而達(dá)到全身作用，包括將藥物放在肌膚表面，使它通過皮膚滲透。透皮吸收設(shè)備是采用一種結(jié)構(gòu)，例如黏著片或類似物，作為藥物的貯藏庫，使藥物擴(kuò)散與肌膚接觸。一般類型，這種結(jié)構(gòu)是三維穩(wěn)定基質(zhì)稱為單片基質(zhì)。這種基質(zhì)在美國專利5804214、5149538和4956171中有詳細(xì)說明，這種基質(zhì)是由丙烯酸橡膠，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯和乙烯醋酸纖維的聚合體和共聚體組成。
劑型的選擇根據(jù)多種因素如藥物的給藥方式(例如對于口服劑型，片劑，丸劑或膠囊被優(yōu)選)和藥物的生物利用度。最近，已開發(fā)出藥物制劑特別用于生物利用度差的藥物，它是根據(jù)通過增加表面積即減少粒徑可以增加生物利用度的原則。例如，美國專利號4,107,288描述了粒徑范圍在10-1,000nm的藥物制劑，其中活性物質(zhì)被支持到高分子的交聯(lián)基質(zhì)上。美國專利號5,145,684描述了一種藥物制劑，其中藥物在表面改性劑存在下被研磨成毫微顆粒(平均粒徑400nm)，然后分散到液體介質(zhì)中，得到表現(xiàn)出具有相當(dāng)高的生物利用度的藥物劑型。
該組合物通常由式(I)化合物組合以至少一種藥物可接受的賦型劑組成?？山邮艿馁x型劑為非毒性、輔助給藥、不反向影響式(I)化合物的治療效果。這些賦型劑可以是任何固體、液體、半固體，或者當(dāng)為氣溶膠組合物時，氣體賦型劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)獲得的那些。
固體藥物賦型劑包括淀粉、纖維素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、白明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸鹽、氯化鈉、干脫脂乳等。液體和半固體賦型劑可以選自甘油、丙二醇、水、和多種油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。優(yōu)選的液體載體，特別是用于注射溶液的液體載體包括水、鹽水、葡萄糖溶液和丙二醇等。
壓縮氣體可以在氣溶膠劑型中用于分散本發(fā)明的化合物。適合用于該目的的惰性氣體為氮?dú)?、二氧化碳等?br> 其它適合的藥物賦型劑和它們的劑型在Remington’s PharmaceuticalSciences中描述，由E.W.Martin編輯(Mack Publishing Company，第18版，1990)。
制劑中化合物的量可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的范圍內(nèi)改變。通常，該制劑含有，根據(jù)重量百分比0.01-99.99重量％的式(I)化合物(基于制劑總重量)，其余用適當(dāng)?shù)乃幬镔x型劑補(bǔ)足。優(yōu)選地，該化合物存在量為1-80wt％。含有式(I)化合物的有代表性的制劑在實(shí)施例30中描述。
實(shí)施例ICBz-AA2-AA1-NHOH的一般實(shí)驗(yàn)(式I中二肽化合物，其中ZR7為苯甲氧羰基)1.BOC-AA1和FMOC-AA1于空的帶活塞的固相提取瓶中加入ArgoGel-OHTM(ArgonautTechnologies，Belmont，CA)，加入3當(dāng)量BOC或者FMOC保護(hù)的AA1，3當(dāng)量二異丙基碳化二亞胺和0.05當(dāng)量0.116M二甲氨基吡啶的THF溶液中，加入足量的CH2Cl2使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。[或者，向樹脂中加入3當(dāng)量BOC或FMOC保護(hù)AA1，3當(dāng)量HATU和6當(dāng)量DIPEA。加入足量的NMP使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)]。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，干燥得到BOC-AA1或FMOC-AA1樹脂。未反應(yīng)的樹脂位點(diǎn)以Ac2O遮蓋(capping)溶液遮蓋，(19mL Ac2O，9mL DIPEA，0.8gr HOBt，400mL NMP)，向樹脂(～12.5ml/gr樹脂)中加入足夠量，使樹脂膨脹。樹脂如上過濾和清洗。2.H2N-AA1-樹脂2a.BOC保護(hù)材料由上得到的樹脂(BOC-AA1-樹脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/TIS處理兩小時。反應(yīng)液抽濾，用用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到H2N-AA1-樹脂。
2b.FMOC保護(hù)材料-由上得到的樹脂(FMOC-AA1-樹脂)先用DMF洗，然后用含20％哌啶的DMF處理20分鐘。反應(yīng)液抽濾，用用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到H2N-AA1-樹脂。3.CRz-AA2-AA1-樹脂向H2N-AA1-樹脂中加入3當(dāng)量CBZ保護(hù)的AA2，3當(dāng)量二異丙基碳化二亞胺和0.05當(dāng)量0.116M二甲氨基吡啶的THF溶液，加入充分的CH2Cl2使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。[或者，向樹脂中加入3當(dāng)量BOC或FMOC保護(hù)AA1，3當(dāng)量HATU和6當(dāng)量DIPEA。加入足量的NMP使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)]。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到CBz-AA2-AA1-樹脂。4.保護(hù)基團(tuán)的去除如果AA1或AA2含有一個要去除的酸不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，上述得到的樹脂(CBz-AA2-AA1-樹脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/三異丙基硅烷(TIS)處理兩小時。反應(yīng)液抽濾，用CH2Cl2洗三遍，MeOH洗三遍，再用CH2Cl2洗三遍。5.CBz-AA2-AA1-NHOHCBz-AA2-AA1-樹脂先用THF洗。加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。然后加入25當(dāng)量50％NH2OH水溶液，在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)兩天。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，濾液真空濃縮，得到CBz-AA2-AA1-NHOH。
實(shí)施例IIR7-SO2-AA2-AA1-NHOH的一般實(shí)驗(yàn)(式I中二肽化合物，其中Z為-SO2-)1.FMOC-AA2-AA1-樹脂于HN2-AA1-樹脂中加入3當(dāng)量FMOC保護(hù)的AA2，3當(dāng)量二異丙基碳化二亞胺和0.05當(dāng)量0.116M二甲氨基吡啶的THF溶液中，加入足量的CH2Cl2使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到FMOC-AA2-AA1-樹脂。2.H2N-AA2-AA1-樹脂F(xiàn)MOC-AA2-AA1-樹脂先用DMF洗，然后用含20％哌啶的DMF溶液處理20min。反應(yīng)液抽濾，用用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到H2N-AA2-AA1-樹脂。3.R7-SO2-AA2-AA1-樹脂H2N-AA2-AA1-樹脂先用3二氧雜環(huán)己烷水溶液洗，然后加入10當(dāng)量的磺酰氯，R7-SO2Cl。加入足量的90％二氧雜環(huán)己烷使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。然后加入20當(dāng)量二異丙基碳化二亞胺。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2C12洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，產(chǎn)生R7-SO2-AA2-AA1-樹脂。4.R7-SO2-AA2-AA1-NHOHR7-SO2-AA2-AA1-樹脂先用THF洗。加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。然后加入25當(dāng)量50％NH2OH水溶液，在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)兩天。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，濾液真空濃縮，得到R7-SO2-AA2-AA1-NHOH。
實(shí)施例IIIR7-NHCO-AA2-AA1-NHOH的一般實(shí)驗(yàn)(式I中二肽化合物，其中Z為-NHCO-)1.R7-NHCO-AA2-AA1-樹脂NH2-AA2-AA1-樹脂先用THF洗，加入一定量的異氰酸酯，R7N＝C＝O。加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R7-NHCO-AA2-AA1-樹脂。2.保護(hù)基團(tuán)的去除如果AA1或AA2含有一個要去除的酸不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，上述得到的樹脂(R7-NHCO-AA2-AA1-樹脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/三異丙基硅烷(TIS)處理兩小時。反應(yīng)液抽濾，用CH2Cl2洗三遍，MeOH洗三遍，再用CH2Cl2洗三遍。3.R7-NHCO-AA2-AA1-NHOHR7-NHCO-AA2-AA1-樹脂先用THF洗。加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。然后加入25當(dāng)量50％NH2OH水溶液在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)兩天。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，濾液真空濃縮，得到R7-NHCO-AA2-AA1-NHOH。
表II和表V中的二肽異羥肟酸(其中Z為-CONH-)用實(shí)施例III中的步驟制備。
實(shí)施例VICBz-NR6-CH2CO-AA1-NHOH的一般實(shí)驗(yàn)1.BrCH2CO-AA1-樹脂向H2N-AA1-樹脂中加入12當(dāng)量溴乙酸，13當(dāng)量二異丙基碳化二亞胺。加入足量的CH2Cl2使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)2小時。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用DMSO洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到BrCH2CO-AA1-樹脂。2.R6-NHCH2CO-AA1-樹脂BrCH2CO-AA1-樹脂先用DMSO洗。加入足量的DMSO使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)，然后加入所需的40當(dāng)量伯胺，NR6NH2。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)2小時。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R6-NHCH2CO-AA1-樹脂。3.CBz-NR6-CH2CO-AA1-樹脂向R6-NHCH2CO-AA1-樹脂中加入3當(dāng)量CBZOSu，3當(dāng)量Et3N和0.05當(dāng)量的0.116M 4-二甲基氨基吡啶的THF溶液。加入足量的CH2Cl2使樹脂(～12.5mL/gr的樹脂)膨脹。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到CBz-NR6-CH2CO-AA1-樹脂。4.保護(hù)基團(tuán)的去除如果AA1或AA2含有一個要去除的酸不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，上述得到的樹脂(CBz-NR6-CH2CO-AA1-樹脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/三異丙基硅烷(TIS)處理兩小時。反應(yīng)液抽濾，用CH2Cl2洗三遍，MeOH洗三遍，再用CH2Cl2洗三遍。5.CBz-NR6-CH2CO-AA-NHOHCBz-NR6-CH3CO-AA1-樹脂先用THF洗。加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)，然后加入25當(dāng)量50％NH2OH水溶液，在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)兩天。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，濾液真空濃縮，得到CBz-NR6-CH2CO-AA1-NHOH。
實(shí)施例VIIR7NHCO-AA2-AA1-NHOH的一般實(shí)驗(yàn)(式I中二肽化合物，其中Z為-C(O)NH-)1.向ArOCO-AA2-AA1-樹脂(Ar＝Ph)中加入足量的DMF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。加入20當(dāng)量R7NH2，反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R7NHCO-AA2-AA1-樹脂。2.R7NHCO-AA2-AA1-樹脂先用THF洗，加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)，然后加入25當(dāng)量50％NH2OH水溶液，在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)兩天。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，濾液真空濃縮，得到R7NHCO-AA2-AA1-NHOH。
實(shí)施例VIIICBz-AA3-AA2-AA1-NHOH的一般實(shí)驗(yàn)(式I中二肽化合物，其中n＝1，ZR7為苯甲氧羰基)1.CBz-AA2-AA2-AA1-樹脂向H2N-AA2-AA1-樹脂中加入3當(dāng)量CBZ保護(hù)的AA3，3當(dāng)量二異丙基碳化二亞胺和0.05當(dāng)量的0.116M二甲氨基吡啶的THF溶液。加入足量的CH2Cl2使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。[或者，向樹脂中加入3當(dāng)量CBz保護(hù)AA3，3當(dāng)量HATU，3當(dāng)量HOAt和6當(dāng)量DIPEA。加入足量的NMP使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)]。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到CBz-AA2-AA1-樹脂。2.保護(hù)基團(tuán)的去除如果AA1、AA2或AA3含有一個要去除的酸不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，上述得到的樹脂(CBz-AA3-AA2-AA1-樹脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/三異丙基硅烷(TIS)處理兩小時。反應(yīng)液抽濾，用CH2Cl2洗三遍，MeOH洗三遍，再用CH2Cl2洗三遍。3.CBz-AA3-AA2-AA1-NHOHCBz-AA3-AA2-AA1-樹脂先用THF洗。加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。然后加入25當(dāng)量50％NH2OH水溶液，在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)兩天。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，濾液真空濃縮，得到CBz-AA3-AA2-AA1-NHOH。
實(shí)施例IXR7Z-AA3-AA2-AA1-NHOH的一般實(shí)驗(yàn)(式I中二肽化合物，其中Z為-SO2-或-C(O)NH-)1.FMOC-AA3-AA2-AA1-樹脂于HN2-AA2-AA1-樹脂中加入3當(dāng)量FMOC保護(hù)的AA3，3當(dāng)量二異丙基碳化二亞胺和0.05當(dāng)量0.116M 4-二甲氨基吡啶的THF溶液中，加入足量的CH2Cl2使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。[或者，向樹脂中加入3當(dāng)量FMOC保護(hù)的AA3，3當(dāng)量HATU，3當(dāng)量HOAt和6當(dāng)量DIPEA。加入足量的NMP使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)]。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到FMOC-AA3-AA2-AA1-樹脂。2.H2N-AA3-AA2-AA1-樹脂F(xiàn)MOC-AA3-AA2-AA1-樹脂先用DMF洗，然后用含20％哌啶的DMF溶液處理20分鐘。反應(yīng)液抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到H2N-AA3-AA2-AAl-樹脂。3.R7Z-AA3-AA2-AA1-樹脂3a.Z＝SO2∶H2N-AA3-AA2-AA1-樹脂先用3二氧雜環(huán)己烷水溶液洗，然后加入10當(dāng)量所需的磺酰氯，R7-SO2Cl。加入足量的90％二氧雜環(huán)己烷水溶液使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。然后加入20當(dāng)量二異丙基乙基胺。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，產(chǎn)生R7SO2-AA3-AA2-AA1-樹脂。
3b.Z＝NHCO∶H2N-AA3-AA2-AA1-樹脂先用THF洗然后用一定量3當(dāng)量的異氰酸鹽，R7N＝C＝O，加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R7NHCO-AA3-AA2-AA1-樹脂。4.R7Z-AA3-AA2-AA1-NHOHR7Z-AA3-AA2-AA1-樹脂先用THF洗。加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。然后加入25當(dāng)量50％NH2OH水溶液，在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)兩天。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，濾液在Speed Vac上濃縮，得到R7Z-AA3-AA2-AA1-NHOH。
實(shí)施例XR7Z-NR10C(O)CH2-AA2-AA1-NHOH的一般實(shí)驗(yàn)(式I中二肽化合物，其中n＝1，m＝0，R9為H(A為C(O)CH2NR10)，Z為單鍵，-SO2，-C＝O，或-C(O)NH-)1.BrCH2CO-AA2-AA1-樹脂向H2N-AA2-AA1-樹脂中加入12當(dāng)量溴乙酸，12當(dāng)量二異丙基碳化二亞胺。加入足量的CH2Cl2使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)2小時。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用DMSO洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到BrCH2CO-AA2-AA1-樹脂。2.R10NHCH2CO-AA2-AA1-樹脂BrCH2CO-AA2-AA1-樹脂先用DMSO洗。加入足量的DMSO使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)，然后加入40當(dāng)量所需的胺，NR10NH2或R7R10NH。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜.反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R10NHCH2CO-AA2-AA1-樹脂。(如果用R7R10NH，相應(yīng)于Z為單鍵，直接到步驟4。)3.R7Z-NR10CH2CO-AA2-AA1-樹脂3a.Z＝SO2∶R10NHCH2CO-AA2-AA1-樹脂先用二氧雜環(huán)己烷水溶液洗，然后加入10當(dāng)量的磺酰氯，R7-SO2Cl。加入足量的90％二氧雜環(huán)己烷水溶液使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。然后加入20當(dāng)量二異丙基乙胺。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，產(chǎn)生R7SO2NR10CH2CO-AA2-AA1-樹脂。3b.Z＝-CO-∶向R10NHCH2CO-AA2-AA1-樹脂中加入足量的CH2Cl2使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。3當(dāng)量所需的氯酸，R7COCl和3當(dāng)量Et3N[第一種選擇性的方法是向樹脂中加入足量的CH2Cl2使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)，然后加入3當(dāng)量所需的羧酸，R7COOH，3當(dāng)量二異丙基碳化二亞胺和0.05當(dāng)量的0.116M二甲基氨基吡啶的THF溶液。第二種選擇性的方法是向樹脂中加入3當(dāng)量所需的羧酸，R7COOH，3當(dāng)量HATU，3當(dāng)量HOAt和6當(dāng)量DIPEA，然后是足量的NMP使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)]反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R7CO-NR10CH2-AA3-AA2-AA1-樹脂。3c.Z＝-CONH-∶R10NHCH2CO-AA2-AA1-樹脂先用THF洗，然后用3當(dāng)量所需的異氰酸鹽，R7N＝C＝O，加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)。反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)過夜。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R7NHCO-NR10CH2-AA2-AA1-樹脂。4.保護(hù)基團(tuán)的去除如果AA1或AA2含有一個要去除的酸不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，上述得到的樹脂(R7Z-NR10CH2CO-AA2-AA1-樹脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/三異丙基硅烷(TIS)處理兩小時。反應(yīng)液抽濾，用CH2Cl2洗三遍，MeOH洗三遍，再用CH2Cl2洗三遍。5.R7Z-NR10C(O)CH2-AA2-AA1-NHOHR7Z-NR10CH2CO-AA2-AA1-樹脂先用THF洗。加入足量的THF使樹脂膨脹(～12.5ml/gr樹脂)，然后加入25當(dāng)量50％NH2OH水溶液，在旋轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行反應(yīng)并旋轉(zhuǎn)兩天。反應(yīng)物抽濾，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，濾液真空濃縮，得到R7Z-NR10C(O)CH2-AA2-AA1-NHOH。*注明在所有情況，所有固體試劑在溶劑后加。如果試劑不是固體，溶劑在液體試劑后加。對于待需去除的側(cè)鏈的AA2或AA1這種情況在NH2OH斷裂前進(jìn)行。典型的待需去除的側(cè)鏈的氨基酸有Glu(OtBu)，His(Boc)和Ser(OtBu)。
實(shí)施例XI原膠原C-蛋白酶的分離和制備人PCP的克隆和HT-1080載體的構(gòu)建人原膠原C-蛋白酶(PCP，也被認(rèn)為是骨形態(tài)發(fā)生蛋白或BMP-1)是由人成纖維細(xì)胞cDNA庫克隆而來(Stratagene，San Diego，CA)?？寺∈腔趫蟮赖暮塑账嵝蛄型ㄟ^PCR進(jìn)行的。(Wozney，J.M.，Rosen，V.，Celeste，A.J.，Mitsock，L.M.，Whitters，M.J.，Kriz，R.W.，Hewick，R.M.，和Warig，E.A.(1989)direct GenBank submission accession M22488，locus HUMBMP1)應(yīng)用Taq聚合酶，5’引物GCGCGCGGTACCCGCCCCGCCAGCATGCCCGGCGTGGCCCGCCTGCCGCTGCTGCTCGGGCTGCTGCTGCTCCCGCGTCCCGGCCGGCCGCTGGACTFGGCCGACTACACCTATGACCTGGC(SEQ ID NO1)(OligoTherapeutics，Inc.，Wilsonville，OR)，以及3’反向鏈引物CCGCTCGAGCCTCACTGGGGGGTCCGGTTTCTTTTCTGCACTCGGAATTTGAGCTGGTG(SEQ D NO2)(Gibco)產(chǎn)生完整全長核苷酸編碼的信號序列、前肽、催化結(jié)構(gòu)域和所有的C-末端結(jié)構(gòu)域形成天然翻譯終止位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物由凝膠電泳采用Wizard DNA純化試劑盒純化，通過TA克隆法直接與哺乳動物表達(dá)載體pCR3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)連接。連接產(chǎn)物用于應(yīng)用熱休克法轉(zhuǎn)化E coli菌系TOP10F’(Invitrogen，Carlsbad，CA)，轉(zhuǎn)化體用純化的質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶分析法選擇，應(yīng)用的限制性內(nèi)切酶為HindIII和BamHI。對PCP插入檢測為陽性的轉(zhuǎn)化體采用Perkin-Elmer/ABI系統(tǒng)進(jìn)行序列分析。兩種克隆被選擇，組合，編碼與Wozney等預(yù)言一樣的完整氨基酸序列。兩種克隆采用酶Bbr I進(jìn)行限制性重組，在自然發(fā)生的內(nèi)部位點(diǎn)斷裂，和EcoRV，在插入體和載體連接處斷裂。被切除的片段重新連接到EcoRV-處理的pCR3.1。最終構(gòu)建物含有與Wozney等報道一致的完整編碼序列，例外是信號序列中的沉默突變，在由翻譯起始位點(diǎn)算起的第39和45位G-＞A。完成的質(zhì)粒構(gòu)建由E.coli DH5擴(kuò)增，離子交換色譜純化(MaxiPrep columnsfrom Qiagen(Valencia，CA)catalog#12162)。HT-1080的轉(zhuǎn)染和PCP-表達(dá)克隆的選擇人纖維肉瘤系HT-1080(ATCC)于100mm培養(yǎng)皿中，在含10％熱不穩(wěn)定胎牛血清(HI-FBS)的高糖DMEM(DMEM-HG)中生長，在不含血清的介質(zhì)中，采用用于脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(Gibco，Bethesda，MD)的標(biāo)準(zhǔn)方法，用2ìg純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體通過用400ìg/mlG418(Gibco)處理平板培養(yǎng)物進(jìn)行選擇。選擇10天后，貼壁的單個菌落由培養(yǎng)板中挑出，在12孔板中重復(fù)，生長直到匯合。個別的穩(wěn)定的菌落被篩選出來用于PCP表達(dá)，采用TaqMan分析(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)，應(yīng)用相等量的總RNA。5’端引物為GACGAAGAGGACCTGAGGGCCTT(SEQ D NO3)(Perkin-Elmer，F(xiàn)osterCity，CA)，3’端反向引物為TTCCTGGAACTGCAGCTTTGA(SEQ DNO4)(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)，反向探針為TGCCGTCTGAGATCCACAGCCTGCT(SEQ ID NO5)(Perkin-Elmer)。在TaqMan篩選中基于PCPmRNA的最高表達(dá)水平，選用穩(wěn)定的HT-1080/hPCP-23系。HT-1080/hPCP-23穩(wěn)定系的原種移至含5％胎牛血清(HI-FBS)和10％DMSO(無G418)的DMEM-HG中，-70℃緩慢冷卻過夜，然后轉(zhuǎn)至液氮浴中長期貯存。新生的HT-1080/hPCP-23在含10％HI-FBS和250ìg/mlG418的DMEM-HG中維持不超過7代。用于收獲的PCP的表達(dá)通過HT-1080/hPCP-23復(fù)制和生長而完成，在大鼠尾型I膠原—涂層板，不含血清和無G418的OptiMEM(Gibco)中，進(jìn)行24小時。HT1080細(xì)胞中PCP的生產(chǎn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生PCP的HT1080細(xì)胞系被采用，在含5％HI-FBS和4ml/LG418(GIBCO)的optiMEM介質(zhì)中生長。培養(yǎng)物維持在37℃，溶解氧30％。產(chǎn)生典型的10升的一批大小。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4-6×105個/ml，收集培養(yǎng)液，用0.2ìm膜過濾。另外一種方法是以每天0.8到1.0培養(yǎng)體積的新鮮介質(zhì)灌流。灌流的培養(yǎng)物的密度達(dá)到1-2.5×106個/ml，維持2星期，持續(xù)收獲。由HT1080細(xì)胞中純化PCP以Dyematrex Gel Green A(Millipore，Bedford，MA)填充的柱子用50mMHEPES平衡，pH7.2，含有6mM CaCl2和0.3MNaCl。荷載HT1080細(xì)胞培養(yǎng)液后，用10倍柱體積的含1.0MNaCl的平衡緩沖液洗脫。PCP用50mM HEPES，PH7.2(含3M NaCl，2M尿素，6mM CaCl2)洗脫。洗脫部分混合濃縮至150-200mls，用4.0 L50 mMHEPES，6mM CaCl2，pH7.2透析過夜。然后用5000g離心15min除去沉淀物。含PCP樣品在-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 含PCP樣品解凍，用含有6mM CaCl2，pH7.2的50mM HEPES稀釋，如果必要，NaCl濃度在0.1-0.15M。pH用2NHCl調(diào)至6.7。蛋白溶液用0.45ìm膜過濾，除去沉淀物。然后負(fù)載到Q-Sepharose HighPerformance(Pharmacia，Piscataway，NJ)填充的柱上，該柱已用含有6mMCaCl2和0.15M NaCl，pH6.7的50m MHEPES平衡.PCP不保留在柱上，因此在洗脫液中。PCP濃縮至1mg/ml用于篩選。果蠅細(xì)胞中PCP的產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)生PCP的果蠅細(xì)胞在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，典型批體積是10升，在SF900IISF介質(zhì)(GIBCO)。溫度維持30C，溶解氧30％。定期性的，細(xì)胞流入一個含有谷氨酸鹽、脂質(zhì)和yeastolate的混合物中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30-50×106個/ml，上清液通過離心和用30Kd膜超濾濃縮而收獲。純化來自果蠅細(xì)胞的培養(yǎng)液體的PCP來自果蠅細(xì)胞的培養(yǎng)液體濃縮8倍，如果必要pH調(diào)整至7.1-7.2。培養(yǎng)液體3000g離心10分鐘，用0.45ìm的濾膜過濾。然后負(fù)載到用羧基-砜(J.T.Baker/Mallinckrodt，Phillpsburg，NJ)填充的柱上，該柱已用含有6mMCaCl2，pH7.2的50mM HEPES平衡.負(fù)載后，柱用10倍柱體積的平衡緩沖液洗脫。保留蛋白用9倍柱體積的0.1到1.0M的NaCl梯度洗脫。含有活性PCP的收集液混合進(jìn)一步純化。
由羧基-砜柱上洗脫下來的PCP負(fù)載到Dyematrex Gel Green A柱上(Millpore，Bedford，MA)，該柱已用含有6mM CaCl2和0.3M NaCl，pH7.4的50mM HEPES平衡.然后用含1.0M NaCl的平衡緩沖液洗脫。保留的蛋白用含有6mM CaCl2，3M NaCl，2M尿素，pH7.4的50mM HEPES洗脫。洗脫峰濃縮，用含有6mM CaCl2和0.3M NaCl，pH7.4的50mM HEPES透析。制備物3000g離心10分鐘。向上清液中加入Brij 35(Sigma，Madison，WI)至終濃度0.02％。此制備用于篩選。
實(shí)施例XII膠原酶的分離如Gehring，E.R.等J.Biol.Chem，270，22507，(1995)中描述的，人膠原酶-1的催化結(jié)構(gòu)域作為與泛素蛋白融合的蛋白在E.Coli中表達(dá)。融合蛋白純化后，膠原酶-1催化結(jié)構(gòu)域通過用1mM氨基苯基汞乙酸(APMA)37℃處理1小時而釋放，然后用鋅螯合色譜純化。
如Mookhtiar，K.A.等，Biochemistry，29，10620，(1990).中描述的，人膠原酶-2和白明膠酶B以活性形式由光滑的表皮中分離得到。
人膠原酶-3的前肽和催化結(jié)構(gòu)域作為與泛素蛋白融合的N-端融合蛋白在E.Coli中表達(dá)。蛋白純化后，催化結(jié)構(gòu)域通過用1mM氨基苯基汞乙酸(APMA)37℃處理1小時而釋放，然后用鋅螯合色譜純化。
如Roswit，W.T.等，Arch.Biochem.Biophys.，225，285-295(1983).中描述的，大鼠膠原酶-3以活性形式由子宮平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)中純化而來。
實(shí)施例XIII原膠原C端蛋白酶活性的抑制化合物對PCP的抑制力在如下的體外檢測方法中說明，應(yīng)用合成的肽作為底物。方法A用20μM底物(Dabcyl-Pro-Tyr-Tyr-Gly-Asp-Glu-Pro-n-Leu-Edans)(SEQ ID NO6).進(jìn)行連續(xù)檢測。最終檢測條件是20μM底物，50 mM HEPES pH 7.5，50mM NaCl，3％DM50，37℃and PCP酶。產(chǎn)物的形成由熒光分光光器監(jiān)測。Ex.＝335nm，Em.＝490nm.IC50通過初速度對化合物濃度作圖計算得到。方法B80μL緩沖液A含有溶于DMSO或載體工具的相當(dāng)量的檢驗(yàn)化合物，與溶于20μM HEPES的大約10μL 1mg/mL PCP酶和10μL0.1mM底物混合。混合物在室溫下溫孵1-2小時，用Victor Plate reader讀取熒光數(shù)值(Ex.405nm，Em.460nm 2000-4000，0.1-1sec/孔)，底物為DACM-Cys-Pro-Tyr-Aps-Glu-pro-nLeu-Lys-FITC-OH.(SEQ IDNO7)(DACM＝二甲基氨基香豆基馬來酰亞胺，F(xiàn)ITC＝熒光黃異硫氰酸鹽)。IC50通過初速度對化合物濃度作圖計算得到。
另外的體外檢測方法是用天然的原膠原作為底物，這些方法在WO97/05865中有進(jìn)一步的描述(“用于治療與膠原過量有關(guān)疾病的C-端蛋白酶抑制劑”)。
表I-III，V and VI中的化合物IC50的范圍在0.02到200μM。
表VI中的化合物IC50的范圍在10-1000ìM。
實(shí)施例XIV膠原酶活性的測定如Knight，C.G.等，F(xiàn)EBS Lett.，296(3)263-266(1992)描述的，本發(fā)明體外37℃對膠原酶-1、膠原酶-2和膠原酶-3的抑制活性是基于水解MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2(SEQ ID NO8)(Bachem，Inc.)膠原酶酶用檢測緩沖液稀釋(50mM Tricine pH 7.5，200mM NaCl，10mM CaCl2，和0.005％Brij-35)含有10ìM溶于DMSO的上述底物。加入溶于DMSO或僅僅溶于DMSO(對照樣品)的本發(fā)明化合物，其DMSO的終濃度為2.5％.熒光變化用Perkin-Elmer LS-52B熒光儀監(jiān)測，激發(fā)波長為328nm，發(fā)射波長為393nm。
由表I-VI選出的化合物對PCP的選擇性抑制超過對人膠原酶酶10到1000倍。
序列表<110> Dankwardt，Sharon MarieVan Wart，HaroldWalker，Keith Adrian Murray<120>肽原膠原C端蛋白酶抑制劑<130>20425<160>8<170>用于Windows3.0版的FastSEQ<210>1<211>122<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>1gcgcgcggta cccgccccgc cagcatgccc ggcgtggccc gcctgccgct gctgctcggg60ctgctgctgc tcccgcgtcc cggccggccg ctggacttgg ccgactacac ctatgacctg120gc122
<210>2<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>2ccgctcgagc ctcactgggg ggtccggttt cttttctgca ctcggaattt gagctggtg59<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>3gacgaagagg ac ctgagggc ctt23<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4ttcctggaac tgcagctttg a21
<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5tgccgtctga gatccacagc ctgct25<210>6<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>6Pro Tyr Tyr Gly Asp Glu Pro Leu1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽
<400>7Cys Pro Tyr Gly Asp Glu Pro Leu Lys1 5<210>8<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<223>Xaa＝DPA<400>8Arg Ala Xaa Leu Gly Leu Pro1 權(quán)利要求
1.選自由式(I)表示的化合物組的化合物 其中，R1和R4相互獨(dú)立，為氫或烷基；R2為(i)環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，雜芳基，雜芳烷基，雜芳烯基，雜環(huán)或雜環(huán)烷基；或(ii)-(亞烷基)-B-X，其中B為-O-、-NR8-、-S(O)n-(其中n為0、1或2)、-C＝O-、-CONR8-、-NR8CO2-、-NR8SO2-或-C(＝NR8)NR8SO2-(其中R8為H或烷基)，X為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基雜芳基，或雜芳烷基；或(iii)-(亞烷基)-B-X，其中B為NR8CO(其中R8為H或烷基)，X為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，或雜芳烷基；或(iv)R2和R3形成亞烷基或雜亞烷基鏈；R3為氫或烷基；R6為氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基或雜芳烷基；R5為(i)氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，雜芳基，雜芳烷基，雜芳烯基，雜環(huán)烷基，雜烷基，或-(亞烷基)-C(O)-X1，其中X1為烷基，羥基，烷氧基，芳基，芳烷基，芳氧基，芳烷氧基、雜芳基，雜芳氧基，雜芳烷氧基，或NR’R”(R’和R”相互獨(dú)立為H或烷基，或R’和R”形成亞烷基鏈)；或(ii)R4和R5形成亞烷基鏈；或(iii)R5和R6形成亞烷基鏈；n為0或1；A為-C(＝O)-CH(R9)-(CH2)m-N(R10)-，其中，m為0-5的整數(shù)；R9為氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，雜芳烷基，雜環(huán)烷基，雜烷基，或-(亞烷基)-C(O)-X1，其中X1為烷基，羥基，烷氧基，芳基，芳烷基，芳氧基，芳烷氧基、雜芳基，雜芳氧基，雜芳烷氧基，或NR’R”(R’和R”相互獨(dú)立，為H或烷基，或R’和R”形成亞烷基鏈)；和R10為氫，烷基，芳烷基，或雜芳烷基；Z為Y-B其中，Y為亞烷基或單鍵；和B為-CO-，-C(O)O-，-CONR8-，-SO2-，或SO2NR8-(其中R8為氫或烷基)，亞烷基(任選被羥基、烷氧基、氨基、單烷基氨基或二烷基氨基取代)或單鍵；R7為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，或雜芳烷基；條件是當(dāng)n＝0和Z為SO2時，那么R2不含有咪唑基；和它們藥物可接受的鹽、前體藥物、單獨(dú)的異構(gòu)體、異構(gòu)體的混合物。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中n為0。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中R3和R6為氫。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中R2為芳烷基或雜芳烷基。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中Z為-C(O)O-或-S(O)2-。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中R2為任選取代的苯甲基或雜芳烷基。
7.權(quán)利要求6的化合物，其中R2為4-叔-丁氧苯甲基，3-氯苯甲基，3-吲哚甲基，2-噻吩基甲基，4-咪唑甲基或4-噻唑甲基。
8.權(quán)利要求7的化合物，其中R2為4-噻唑甲基。
9.權(quán)利要求8的化合物，其中R7為芳基，芳烷基，雜芳基或雜芳烷基。
10.權(quán)利要求8的化合物，其中Z為-C(O)O-，R7為任選取代的苯甲基。
11.權(quán)利要求9的化合物，其中Z為-S(O)2-，R7為芳基或雜芳基。
12.權(quán)利要求10或11的化合物，其中R1和R4為氫，R5為烷基。
13.權(quán)利要求12的化合物，其中R5為(S，S)-1-甲基丙基。
14.權(quán)利要求3的化合物，其中R2為-(亞烷基)-B-X其中B為-O-、-NR8-、-S(O)n-(其中n為0、1或2)、-C＝O、-CONR8-、-NR8CO2-、-NR8SO2-或-C(＝NR8)NSO2(其中R8為H或烷基)，X為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，或雜芳烷基。
15.權(quán)利要求14的化合物，其中Z為-C(O)O-或-S(O)2-。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中R2為-CH2-B-X，B為-NHCO2，X為苯甲基。
17.權(quán)利要求16的化合物，其中R7為芳基或芳烷基。
18.權(quán)利要求17的化合物，其中R1和R4為氫，R5為烷基。
19.權(quán)利要求18的化合物，其中R5為(S，S)-1-甲基丙基。
20.權(quán)利要求1的化合物，其中n為1。
21.權(quán)利要求20的化合物，其中m為0，R3和R6為氫。
22.權(quán)利要求21的化合物，其中R2為芳烷基或雜芳烷基。
23.權(quán)利要求22的化合物，其中Z為-C(O)O-或-S(O)2-。
24.權(quán)利要求23的化合物，其中R2為任選取代的苯甲基或雜芳烷基。
25.權(quán)利要求24的化合物，其中R2為4-叔-丁氧苯甲基，3-氯苯甲基，3-吲哚甲基，2-噻吩基甲基，4-咪唑甲基或4-噻唑甲基。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中R2為4-噻唑甲基。
27.權(quán)利要求26的化合物，其中R7為芳基，芳烷基，雜芳基或雜芳烷基。
28.權(quán)利要求27的化合物，其中Z為-C(O)-，R7為苯甲基。
29.權(quán)利要求27的化合物，其中Z為-SO2-，R7為芳基。
30.權(quán)利要求28或29的化合物，其中R1和R4為氫，R5為烷基。
31.權(quán)利要求30的化合物，其中R5為(S，S)-1-甲基丙基。
32.權(quán)利要求21的化合物，其中R2為-(亞烷基)-B-X，其中B為-O-、-NR8-、-S-、-C＝O、-CONR8-、-NR8CO2-、-NSO2-或-C(＝NR8)NSO2-(其中R8為H或烷基)，X為環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，芳基，芳烷基，雜芳基，或雜芳烷基。
33.權(quán)利要求32的化合物，其中Z為-C(O)O-或-S(O)2-。
34.權(quán)利要求33的化合物，其中R2為-CH2-B-X，B為-NHCO2，X為苯甲基。
35.權(quán)利要求34的化合物，其中R7為芳基或芳烷基。
36.權(quán)利要求35的化合物，其中R1和R4為氫，R5為烷基。
37.權(quán)利要求36的化合物，其中R5為(S，S)-1-甲基丙基。
38.含有權(quán)利要求1到37的任意一個的化合物和一個藥物可接受的賦形劑的藥物組合物。
39.用于制備權(quán)利要求1的化合物的方法(i)將式II中的化合物，其中L為離去基團(tuán)和R1-R7、A、n和Z如權(quán)利要求1所限定，用羥胺或其保護(hù)的衍生物處理，(ii)如果需要去保護(hù)，分離權(quán)利要求1的化合物。
40.按照如權(quán)利要求39所要求的方法制備的權(quán)利要求1的化合物。
41.作為治療活性物質(zhì)的權(quán)利要求1-37中任何一個所要求的化合物。
42.權(quán)利要求1-37中任何一個所要求的化合物在制備用于治療纖維變性疾病、更優(yōu)選急性呼吸窘迫綜合癥的含有權(quán)利要求1-37中任何一個所要求的化合物作為活性成分的藥物中的應(yīng)用。用權(quán)利要求1到37的任何化合物，制備一個藥物，其含有權(quán)利要求1到37的任何化合物作為活性成分，用于治療。
43.一種治療纖維變性的方法，在病人需要原膠原C端蛋白酶抑制劑時給予病人，所述抑制劑對原膠原C端蛋白酶的選擇性至少高于對膠原酶-1、膠原酶-2和膠原酶-3的10倍。
44.如上文中描述的本發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(Ⅰ)化合物,其中R
文檔編號C07K14/78GK1330661SQ99814311
公開日2002年1月9日 申請日期1999年12月6日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月10日
發(fā)明者沙侖·馬里·丹克沃德特, 哈羅德·埃德加·范瓦特, 基思·阿德里安·默里·沃克 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司