專利名稱：一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地涉及一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白及其應(yīng) 用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,TB)感染所致的人類疾 病，是分支桿菌病的主要類型，主要通過呼吸道傳播。自1882年德國科學(xué)家Rrobert Koch 發(fā)現(xiàn)TB以來，全球約有兩億人死于TB，且疫情發(fā)展日趨嚴(yán)重。據(jù)WHO預(yù)計(jì)，全球現(xiàn)有TB病 人2000萬，如不控制今后10年還將有9000萬人發(fā)病。我國現(xiàn)有3. 3億結(jié)核菌感染者，肺 結(jié)核病人600多萬，其中有嚴(yán)重傳染性的病人150萬，每年死于結(jié)核病的達(dá)25萬人。因此， 結(jié)核病的預(yù)防、早期診斷和及時治療是高度關(guān)注的課題。MTB有H37RV與H37Ra兩種標(biāo)準(zhǔn)菌 株，前者為毒力株而后者為減毒突變株，它們均來源于1934年的人肺H37分離株。與一些 臨床分離株不同的是，H37RV對藥物敏感、利于基因工程操作并在TB動物模型中保留了完 整毒力，因而該菌株被廣泛應(yīng)用于TB相關(guān)的生物醫(yī)藥研究(MTb H37RV project at Sanger Institute, NCBI)。目前常用的結(jié)核病診斷方法有胸部X光透視和主要依靠患者痰液、胸 水、支氣管肺泡液的顯微鏡直接涂片檢查(AFP)和培養(yǎng)法，以及分子生物學(xué)和血清學(xué)檢查， 這些方法多基于高特異性的抗原建立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白，它的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；它來自結(jié)核分支桿菌H37RV。本發(fā)明一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白，是由下述方法制的1)人工合成下述引物38-16-1la :ATCGCATATGTGTGGCTCGAAACCACCGAGC38-16-1lb :GATTGTTCATACCACCACCACCGCTGGAAATCGTCGCGATCGC38-16-1Ic GGTGGTGGTGGTATGAACAATCTCGCATTG 38-16-1Id :TCCGCAATCACCACCACCACCCTACTTCGTATGGCGATGCG38-16-1Ie GGTGGTGGTGGTGATTGCGGATCCCATGAC38-16-1If :ATCGCTCGAGTCCCAAGCTTCCTATGCGAA以結(jié)核分支桿菌H37RV為模板進(jìn)行擴(kuò)增，制得基因38Kd-16Kd_llKd ；2)將基因插入達(dá)載體pET-28b上，得重組質(zhì)粒pET-28b-38Kd-16Kd_llKd ；3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21 (DE3)中表達(dá)、純化。本發(fā)明另一個目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌抗體IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，它包 括TB抗原和酶標(biāo)二抗，其中TB抗原是上述的一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白，TB抗原包被量為ι. 0-8. 0 μ g/孔，酶標(biāo)二抗工作濃度為2. 0-16. Omg/mL ；優(yōu)選TB抗原包被量為2. O μ g/孔，酶標(biāo)二抗工作濃度為4. Omg/mL。本發(fā)明另一個目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌抗體IgG膠體金試劑盒，它包括TB 抗原、膠體金標(biāo)記TB抗原和質(zhì)控線包被兔抗TB抗體，其中TB抗原是上述的一種結(jié)核分枝 桿菌重組融合蛋白；TB抗原噴點(diǎn)濃度為0. 25-2. Omg/mL,金標(biāo)記TB抗原染色液的工作濃度為OD值 50. 0-100.0，TB抗原噴點(diǎn)量為0. 5-1. 75 μ L/cm，金標(biāo)記TB抗原噴點(diǎn)量為0. 5-1. 75 μ L/ cm,質(zhì)控線抗TB抗體包被濃度為0. 5-2. Omg/mL ；反應(yīng)膜封閉時間為45-75分鐘，反應(yīng)膜 干燥條件為相對濕度25% -30%下干燥30-75分鐘，金標(biāo)記抗原墊干燥條件為相對濕度 25% -30%下干燥3-5小時，標(biāo)本檢測反應(yīng)時間為15°C 30°C下反應(yīng)10-30分鐘。優(yōu)選TB抗原噴點(diǎn)濃度為1. Omg/mL,金標(biāo)記TB抗原染色液的工作濃度為OD值 80. 0，TB抗原噴點(diǎn)量為1. 0 μ L/cm,金標(biāo)記TB抗原噴點(diǎn)量為1. 0 μ L/cm,質(zhì)控線抗TB抗體包 被濃度為1. Omg/mL ；反應(yīng)膜封閉時間為60分鐘，反應(yīng)膜干燥條件為相對濕度25% -30%下 干燥60分鐘，金標(biāo)記抗原墊干燥條件為相對濕度25% -30%下干燥4小時，標(biāo)本檢測反應(yīng) 時間為15°C 30°C下反應(yīng)25-30分鐘，溫度低于15°C時標(biāo)本檢測反應(yīng)時間延長10分鐘。本發(fā)明的又一個目的是一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白在制備單抗、多抗、疫苗、 檢測試劑盒及蛋白芯片中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白，在制備單抗、多抗、疫苗及 蛋白芯片中的應(yīng)用。本發(fā)明選擇了結(jié)核分枝桿菌H37RV三個強(qiáng)抗原表位，利用PCR方法，構(gòu)建了一種結(jié) 核分枝桿菌重組融合蛋白，與常用抗原相比特異性更強(qiáng)，并以其為抗原，制備了結(jié)核分枝桿 菌抗體IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和結(jié)核分枝桿菌抗體IgG膠體金試劑盒，與市場上的同類 試劑盒相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可為結(jié)核病感染的檢測提供更為特異、準(zhǔn)確 的工具，很好地滿足了結(jié)核分枝桿菌感染臨床診斷的需要；還可用于制備單抗、多抗、疫苗 及蛋白芯片。


圖1是表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-38Kd-16Kd_llKd的構(gòu)建流程圖。圖2是表達(dá)質(zhì)粒pET-28b-38Kd-16Kd酶切產(chǎn)物電泳圖，其中1表示DNA Marker, 2, 3、4分別表示酶切后的三個陽性菌，5表示酶切前的空pET-28b質(zhì)粒。圖3是結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白純化電泳圖，其中1表示細(xì)胞裂解后的上清，2表示細(xì)胞裂解后的沉淀，3表示純化的TB蛋白。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白的制備1. 1基因融合通過計(jì)算機(jī)分析TB H37RV基因組全序列，選擇其強(qiáng)抗原表位38Kda蛋白 (GENEBANKlocus :YP_177770)、16Kda(GENEBANK locus :NP_214765)和 IlKda(GENEBANK locus :AAL16896)的DNA序列為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物為
38Kd擴(kuò)增引物38-16-1 la :atcgCATATGtgtggctcgaaaccaccgagc 54. 8% Tm :79· 638-16-1 lb :GATTGTTCATACCACCACCACCGCTGGAAATCGTCGCGATC GC 55. 8% Tm 8616Kd擴(kuò)增引物38-16-1 Ic ggtggtggtggtATGAACAATCTCGCATTG 50% Tm 7638-16-1Id :TCCGCAATCACCACCACCACCCTACTTCGTATGGCGATGCG 58.5% Tm 89IlKd擴(kuò)增引物38-16-1 Ie ggtggtggtggtGATTGCGGATCCCATGAC 60% Tm 80. 838-16-1 If :atcgCTCGAGTCCCAAGCTTCCTATGCGAA 50% Tm 56. 6取結(jié)核分支桿菌H37RV的菌體，加IOOmL蛋白酶K (10mg/mL)，置56°C水浴消化4 小時，用常規(guī)酚/氯仿法純化，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；50mL 擴(kuò)增體系ddH20 31. 5mL, IOXbuffer 5. OmL, 4XdNTP 4. OmL，上、下游引物 混液 4. OmL, DNA 1. 5mL, Taqplus 0. 2mL(lU)；38-16-lla和 38-16-llb 用于擴(kuò)增 38Kd基因的片段，38-16-llc 和 38-16-lld用于 擴(kuò)增16Kd基因的片段，38-16-lle和38-16-llf用于擴(kuò)增IlKd基因的片段；引物38-16-lla 禾口 38-16-llf分別帶有NdeI和XhoI的酶切位點(diǎn)，引物38-16-llc和38_16_llb順序互補(bǔ)， 并共同對應(yīng)于16Kd基因片段的5’末端序列，引物38-16-lle和38-16-lld順序互補(bǔ)，并共 同對應(yīng)于IlKd基因片段的5’末端序列；以結(jié)核分支桿菌H37RV(購自中國藥品生物制品檢定所)基因組為模板，以引物 38-16-lla 和 38_16_llb 擴(kuò)增 38Kd 基因的片段，以引物 38-16-llc 和 38-16-lld 擴(kuò)增 16Kd 基因的片段，以引物38-16-lle和38-16-llf擴(kuò)增IlKd基因的片段；產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后切割，將含DNA條帶的膠塊按DNA快速純化試劑盒 (購自六合通-北京 TAKARA 公司，產(chǎn)品名稱TAKARA MiniBEST Plasmid purification)說 明回收DNA;然后再以38Kda和IlKda基因片段為模板用連接PCR擴(kuò)增38Kda、16Kda和IlKda 融合基因，中間以4個Gly(ggtggtggtggt)連接；即以第一輪PCR擴(kuò)增得到的38Kd目的DNA 片段和16Kd目的DNA片段為模板，加入引物38-16-1 Ia和38-16-1 ld，擴(kuò)增38Kd_16Kd目的 DNA片段；以第二輪PCR擴(kuò)增得到的38Kd-16Kd和以第一輪PCR擴(kuò)增得到的IlKd目的DNA 片段為模板，加入引物38-16-lla和38-16-1 If，擴(kuò)增38Kd-16Kd_lIKd目的DNA片段；得到 完整的結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白DNA重組片段38Kd-16Kd-llKd ；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝 膠電泳檢測，結(jié)果如附圖1所示；質(zhì)粒DNA 禾口 38Kd-16Kd-llKd 均經(jīng)內(nèi)切酶切，50mL 體系10x buffer 5. OmL, DNA12mL, Xho I和Nde I各15U, ddH20補(bǔ)至50mL ；37°C水浴6h。50mL酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳分離，切割DNA條帶瓊脂塊，并按DNA快速純化試劑盒說明回收DNA ；將融合基因片段克隆至pET_28b質(zhì)粒(具有Xho I和Nde I酶切位點(diǎn)，購自華美生物公司)，20mL 連接體系:ddH2015. OmL, IOx buffer 2. OmL, PET_28b 2. OmL, Pab 1. OmL, T4DNA連接酶20U ；質(zhì)粒自身連接對照，20mL連接反應(yīng)體系ddH20 16. OmL, IOxbuffer 2. OmL, PET-28b 2. OmL, T4DNA連接酶20U ；按上述加樣后，混勻、稍離心，14°C _16°C連接過 夜；轉(zhuǎn)化E. coli涂平板(含有15微克/毫升卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基)并挑克隆提質(zhì)粒測序，確定序列正確的克隆。重組質(zhì)粒的酶切(Ndel/Xhol)電泳圖如附圖2所示。1. 2產(chǎn)物測序測序引物為S38-16(GCTGGAAATCGTCGCGATCAA)及 T7promoter 和 T7terminator 的通用引物。所有擴(kuò)增引物和測序引物的合成以及重組質(zhì)粒序列pET-28b-38Kd-16Kd-l IKd 的測定都由華大基因公司提供服務(wù)。測得目的融合基因的核苷酸序列 如SEQ ID N0:1所
1. 3結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白的表達(dá)、純化將驗(yàn)證正確克隆的質(zhì)粒(pET-28b-38Kd-16Kd-llKd)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (購自華美生物公司)宿主菌，目的蛋白在包含體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)將含有38Kd-16Kd-llKd基 因的BL21(DE3)宿主菌培養(yǎng)到OD 0.6，用終濃度ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，4小時之后收集菌體、 超聲破碎、高速離心、收集沉淀。對收集的沉淀用Ni柱(Pharmcia公司chelating sephrose fast flow)進(jìn)行純化，用如下溶液洗脫300mM 咪唑，20mM Tris,500Mm NaCl，8M Urea。 38Kda、16Kda和IlKd融合基因表達(dá)蛋白共619個氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。1. 4結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白鑒定1. 4. 1純度和分子量的測定經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(蛋白上樣量10 μ g)，為單一 區(qū)帶，薄層掃描鑒定純度為95. 8%。分子量約為66Kd，檢測結(jié)果見附圖3。1. 4. 2濃度測定經(jīng)Folin-酚法測定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)參比品，抗原蛋白 濃度為 3. 5 士0. 12mg/mL。1. 4. 3活性測定用間接ELISA方法測定。包被量2. 0 μ g/孔，使用內(nèi)部質(zhì)控血清 測定OD值，結(jié)果見表1。表1結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白活性測定結(jié)果 抗原抗體反應(yīng)采用蛋白印記技術(shù)(Western Blot)，以抗人結(jié)核IgG抗體陽性人 血清測試TB融合蛋白抗原，可見陽性反應(yīng)，SDS-PAGE并證實(shí)抗原的分子量為66KD。結(jié)果見 附圖4。1. 4. 4融合蛋白穩(wěn)定性測定蛋白質(zhì)濃度的穩(wěn)定性測定，分三次測定保存的結(jié)核抗原溶液的蛋白質(zhì)濃度的穩(wěn)定 性，結(jié)果見表2.表2.結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白抗原的濃度測定 測試結(jié)果顯示，_85°C保存的結(jié)核抗原溶液的蛋白質(zhì)濃度非常穩(wěn)定。結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白活性的穩(wěn)定性測定，分三次噴點(diǎn)_85°C保存的結(jié)核分 枝桿菌重組融合蛋白并制成膠體金試劑盒，以企業(yè)質(zhì)控參比品進(jìn)行測定結(jié)果見表3.表3結(jié)核抗體企業(yè)質(zhì)控參比品的考核結(jié)果 測定結(jié)果顯示，_85°C保存的結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白的免疫活性穩(wěn)定。注本發(fā)明所用樣本由全軍結(jié)核病研究中心提供。由臨床細(xì)菌學(xué)檢查及臨床X線 等臨床確診的結(jié)核病患者血清結(jié)核抗體IgG陽性的感染者及陰性血清、血漿制成。30支樣 品，其中15支抗人結(jié)核抗體IgG陰性參考品(N) ；15支抗人結(jié)核抗體IgG陽性參考品(P)。實(shí)施例2酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測結(jié)核分枝桿菌抗體IgG的建立采用間接ELISA方法檢測結(jié)核分枝桿菌抗體IgG，可用于TB抗原活性的鑒定和TB 感染的輔助診斷。本實(shí)施例以實(shí)施例1制得的結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白做抗原；為確定 抗原包被量和酶標(biāo)二抗工作濃度，以陽性和陰性參考品為測試樣品，采用方陣滴定法選擇 最佳抗原包被量和相應(yīng)的酶標(biāo)二抗工作濃度，見下表4。表4最佳抗原包被量和相應(yīng)的酶標(biāo)二抗工作濃度的選擇 注以陽性和陰性參考品為測試樣品，陰性參考品出現(xiàn)任何一份陽性即判斷出現(xiàn) 假陽性結(jié)果，在表中即以“士”表示；陽性參考品出現(xiàn)任何一份陰性即判定出現(xiàn)假陰性結(jié) 果，在表中即以“士”表示。根據(jù)測試結(jié)果，在抗原包被量為2. 0 μ g/孔，酶標(biāo)二抗使用濃度為4mg/ml時，檢測 結(jié)果最佳，故以TB重組抗原2. 0 μ g/孔包被微孔板和4mg/ml酶標(biāo)二抗IgG，建立結(jié)核分枝 桿菌抗體IgG酶聯(lián)免疫檢測法(間接ELISA)。實(shí)施例3結(jié)核分枝桿菌抗體IgG診斷試劑盒(膠體金法)的制備及性能檢定2. 1試劑盒組成及制備本發(fā)明試劑盒以實(shí)施例1純化的結(jié)核分枝桿菌(TB)重組融合蛋白作為抗原，采用 雙抗原夾心法。使用時加入待檢血清，如樣品中含有抗TB特異性抗體，則先與金標(biāo)記TB抗 原結(jié)合，前行再與膜表面的相應(yīng)TB抗原結(jié)合形成復(fù)合物而呈現(xiàn)紫紅顏色。如樣品中無抗TB 特異性抗體，則只有質(zhì)控線顏色，其顏色強(qiáng)度直接與樣品中存在的抗TB特異性抗體IgG的
量呈正比。試劑盒主要組成成分為測試板，包括加樣區(qū)、金標(biāo)抗原包被膜區(qū)、抗原包被檢測 區(qū)、質(zhì)控區(qū)和吸水墊區(qū)。2. 1. 1質(zhì)控線包被兔抗TB抗體(購自北京賽蒂克生物技術(shù)公司，蛋白濃度為 4.0 士 0. 15mg/mL，免疫瓊脂雙擴(kuò)散效價(jià)彡1 16)。2. 1. 2膠體金標(biāo)記TB抗原膠體金直徑30nm膠體金顆粒，原液光密度OD不小于 10. 0。2. 1.3條件優(yōu)化2. 1. 3. 1抗原和金標(biāo)抗原包被濃度的確定采用方陣滴定選擇最佳抗原包被濃度和相應(yīng)的金標(biāo)記抗原工作濃度，見下表5。表5最佳抗原和相應(yīng)的金標(biāo)記抗原工作濃度的選擇 注以陽性和陰性血清質(zhì)控參比品為測試樣品，陰性參考品出現(xiàn)任何一份陽性即 判斷出現(xiàn)假陽性結(jié)果，在表中即以“+/”表示；陽性參考品出現(xiàn)任何一份陰性即判定出現(xiàn)假 陰性結(jié)果，在表中即以“_/”表示。根據(jù)測試結(jié)果，在抗原噴點(diǎn)量為1. 0 μ L/cm和金標(biāo)記抗原噴點(diǎn)量為1. 0 μ L/cm的 條件下，選定最佳抗原噴點(diǎn)濃度為1. Omg/mL，金標(biāo)記抗原染色液的工作濃度為OD值80. 0。2. 1. 3. 2最佳抗原噴點(diǎn)量的確定在已確定最佳抗原噴點(diǎn)濃度為1. Omg/mL和最佳 金標(biāo)記抗原噴點(diǎn)濃度為OD值80. 0的基礎(chǔ)上，采用方陣滴定選擇最佳抗原噴點(diǎn)量(見表6)表6最佳抗原噴點(diǎn)量的確定 根據(jù)測試結(jié)果，選定最佳抗原噴點(diǎn)量為1. O μ L/cm.2. 1.3. 3最佳金標(biāo)記抗原噴點(diǎn)量的確定在已確定最佳抗原噴點(diǎn)濃度為l.Omg/mL,噴點(diǎn)量為1. O μ L/cm和最佳金標(biāo)記抗原噴點(diǎn)濃度為OD值80. 0的基礎(chǔ)上，采用方陣滴定 選擇最佳金標(biāo)記抗原噴點(diǎn)量(見表7)。表7最佳金標(biāo)記抗原噴點(diǎn)量的確定 根據(jù)測試結(jié)果，選定最佳金標(biāo)記抗原噴點(diǎn)量為1. 0 μ L/cm。2. 1. 3. 4質(zhì)控線抗TB抗體包被濃度的選擇抗TB抗體包被量為1 μ L/cm。質(zhì)控線抗TB包被濃度選擇的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。表8質(zhì)控線抗TB包被濃度的選擇 -未出現(xiàn)對照線；+對照線清晰；+++ 對照線線清晰粗大。表8顯示，兔抗TB抗體與本試驗(yàn)中所用金標(biāo)抗原有較好的反應(yīng)性。1. Omg/mL濃度 的抗TB包被基本上能夠較好地顯示對照效果，繼續(xù)提高抗體濃度未能明顯提高反應(yīng)強(qiáng)度。 因而選擇1. Omg/mL抗TB的濃度作為質(zhì)控線包被濃度。2. 1.3.5反應(yīng)膜封閉時間的選擇硝酸纖維素膜包被TB抗原和抗TB抗體后，經(jīng)封閉液封閉可以有效地降低非特異 性反應(yīng)。對反應(yīng)膜封閉時間的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9。表9反應(yīng)膜封閉時間(37°C )的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果 -陰性反應(yīng)；士可疑陽性；++陽性反應(yīng)；X 反應(yīng)膜背景模糊表9表明，封閉時間不同對正確反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。封閉時間過短會造 成反應(yīng)膜背景模糊，影響結(jié)果判讀。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明封閉45分鐘-75分鐘，封閉效果較 好，有助于提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇封閉60分鐘為生產(chǎn)控制條件。2. 1. 3. 6反應(yīng)膜干燥條件的選擇表10反應(yīng)膜干燥條件選擇的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 反應(yīng)膜適宜的干燥條件不僅與試劑的靈敏度有關(guān)，而且與試劑的穩(wěn)定性關(guān)系更為 密切。表10的結(jié)果表明，在相對濕度為20%環(huán)境下，干燥時間短則試劑的穩(wěn)定性差，干燥時 間長則影響反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在相對濕度為25%、30%的環(huán)境下干燥時間為45分鐘、60 分鐘、75分鐘時，反應(yīng)結(jié)果比較接近，都有較好的敏感度和穩(wěn)定性?？紤]到在生產(chǎn)過程中的 可控性，采用相對濕度25% -30%、干燥60分鐘的條件為生產(chǎn)中的干燥條件。2. 1. 3. 7金標(biāo)記抗原墊干燥時間的選擇表11金標(biāo)記抗原墊干燥時間選擇的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 金標(biāo)記抗原墊干燥在37°C條件下。表11顯示，干燥環(huán)境相對濕度過低可能影響反 應(yīng)強(qiáng)度。在比較適宜的干燥環(huán)境下，干燥時間3小時、4小時、5小時干燥效果比較接近，試 劑的反應(yīng)敏感性及穩(wěn)定性均較好。故選用相對濕度25% -30%、干燥4小時為生產(chǎn)控制條 件。2. 1. 3. 8標(biāo)本檢測反應(yīng)時間的選擇表12標(biāo)本檢測反應(yīng)時間的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果(A) 表13標(biāo)本檢測反應(yīng)時間的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果⑶ 表12和表13表明，在通常室溫條件下(15°C 30°C )，抗TB陽性或強(qiáng)陽性反應(yīng) 血清在反應(yīng)后5-10分鐘即可出現(xiàn)明確的陽性反應(yīng)結(jié)果?？筎B弱陽性反應(yīng)血清在常溫下反 應(yīng)時，需要較長的反應(yīng)時間，在反應(yīng)25-30分鐘時可獲得明確的陽性反應(yīng)結(jié)果。抗TB陰性 血清在通常室溫條件下(15°C 30°C )，反應(yīng)在30分鐘內(nèi)，基本能正確反映測定血清性質(zhì)。 反應(yīng)時間過長有可能造成假陽性。因此，將結(jié)果判定時間確定在反應(yīng)25-30分鐘時判定反 應(yīng)結(jié)果。考慮到特殊情況下，可能實(shí)際工作的室溫低于15°C，影響反應(yīng)結(jié)果，采取延長10分 鐘反應(yīng)時間的措施，也可獲得比較滿意的結(jié)果。2. 1.4試劑盒的制造1)檢測板的包被NC膜的預(yù)切割、粘貼，將抗原以pH7. 2,0. 02mol/L PBS緩沖液稀 釋至最佳濃度，質(zhì)控抗TB抗體以pH7. 2,0. 02mol/L PBS緩沖液稀釋至最佳濃度，分別以優(yōu) 化條件噴點(diǎn)于NC膜上，干燥、封閉、干燥；封閉液配方0. 02mol/L PBS緩沖液(pH7. 2，含0. 25%脫脂奶粉)；2)金標(biāo)記抗原的粘貼以0. 05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)配制金標(biāo)記抗原 溶液，包被于玻璃纖維模上，干燥后粘貼于包被好的檢測板；3)組裝檢測板切割成測試條，裝配、密封包裝。2. 1. 5檢測方法及結(jié)果分析1)取出測試板，置于一平面操作臺上，平衡至室溫。2)加樣微量加樣器于加樣孔加入未稀釋的待測血清100 iU。3) 15-20分鐘內(nèi)觀察并記錄結(jié)果。強(qiáng)陽性結(jié)果可在5分鐘出現(xiàn)，弱陽性和陰性結(jié)果 需等待20分鐘觀察。陽性判讀窗口(C和T位置)出現(xiàn)兩條紫紅色線條；陰性判讀窗口 僅出現(xiàn)一條紫紅色線條(C位置)；無效判讀窗口無紫紅色線條。2. 2試劑盒性能評價(jià)2. 2. 1對30份TB參考品的檢測結(jié)果應(yīng)用本發(fā)明制備的試劑盒，對TB抗體參考品進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果見表14。表14對30份TB抗體參考品檢測結(jié)果
-陰性反應(yīng)；+陽性反應(yīng)；++ 較強(qiáng)陽性反應(yīng)；+++ 強(qiáng)陽性反應(yīng)。從試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，陰性、陽性符合率均達(dá)100%。因此我們認(rèn)為采用這一檢 測系統(tǒng)是可行的。2. 2. 2對HBV、HCV、HAV和梅毒等抗體陽性血清的交叉反應(yīng)測試采用本發(fā)明試劑盒對HBV(乙型肝炎)、HCV(丙型肝炎)、HAV(甲型肝炎)、癌癥和 非結(jié)核病呼吸系統(tǒng)患者血清的交叉反應(yīng)，以進(jìn)一步評價(jià)其特異性，對上述確認(rèn)患者血樣進(jìn) 行了測試，結(jié)果見下表。表15HBV、HCV、HAV和梅毒等抗體陽性血清的交叉反應(yīng)測試結(jié)果 結(jié)果顯示該試劑盒與上述患者血樣無交叉反應(yīng)發(fā)生。2. 2. 3對梅毒(RF)陽性血清、血脂、膽紅素和血紅蛋白等干擾物的交叉反應(yīng)檢測表16對梅毒(RF)陽性血清、血脂、膽紅素和血紅蛋白等干擾物的測試結(jié)果 結(jié)果顯示該試劑盒與RF陽性血清、血脂、膽紅素和血紅蛋白等干擾物的交叉反應(yīng) 未超過正常人血清樣品的假陽性率。2. 2. 4與國外同類產(chǎn)品比較等試驗(yàn)資料以本發(fā)明試劑盒與上海澳普生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的新一代結(jié)核抗體快速診斷 試劑盒作比較。對215份陽性血清和健康人陰性血清進(jìn)行了比較檢測，結(jié)果見下表表17與上海澳普結(jié)核抗體試劑盒的比較測試結(jié)果 真實(shí)性和預(yù)示值計(jì)算分析表18真實(shí)性和預(yù)示值計(jì)算分析 本發(fā)明試劑盒與參比品上海澳普結(jié)核抗體試劑盒的檢測符合率為93. 49%。SEQUENCE LISTING<110>吉林大學(xué)<120> 一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白及其應(yīng)用<130>GD0702<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1857<212>DNA
<213> ^W/f'XV^M (Mycobacterium tuberculosis)<400>1tgtggctcga aaccaccgag cggttcgcct gaaacgggcg ccggcgccgg tactgtcgcg60actacccccg cgtcgtcgcc ggtgacgttg gcggagaccg gtagcacgct gctctacccg120ctgttcacct gtggggtccg gcctttcacg agaggtatcc gaacgtcacg atcaccgctc180agggcaccgg ttctggtgcc gggatcgcgc aggccgccgc cgggacggtc aacattgggg240cctccgacgc ctattgtcgg aaggtgatat ggccgcgcac aaggggctga tgaacatcgc300gctagccatc tccgctcagc aggtcaacta caacctgccc ggagtgagcg agcacctcaa360gctgaacgga aaagtcctgg cgccatgtac cagggcacca tcaaaacctg ggacgacccg420cagatcgctg cgctcaaccc cggcgtgaac ctgcccggca ccgcggtagt tccgctgcac480cgctccgacg ggtccggtga caccttctgt tcacccagta cctgtccaag caagatcccg540agggctgggg caagtcgccc ggcttcggca ccaccgtcga cttcccggcg gtgccgggtg 600cgctgggtga gaacggcaac ggcggcatgg tgaccgttgc gccgagacac cgggctgcgt660ggcctatatc ggcatcagct tcctcgacca ggccagtcaa cggggactcg gcgaggccca720actaggcaat agctctggca atttcttgtt gcccgacgcg caagcattca ggccgcggcg780gctggcttcg catcgaaaac cccggcgaac caggcgattt cgatgatcga cgggcccgcc840ccggacggct acccgatcat caactacgag tacgccatcg tcaacaaccg caaaaggacg 900ccgccaccgc gcagaccttg caggcatttc tgcactgggc gatcaccgac ggcaacaagg960cctcgttcct cgaccaggtt catttccagc cgctgccgcc cgcggtggtg aagttgctga1020cgcgttgatc gcgacgattt ccagcggtgg tggtggtatg aacaatctcg cattgtggtc1080gcgtccggtg tgggacgttg agccctggga ccgctggcta cgtgacttct tcggccctgc1140cgcacgacgg actggtaccg cccggtcgcc ggagacttca cgccggccgc cgagatcgtc1200aaggatggcg cgacgcggtg gtccgtttgg aactgcccgg cattgacgtc gacaaggacg1260tcaacgtcgg cttgaccctg gccagccggt gagccgcctg gtgatccgcg gcgaacaccg1320cgacgagcac acgcaagcgc cggagacaaa gacggccgca ccctgcgtga gatccgctac1380ggatcattcc gccgccgttc cggctgcccg cgcacgtcac cagcgaggcc atcgcggctt1440cctatgacgc cggtgtgctg accgccgggt tgccggcgcc tacaaggccc cagccgaaac1500tcaggcgcag cgcatcgcca tacgaagtag ggtggtggtg gtgattgcgg atcccatgac1560agagcagcag tggaatttcg cgggtatcga ggccgcggca agcgcaatcc agggaaatgt1620cacgtccatt cattccctcc ttgacgaggg gaagcagtcc ctgaccaagc tcgcagcggc1680ctggggcggt agcggttcgg aggcgtacca gggtgtccag caaaaatggg acgccacggc1740taccgagctg aacaacgcgc tgcagaacct ggcgcggacg atcagcgaag ccggtcaggc1800aatggcttcg accgaaggca acgtcactgg gatgttcgca taggaagctt gggaatc1857<210>2<211>619<212>PRT<213> ^W/t'^MM (Mycobacterium tuberculosis)〈220〉 <221>misc_feature
<222> (349)·· (349)<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid<400>2
Cys Gly Ser Lys Pro Pro Ser Gly Ser Pro Glu Thr Gly Ala Gly Ala151015Gly Thr Val Ala Thr Thr Pro Ala Ser Ser Pro Val Thr Leu Ala Glu202530Thr Gly Ser Thr Leu Leu Tyr Pro Leu Phe Thr Cys Gly Val Arg Pro354045Phe Thr Arg Gly lie Arg Thr Ser Arg Ser Pro Leu Arg Ala Pro Val505560Leu Val Pro Gly Ser Arg Arg Pro Pro Pro Gly Arg Ser Thr Leu Gly65707580Pro Pro Thr Pro lie Val Gly Arg Gly Tyr Gly Arg Ala Gln Gly Ala859095Asp Glu His Arg Ala Ser His Leu Arg Ser Ala Gly Gln Leu Gln Pro100105110Ala Arg Ser Glu Arg Ala Pro Gln Ala Glu Arg Lys Ser Pro Gly Ala115120125Met Tyr Gln Gly Thr lie Lys Thr Trp Asp Asp Pro Gln lie Ala Ala130135140Leu Asn Pro Gly Val Asn Leu Pro Gly Thr Ala Val Val Pro Leu His145150155160Arg Ser Asp Gly Ser Gly Asp Thr Phe Cys Ser Pro Ser Thr Cys Pro165170175Ser Lys lie Pro Arg Ala Gly Ala Ser Arg Pro Ala Ser Ala Pro Pro180185190Ser Thr Ser Arg Arg Cys Arg Val Arg Trp Val Arg Thr Ala Thr Ala195200205Ala Trp Gly Pro Leu Arg Arg Asp Thr Gly Leu Arg Gly Leu Tyr Arg210215220His Gln Leu Pro Arg Pro Gly Gln Ser Thr Gly Thr Arg Arg Gly Pro225230235240Thr Arg Gln Leu Leu Trp Gln Phe Leu Val Ala Arg Arg Ala Ser lie245250255Gln Ala Ala Ala Ala Gly Phe Ala Ser Lys Thr Pro Ala Asn Gln Ala260265270lie Ser Met lie Asp Gly Pro Ala Pro Asp Gly Tyr Pro lie lie Asn275280285
Tyr Glu Tyr Ala lie Val Asn Asn Arg Lys Arg Thr Pro Pro Pro Arg290295300Arg Pro Cys Arg His Phe Cys Thr Gly Arg Ser Pro Thr Ala Thr Arg305310315320Pro Arg Ser Ser Thr Arg Phe lie Ser Ser Arg Cys Arg Pro Arg Trp325330335Arg Ser Cys Gly Arg Val Asp Arg Asp Asp Phe Gln Arg Trp Trp Trp340345350Tyr Glu Gln Ser Arg lie Val Val Ala Ser Gly Val Gly Arg Cys Ala355360365Leu Gly Pro Leu Ala Thr Gly Leu Leu Arg Pro Cys Arg Thr Thr Asp370375380Trp Tyr Arg Pro Val Ala Gly Asp Phe Thr Pro Ala Ala Glu lie Val385390395400Lys Asp Gly Ala Thr Arg Trp Ser Val Trp Asn Cys Pro Ala Leu Thr405410415Ser Thr Arg Thr Ser Thr Ser Ala Val Pro Trp Pro Ala Gly Glu Pro420425430Pro Gly Asp Pro Arg Arg Thr Pro Arg Arg Ala His Ala Ser Ala Gly435440445Asp Lys Asp Gly Arg Thr Leu Arg Glu lie Arg Tyr Gly Ser Phe Arg450455460Arg Arg Ser Gly Cys Pro Arg Thr Ser Pro Ala Arg Pro Ser Arg Leu465470475480Pro Met Thr Pro Val Cys Gly Pro Pro Gly Cys Arg Arg Leu Gln Gly485490495Pro Ser Arg Asn Ser Gly Ala Ala His Arg His Thr Lys Arg Gly Gly500505510Gly Gly Asp Cys Gly Ser His Asp Arg Ala Ala Val Glu Phe Arg Gly515520525Tyr Arg Gly Arg Gly Lys Arg Asn Pro Gly Lys Cys His Val His Ser530535540Phe Pro Pro Lys Arg Gly Glu Ala Val Pro Asp Gln Ala Arg Ser Gly545550555560Leu Gly Arg Pro Arg Phe Gly Gly Val Pro Gly Cys Pro Ala Lys Met565570575Gly Arg His Gly Tyr Arg Ala Glu Gln Arg Ala Ala Glu Pro Gly Ala580585590Asp Asp Gln Arg Ser Arg Ser Gly Asn Gly Phe Asp Arg Arg Gln Arg
595600605 His Trp Asp Val Arg lie Gly Ser Leu Gly lie61061權(quán)利要求
一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白的基因38Kd-16Kd-11Kd，其特征在于它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白，其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白，其特征在于它來自結(jié)核 分支桿菌H37RV。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白，其特征在于它是由下述 方法制得1)人工合成下述引物38-16-1 la :ATCGCATATGTGTGGCTCGAAACCACCGAGC38-16-1 lb :GATTGTTCATACCACCACCACCGCTGGAAATCGTCGCGATCGC38-16-1Ic GGTGGTGGTGGTATGAACAATCTCGCATTG38-16-1Id :TCCGCAATCACCACCACCACCCTACTTCGTATGGCGATGCG38-16-1Ie :GGTGGTGGTGGTGATTGCGGATCCCATGAC38-16-1If :ATCGCTCGAGTCCCAAGCTTCCTATGCGAA以結(jié)核分支桿菌H37RV為模板進(jìn)行擴(kuò)增，制得基因38Kd-16Kd-llKd ；2)將基因插入達(dá)載體pET-28b上，得重組質(zhì)粒pET-28b-38Kd-16Kd-llKd；3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)、純化。
5.一種結(jié)核分枝桿菌抗體IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，它包括TB抗原和酶標(biāo)二抗，其特 征在于TB抗原是權(quán)利要求2、3或4所述的一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白，TB抗原包被 量為1. 0-8. Oyg/孔，酶標(biāo)二抗工作濃度為2. 0-16. Omg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種結(jié)核分枝桿菌抗體IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在 于TB抗原包被量為2. 0 μ g/孔，酶標(biāo)二抗工作濃度為4. Omg/mL。
7.一種結(jié)核分枝桿菌抗體IgG膠體金試劑盒，它包括TB抗原、膠體金標(biāo)記TB抗原和 質(zhì)控線包被兔抗TB抗體，其特征在于TB抗原是權(quán)利要求2、3或4所述的一種結(jié)核分枝桿 菌重組融合蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種結(jié)核分枝桿菌抗體IgG膠體金試劑盒，其特征在于TB 抗原噴點(diǎn)濃度為0. 25-2. Omg/mL,金標(biāo)記TB抗原染色液的工作濃度為OD值50. 0-100. 0，TB 抗原噴點(diǎn)量為0. 5-1. 75 μ L/cm,金標(biāo)記TB抗原噴點(diǎn)量為0. 5-1. 75 μ L/cm,質(zhì)控線抗TB抗 體包被濃度為0. 5-2. Omg/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種結(jié)核分枝桿菌抗體IgG膠體金試劑盒，其特征在于TB 抗原噴點(diǎn)濃度為1. Omg/mL,金標(biāo)記TB抗原染色液的工作濃度為OD值80. 0，TB抗原噴點(diǎn)量 為1. 0 μ L/cm,金標(biāo)記TB抗原噴點(diǎn)量為1. 0 μ L/cm,質(zhì)控線抗TB抗體包被濃度為1. Omg/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白在制備單抗、多抗、 疫苗及蛋白芯片中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白及其應(yīng)用，它是要根據(jù)結(jié)核分枝桿菌三個強(qiáng)抗原表位，利用PCR方法，以H37RV為模板構(gòu)建的一種結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白，與常用抗原相比特異性更強(qiáng)，并以其為抗原，制備了結(jié)核分枝桿菌抗體IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和結(jié)核分枝桿菌抗體IgG膠體金試劑盒，與市場上的同類試劑盒相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為結(jié)核病感染的檢測提供更為特異、準(zhǔn)確的工具，很好地滿足了結(jié)核分枝桿菌感染臨床診斷的需要；還可用于制備單抗、多抗、疫苗及蛋白芯片。
文檔編號C07K19/00GK101838660SQ20091021795
公開日2010年9月22日 申請日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日
發(fā)明者于庭, 于艷輝, 劉秀敏, 包洪, 常靜, 滕春燕, 肖霞, 高藝航 申請人:吉林大學(xué)