專利名稱：Cu²⁺特異性單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種Cu2+特異性單克隆抗體，同時(shí)還公開了該單克隆抗體的制備方法，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
銅在土壤中和農(nóng)作物中積累，會(huì)污染糧食籽粒，進(jìn)而銅在農(nóng)畜等產(chǎn)品中有不同程 度的殘留，造成農(nóng)畜產(chǎn)品中銅污染超標(biāo)，嚴(yán)重影響我國(guó)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量和國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，而且還 嚴(yán)重危害人類的身體健康。因此，世界各國(guó)都十分重視環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品重金屬污染的控制和 監(jiān)測(cè)。傳統(tǒng)的重金屬銅檢測(cè)方法如原子吸收光譜分析、電感耦合等離子發(fā)射光譜分析等需 要大型的昂貴的分析儀器，無法用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，難以適應(yīng)環(huán)境及農(nóng)畜產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)抽查及產(chǎn) 品進(jìn)出口快速通關(guān)的要求。因此，需要發(fā)明一種新的重金屬銅檢測(cè)方法以解決上述問題。免疫學(xué)檢測(cè)方法具有快速、廉價(jià)、簡(jiǎn)便、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)，可便攜而進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān) 測(cè)?？朔藗鹘y(tǒng)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)。通過制備針對(duì)Cu2+特異性的單克隆抗體，建立重金屬銅 免疫學(xué)檢測(cè)方法。該方法的完成將解決Cu2+螯合、偶聯(lián)、單克隆抗體的制備等關(guān)鍵技術(shù)，為 建立Cu2+免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。該專利不僅為食品安全檢測(cè)，而且為我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品等的 出入境檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)部門的水域監(jiān)測(cè)提供有效的技術(shù)手段和檢測(cè)方法。對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的 可持續(xù)健康發(fā)展、解決食品安全問題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種Cu2+特異性單克隆抗體，具有抗體滴度高、特異性強(qiáng)的特性。本發(fā)明還進(jìn)一步提供Cu2+特異性單克隆抗體的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明提供的Cu2+特異性單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體對(duì)Cu2+具有 特異性。所述單克隆抗體特異性結(jié)合Cu2+螯合物，所述Cu2+螯合物為Cu2+-1,4,7, 10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacetic acid(Cu2+-DOTA) ■ Cu2+-DOTA-牛il 清白蛋白偶聯(lián)物或Cu2+-DOTA-卵清蛋白偶聯(lián)物。本發(fā)明提供一種Cu2+特異性單克隆抗體的制備方法，所述方法包括下述步驟(1)完全抗原的制備取0. 5 IOmg水溶性銅鹽溶于50 μ L水，配制2. 0 80mg/mL的Cu2+溶 液；取 0.8 20mg雙功能螯合劑 S-2-(4-isothiocyanatobenzyl)-l，4，7， 10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacetic acid(p-SCN—Bn—DOTA)溶于 50 μ L 二 甲基亞砜,配制16 400mg/mL的p-SCN-Bn_D0TA溶液；取2. 0 20. Omg載體蛋白溶于ImL HEPES緩沖溶液或碳酸鹽緩沖液，配制2 20mg/mL的載體蛋白溶液；將配制的50 μ L2. 0 80mg/mL 的 Cu2+ 溶液逐滴加入到 50 μ Lp-SCN-Bn-DOTA 溶液中，于 15 55°C、pH4. 5 6. 5、 振蕩條件下反應(yīng)15min 3h形成半抗原溶液；再將此半抗原溶液逐滴加入到ImL 2 20mg/mL的載體蛋白溶液中，于4°C或室溫、pH7. 5 10. 5條件下振蕩反應(yīng)24h ；用超濾或透析的方法去除未反應(yīng)的低分子物質(zhì)，得Cu2+的免疫抗原及檢測(cè)抗原；(2)小鼠免疫將步驟(1)制備的免疫抗原免疫小鼠；⑶細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的兩種檢測(cè)抗原分別包被ELISA板，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞株的篩選；選擇陽性值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋法進(jìn)行克隆。上述制備方法中，步驟(1)中所用水溶性銅鹽包括Cu (NO3) 2或CuCl2、CuSO4, Cu (CH3COO) 2、CuBr2 任意一種。上述制備方法中，步驟(1)中所用載體蛋白為鑰孔血藍(lán)蛋白或牛血清白蛋白或卵 清蛋白或人血清白蛋白中的任意一種。上述制備方法中，步驟(1)反應(yīng)溶液中載體蛋白與ρ-SCN-Bn-DOTA與Cu2+的質(zhì)量 比為(8 12) (8 12) 1。上述制備方法中，步驟(1)中溶解載體蛋白的緩沖溶液為HEPES緩沖液，濃度為 30 lOOmM、pH為7. 5 10. 5 ；或碳酸鹽緩沖液，pH為9. 0 10. 5。上述制備方法中，步驟(1)中用于溶解、保存完全抗原的緩沖液為HEPES緩沖溶 液，濃度為30 100mM、pH為6. 5 8. 0 ；或檸檬酸銨緩沖液，濃度為10 30mM、pH為6. 5 8. 0。上述制備方法中，步驟(1)中采用超濾方法去除未反應(yīng)的低分子物質(zhì)時(shí)，選用截 留分子量為10000 30000dal的超濾離心管，6000rpm 8000rpm超濾6次，每次5 30mino上述制備方法中，免疫抗原為Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH 或 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA 或 Cu2+-p-SCN_Bn-D0TA-0VA 或 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA_HAS 的任意一種。上述制備方法中，步驟⑷中所用檢測(cè)抗原為Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA、 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別應(yīng)用；或 Cu2+-p-SCN_Bn-D0TA-0VA、p-SCN-Bn-DOTA-OVA 分別 應(yīng)用；或 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-HAS、p-SCN-Bn-DOTA-HAS 分別應(yīng)用。上述制備方法中，步驟(3)中融合用小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混
口 O本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果1、利用本發(fā)明中的抗體和檢測(cè)技術(shù)對(duì)農(nóng)畜產(chǎn)品中的Cu2+殘留進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)速度 快、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、檢測(cè)成本低。2、利用本發(fā)明中的抗體和檢測(cè)技術(shù)對(duì)農(nóng)畜產(chǎn)品中的Cu2+殘留進(jìn)行檢測(cè)，只需一臺(tái) 酶標(biāo)儀即可檢測(cè)，簡(jiǎn)單易攜，并可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。


圖1為完全抗原電泳結(jié)果圖；1 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA, 2 p-SCN-Bn-DOTA-BSA, 3 :BSA
圖 2 為 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA、p-SCN-Bn-DOTA-BSA、BSA 的紫外光譜檢測(cè)結(jié)果；圖3為螯合劑對(duì)抗原抗體反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果；圖4為金屬銅對(duì)抗原抗體反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實(shí)施例。其作用被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡釋而非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。實(shí)施例1(1)完全抗原的制備稱取4mg Cu (NO3) 2 溶于 50 μ L 超純水，IOmg p-SCN-Bn-DOTA 溶于 50 μ LDMSO, 20mg 載體蛋白 KLH 或 BSA、OVA、HSA 溶于 ImL IOOmM HEPES 緩沖液(pH9. 5)。將 Cu(NO3)2 溶液 逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不斷攪拌下反應(yīng)3h，形成Cu2+-p-SCN-Bn_D0TA半抗原。 將Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0. 5mL載體蛋白溶液中，室溫、振蕩反應(yīng)24h。將抗 原轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500rpm離心lOmin，以IOOmM HEPES緩沖液 (pH7. 5)洗滌6次，再將抗原以IOOmMHEPES緩沖液(pH7. 5)稀釋、分裝，得Cu2+完全抗原， 于-20°C保存。(2)小鼠免疫將步驟(1)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫6 8周齡BALB/c小 鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為50yg/只。初次免疫用等量 弗氏完全佐劑混合乳化，第2次免疫用弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免 疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。用包被液對(duì)檢測(cè)抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 進(jìn)行稀釋， 以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜或37°C作用2h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次。用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入以磷酸鹽緩沖液稀釋的待檢血清，100 μ L/孔，37°C 作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入用PBS 5000 倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin。 加入50yL/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm測(cè)OD值。以免疫小鼠血清OD值/ 正常小鼠血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(3)細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原 用量為IOOyg/只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混合，Imin內(nèi)加入 0. 7 1.2mL 50%聚乙二醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培 養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng) 液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后 用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。
(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板，100 μ L/孔，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1.5h ；用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌， 3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且( 值> 0.2判斷為陽性。(5)單克隆抗體的鑒定通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的 抗體是否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA包 被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶 液(1、2、5、10、20、50、1 OOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37 °C作 用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀 釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入 50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤 細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(6)腹水的制備與純化取8 10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只，7天后腹腔接種用無 血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為0.5 2 X IO6個(gè)，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針 頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為抗Cu2+單克隆抗體，分裝，-80°C凍存?zhèn)溆谩Ｓ昧?酸銨沉淀法初步純化后再經(jīng)蛋白G親和層析柱純化。實(shí)施例2(1)完全抗原的制備稱取4mg Cu (NO3)2 溶于 50 μ L超純水，IOmg p-SCN-Bn-DOTA 溶于 50 μ L DMSO, 20mg 載體蛋白KLH或BSA、OVA、HSA溶于ImL 50mM碳酸鹽緩沖液(pH9. 5)。將Cu(NO3)2溶液逐 滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不斷攪拌下反應(yīng)3h，形成Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA半抗原。 將Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0. 5mL載體蛋白溶液中，室溫、振蕩反應(yīng)24h。將抗 原轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500rpm離心lOmin，以15mM檸檬酸銨緩沖液 (pH7. 5)洗滌6次，再將抗原以15mM檸檬酸銨緩沖液(pH7. 5)稀釋、分裝，得Cu2+完全抗原， 于-20°C保存。(2)小鼠免疫將步驟(1)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫6 8周齡BALB/c小 鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為50yg/只。初次免疫用等量弗氏完全佐劑混合乳化，第2次免疫用弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。用包被液對(duì)檢測(cè)抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 進(jìn)行稀釋， 以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜或37°C作用2h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次。用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入以磷酸鹽緩沖液稀釋的待檢血清，100 μ L/孔，37°C 作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入用PBS 5000 倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin。 加入50yL/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm測(cè)OD值。以免疫小鼠血清OD值/ 正常小鼠血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(3)細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原 用量為IOOyg/只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混合，Imin內(nèi)加入 0. 7 1.2mL 50%聚乙二醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培 養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng) 液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后 用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板，100 μ L/孔，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1.5h ；用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌， 3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD 值> 2. 1，并且( 值> 0.2判斷為陽性。(5)單克隆抗體的鑒定通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的 抗體是否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA包 被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶 液(1、2、5、10、20、50、1 OOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37 °C作 用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀 釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2Μ H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤 細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(6)腹水的制備與純化取8 10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只7天后腹腔接種用無 血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為0.5 2 X IO6個(gè)，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針 頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為抗Cu2+單克隆抗體，分裝，-80°C凍存?zhèn)溆?。用?酸銨沉淀法初步純化后再經(jīng)蛋白G親和層析柱純化。實(shí)施例3(1)完全抗原的制備稱取4mg Cu (NO3)2 溶于 50 μ L超純水，IOmg p-SCN-Bn-DOTA 溶于 50 μ L DMSO, 20mg 載體蛋白 KLH 或 BSA、OVA、HSA 溶于 ImL IOOmM HEPES 緩沖液(ρΗ9· 5)。將 Cu (NO3) 2 溶液 逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不斷攪拌下反應(yīng)3h，形成Cu2+-p-SCN-Bn_D0TA半抗原。 將Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0. 5mL載體蛋白溶液中，室溫、振蕩反應(yīng)24h。將抗 原轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500rpm離心lOmin，以IOOmM HEPES緩沖液 (pH7. 5)洗滌6次，再將抗原以IOOmMHEPES緩沖液(pH7. 5)稀釋、分裝，得Cu2+完全抗原， 于-20°C保存。(2)小鼠免疫將步驟(1)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫6 8周齡BALB/c小 鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為50yg/只。初次免疫用等量 弗氏完全佐劑混合乳化，第2次免疫用弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免 疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。用包被液對(duì)檢測(cè)抗原Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA 和 p-SCN-Bn-DOTA-OVA 進(jìn)行稀釋， 以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA 和 p-SCN-Bn-D0TA-0VA 分別包被 ELISA 板 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜或37°C作用2h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次。用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入以磷酸鹽緩沖液稀釋的待檢血清，100 μ L/孔，37°C 作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入用PBS 5000 倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin。 加入50yL/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm測(cè)OD值。以免疫小鼠血清OD值/ 正常小鼠血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(3)細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原 用量為IOOyg/只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混合，Imin內(nèi)加入 0. 7 1.2mL 50%聚乙二醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培 養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng) 液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA 和 p-SCN-Bn-DOTA-OVA 分別包被ELISA 板，100 μ L/孔，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1.5h ；用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌， 3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD 值> 2. 1，并且( 值> 0. 2判斷為陽性。選擇陽性值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋 法進(jìn)行克隆。(5)單克隆抗體的鑒定通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的 抗體是否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-OVA包 被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶 液(1、2、5、10、20、50、1 OOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37 °C作 用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀 釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入 50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤 細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(6)腹水的制備與純化取8 10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只，7天后腹腔接種用無 血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為0.5 2 X IO6個(gè)，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針 頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為抗Cu2+單克隆抗體，分裝，-80°C凍存?zhèn)溆?。用?酸銨沉淀法初步純化后再經(jīng)蛋白G親和層析柱純化。實(shí)施例4(1)完全抗原的制備稱取4mg Cu (NO3) 2 溶于 50 μ L 超純水，IOmg p-SCN-Bn-DOTA 溶于 50 μ LDMSO, 20mg 載體蛋白KLH或BSA、OVA、HSA溶于ImL 50mM碳酸鹽緩沖液(pH9. 5)。將Cu (NO3) 2溶液逐 滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不斷攪拌下反應(yīng)3h，形成Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA半抗原。 將Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0. 5mL載體蛋白溶液中，室溫、振蕩反應(yīng)24h。將抗 原轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500rpm離心lOmin，以15mM檸檬酸銨緩沖液 (pH7. 5)洗滌6次，再將抗原以15mM檸檬酸銨緩沖液(pH7. 5)稀釋、分裝，得Cu2+完全抗原， 于-20°C保存。(2)小鼠免疫
將步驟(1)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫6 8周齡BALB/c小 鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為50yg/只。初次免疫用等量 弗氏完全佐劑混合乳化，第2次免疫用弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免 疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。
用包被液對(duì)檢測(cè)抗原Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA 和 p-SCN-Bn-DOTA-OVA 進(jìn)行稀釋， 以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA 和 p-SCN-Bn-DOTA-OVA 分別包被 ELISA 板 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜或37°C作用2h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次。用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入以磷酸鹽緩沖液稀釋的待檢血清，100 μ L/孔，37°C 作用lh。用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入用PBS 5000 倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin。 加入50yL/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm測(cè)OD值。以免疫小鼠血清OD值/ 正常小鼠血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(3)細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原 用量為IOOyg/只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混合，Imin內(nèi)加入 0. 7 1.2mL 50%聚乙二醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培 養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng) 液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后 用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA 和 p-SCN-Bn-D0TA-0VA 分別包被 ELISA 板，100 μ L/孔，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1.5h ；用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌， 3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD 值> 2. 1，并且( 值> 0. 2判斷為陽性。選擇陽性值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋 法進(jìn)行克隆。(5)單克隆抗體的鑒定通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的 抗體是否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-OVA包 被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶 液(1、2、5、10、20、50、1 OOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37 °C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀 釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入 50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤 細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(6)腹水的制備與純化取8 10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只，7天后腹腔接種用無血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為0.5 2 X IO6個(gè)，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針 頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為抗Cu2+單克隆抗體，分裝，-80°C凍存?zhèn)溆?。用?酸銨沉淀法初步純化后再經(jīng)蛋白G親和層析柱純化。實(shí)施例5(1)完全抗原的制備稱取4mg Cu (NO3)2 溶于 50 μ L超純水，IOmg p-SCN-Bn-DOTA 溶于 50 μ L DMSO, 20mg 載體蛋白 KLH 或 BSA、OVA、HSA 溶于 ImL IOOmM HEPES 緩沖液(ρΗ9· 5)。將 Cu(NO3)2 溶液 逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不斷攪拌下反應(yīng)3h，形成Cu2+-p-SCN-Bn_D0TA半抗原。 將Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0. 5mL載體蛋白溶液中，室溫、振蕩反應(yīng)24h。將抗 原轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500rpm離心lOmin，以IOOmM HEPES緩沖液 (pH7. 5)洗滌6次，再將抗原以IOOmMHEPES緩沖液(pH7. 5)稀釋、分裝，得Cu2+完全抗原， 于-20°C保存。(2)小鼠免疫將步驟(1)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA免疫6 8周齡BALB/c小 鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為50yg/只。初次免疫用等量 弗氏完全佐劑混合乳化，第2次免疫用弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免 疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。用包被液對(duì)檢測(cè)抗原Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA 和 p-SCN-Bn-DOTA-OVA 進(jìn)行稀釋， 以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA 和 p-SCN-Bn-D0TA-0VA 分別包被 ELISA 板 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜或37°C作用2h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次。用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入以磷酸鹽緩沖液稀釋的待檢血清，100 μ L/孔，37°C 作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入用PBS 5000 倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin。 加入50yL/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm測(cè)OD值。以免疫小鼠血清OD值/ 正常小鼠血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(3)細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原 用量為IOOyg/只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混合，Imin內(nèi)加入 0. 7 1.2mL 50%聚乙二醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后 用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-OVA 和 p-SCN-Bn-DOTA-OVA 分別包被 ELISA 板，100 μ L/孔，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1.5h ；用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌， 3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD 值> 2. 1，并且( 值> 0. 2判斷為陽性。選擇陽性值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋 法進(jìn)行克隆。(5)單克隆抗體的鑒定通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的 抗體是否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-OVA包 被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次； 用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶 液(1、2、5、10、20、50、1 OOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37 °C作 用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀 釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入 50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤 細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(6)腹水的制備與純化取8 10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只，7天后腹腔接種用無 血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為0. 5 2 X IO6個(gè)，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針 頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為抗Cu2+單克隆抗體，分裝，-80°C凍存?zhèn)溆谩Ｓ昧?酸銨沉淀法初步純化后再經(jīng)蛋白G親和層析柱純化。實(shí)施例6(1)完全抗原的制備稱取4mg Cu (NO3)2 溶于 50 μ L超純水，IOmg p-SCN-Bn-DOTA 溶于 50 μ L DMSO, 20mg 載體蛋白 KLH 或 BSA、OVA、HSA 溶于 ImL IOOmM HEPES 緩沖液(ρΗ9· 5)。將 Cu(NO3)2 溶液 逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不斷攪拌下反應(yīng)3h，形成Cu2+-p-SCN_Bn-D0TA半抗原。 將Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0. 5mL載體蛋白溶液中，室溫、振蕩反應(yīng)24h。將抗 原轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500rpm離心lOmin，以IOOmM HEPES緩沖液(pH7. 5)洗滌6次，再將抗原以IOOmMHEPES緩沖液(pH7. 5)稀釋、分裝，得Cu2+完全抗原， 于-20°C保存。(2)小鼠免疫 將步驟(1)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-HSA免疫6 8周齡BALB/c小 鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為50yg/只。初次免疫用等量 弗氏完全佐劑混合乳化，第2次免疫用弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免 疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。用包被液對(duì)檢測(cè)抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-OVA 和 p-SCN-Bn-DOTA-OVA 進(jìn)行稀釋， 以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA 和 p-SCN-Bn-DOTA-OVA 分別包被 ELISA 板 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜或37°C作用2h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次。用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入以磷酸鹽緩沖液稀釋的待檢血清，100 μ L/孔，37°C 作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入用PBS 5000 倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin。 加入50yL/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm測(cè)OD值。以免疫小鼠血清OD值/ 正常小鼠血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(3)細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原 用量為IOOyg/只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混合，Imin內(nèi)加入 0. 7 1.2mL 50%聚乙二醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培 養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng) 液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后 用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA 和 p-SCN-Bn-DOTA-OVA 分別包被 ELISA 板，100 μ L/孔，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1.5h ；用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌， 3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD 值> 2. 1，并且( 值> 0. 2判斷為陽性。選擇陽性值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋 法進(jìn)行克隆。(5)單克隆抗體的鑒定通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的 抗體是否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-OVA包被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶 液(1、2、5、10、20、50、1 OOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37 °C作 用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀 釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入 50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤 細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(6)腹水的制備與純化取8 10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只，7天后腹腔接種用無 血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為0.5 2 X IO6個(gè)，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針 頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為抗Cu2+單克隆抗體，分裝，-80°C凍存?zhèn)溆?。用?酸銨沉淀法初步純化后再經(jīng)蛋白G親和層析柱純化。實(shí)施例7(1)完全抗原的制備稱取3. 2mg CuCl2 溶于 50 μ L 超純水，IOmg p-SCN-Bn-DOTA 溶于 50 μ L DMSO, 20mg 載體蛋白KLH或BSA、OVA、HSA溶于ImL IOOmM HEPES緩沖液(pH9. 5)。將CuCl2溶液逐滴 加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不斷攪拌下反應(yīng)3h，形成Cu2+-p-SCN-Bn_D0TA半抗原。將 Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0. 5mL載體蛋白溶液中，室溫、振蕩反應(yīng)24h。將抗 原轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500rpm離心lOmin，以IOOmM HEPES緩沖液 (pH7. 5)洗滌6次，再將抗原以IOOmMHEPES緩沖液(pH7. 5)稀釋、分裝，得Cu2+完全抗原， 于-20°C保存。(2)小鼠免疫將步驟(1)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫6 8周齡BALB/c小 鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為50yg/只。初次免疫用等量 弗氏完全佐劑混合乳化，第2次免疫用弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免 疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。用包被液對(duì)檢測(cè)抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 進(jìn)行稀釋， 以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜或37°C作用2h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次。用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入以磷酸鹽緩沖液稀釋的待檢血清，100 μ L/孔，37°C 作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入用PBS 5000 倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin。 加入50yL/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm測(cè)OD值。以免疫小鼠血清OD值/ 正常小鼠血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(3)細(xì)胞融合
選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原 用量為IOOyg/只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混合，Imin內(nèi)加入 0. 7 1.2mL 50%聚乙二醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培 養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng) 液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后 用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆
以相同濃度的 Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板，100 μ L/孔，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1.5h ；用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX 3次；加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，IOOyL/孔，37°C作用Ih;用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌， 3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD 值> 2. 1，并且( 值> 0. 2判斷為陽性。選擇陽性值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋 法進(jìn)行克隆。(5)單克隆抗體的鑒定 通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的 抗體是否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA包 被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶 液(1、2、5、10、20、50、1 OOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37 °C作 用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀 釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入 50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤 細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(6)腹水的制備與純化取8 10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只，7天后腹腔接種用無 血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為0.5 2 X IO6個(gè)，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待水鼠腹部膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針 頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為抗Cu2+單克隆抗體，分裝，-80°C凍存?zhèn)溆?。用?酸銨沉淀法初步純化后再經(jīng)蛋白G親和層析柱純化。實(shí)施例8(1)完全抗原的制備稱取4. 4mg CuSO4 ·5Η20 溶于 50 μ L 超純水，IOmg p-SCN-Bn-DOTA 溶于 50 μ LDMSO, 20mg 載體蛋白 KLH 或 BSA、0VA、HSA 溶于 ImL IOOmM HEPES 緩沖液(pH9. 5)。將 CuSO4 ·5Η20溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不斷攪拌下反應(yīng)3h，形成Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA半 抗原。將Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0. 5mL載體蛋白溶液中，室溫、振蕩反應(yīng)24h。 將抗原轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500rpm離心lOmin，以IOOmM HEPES緩沖 液(PH7.5)洗滌6次，再將抗原以IOOmM HEPES緩沖液(pH7. 5)稀釋、分裝，得Cu2+完全抗 原，于-20°C保存。(2)小鼠免疫將步驟(1)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫6 8周齡BALB/c小 鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為50yg/只。初次免疫用等量 弗氏完全佐劑混合乳化，第2次免疫用弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免 疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。用包被液對(duì)檢測(cè)抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA進(jìn)行稀釋， 以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜或37°C作用2h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次。用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入以磷酸鹽緩沖液稀釋的待檢血清，100 μ L/孔，37°C 作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入用PBS 5000 倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin。 加入50yL/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm測(cè)OD值。以免疫小鼠血清OD值/ 正常小鼠血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(3)細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原 用量為IOOyg/只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混合，Imin內(nèi)加入 0. 7 1.2mL 50%聚乙二醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培 養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng) 液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后 用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板，100 μ L/孔，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1.5h ；用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌， 3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD 值> 2. 1，并且( 值> 0. 2判斷為陽性。選擇陽性值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋 法進(jìn)行克隆。
(5)單克隆抗體的鑒定通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的抗體是否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA包 被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶 液(1、2、5、10、20、50、1 OOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37 °C作 用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀 釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入 50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤 細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(6)腹水的制備與純化取8 10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只，7天后腹腔接種用無 血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為0.5 2 X IO6個(gè)，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針 頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為抗Cu2+單克隆抗體，分裝，-80°C凍存?zhèn)溆?。用?酸銨沉淀法初步純化后再經(jīng)蛋白G親和層析柱純化。實(shí)施例9(1)完全抗原的制備稱取3. 4mg Cu (CH3COO)2 溶于 50 μ L 超純水，IOmg p-SCN-Bn-DOTA 溶于 50 μ LDMSO, 20mg 載體蛋白 KLH 或 BSA、0VA、HSA 溶于 ImL IOOmM HEPES 緩沖液(pH9. 5)。將 Cu (CH3COO) 2 溶液逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不斷攪拌下反應(yīng)3h，形成Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA半 抗原。將Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0. 5mL載體蛋白溶液中，室溫、振蕩反應(yīng)24h。 將抗原轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500rpm離心lOmin，以IOOmM HEPES緩沖 液(PH7.5)洗滌6次，再將抗原以IOOmM HEPES緩沖液(pH7. 5)稀釋、分裝，得Cu2+完全抗 原，于-20°C保存。(2)小鼠免疫將步驟(1)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫6 8周齡BALB/c小 鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為50yg/只。初次免疫用等量 弗氏完全佐劑混合乳化，第2次免疫用弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免 疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。用包被液對(duì)檢測(cè)抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 進(jìn)行稀釋， 以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜或37°C作用2h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次。用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入以磷酸鹽緩沖液稀釋的待檢血清，100 μ L/孔，37°C 作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入用PBS 5000 倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin。加入50yL/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm測(cè)OD值。以免疫小鼠血清OD值/ 正常小鼠血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(3)細(xì)胞融合 選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原 用量為IOOyg/只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混合，Imin內(nèi)加入 0. 7 1.2mL 50%聚乙二醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培 養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng) 液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后 用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板，100 μ L/孔，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1.5h ；用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌， 3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD 值> 2. 1，并且( 值> 0. 2判斷為陽性。選擇陽性值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋 法進(jìn)行克隆。(5)單克隆抗體的鑒定通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的 抗體是否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA包 被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶 液(1、2、5、10、20、50、1 OOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37 °C作 用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀 釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入 50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤 細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(6)腹水的制備與純化取8 10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只，7天后腹腔接種用無 血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為0.5 2 X IO6個(gè)，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針 頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為抗Cu2+單克隆抗體，分裝，-80°C凍存?zhèn)溆谩Ｓ?硫酸銨沉淀法初步純化后再經(jīng)蛋白G親和層析柱純化。實(shí)施例10
(1)完全抗原的制備稱取3. 7mg CuBr2 溶于 50 μ L 超純水，IOmg p-SCN-Bn-DOTA 溶于50 μ L DMSO, 20mg 載體蛋白 KLH 或 BSA、0VA、HSA 溶于 ImL IOOmM HEPES 緩沖液(pH9. 5)。將 CuBr2 溶液 逐滴加入到p-SCN-Bn-DOTA溶液中，不斷攪拌下反應(yīng)3h，形成Cu2+-p-SCN-Bn_D0TA半抗原。 將Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA溶液逐滴加入到0. 5mL載體蛋白溶液中，室溫、振蕩反應(yīng)24h。將抗 原轉(zhuǎn)移至截留分子量為30000dal超濾管中，7500rpm離心lOmin，以IOOmM HEPES緩沖液 (pH7. 5)洗滌6次，再將抗原以IOOmMHEPES緩沖液(pH7. 5)稀釋、分裝，得Cu2+完全抗原， 于-20°C保存。(2)小鼠免疫將步驟(1)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫6 8周齡BALB/c小 鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為50yg/只。初次免疫用等量 弗氏完全佐劑混合乳化，第2次免疫用弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免 疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。用包被液對(duì)檢測(cè)抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 進(jìn)行稀釋， 以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板 100 μ L/ 孔，4°C放置過夜或37°C作用2h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次。用20%兔血清作為封閉液，IOOyL/孔，37°C作用1. 5h。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入以磷酸鹽緩沖液稀釋的待檢血清，100 μ L/孔，37°C 作用lh。用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。加入用PBS 5000 倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用lh。用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽 緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次。鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin。 加入50yL/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm測(cè)OD值。以免疫小鼠血清OD值/ 正常小鼠血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(3)細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原 用量為IOOyg只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 10 1混合，Imin內(nèi)加入 0. 7 1.2mL 50%聚乙二醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培 養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng) 液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后 用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-BSA 和 p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別包被 ELISA 板，100 μ L/孔，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1.5h ；用含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX 3次；加入待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，IOOyL/孔，37°C作用Ih;用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌， 3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2MH2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD 值> 2. 1，并且( 值> 0. 2判斷為陽性。選擇陽性值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋 法進(jìn)行克隆。(5)單克隆抗體的鑒定通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的 抗體是否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA包 被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次； 用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶 液(1、2、5、10、20、50、1 OOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37 °C作 用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍稀 釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖 液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；加入 50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清OD值/骨髓瘤 細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。(6)腹水的制備與純化 取8 10周齡BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只，7天后腹腔接種用無 血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠注射細(xì)胞數(shù)為0.5 2 X IO6個(gè)，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠腹部膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)，用16號(hào)針 頭無菌采集腹水。將腹水離心，上清液即為抗Cu2+單克隆抗體，分裝，-80°C凍存?zhèn)溆?。用?酸銨沉淀法初步純化后再經(jīng)蛋白G親和層析柱純化。試驗(yàn)例1對(duì)本發(fā)明制得的完全抗原進(jìn)行如下檢測(cè)(1)完全抗原的SDS-PAGE電泳檢測(cè)SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，BSA的遷移速度比p-SCN-Bn-DOTA-BSA復(fù)合物 快、p-SCN-Bn-DOTA-BSA復(fù)合物的遷移速度比Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA_BSA復(fù)合物快， 表明Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA復(fù)合物的分子量大于p-SCN-Bn-DOTA-BSA復(fù)合物， p-SCN-Bn-DOTA-BSA復(fù)合物的分子量大于BSA。根據(jù)此結(jié)果可以初步鑒定完全抗原的合成 成功。檢測(cè)結(jié)果見圖1。(2)完全抗原的紫外分光光度法檢測(cè)對(duì)完全抗原進(jìn)行200 SOOnm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明完全抗原的紫外吸收峰相比 載體蛋白發(fā)生漂移，峰值與載體蛋白相比發(fā)生改變，據(jù)此進(jìn)一步證實(shí)完全抗原的合成成功。 以 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA、p-SCN-Bn-DOTA-BSA 為例，檢測(cè)結(jié)果見圖 2。(3)完全抗原的Cu2+含量測(cè)量石墨爐原子吸收分光光度法檢測(cè)完全抗原中的Cu2+含量，結(jié)果表明完全抗原 中Cu2+含量達(dá)4.0 μ g/mL 20.0 μ g/mL，此結(jié)果進(jìn)一步表明完全抗原的合成成功。以 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-KLH, Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA_BSA、p-SCN-Bn-DOTA-BSA 為例，檢測(cè)結(jié)果見 表1。表1完全抗原中Cu2+含量檢測(cè)結(jié)果 試驗(yàn)例2單克隆抗體特異性的鑒定初篩陽性的細(xì)胞上清進(jìn)一步用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定所分泌的抗體是 否針對(duì)Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。以其中4株細(xì)胞上清為例，具體步驟如下抗原 Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA包被ELISA板，4°C放置過夜；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液 (PBST)洗滌，3minX3次；用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用1. 5h ；用系列濃 度的p-SCN-Bn-DOTA溶液(1、2、5、10、20、50、IOOmM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混 勻，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次； 加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih;用含0.5% 吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C 避光反應(yīng)IOmin ；加入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì) 胞上清OD值/骨髓瘤細(xì)胞上清血清OD值> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。結(jié)果螯合 劑濃度小于5mmol/L，螯合劑對(duì)抗原抗體反應(yīng)沒有影響。檢測(cè)結(jié)果見圖3。(2)采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，對(duì)陽性細(xì)胞上清進(jìn)一步鑒定，具體步驟法如 下以完全抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA包被ELISA板，100 μ L/孔，4 °C放置過夜；用 含0.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次；用20%兔血清作為封閉液， 100 μ L/孔，37 °C作用1.5h;用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3 次；用含2mM p-SCN-Bn-DOTA的HEPES緩沖液逐級(jí)系列稀釋銅標(biāo)準(zhǔn)溶液、鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液、鉛 標(biāo)準(zhǔn)溶液、鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液、錳標(biāo)準(zhǔn)溶液、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液、鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液、鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液、鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液成 0. 5mmol/L、0. 25mmol/L、0. 125mmol/L、0. 0625mmol/L、0. 03125mmol/L、0. 015625mmol/L、 0. 0078125mmol/L、0. 00390625mmol/L 系列濃度，稀釋好的溶液置 37 50°C、0. 5 lh，再 與稀釋到一定倍數(shù)的銅抗體等體積混勻室溫反應(yīng)lh，加入到ELISA板中，100 μ L/孔，37°C 作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用PBS 5000倍 稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ；用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩 沖液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯二胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin ；力口 入50 μ L/孔的2M H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。計(jì)算金屬對(duì)抗體的半數(shù)抑制濃 度。以銅標(biāo)準(zhǔn)溶液為例檢測(cè)結(jié)果見圖4。試驗(yàn)例3采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，對(duì)檢測(cè)曲線進(jìn)行初步探索，方法如下包被以完全抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA 包被 ELISA 板，100 μ L/ 孔，4°C放置過夜；洗滌用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次；封閉用20%兔血清作為封閉液，100 u L/孔，37°C作用1. 5h ；洗滌用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX 3次；加樣用含2mM p-SCN-Bn-DOTA的HEPES緩沖液逐級(jí)系列稀釋銅標(biāo)準(zhǔn)溶液成 0. 5mmol/L、0. 25mmol/L、0. 125mmol/L、0. 0625mmol/L、0. 03125mmol/L、0. 015625mmol/L、 0. 0078125mmol/L、0. 00390625mmol/L 系列濃度，稀釋好的溶液置 37 50°C、0. 5 lh，再 與稀釋到一定倍數(shù)的銅抗體等體積混勻室溫反應(yīng)lh，加入到ELISA板中，100 u L/孔，37°C 作用lh ；洗滌用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入酶標(biāo)二抗加入用PBS 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 u L/孔， 37°C 作用 lh ；洗滌用含0. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；顯色鄰苯二胺(0PD)顯色，100 u L/孔，37°C避光反應(yīng)lOmin ；終止加入50 u L//孔的2M H2S04終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。結(jié)果抗體的IC5(1 = 0. 399mg/L,結(jié)果表明，制備的抗體對(duì)Cu2+ 有很好的識(shí)別能力，可用于研制Cu2+快速檢測(cè)試劑盒及膠體金免疫層析試紙。
權(quán)利要求
一種Cu2+特異性單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體對(duì)Cu2+具有特異性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體為特異性結(jié) 合 Cu2+ 螯合物，所述 Cu2+ 螯合物為 Cu2+-1，4，7，10-tetraazacyclododecane_l，4，7， 10-tetraacetic acid或Cu2+-DOTA-牛血清白蛋白偶聯(lián)物或Cu2+-DOTA-卵清蛋白偶聯(lián)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述Cu2+特異性單克隆抗體的制備方法，包括下述步驟 (1)完全抗原的制備取0. 5 IOmg水溶性銅鹽溶于50 μ L水，配制2. 0 80mg/mL的Cu2+溶 液；取 0.8 20mg 雙功能螯合劑 S-2-(4-isothiocyanatobenzyl)-l，4 7，1 0-tetraazacyclododecane-l,4,7,lO-tetraaceticacid(p-SCN-Bn-DOTA)溶于 50 μ L 二 甲基亞砜,配制16 400mg/mL的p-SCN-Bn_D0TA溶液；取2. 0 20. 0 mg載體蛋白溶于 ImL HEPES緩沖溶液或碳酸鹽緩沖液，配制2 20mg/mL的載體蛋白溶液；將配制的50 μ L 2. 0 80 mg/mL的Cu2+溶液逐滴加入到50 μ L p-SCN-Bn-DOTA溶液中，于15 55 "C、 PH4. 5 6. 5、振蕩條件下反應(yīng)15min 3h形成半抗原溶液；再將此半抗原溶液逐滴加入到 lmL2 20mg/mL的載體蛋白溶液中，于4°C或室溫、pH7. 5 10. 5條件下振蕩反應(yīng)24h ；用 超濾或透析的方法去除未反應(yīng)的低分子物質(zhì)，得Cu2+的免疫抗原及檢測(cè)抗原；(2)小鼠免疫將步驟(1)制備的免疫抗原免疫小鼠；(3)細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；(4)雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆以相同濃度的兩種檢測(cè)抗原分別包被ELISA板，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞株的篩選；選擇陽性 值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋法進(jìn)行克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于步驟(1)中所用水溶性銅鹽包括 Cu (NO3) 2 或 CuCl2、CuSO4, Cu (CH3COO) 2、CuBr2 任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于步驟(1)中所用載體蛋白為鑰孔血藍(lán) 蛋白或牛血清白蛋白或卵清蛋白或人血清白蛋白中的任意一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于步驟(1)反應(yīng)溶液中載體蛋白與 p-SCN-Bn-DOTA 與 Cu2+ 的質(zhì)量比為(8 12) (8 12) 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于步驟(1)中采用超濾方法去除未反應(yīng) 的低分子物質(zhì)時(shí)，選用截留分子量為10000 30000dal的超濾離心管，6000rpm 8000rpm 超濾6次，每次5 30min。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于免疫抗原為Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH 或 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA-BSA 或 Cu2+-p-SCN_Bn-D0TA-0VA 或 Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA_HAS 的任意 一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于步驟(4)中所用檢測(cè)抗原為 Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA、p-SCN-Bn-DOTA-BSA 分別應(yīng)用； 或 Cu2+-p-SCN-Bn-D0TA-0VA、p-SCN-Bn-DOTA-OVA 分別應(yīng)用；或 Cu2+-p-SCN_Bn-D0TA-HAS、 p-SCN-Bn-DOTA-HAS 分別應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于步驟(3)中融合用小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 12 1混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Cu2+特異性單克隆抗體及其制備方法，將Cu2+與雙功能螯合劑反應(yīng)形成半抗原，Cu2+-螯合劑半抗原再與載體蛋白反應(yīng)形成Cu2+-螯合劑-載體蛋白完全抗原。用該完全抗原免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞，獲得了抗Cu2+單克隆抗體。所述單克隆抗體對(duì)Cu2+具有特異性，抗體滴度高、特異性強(qiáng)。本發(fā)明還提供抗Cu2+單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明中的抗體和檢測(cè)技術(shù)對(duì)農(nóng)畜產(chǎn)品中的Cu2+殘留進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)速度快、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、檢測(cè)成本低。
文檔編號(hào)C07K14/77GK101845096SQ200910218168
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者劉國(guó)文, 唐佳, 孔濤, 孫佳, 張燚, 張鵬, 李小兵, 楊威, 王哲, 許超 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)