專利名稱：用于制造全硅烷化肽的方法
用于制造全硅烷化肽的方法本專利申請(qǐng)書要求對(duì)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/014，923的權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引 用結(jié)合到本專利申請(qǐng)中。本發(fā)明涉及一種用于利用全硅烷化技術(shù)來(lái)制造肽或肽類似物的方法。肽或肽類似物是有用的，例如作為藥物。這種肽的一個(gè)例子是西曲瑞克，它可以用 于治療女性的子宮內(nèi)膜組織異位和子宮平滑肌瘤、以及男性的良性前列腺肥大。西曲瑞克 是一種促性腺激素釋放激素的拮抗劑(GnRH拮抗劑)，它具有以下序列。Ac-D-Nal-D-Cl-Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2(SEQID NO 1)在 EP-A-184243 中、在 Callens, IB C' s 2nd International Conference on Peptide Technologies, Rogozhin et al. Isvestija Akademia Nauk SSSR, SeriyaKhimecheskaya, No. 3, p. 657-660 (1978)以及Kricheldorf, Liebigs Ann. Chem. 763, p. 17-38(1972)中對(duì)全硅烷化技術(shù)進(jìn)行了討論。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種使用全硅烷化技術(shù)用于有效并且快速的肽合成的方法，它在 所生產(chǎn)的肽或肽類似物的生產(chǎn)率和純度方面可以有良好的結(jié)果。因此本發(fā)明考慮了一種用于制造肽或肽類似物的方法，該方法包括使一種具有式 (I) X-A-C00H的化合物與一種含有4至15個(gè)氨基酸的全硅烷化肽或全硅烷化肽類似物進(jìn)行 反應(yīng)，其中X是一種氨基保護(hù)基團(tuán)，A是一種氨基酸、肽或肽類似物殘基，并且-C00H表示一 種任選活化的羧基基團(tuán)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大規(guī)模的制備性全硅烷化作用對(duì)于高級(jí)肽(例如，四肽、五肽、等等)是 可能的，并且后者具有足夠的反應(yīng)性和溶解性以便允許高產(chǎn)量地制造具有高純度(特別是 光學(xué)純度)的更長(zhǎng)鏈的肽和肽類似物。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除了三甲基氰硅烷之外的硅烷化試劑是 適于使更長(zhǎng)鏈的肽硅烷化的。在本發(fā)明中，“肽”應(yīng)當(dāng)被理解為是特別地表示一種化合物，該化合物基本上由通 過(guò)酰胺鍵彼此連接的多個(gè)氨基酸構(gòu)成的。在本發(fā)明中，“肽類似物”應(yīng)當(dāng)被理解為是特別地表示一種化合物，該化合物基本 上由多個(gè)氨基酸構(gòu)成并且任選地包括可以結(jié)合到一種肽中的其他化合物，例如雜取代的羧 酸，例如羥基羧酸或巰基羧酸。肽類似物在肽序列中經(jīng)常包括至少1個(gè)鍵，該鍵不同于酰胺 鍵，例如尿烷，脲，酯或硫代酯鍵。在本發(fā)明中肽或肽類似物可以是直鏈的，環(huán)的或分支的， 并且優(yōu)選地是直鏈的。在本發(fā)明中作為肽或肽類似物以及殘基“A”的組分是有用的氨基酸包括天然的以 及非天然的氨基酸。”這些氨基酸可以選自例如以下的天然氨基酸丙氨酸、纈氨酸、正纈氨 酸、亮氨酸、正亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、異絲氨酸、同型絲氨酸、蘇氨酸、別蘇氨酸、甲硫氨 酸、乙硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、 賴氨酸、精氨酸、組氨酸、鳥氨酸、谷氨酰胺以及瓜氨酸。特別地，含有絲氨酸、異絲氨酸、同型絲氨酸和/或酪氨酸、更特別地是絲氨酸和/ 或酪氨酸的全硅烷化片段是優(yōu)選的。
還可以使用它們的非天然的對(duì)映異構(gòu)體。這些氨基酸可以選自例如以下的合成起源的氨基酸，它們是(1-萘基)丙氨酸、 (2-萘基)丙氨酸、高苯丙氨酸、(4-氯苯基)丙氨酸、(4-氟苯基)丙氨酸、(3-吡啶基)丙 氨酸、苯基甘氨酸、二氨基庚二酸(2，6_ 二氨基庚烷-1，7-二酸)、2氨基丁酸、2氨基四氫化 萘-2-羧酸、赤型- β _甲基苯丙氨酸、蘇型- β _甲基苯丙氨酸、(2-甲氧苯基)苯基、1氨 基-5-羥基茚滿-2-羧酸、2-氨基庚烷-1，7-二酸、(2，6_ 二甲基-4-羥苯基)丙氨酸、赤 型-β -甲基酪氨酸、或蘇型_ β _甲基酪氨酸。根據(jù)本發(fā)明的方法的操作步驟總體上是在液相中進(jìn)行的。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，這種全硅烷化肽優(yōu)選地含有4、5、6、7或8個(gè)氨基酸，更優(yōu) 選地4、5或6個(gè)氨基酸。應(yīng)當(dāng)理解，這些數(shù)字類似地施用于在一種肽類似物中所連接的單 元的數(shù)目。在根據(jù)本發(fā)明的方法中可以適合以全硅烷化形式進(jìn)行反應(yīng)的肽序列的具體例子 包括H-Phe-IIe-Gly-Leu-OH(SEQ ID NO 2)H-Leu-Arg-Pro-(D)AlaNH2(SEQ ID NO 3)H-Ser-Tyr-(D)Cit-Leu-Arg-Pro-(D)AlaNH2(SEQ ID NO 4)H-Ser(tBu)-Thr-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-OH(SEQ ID NO 5)H-Trp-Ser-Tyr-(D)Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHNHC0NH2(SEQ ID NO 6)在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟(a)中，該全硅烷化肽或肽類似物是通過(guò)與一種硅烷 化劑的反應(yīng)(優(yōu)選在一種有機(jī)溶劑中)通過(guò)使一種對(duì)應(yīng)的肽(類似物)硅烷化來(lái)獲得的。 可以將這種全硅烷化肽或肽類似物分離并純化，如果希望的話。然而，優(yōu)選的是原位使用這 種全硅烷化肽或肽類似物，例如通過(guò)將一種含有全硅烷化肽或肽類似物的溶液與一種含有 (可任選地活化的)具有式(I)的化合物的溶液相組合。在本發(fā)明中，優(yōu)選的是使用不含有氰基基團(tuán)的硅烷化劑，例如N-三烷基甲硅烷基 胺類或N-三烷基甲硅烷基酰胺類。此類硅烷化劑的例子包括N，0-雙(三甲基硅烷基)乙 酰胺、N，0-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、六甲基二硅氮烷、N-甲基-N-三甲基硅烷基 乙酰胺(MSA)、N，_甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺、N-(三甲基硅烷基)乙酰胺、N-(三 甲基硅烷基)二乙胺、N-(三甲基硅烷基)二甲胺、1_(三甲基硅烷基)咪唑、3-(三甲基硅 烷基)-2_噁唑烷酮N-甲基-N-三甲基硅烷基乙酰胺(MSA)是優(yōu)選的?？傮w上，步驟(a)的反應(yīng)是在從0°C至100°C，優(yōu)選地從25°C至50°C的溫度下進(jìn)行 的。在步驟(a)的反應(yīng)中，總體上相對(duì)于有待硅烷化的官能團(tuán)的摩爾量，使用了 0. 5至 5當(dāng)量、優(yōu)選0. 7至1. 5當(dāng)量的硅烷化劑。使用相對(duì)于有待硅烷化的官能團(tuán)的摩爾量的2至 4當(dāng)量的硅烷化劑也是可能的。“有待硅烷化的官能團(tuán)”應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為特別地表示以下基團(tuán)， 這些基團(tuán)具有一個(gè)與該硅烷化劑進(jìn)行反應(yīng)的活性氫原子，例如氨基，羥基，巰基或羧基的基 團(tuán)。應(yīng)當(dāng)理解，“全硅烷化”旨在特別地表示一種肽或肽類似物，其中這些具有一種可 以與該硅烷化劑進(jìn)行反應(yīng)的活性氫原子的基團(tuán)被充分地硅烷化以確保得到一種用于偶聯(lián) 的步驟(b)的均相反應(yīng)介質(zhì)。
當(dāng)在一種溶劑的存在下進(jìn)行這種硅烷化時(shí)，所述溶劑優(yōu)選地是一種極性有機(jī)溶 劑，更優(yōu)選地是一種極性疏質(zhì)子有機(jī)溶劑。一種酰胺類型的溶劑，例如N，N-二甲基甲酰胺， 或特別是N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)是更加特別優(yōu)選的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，硅烷化是在一種液體硅烷化介質(zhì)中進(jìn)行的，該介質(zhì)基本上 由硅烷化劑以及肽或肽類似物構(gòu)成。在本發(fā)明中，肽或肽類似物殘基A應(yīng)當(dāng)理解為特別地表示一種肽或肽類似物，該 肽或肽類似物在它的N端或在一種肽類似物中的任選地相應(yīng)位置上鍵合到氨基受到保護(hù) 的A的羧基基團(tuán)上，這種氨基受到保護(hù)的A包括優(yōu)選地從2至20個(gè)氨基酸，并且更優(yōu)選地 2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)氨基酸。在根據(jù)本發(fā)明的方法中可以適當(dāng)?shù)胤磻?yīng)的具有化學(xué)式A的化合物的序列的具體 例子包括Z-Asp (OtBu)-Ala-OHZ-Ser-Tyr-(D)Cit-OHAc- (D) Nal-(D) Cph- (D) Pal-OHBoc-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Asn-Leu-OH(SEQ ID NO 7)Fmoc-His(Trt)-OH根據(jù)本發(fā)明的方法可以特別地施用于以下反應(yīng) 術(shù)語(yǔ)“氨基保護(hù)基團(tuán)X”是指能夠用來(lái)替換一個(gè)氨基基團(tuán)的酸性質(zhì)子以降低其親核 性的保護(hù)基團(tuán)。典型地，在將有待加入的下一個(gè)氨基酸加入到這種增長(zhǎng)的肽鏈之前在脫保 護(hù)反應(yīng)中除去該氨基保護(hù)基團(tuán)X。該氨基保護(hù)基團(tuán)X優(yōu)選地是具有位阻的。術(shù)語(yǔ)“位阻”旨 在特別地表示一種取代基，該取代基包括至少3個(gè)碳原子，特別地是至少4個(gè)碳原子，包括 至少一個(gè)仲、叔或季碳原子。這個(gè)位阻基團(tuán)經(jīng)常包括最多100個(gè)，優(yōu)選地最多50個(gè)碳原子。提及由X在此所代表的氨基保護(hù)基團(tuán)的非限制性例子，可以特別提到的是取代或未取代的?；愋偷幕鶊F(tuán)，例如甲?；?、丙烯?；?acrylyl) (Acr)、苯甲?；?Bz)、乙?；?(Ac)、三氟乙?；纪榛趸驶愋偷娜〈蛭慈〈鶊F(tuán)，例如芐氧基羰基(Z)、對(duì)氯 芐氧基羰基、對(duì)溴芐氧基羰基、對(duì)硝基芐氧基羰基、對(duì)甲氧基芐氧基羰基、二苯甲氧基羰基、 2(對(duì)聯(lián)苯基)異丙基氧基羰基、2(3，5 二甲氧基苯基)異丙基氧基羰基、對(duì)苯基偶氮基芐 氧基羰基、三苯基膦?；一趸驶?芴甲氧羰基基團(tuán)(Fmoc)，烷氧基羰基類型的取 代或未取代的基團(tuán)，例如叔丁氧羰基(BOC)、叔戊氧基羰基、二異丙基甲氧基羰基、異丙基氧 基羰基、乙氧基羰基、烯丙氧羰基、2甲基磺?；已趸驶?，2，2三氯乙氧基羰基，環(huán)烷 氧基羰基類型的基團(tuán)，例如環(huán)戊基氧基羰基、環(huán)己基氧基羰基、金剛烷基氧基羰基或異冰片 基氧基羰基的基團(tuán)，以及含有一個(gè)雜原子的基團(tuán)，例如苯磺?；?、對(duì)甲苯磺酰基、均三甲苯 磺酰基、甲氧基三甲基苯磺?；?-硝基苯磺?；?-硝基苯次磺?；?、4-硝基苯磺酰基、 或4-硝基苯次磺酰基的基團(tuán)在這些基團(tuán)X中，那些包括一個(gè)羰基、次磺酰基或磺?；?團(tuán)的基團(tuán)是優(yōu)選的。一種氨基保護(hù)基團(tuán)X是優(yōu)選地選自烯丙氧羰基基團(tuán)、叔丁氧基羰基 (BOC)、芐氧基羰基(Z)、9_芴甲氧羰基(Fmoc)、4-硝基苯磺?；?Nosyl)、2-硝基苯次磺酰 基(Nps)以及取代的衍生物。更優(yōu)選地，該氨基保護(hù)基團(tuán)X是叔丁氧羰基(BOC)。氨基保護(hù)基團(tuán)X可以通過(guò)不同方法而被引入，例如通過(guò)將適當(dāng)?shù)乃猁u化物(例如， 芐氧羰基氯)或酸酐(例如，乙酸酐以及二碳酸二叔丁酯(BOC2O))進(jìn)行反應(yīng)。另一方面， 可以通過(guò)酸解、氫解、用稀氨水處理、用鈉處理、用氨基鈉處理、用胼處理，或酶促水解來(lái)去 除氨基保護(hù)基團(tuán)X。根據(jù)本發(fā)明的方法經(jīng)常進(jìn)一步包括將基團(tuán)X從通過(guò)這種具有式(I)的 化合物與該全硅烷化肽的反應(yīng)而產(chǎn)生的化合物中去除。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，在這種具有式(I)的化合物與該全硅烷化肽之間的反應(yīng) 經(jīng)常是在一種羧基基團(tuán)活化劑的存在下進(jìn)行的。在那種情況下，這種羧酸活化劑是適當(dāng)?shù)?選自碳二亞胺、酰商、磷鐺鹽以及脲鐺或胍鐺鹽。更優(yōu)選地，該羧酸活化劑是一種酰商。仍 然更優(yōu)選地，它是從氯甲酸異丁酯和新戊酰氯中選擇出的當(dāng)使用額外的羧基活化劑時(shí)經(jīng)常得到良好的結(jié)果，這些活化劑降低了副反應(yīng)和/ 或增加了反應(yīng)效率。例如，磷鐺和脲鐺鹽在一種叔堿(例如，二異丙基乙胺(DIPEA)和三乙 胺(TEA))的存在下可以將受保護(hù)的氨基酸轉(zhuǎn)化成活化的種類(例如，B0P、PyB0P、HBTU、以 及TBTU都生成HOBt酯)。其他試劑通過(guò)提供一種保護(hù)劑有助于防止外消旋作用。這些試劑 包括碳二亞胺(例如，DCC或WSCDI)，它們具有一個(gè)添加的輔助親核體(例如，1-羥基-苯 并三唑(HOBt)U-羥基-氮雜苯并三唑(HOAt)、或HOSu)或它們的衍生物?？梢允褂玫牧?一種試劑是TBTU。還使用了使用氯甲酸異丁酯的混合酸酐法(具有或不具有一種添加的輔 助親核體)，疊氮化物法也是如此，這是由于與它相關(guān)的低外消旋作用的緣故。這些類型的 化合物也可以增加碳二亞胺介導(dǎo)的偶合的速率，連同阻止了 Asn和Gln殘基的脫水。典型 的額外的試劑也包括堿類，例如N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)或N-甲基嗎啉 (NMM) ο在根據(jù)本發(fā)明的方法中，步驟(b)的反應(yīng)總體上是在-50°C至50°C、優(yōu)選地 從-40°C至10°C的溫度下進(jìn)行的。另一方面，本發(fā)明考慮了使用一種極性有機(jī)溶劑來(lái)提供一種部分硅烷化的肽或肽 類似物的溶液，該肽或肽類似物是通過(guò)使一種具有式(I)X-A-COOH的化合物與一種全硅烷 化肽或全硅烷化肽類似物進(jìn)行反應(yīng)來(lái)獲得的，其中X是一種氨基保護(hù)基團(tuán)，A是一種氨基酸、肽或肽類似物殘基，并且-COOH表示一種任選活化的羧基基團(tuán)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可能的是在整個(gè)反應(yīng)中在溶液中在一種極性有機(jī)溶劑中維持部分硅烷 化的、特別是具有至少5個(gè)氨基酸(或任選地類似的單元)的偶合產(chǎn)物，從而提供了一種均 相溶液，該溶液特別適合于工作進(jìn)程以及純化或可任選的進(jìn)一步的反應(yīng)步驟，例如脫保護(hù) 以及隨后的偶聯(lián)步驟。出乎意料的是，當(dāng)該反應(yīng)在低溫下進(jìn)行時(shí)這也是可能的。該極性有機(jī)溶劑可以選自例如醚類，特別是水混溶性的醚類，例如四氫呋喃、二噁 烷或來(lái)自硝基烷的1，2- 二甲氧基乙烷，特別地水混溶性的硝基烷，例如硝基甲烷或來(lái)自酰 胺類型的溶劑，特別是水混溶性的酰胺。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，該極性有機(jī)溶劑優(yōu)選地是一種酰胺類型的溶劑，優(yōu)選地 選自N，N-二甲基甲酰胺和N，N-二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮。更優(yōu)選地是，該溶劑 是N，N-二甲基乙酰胺。該溶劑允許特別有效地工作進(jìn)程以及所產(chǎn)生的肽或肽類似物的回 收，而沒(méi)有副產(chǎn)物的實(shí)質(zhì)性形成。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，在該溶液中該部分烷基化的肽或肽類似物的濃度相對(duì)于 該溶液的總重量總體上是等于或大于約重量，優(yōu)選地等于或大于約5%重量。在根據(jù)本 發(fā)明的用途中，在該溶液中該部分硅烷化的肽或肽類似物的濃度相對(duì)于該溶液的總重量總 體上是等于或小于約20%重量，優(yōu)選地等于或小于約15%重量。在根據(jù)本發(fā)明的用途的一個(gè)具體方面，在A中氨基酸單元以及任選的類似物單元 的數(shù)目與該全硅烷化肽或該全硅烷化肽類似物中氨基酸單元以及任選的類似物單元的數(shù) 目的比值總體上是等于或大于1 5，優(yōu)選地等于或大于1 4。在這個(gè)方面，所述比值總 體上是等于或小于3 2，優(yōu)選地等于或小于1 1。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，該溶液總體上含有相對(duì)于該溶液的總重量10%重量至 95%重量的極性有機(jī)溶劑。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，該部分地硅烷化的肽或肽類似物是優(yōu)選地通過(guò)如之前在 此說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的方法而獲得的。在根據(jù)本發(fā)明的用途的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該溶液在從-40°C至+10°C 的溫度下是均相的。本發(fā)明也考慮了 一種用于制造肽或肽類似物的方法，包括根據(jù)本發(fā)明的用途。以下實(shí)例旨在說(shuō)明本發(fā)明而非限制本發(fā)明。在這些實(shí)例中并且貫穿本說(shuō)明書，所采用的縮寫定義如下AcOH是乙酸、AcOEt是乙酸乙酯、Boc是叔丁氧基羰基、n-BuOH是正丁醇、i-BuOH是 異丁醇、Cbz是芐氧基羰基、DCC是1，3 二環(huán)己基碳二亞胺、DCM是二氯甲烷、DIC是1，3- 二 異丙基碳二亞胺、DIPEA是N，N- 二異丙基乙胺、DMF是N，N- 二甲基甲酰胺、DMA是N，N- 二 甲基乙酰胺、EDC是1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、Fmoc是芴甲氧羰基、HBTU 是N，N，N' ,N'-四甲基-0-(1Η-苯并三唑-1-基)脲鐺-六氟磷酸鹽)、Η0ΒΤ是1-羥基 苯并三唑、HOOBT是3，4- 二氫-3-羥基-4-氧-1，2，3-苯并三嗪、IBCF是氯甲酸異丁酯、 i-BuOH是異丁醇、IPE是二異丙醚、MeCN是乙腈、MeOH是甲醇、MSA是N-甲基-N-三甲基甲 硅烷基乙酰胺、NMM是N-甲基嗎啉、NMP是1-甲基_2_吡咯烷酮、tBu是叔丁基、TEA是三 乙胺、THF是四氫呋喃、Tos是甲苯磺酰基、而Trt是三苯甲基。實(shí)例1 [2+4] :Z_Asp (OtBu)-Ala-Phe-IIe-Gly-Leu-OH (SEQ ID NO 8)
在氮?dú)夥障?，將Phe-Ile-Gly-Leu (SEQ ID NO 2) (1. 0當(dāng)量)分散在DCM中并且在 室溫下用MSA將其溶解。在氮?dú)夥障?，?5°C 士5下將Z-ASp(0tBut)-Ala(l. 05當(dāng)量)和 TEA(1. 0當(dāng)量)溶于CH2C12/DMF的混合物中然后冷卻到_15°C。羧基的功能通過(guò)加入吡啶 (1. 0當(dāng)量)和新戊酰氯(1. 0當(dāng)量)而被激活。10分鐘后，將這種烷基化的肽轉(zhuǎn)移到這種 活化的肽上。用水稀釋這種均相的偶聯(lián)反應(yīng)介質(zhì)，產(chǎn)生一種兩相系統(tǒng)。在真空下將CH2C12 去除，其中沉淀的肽和Z-Asp (OtBut) -Ala-Phe-Ile-Gly-Leu通過(guò)過(guò)濾被分離，用水洗滌然 后真空干燥。我們得到了一種白色固體，其產(chǎn)率為以重量計(jì)至少70%。實(shí)例2 [3+4] =Z-Ser-Tyr- (D) Cit-Leu-Arg-Pro- (D) AlaNH2. HCl (SEQ ID NO 4)在氮?dú)夥障?，將LeuArgPro (D) AlaNH2 (SEQ ID NO 3) (1.05 當(dāng)量)溶于 DMA 中并且 在最高溫度40°C下用MSA將其硅烷化，然后將該溶液冷卻至大約_5°C。在氮?dú)夥障拢谧?高溫度40°C下將ZSerTyr OOCitOH(1.0當(dāng)量)和HOOBt (1. 05當(dāng)量)溶于DMA中并且將該 溶液冷卻至約_5°C。然后，將溶液A轉(zhuǎn)到溶液B中，通過(guò)加入EDC. HCl (1. 1當(dāng)量)來(lái)起始偶 合，并且將該反應(yīng)混合物在_5°C下攪拌至少1小時(shí)然后在大約5°C下持續(xù)至少3小時(shí)。通過(guò) HPLC檢查該反應(yīng)的結(jié)束。在真空下將該溶劑去除，并接著在的NaCl水溶液中將該濃縮 液稀釋，并且通過(guò)稀HCl的受控加入將pH調(diào)節(jié)到2. 5至3. 3之間。為了去除HOOBt和DMA， 用DCM洗滌該水性溶液，然后用n-BuOH對(duì)這種肽萃取三次。通過(guò)減壓蒸發(fā)將這種溶劑去除 直到水含量為< 重量。通過(guò)將溫度維持在大約45°C下用丙酮逐步稀釋該漿料以便使該 肽作為一種白色固體而沉淀，在大約20°C下在持續(xù)至少1小時(shí)攪拌后過(guò)濾該白色固體。用 丙酮并且最終用乙腈洗滌該固體。將該沉淀干燥直到丙酮含量重量，并且我們得到了 一種白色固體，其產(chǎn)率為以重量計(jì)至少70%。實(shí)例3 [3+7] :Ac- (D)Nal-(D)Cph-(D)Pal-Ser-Tyr-(D)Cit-Leu-Arg-Pro-(D) Ala-NH2. HCl(SEQ ID NO 1)在氮?dú)夥障拢瑢erTyr (D) CitLeuArgPro (D) AlaNH2 (SEQ ID NO :4) (1. 05 當(dāng)量) 溶于DMA中并且在最高溫度40°C下用MSA將其硅烷化至少60分鐘，然后將該溶液冷卻 到約-5°C。在氮?dú)夥障?，在最高溫?0°C下將Ac(D)Nal (D)Cph(D)Pal0H(l. 0當(dāng)量)和 H00Bt(1.05當(dāng)量)溶于DMA中，并且將該溶液冷卻到大約-5°C。然后，將溶液A轉(zhuǎn)移到溶 液B中，通過(guò)加入EDC. HCl (1. 1當(dāng)量)啟動(dòng)偶聯(lián)，并且將該反應(yīng)混合物在_5°C下攪拌至少 2小時(shí)然后在大約5°C 士5下保持至少8小時(shí)。通過(guò)HPLC檢查該反應(yīng)的結(jié)束。用水稀釋 該反應(yīng)混合物，該反應(yīng)混合物在整個(gè)反應(yīng)中保持均相，并且用HCl的稀水溶液將pH調(diào)節(jié)到 2. 0 士0. 5。然后，在士 35°C下用DCM將該溶液洗滌2次，之后跟隨用n-BuOH對(duì)這種肽的3次 萃取。最后，用水洗滌這些組合的有機(jī)相。通過(guò)減壓蒸發(fā)將該溶劑去除直到水含量為 重量。用丙酮稀釋該漿料以便將這種肽作為一種白色固體而沉淀，在大約15°C下持續(xù)至少 1小時(shí)攪拌后過(guò)濾該白色固體。用丙酮洗滌該固體。將該沉淀干燥直到丙酮含量重 量。然后，將這種干燥的固體在甲醇與丙酮的1/1混合物中在大約20°C下研磨持續(xù)至少1 小時(shí)，過(guò)濾并用丙酮洗滌。我們得到了一種白色固體，其產(chǎn)率為以重量計(jì)至少70%。實(shí)例 4 [4+7] =Boc-Cys (Trt)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr-Cys(Trt)Val LeuGly OH(SEQ ID NO 9)在氮?dú)夥障?，將Ser (tBu)-Thr-Cys (Trt) Val Leu Gly OH(SEQ ID NO :5) (1. 0 當(dāng) 量)溶于NMP中并且在最高溫度50°C下用MSA將其硅烷化至少90分鐘，然后將該溶液冷卻到大約 5°C。在氮?dú)夥障拢瑢?Boc-Cys (Trt)-Ser (tBu)-Asn-Leu-OH(SEQ ID NO 7) (1. 02 當(dāng) 量)和NMM(1.05當(dāng)量)溶于NMP中，然后將該溶液冷卻到-15°C 士5。然后，這個(gè)羧基的部 分通過(guò)IBCF(1. 05當(dāng)量)的加入而被活化。然后，將溶液A轉(zhuǎn)移到溶液B中，并且將該反應(yīng) 混合物在0°C下攪拌至少60分鐘。用沉淀了這種肽的KHS04的水性溶液稀釋該反應(yīng)混合 物，該反應(yīng)混合物在整個(gè)反應(yīng)中保持均相。將該固體過(guò)濾，用水然后用丙酮與水的9/1的混 合物對(duì)其進(jìn)行洗滌。干燥之后，我們得到了一種白色固體，其產(chǎn)率為以重量計(jì)至少75%。實(shí)例 5 [4+7] =Fmoc-His (Trt) -Trp-Ser-Tyr- (D) Ser (tBu) -Leu-Arg-Pro-NHNHCO NH2(SEQ ID NO 10)在氮?dú)夥障?，將H-TrpSerTyr (D) Ser (tBu) LeuArgProNHNHC0NH2 (SEQ ID NO 6) (1.0當(dāng)量)溶于DMA中并且在最高溫度40°C下用MSA將其硅烷化至少60分鐘。將該溶液 冷卻到士25°C，并且加入Fmoc-His (Trt)-0H(1. O當(dāng)量)和HBTU(1. 1當(dāng)量)，將該溶液在 士25°C下混合直到完全溶解然后冷卻到約_5°C。通過(guò)DIPEA(1. 1當(dāng)量)的受控加入來(lái)起始 這種偶聯(lián)。通過(guò)HPLC檢查該反應(yīng)的結(jié)束。用沉淀了這種肽的KHS04的水性溶液稀釋該反 應(yīng)混合物，該反應(yīng)混合物在偶聯(lián)過(guò)程中保持均相。將該固體過(guò)濾并且用水洗滌。干燥之后， 我們得到了一種白色固體，其產(chǎn)率以重量至少70%。
10
權(quán)利要求
用于生產(chǎn)肽或肽類似物的方法，該方法包括(a)通過(guò)與除了三甲基甲硅烷基氰化物以外的硅烷化劑的反應(yīng)通過(guò)使相應(yīng)的肽硅烷化來(lái)生產(chǎn)全硅烷化肽或全硅烷化肽類似物；并且(b)使式(I)X A COOH的化合物與含有4至15個(gè)氨基酸的全硅烷化肽或全硅烷化肽類似物進(jìn)行反應(yīng)，其中X是氨基保護(hù)基團(tuán)，A是氨基酸、肽或肽類似物殘基，并且 COOH表示任選活化的羧基基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該全硅烷化肽含有4、5、6、7或8個(gè)氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該全硅烷化肽含有4、5或6個(gè)氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)的反應(yīng)是在有機(jī)溶劑中 進(jìn)行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中該硅烷化劑選自N-三烷基甲硅烷 基胺類以及N-三烷基甲硅烷基酰胺類，并且優(yōu)選N-甲基-N-三甲基硅烷基乙酰胺(MSA)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中該有機(jī)溶劑是極性有機(jī)溶劑，優(yōu)選酰胺類型的 溶劑，更優(yōu)選N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)的硅烷化反應(yīng)是在從 25°C至50°C的溫度下進(jìn)行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任何一項(xiàng)所述的方法，其中相對(duì)于待硅烷化官能團(tuán)的摩爾量， 使用0. 5至5當(dāng)量、優(yōu)選0. 7至1. 5當(dāng)量的硅烷化劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任何一項(xiàng)所述的方法，其中A包含2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)氨 基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)所述的方法，其中X是吸電子的氨基保護(hù)基團(tuán)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中X是Boc基團(tuán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任何一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)的反應(yīng)是在羧基活化 劑、優(yōu)選地是新戊酰氯和氯甲酸異丁酯的存在下進(jìn)行的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將基團(tuán)X從由該反應(yīng)所 產(chǎn)生的化合物中去除。
14.極性有機(jī)溶劑用于提供部分硅烷化的肽或部分硅烷化的肽類似物的溶液的用途， 該肽或肽類似物通過(guò)使式(I)X-A-COOH的化合物與全硅烷化肽或全硅烷化肽類似物進(jìn)行 反應(yīng)來(lái)獲得，其中X是氨基保護(hù)基團(tuán)，A是氨基酸、肽或肽類似物殘基，并且-COOH表示任選 活化的羧基基團(tuán)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中該極性有機(jī)溶劑是酰胺類型的溶劑，優(yōu)選地選 自N，N- 二甲基甲酰胺以及N，N- 二甲基乙酰胺。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其中該溶劑是N，N-二甲基乙酰胺。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中任何一項(xiàng)所述的用途，其中在A中氨基酸單元以及任選類 似物單元的數(shù)目與在該全硅烷化肽或該全硅烷化肽類似物中氨基酸單元以及任選類似物 單元的數(shù)目的比值是1 5至3 2，優(yōu)選地1 4至1 1。
18.根據(jù)權(quán)利要求14至17中任何一項(xiàng)所述的用途，其中該溶液含有10%重量至95% 重量的極性有機(jī)溶劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求14至18中任何一項(xiàng)所述的用途，其中該部分硅烷化的肽或肽類似 物是通過(guò)使根據(jù)權(quán)利要求9或10中任何一項(xiàng)所述的式(I)的化合物與根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的全硅烷化肽或全硅烷化肽類似物進(jìn)行反應(yīng)來(lái)獲得的。
20.根據(jù)權(quán)利要求14至19中任何一項(xiàng)所述的用途，其中該溶液在_40°C至+10°C的溫 度下是均相的。
21.用于制造一種肽或肽類似物的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求14至20中任何一項(xiàng)所述的用途。
22.在液體介質(zhì)中包含具有4至15個(gè)氨基酸的肽或肽類似物的溶液，所述液體介質(zhì)含 有N-甲基-N-三甲基硅烷基乙酰胺和酰胺類型的溶劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求23所述的溶液，其中該酰胺類型的溶劑是N，N-二甲基乙酰胺。
全文摘要
用于制造全硅烷化的肽或肽類似物的方法，該方法包括(a)通過(guò)與除了三甲基甲硅烷基氰化物以外的硅烷化劑的反應(yīng)通過(guò)使相應(yīng)的肽硅烷化來(lái)生產(chǎn)全硅烷化的肽或全硅烷化的肽類似物；并且(b)使具有化學(xué)式(I)X-A-COOH的化合物與含有從4至15個(gè)氨基酸的全硅烷化的肽或全硅烷化的肽類似物進(jìn)行反應(yīng)，其中X是氨基保護(hù)基團(tuán)，A是氨基酸、肽或肽類似物殘基，并且-COOH表示任選活化的羧基基團(tuán)。
文檔編號(hào)C07K1/107GK101918428SQ200880125084
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月19日
發(fā)明者羅蘭·卡倫斯, 蒂里·德爾普朗什 申請(qǐng)人:索爾維公司