專利名稱：：高密度糖基化聚丙烯親和膜的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及聚丙烯親和膜的制備方法及應用，尤其涉及一種利用點擊化學反應，將疊氮糖基固定在接枝改性的聚丙烯微孔膜上制備高密度糖基化聚丙烯親和膜的方法，以及該聚丙烯親和膜在蛋白質分離或純化等領域的應用。
背景技術：
：聚丙烯膜具有表面能低、結晶度高、無毒、化學穩(wěn)定性好等優(yōu)點，已成為現(xiàn)代工業(yè)中大規(guī)模生產(chǎn)應用的高分子材料。此外，聚丙烯原料經(jīng)濟，加工性能優(yōu)異，可以通過拉伸、熱致相分離等方法方便地成孔，因此被廣泛應用于制備各種用途的分離膜。但是由于其表面的惰性、親水性較差，在用作膜分離材料時，容易發(fā)生膜污染現(xiàn)象，特別是用于生物醫(yī)用領域以及其它與生物分子接觸的環(huán)境時，聚丙烯膜會與生物分子發(fā)生作用，導致蛋白質、血小板等在膜表面大量的吸附，造成膜的污染，嚴重影響膜的性能。表面改性可優(yōu)化膜分離材料的表面性能并且不會破壞它的本體性能，提高膜分離材料的使用效率，延長膜的使用壽命；而糖基具有良好的親水性和抗非特異性吸附能力，可以改善聚丙烯膜的表面性能，并拓展其應用領域。此外，將糖基化修飾層對特定蛋白質的特異性識別作用與具有良好機械性能的聚丙烯膜的分離功能相結合，得到一種新穎的具有生物識別作用的分離膜材料，將在蛋白質選擇性分離、濃縮、手性拆分、病毒的特異性捕捉等方面具有廣闊的應用前景。糖與蛋白質都是重要的生物信息分子，在生物體內(nèi)，很多重要的生理過程都是通過糖與蛋白質的相互作用而實現(xiàn)的。利用糖的生物相容性以及對蛋白識別作用，將糖基引入高分子材料中，在食品檢測、醫(yī)藥、蛋白質分離等領域也取得了一定進展。公開號為CN1460524的中國發(fā)明專利中制備了一種a~烯丙基葡糖苷表面修飾的人工晶狀體，這種白內(nèi)障嚢外摘除術的人工晶狀體光學部和袢的外表面均帶有a烯丙基葡糖苷單體的分子層，具有良好的生物相容性，且制法科學、醫(yī)用移植安全可靠。公開號為CN1401665的中國發(fā)明專利申請中利用殼聚糖具有高度的生物相容性、生物降解性以及抗凝血活性等優(yōu)良特性，將其作為底物構建了一種人工血管的生物醫(yī)用材料。公開號為CN1773636的中國發(fā)明專利中用羧基多糖對四氧化三鐵納米顆粒進行表面改性，由于羧基多糖的無毒、生物相容性好特點，易與藥物、細胞、蛋白質或基因進行連接，適用于作為磁靶向藥物載體、磁性液體細胞內(nèi)熱療、核磁共振對比顯像劑、磁分離等生物醫(yī)學領域。公開號為CN1935342的中國發(fā)明專利中利用紫外接枝2-曱基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，然后利用HEMA羥基將糖基固定在聚丙烯膜上，通過糖基對凝集素的識別作用，從而達到良好的吸附分離效果。糖與蛋白的識別是多個糖基與蛋白質共同作用的結果，即所謂的"集簇效應"，因此提高糖基密度，可以對蛋白質的選擇性分離、手性拆分起到良好的效果，而目前現(xiàn)有技術制備的膜其表面接枝糖基密度較低，有待進一步深入研究。近年來，點擊化學反應以其獨特的優(yōu)點而被廣泛應用于各個領域，其特點是反應模塊化，主要體現(xiàn)在Huisgen1，3-偶極環(huán)加成反應上，即疊氮化合物與炔基化合物反應生成含有三唑雜環(huán)的化合物，其具有反應條件溫和，反應有立體選擇性，反應過程對氧氣和水不敏感，效率高，基本可以達到定量化反應，產(chǎn)物單一、易分離并且在生理條件下穩(wěn)定等優(yōu)點，在合成化學，生物制藥，材料科學等領域被廣泛應用。將點擊化學反應應用于材料表面改性(Macromolecules，2007,40，7513-7520)，大大提高了材料表面的反應效率，在材料中引入更多的功能性基團，更好的實現(xiàn)了材料改性的目的，可應用于生物傳感器、治療載體、細胞培養(yǎng)、蛋白質的選擇性吸附分離等方面。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種高密度糖基化聚丙烯親和膜的制備方法，利用1,3-偶極環(huán)加成反應進行糖基的膜表面固定化，由于1，3-偶極環(huán)加成反應定量化的反應產(chǎn)率大大提高了糖基在膜表面的密度，制得高密度糖基化聚丙烯親和膜，以克服現(xiàn)有技術中膜表面接枝糖基密度較低的缺點。一種高密度糖基化聚丙烯親和膜的制備方法，包括如下步驟(1)在光引發(fā)劑作用下，通過紫外輻照將丙烯酸或曱基丙烯酸單體接枝到聚丙烯微孔膜表面，得到接枝改性的聚丙烯微孔膜；(2)在催化劑作用下，將含炔基的胺或含炔基的醇與步驟(1)中得到的接枝改性的聚丙烯微孔膜表面的羧基反應，得到表面固定炔基的聚丙烯微孔膜；(3)利用1,3-偶極環(huán)加成反應將疊氮糖與步驟(2)中得到的表面固定炔基的聚丙烯微孔膜表面的炔基偶聯(lián)，得到高密度糖基化聚丙烯親和膜。所述高密度糖基化聚丙烯親和膜的制備方法，可具體包括如下步驟(1)將聚丙烯微孔膜在光引發(fā)劑溶液中浸泡后取出自然晾干，再浸入丙烯酸單體的水溶液或甲基丙烯酸單體的水溶液中，通過紫外光輻照接枝聚合10~60分鐘后取出，經(jīng)洗滌、烘干得到表面接枝改性的聚丙烯微孔膜，單體接枝率為！~98克/平方米膜；所述的光引發(fā)劑溶液中光引發(fā)劑的濃度為0.001~0.010摩爾/升，其原因在于引發(fā)劑濃度決定表面接枝密度，但過高的引發(fā)劑濃度也會阻礙單體向膜孔內(nèi)擴散，影響膜孔內(nèi)糖基接枝量；由于單體濃度決定單體在聚丙烯微孔膜表面的接枝密度，但單體濃度過高會造成接枝過程中溶液自聚，降低接枝率，從而影響表面糖基密度，單體濃度過低亦會降低接枝率，從而影響表面糖基密度。為了得到較高密度糖基化聚丙烯親和膜，所述的丙烯酸單體的水溶液中單體的體積百分濃度優(yōu)選為2%~55%,曱基丙烯酸單體的水溶液中單體的體積百分濃度優(yōu)選為2%~55%;(2)將步驟(1)中得到的接枝改性的聚丙烯微孔膜浸入pH值為5.0~6.5的緩沖溶液中，加入含炔基的胺或含炔基的醇，以及催化劑，在氮氣保護下，室溫振蕩反應12~36小時后取出，經(jīng)洗滌、烘干得到表面固定炔基的聚丙烯微孔膜，炔基固定率為0.26~32克/平方米膜；其中，含炔基的胺或含炔基的醇的加入量為含炔基的胺或含炔基的醇與聚丙烯微孔膜表面羧基的摩爾比為2-10;其原因在于步驟(2)中的反應為固體表面與溶液的非均相反應，使其中一種反應物含炔基的胺或含炔基的醇大大過量，有利于非均相反應的充分進行；(3)將步驟(2)中得到的表面固定炔基的聚丙烯微孔膜浸入疊氮糖溶液中，在氮氣保護下加入1，3-偶極環(huán)加成反應催化劑，室溫下振蕩反應24~48小時后取出，經(jīng)洗滌、烘干得到高密度化聚丙烯親和膜，糖基固定率為0.98~197克/平方米膜；其中，疊氮糖的加入量為疊氮糖與聚丙烯微孔膜表面炔基的摩爾比為2~10。其原因在于步驟(3)中的反應為固體表面與溶液的非均相反應，使其中一種反應物疊氮糖大大過量，有利于反應充分進行。由于通過改變聚丙烯微孔膜的孔徑、孔隙率以及厚度可以廣泛調(diào)節(jié)聚丙烯微孔膜表面的糖基化密度，為了得到糖基密度較高的聚丙烯親和膜，所述的聚丙烯微孔膜優(yōu)選平均孔徑為0.1~2微米，孔隙率為40~85%，膜厚為150~200微米的聚丙烯微孔膜。所述的光引發(fā)劑溶液可選用本領域常規(guī)的光引發(fā)劑溶液，優(yōu)選二苯曱酮的正庚烷溶液，其中，光引發(fā)劑為二苯曱酮(BP),由于正庚烷可以輕微溶脹聚丙烯微孔膜，使得接枝更容易發(fā)生在聚丙烯微孔膜的膜孔內(nèi)，提高接枝單體固定在聚丙烯微孔膜上的穩(wěn)定性。采用含炔基的胺或含炔基的醇，是為了通過其中含有的氨基或羥基與接枝改性的聚丙烯微孔膜表面的羧基反應，將炔基固定到聚丙烯微孔膜表面。由于小分子直鏈炔基胺或炔基醇更容易擴散到膜孔內(nèi)，使反應更容易發(fā)生在膜孔內(nèi)，所述的含炔基的胺優(yōu)選丙炔胺，含炔基的醇優(yōu)選丙炔醇。所述的緩沖溶液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液(即PBS緩沖溶液)。步驟(2)中，所述的催化劑為l-(3-二曱氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，其中EDC與NHS的摩爾比為0.5~2,EDC與聚丙烯微孔膜表面羧基的摩爾比為2~10。在1,3-偶極環(huán)加成反應催化劑的作用下，疊氮糖能夠與聚丙烯微孔膜表面的炔基發(fā)生1，3-偶極環(huán)加成反應，使疊氮基團與炔基偶聯(lián)，從而引入糖基并將其固定在聚丙烯微孔膜的表面。所述的疊氮糖可選用任何疊氮單糖、疊氮二糖、疊氮三糖等中的一種，考慮疊氮單糖、疊氮二糖的空間體積較小，更容易擴散到膜孔內(nèi)，因此本發(fā)明疊氮糖優(yōu)選1-疊氮基葡萄糖、2-疊氮乙基葡萄糖、3-疊氮丙基葡萄糖、2-疊氮乙基甘露糖、2-疊氮乙基半乳糖或2-疊氮乙基乳糖。步驟(3)中，疊氮糖溶液中的溶劑為水與叔丁醇的混合溶液，其中dl丁醇與水的體積比可為1~4。步驟(3)中，1，3-偶極環(huán)加成反應催化劑為五水碌u酸銅和抗壞血酸鈉，五水硫酸銅與聚丙烯微孔膜表面炔基的摩爾比為0.02~0.1，抗壞血酸鈉與聚丙烯微孔膜表面炔基的摩爾比為0.1~1。本發(fā)明的高密度糖基化聚丙烯親和膜可應用在蛋白質的分離、濃縮、靶向清除、鑒定或病毒的特異性捕捉中，還可以應用于微生物的分離、濃縮，以及細胞培養(yǎng)、醫(yī)療器械等領域。本發(fā)明中接枝率、炔基固定率或糖基固定率均采用如下稱重法計算接枝率、炔基固定率或糖基固定率用Y表示Y=(W0)/S;Y的單位為克/平方米，其中，Wo為接枝反應、炔基固定反應或糖基固定反應前聚丙烯微孔膜的重量，W,為接枝反應、炔基固定反應或糖基固定反應后聚丙烯微孔膜的重量，S為接枝反應、炔基固定反應或糖基固定反應前膜的面積。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)通過調(diào)節(jié)紫外輻照接枝聚合條件，可方便的調(diào)節(jié)單體在聚丙烯微孔膜上的接枝率，從而控制聚丙烯膜上的糖基固定率。(2)利用高效的1,3-偶極環(huán)加成反應，可得到高密度的糖基化聚丙烯親和膜，易于實現(xiàn)膜表面糖基的集簇效應，顯著增強了糖基對蛋白質的選擇性吸附效果；同時，這種高密度糖基化的聚丙烯親和膜可適用于高濃度蛋白質溶液中蛋白質的分離和濃縮，使用范圍廣。(3)各個反應的反應條件均很溫和，操作簡單，原料易得，經(jīng)濟可行。(4)1，3-偶極環(huán)加成反應具有高度的專一性且反應溫和，無需對糖上的羥基進行保護。(5)得到的聚丙烯親和膜表面固定了大量的糖基，使得膜具有良好的親和性與生物相容性，大大提高了膜的抗污染能力，在生物醫(yī)用材料方面具有良好的應用前景。(6)本發(fā)明方法是利用化學鍵將糖基固定在膜表面(即糖基通過三唑類五元環(huán)連接在膜表面)，在使用過程中性能穩(wěn)定，糖基不會脫落，在蛋白質的選擇性分離、濃縮或靶向清除過程中，可通過吸附、洗脫的方式循環(huán)使用，大大降低了生產(chǎn)成本。圖1為葡萄糖糖基化聚丙烯親和膜的分子結構示意圖；圖2為甘露糖糖基化聚丙烯親和膜的分子結構示意圖。具體實施方式實施例l稱取適量的BP溶解在正庚烷中，配成BP濃度為0.005摩爾/升的光引發(fā)劑溶液，將直徑為3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔徑為0.2微米，孔隙率為80%，膜厚為160微米)浸入到光引發(fā)劑溶液中，浸泡1小時后取出自然晾干，然后將聚丙烯平板微孔膜浸入單體體積濃度為2%的丙烯酸單體溶液中，紫外光輻照IO分鐘后取出，用丙酮和大量水清洗后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到接枝率為1.00克/平方米膜的丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。將上述丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜置入pH為5.0的PBS緩沖溶液中，加入NHS、EDC和丙炔胺，其中聚丙烯微孔膜表面的羧基、EDC、NHS以及丙炔胺的摩爾比為l:2:l:2，氮氣保護下，室溫4展蕩反應12小時后停止反應，用丙酮和水洗滌后，放入40'C烘箱，真空干燥24小時，得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜，炔基固定率為0.26克/平方米膜。將上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入1-疊氮基葡萄糖的水/叔丁醇(其中，水、4又丁醇的體積比1:1)溶液中，加入抗壞血酸鈉和五水硫酸銅，其中聚丙烯微孔膜表面炔基、1-疊氮基葡萄糖、五水硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為l:2:0.02:o.i，在氮氣保護下，室溫振蕩反應24小時后停止反應，用水洗滌后，》文入4(rC烘箱，真空干燥24小時，得到高密度糖基化聚丙烯親和膜，糖基固定率為0.98克/平方米膜。實施例2稱取適量的BP溶解在正庚烷中，配成BP濃度為0.001摩爾/升的光引發(fā)劑溶液，將直徑為3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔徑為0.5微米，孔隙率為45%,膜厚為150微米)浸入到光引發(fā)劑溶液中，浸泡1小時后取出自然晾干，然后將聚丙烯微孔膜浸入單體體積濃度為5%的丙烯酸單體溶液中，紫外光輻照20分鐘后取出，用丙酮和大量水清洗后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到接枝率為2.38克/平方米膜的丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。將上述丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH為5.5的PBS緩沖溶液中，加入NHS、EDC和丙炔胺，其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、NHS以及丙炔胺的摩爾比為l:2:2:5,氮氣保護下，室溫振蕩反應24小時后停止反應，用丙酮和水洗滌后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜，炔基固定率為0.88克/平方米膜。將上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入1-疊氮基葡萄糖的水/叔丁醇(其中，水、7，又丁醇的體積比1:2)溶液中，加入五水石危酸銅和抗壞血酸鈉，其中聚丙烯微孔膜表面炔基、1-疊氮基葡萄糖、五水硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為1:4:0.05:0.25，在氮氣保護下室溫振蕩反應36小時后停止反應，用水洗滌后，放入4(TC烘箱，真空干燥24小時，得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜，糖基固定率為4.39克/平方米膜。實施例3稱取適量的BP溶解在正庚烷中，配成BP濃度為0.010摩爾/升的光引發(fā)劑溶液，將直徑為3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔徑為l微米，孔隙率為80%，膜厚為200微米)浸入到光引發(fā)劑溶液中，浸泡1小時后取出自然晾干，然后將聚丙烯微孔膜浸入單體體積濃度為10%的丙烯酸單體溶液中，紫外光輻照30分鐘后取出，用丙酮和大量水清洗后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到接枝率為10.59克/平方米膜的丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。將上述丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH為6.0的PBS緩沖溶液中，加入NHS、EDC和丙炔胺，其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、NHS以及丙炔醇的摩爾比為l:2:4:10,氮氣保護下，室溫振蕩反應36小時后停止反應，用丙酮和水洗滌后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜，炔基固定率為4.42克/平方米膜。將上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入2-疊氮乙基葡萄糖的水/叔丁醇(其中，水、叔丁醇的體積比1:3)溶液中，加入五水硫酸銅和抗壞血酸鈉，其中聚丙烯微孔膜表面炔基、2-疊氮乙基葡萄糖、五水硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為l:6:0.05:0.5，在氮氣保護下，室溫振蕩反應48小時后停止反應，用水洗滌后，放入40。C供箱，真空干燥24小時，得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜，，糖基固定率為20.42克/平方米膜。實施例4稱取適量的BP溶解在正庚烷中，配成BP濃度為0.010摩爾/升的光引發(fā)劑溶液，將直徑為3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔徑為2微米，孔隙率為65%,膜厚為180微米)浸入到光引發(fā)劑溶液中，浸泡1小時后取出自然晾干，然后將聚丙烯微孔膜浸入單體體積濃度為20%的曱基丙烯酸單體溶液中，紫外光輻照30分鐘后取出，用丙酮和大量水清洗后，放入40'C烘箱，真空干燥24小時，得到接枝率為25.43克/平方米膜的曱基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。將上述曱基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH為6.5的PBS緩沖溶液中，加入NHS、EDC和丙炔醇，其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、NHS以及丙炔醇的摩爾比為1:5:5:10,氮氣保護下，室溫振蕩反應36小時后停止反應，用丙酮和水洗滌后，放入40'C烘箱，真空干燥24小時，得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜，炔基固定率為9.80克/平方米膜。將上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入2-疊氮乙基葡萄糖的水/叔丁醇(其中，水、^又丁醇的體積比1:3)溶液中，加入五水石克酸銅和抗壞血酸鈉，其中聚丙烯微孔膜表面炔基、2-疊氮乙基葡萄糖、五水硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為l:8:o.i:l，在氮氣保護下室溫振蕩反應36小時后停止反應，用水洗滌后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜，糖基固定率為52.69克/平方米膜。實施例5稱取適量的BP溶解在正庚烷中，配成BP濃度為0.010摩爾/升的光引發(fā)劑溶液，將直徑為3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔徑為0.2微米，孔隙率為80%，膜厚為160微米)浸入到光引發(fā)劑溶液中，浸泡1小時后取出自然晾干，然后將聚丙烯微孔膜浸入單體體積濃度為55%的曱基丙烯酸單體溶液中，紫外光輻照60分鐘后取出，用丙酮和大量水清洗后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到接枝率為98.00克/平方米膜的曱基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。將上述曱基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH為5.5的PBS緩沖溶液中，加入NHS、EDC和丙炔醇，其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、NHS以及丙炔醇的摩爾比為1:2:4:10,氮氣保護下，室溫振蕩反應36小時后停止反應，用丙酮和水洗滌后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜，炔基固定率為31.85克/平方米膜。將上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入3-疊氮丙基葡萄糖的水/叔丁醇(其中，水、誅又丁醇的體積比1:4)溶液中，加入五水碌u酸銅和抗壞血酸鈉，其中聚丙烯微孔膜表面炔基、3-疊氮丙基葡萄糖、五水硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為i:io:o.i:l,在氮氣保護下，室溫振蕩反應48小時后停止反應，用水洗滌后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜，糖基固定率為196.80克/平方米膜。實施例6稱取適量的BP溶解在正庚烷中，配成BP濃度為0.005摩爾/升的光引發(fā)劑溶液，將直徑為3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔徑為l微米，孔隙率為65%,膜厚為180微米)浸入到光引發(fā)劑溶液中，浸泡1小時后取出自然晾干，然后將聚丙烯微孔膜浸入單體體積濃度為30%的曱基丙烯酸單體溶液中，紫外光輻照20分鐘后取出，用丙酮和大量水清洗后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到接枝率為15.38克/平方米膜的曱基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。將上述曱基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH為6.0的PBS緩沖溶液中，加入NHS、EDC和丙炔胺，其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、nhs以及丙炔胺的摩爾比為i:io:io:io，氮氣保護下，室溫振蕩反應24小時后停止反應，用丙酮和水洗滌后，放入4(TC烘箱，真空干燥24小時，得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜，炔基固定率為5.78克/平方米膜。將上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入2-疊氮乙基甘露糖的水/叔丁醇(其中，水、^又丁醇的體積比l:4)溶液中，加入五水碌u酸銅和抗壞血酸鈉，其中聚丙烯微孔膜表面炔基、2-疊氮乙基甘露糖、五水硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為i:4:0.1:l,在氮氣保護下，室溫振蕩反應48小時后停止反應，用水洗滌后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜，糖基固定率為37.55克/平方米膜。實施例7稱取適量的BP溶解在正庚烷中，配成BP濃度為0.001摩爾/升的光引發(fā)劑溶液，將直徑為3.95厘米的聚丙烯微孔膜(其平均孔徑為2微米，孔隙率為80%,膜厚為200微米)浸入到光引發(fā)劑溶液中，浸泡1小時后取出自然晾干，然后將聚丙烯微孔膜浸入單體體積濃度為10%的曱基丙烯酸單體溶液中，紫外光輻照20分鐘后取出，用丙酮和大量水清洗后，放入40。C烘箱，真空干燥24小時，得到接枝率為8.36克/平方米膜的曱基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔膜。將上述甲基丙烯酸接枝改性的聚丙烯微孔置入pH為5.0的PBS緩沖溶液中，加入NHS、EDC和丙炔胺，其中聚丙烯微孔膜表面羧基、EDC、nhs以及丙炔胺的摩爾比為l:2:4:io,氮氣保護下，室溫振蕩反應12小時后停止反應，用丙酮和水洗滌后，放入40'C烘箱，真空干燥24小時，得到表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜，炔基固定率為3.18克/平方米膜。將上述表面固定炔丙基的聚丙烯微孔膜浸入2-疊氮乙基半乳糖的水/叔丁醇(其中，水、^又丁醇的體積比1:2)溶液中，加入五水石克酸銅和抗壞血酸鈉，其中聚丙烯微孔膜表面炔基、2-疊氮乙基半乳糖、五水硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為l:2:0.02:o.i,在氮氣保護下室溫振蕩反應24小時后停止反應，用水洗滌后，放入4(TC烘箱，真空干燥24小時，得到表面糖基化的聚丙烯微孔膜，糖基固定率為15.97克/平方米膜。應用例1葡萄糖糖基化聚丙烯親和膜對伴刀豆球蛋白(ConA)的吸附分離配制伴刀豆球蛋白/花生凝集素(ConA/PNA)溶液，其中溶劑為pH=7.36的PBS緩沖溶液，溶液中ConA的濃度為1克/升，PNA的濃度為1克/升，CaCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，MnCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，NaCl的濃度為0.1摩爾/升。取實施例2制備的葡萄糖糖基化聚丙烯親和膜(糖基固定率為4.39克/平方米膜)，在無水乙醇中預浸潤，再以濃度為0.01摩爾/升，pH=7.36的PBS緩沖溶液清洗，放入20毫升上述配制的ConA/PNA溶液中，密封，在25。C下恒溫1小時后，取出葡萄糖糖基化的聚丙烯親和膜，并以l摩爾/升的葡萄糖磷酸鹽緩沖溶液沖洗,將吸附在聚丙烯親和膜上的伴刀豆球蛋白洗脫，從而實現(xiàn)伴刀豆球蛋白從蛋白質混合溶液的分離。應用例2配制伴刀豆球蛋白/花生凝集素(ConA/PNA)溶液，其中溶劑為pH=7.36的PBS緩沖溶液，溶液中ConA的濃度為5克/升，PNA的濃度為5克/升，CaCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，MnCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，NaCl的濃度為0.1摩爾/升。取實施例3制備的葡萄糖糖基化聚丙烯親和膜(糖基固定率為20.42克/平方米膜)，在無水乙醇中預浸潤，再以濃度為0.01摩爾/升，pH=7.36的PBS緩沖溶液清洗，放入20毫升上述配制的ConA/PNA溶液中，密封，在25。C下恒溫1小時后，取出葡萄糖糖基化的聚丙烯親和膜，并以l摩爾/升的葡萄糖磷酸鹽緩沖溶液沖洗，將吸附在聚丙烯親和膜上的伴刀豆球蛋白洗脫，從而實現(xiàn)伴刀豆球蛋白從蛋白質混合溶液的分離。應用例3配制伴刀豆球蛋白/花生凝集素(ConA/PNA)溶液，其中溶劑為pH=7.36的PBS緩沖溶液，溶液中ConA的濃度為5克/升，PNA的濃度為5克/升，CaCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，MnCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，NaCl的濃度為0.1摩爾/升。取實施例4制備的葡萄糖糖基化聚丙烯親和膜(糖基固定率為52.69克/平方米膜)，在無水乙醇中預浸潤，再以濃度為0.01摩爾/升，pH=7.36的PBS緩沖溶液清洗，放入50毫升上述配制的ConA/PNA溶液中，密封，在25。C下恒溫1小時后，取出葡萄糖糖基化的聚丙烯親和膜，并以l摩爾/升的葡萄糖磷酸鹽緩沖溶液沖洗，將吸附在聚丙烯親和膜上的伴刀豆球蛋白洗脫，從而實現(xiàn)伴刀豆球蛋白從蛋白質混合溶液的分離。應用例4配制伴刀豆球蛋白/花生凝集素(ConA/PNA)溶液，其中溶劑為pH=7.36的PBS緩沖溶液，溶液中ConA的濃度為10克/升，PNA的濃度為10克/升，CaCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，MnCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，NaCl的濃度為0.1摩爾/升。取實施例5制備的葡萄糖糖基化聚丙烯親和膜(糖基固定率為196.80克/平方米膜)，在無水乙醇中預浸潤，再以濃度為0.01摩爾/升，pH-7.36的PBS緩沖溶液清洗，放入50毫升上述配制的ConA/PNA溶液中，密封，在25。C下恒溫1小時后，取出葡萄糖糖基化的聚丙烯親和膜，并以l摩爾/升的葡萄糖磷酸鹽緩沖溶液沖洗，將吸附在聚丙烯親和膜上的伴刀豆球蛋白洗脫，從而實現(xiàn)伴刀豆球蛋白從蛋白質的混合溶液的分離。應用例5甘露糖糖基化聚丙烯親和膜對伴刀豆球蛋白(ConA)的吸附分離配制伴刀豆球蛋白/花生凝集素(ConA/PNA)溶液，其中溶劑為pH-7.36的PBS緩沖溶液，溶液中ConA的濃度為5克/升，PNA的濃度為5克/升，CaCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，MnCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，NaCl的濃度為0.1摩爾/升。取實施例6制備的甘露糖糖基化聚丙烯親和膜(糖基固定率為37.55克/平方米膜)，在無水乙醇中預浸潤，再以濃度為0.01摩爾/升，pH=7.36的PBS緩沖溶液清洗，放入20毫升上述配制的ConA/PNA溶液中，密封，在25。C下恒溫1小時后，取出甘露糖糖基化的聚丙烯親和膜，并以l摩爾/升的葡萄糖磷酸鹽緩沖溶液沖洗,將吸附在聚丙烯親和膜上的伴刀豆球蛋白洗脫，從而實現(xiàn)伴刀豆球蛋白從蛋白質的混合溶液的分離。應用例l、2、3、4和5中對伴刀豆球蛋白/花生凝集素混合溶液的分離效果如表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>權利要求1、一種高密度糖基化聚丙烯親和膜的制備方法，包括如下步驟(1)在光引發(fā)劑作用下，通過紫外輻照將丙烯酸或甲基丙烯酸單體接枝到聚丙烯微孔膜表面，得到接枝改性的聚丙烯微孔膜；(2)在催化劑作用下，將含炔基的胺或含炔基的醇與步驟(1)中得到的聚丙烯微孔膜表面的羧基反應，得到表面固定炔基的聚丙烯微孔膜；(3)利用1，3-偶極環(huán)加成反應將疊氮糖與步驟(2)中得到的聚丙烯微孔膜表面的炔基偶聯(lián)，得到高密度糖基化聚丙烯親和膜。2、如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將聚丙烯微孔膜在光引發(fā)劑溶液中浸泡后取出晾干，再浸入丙烯酸單體的水溶液或曱基丙烯酸單體的水溶液中，通過紫外光輻照接枝聚合10~60分鐘后取出，經(jīng)洗滌、烘干得到表面接枝改性的聚丙烯微孔膜，單體接枝率為1~98克/平方米膜；所述的光引發(fā)劑溶液中光引發(fā)劑的濃度為0.001~0.010摩爾/升，丙烯酸單體的水溶液中單體的體積百分濃度為2~55%，曱基丙烯酸單體的水溶液中單體的體積百分濃度為2~55%;(2)將步驟(1)中得到的接枝改性的聚丙烯微孔膜浸入pH值為5.0-6.5的磷酸氬二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液中，加入含炔基的胺或含炔基的醇，以及催化劑，在氮氣保護下，室溫振蕩反應12~36小時后取出，經(jīng)洗滌、烘干得到表面固定炔基的聚丙烯微孔膜，炔基固定率為0.26~32克/平方米膜；其中，含炔基的胺或含炔基的醇與聚丙烯微孔膜表面羧基的摩爾比為2~10;(3)將步驟(2)中得到的表面固定炔基的聚丙烯微孔膜浸入疊氮糖溶液中，在氮氣保護下加入1,3-偶極環(huán)加成反應催化劑，室溫下振蕩反應24-48小時后取出，經(jīng)洗滌、烘干得到高密度糖基化聚丙烯親和膜，糖基固定率為0.98~197克/平方米膜；其中，疊氮糖與聚丙烯微孔膜表面炔基的摩爾比為2~10。3、如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的聚丙烯微孔膜的平均孔徑為0.1~2樣吏米，孔隙率為40~85%,膜厚為15020(H效米。4、如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的光引發(fā)劑溶液為二苯曱酮的正庚烷溶液，其中，光引發(fā)劑為二苯曱酮。5、如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的含炔基的胺為丙炔胺，含炔基的醇為丙炔醇。6、如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中，所述的催化劑為l-(3-二曱氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺；其中l(wèi)-(3-二曱氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為0.5-2,l-(3-二曱氨基丙基)-3-乙基^f友二亞胺鹽酸鹽與聚丙烯微孔膜表面羧基的摩爾比為2~10。7、如權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的疊氮糖為1-疊氮基葡萄糖、2-疊氮乙基葡萄糖、3-疊氮丙基葡萄糖、2-疊氮乙基甘露糖、2-疊氮乙基半乳糖或2-疊氮乙基乳糖。8、如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中，所述疊氮糖溶液中的溶劑為水與叔丁醇的混合溶液，其中叔丁醇與水的體積比為1~4。9、如權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中，所述的1，3-偶極環(huán)加成反應催化劑為五水硫酸銅和抗壞血酸鈉，五水硫酸銅與聚丙烯微孔膜表面炔基的摩爾比為0.02~0.1，抗壞血酸鈉與聚丙烯微孔膜表面炔基的摩爾比為0.1~1。10、如權利要求1~IO任一項所述的制備方法制得的高密度糖基化聚丙烯親和膜在蛋白質分離中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種高密度糖基化聚丙烯親和膜的制備方法，是以聚丙烯微孔膜為基體，以二苯甲酮為光引發(fā)劑，在紫外光輻照下接枝丙烯酸或甲基丙烯酸，通過控制引發(fā)劑濃度、接枝時間、單體濃度得到不同接枝率的聚丙烯微孔膜；再通過含炔基的胺或醇與膜表面的羧基反應，得到表面含有炔基的聚丙烯微孔膜；然后利用點擊化學反應，將疊氮糖與膜表面的炔基偶聯(lián)，得到了表面具有高密度糖基的聚丙烯親和膜。本發(fā)明利用點擊化學反應將糖基固定在膜表面，大大提高了膜表面的糖基化密度，且操作簡單、反應條件溫和、產(chǎn)率高、制備的產(chǎn)物穩(wěn)定。本發(fā)明的高密度糖基的化聚丙烯親和膜更易于實現(xiàn)糖與蛋白識別的集簇效應，提高了蛋白質的分離、濃縮或靶向清除的效果。文檔編號C07K1/00GK101544776SQ200910097999公開日2009年9月30日申請日期2009年4月30日優(yōu)先權日2009年4月30日發(fā)明者健吳,徐志康,蒼王申請人:浙江大學