專利名稱：：真菌PepC抑制劑的制作方法真菌PepC抑制劑涉及序列表本申請包含計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過弓I用并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有P印C抑制活性的分離的多肽。本發(fā)明還涉及表達P印C抑制劑的宿主細胞，以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。
背景技術(shù)：
：在表達異源蛋白中重組宿主細胞的使用在近年來大大簡化了具有商業(yè)價值的蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)，否則只能通過由其天然來源純化而獲得。一個經(jīng)常遇到的問題是由指定宿主細胞或在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的高水平蛋白分解酶。先前已經(jīng)報道了失去產(chǎn)生特定蛋白分解化合物的能力的宿主生物體的幾個實例。例如，國際專利申請WO90/00192描述了不能分泌酶活性天冬氨酸蛋白酶的絲狀真菌宿主，并且EP574347描述了缺少枯草桿菌蛋白酶類型的絲氨酸蛋白酶ρ印C或ρ印D的黑曲霉(Aspergillusniger)宿主。Frederick等，Gene，125(1993)57-64中已經(jīng)描述了黑曲霉的ρ印C基因的克隆和表征。至今為止，所有涉及ρ印C突變體和它們在絲狀真菌(特別是曲霉屬)中產(chǎn)生異源多肽的用途的所有已知現(xiàn)有技術(shù)，都優(yōu)選地涉及缺失突變體。這需要對宿主細胞進行基因操作。因此理想的是找到其它方法用于降低特定蛋白酶的活性，例如以抑制劑的形式進行。本發(fā)明的目的是通過提供編碼曲霉屬絲氨酸蛋白酶抑制劑，具體為P印C抑制劑的DNA分子，從而提供可替代的解決方案。在酵母釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，已經(jīng)描述了蛋白酶yscB(pepC同源物)的抑制劑(Schu等，1991，Eur.J.Biochem,197:1_7)。發(fā)現(xiàn)這種抑制劑位于細胞質(zhì)。曲霉屬中的P印C蛋白已知為在液泡中產(chǎn)生的蛋白酶。然而，當使用曲霉屬作為產(chǎn)生宿主時，遇到的與P印C有關(guān)的問題通常是可在上清中發(fā)現(xiàn)P印C。依賴于產(chǎn)生的產(chǎn)物，這可成為得率/穩(wěn)定性的問題。發(fā)明概述本發(fā)明提供編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑的DNA分子。更具體地，本發(fā)明的第一方面提供具有P印C抑制活性的分離的多肽，所述多肽選自下組(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO6的成熟多肽具有至少85%，優(yōu)選至少90%，并且最優(yōu)選至少95%同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO17中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少至少85%，更優(yōu)選至少90%，和最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列；(d)變體，其包含取代、缺失和/或插入一個或幾個氨基酸的SEQIDNO6的成熟多肽。在第二方面，本發(fā)明涉及用于在曲霉屬宿主細胞中產(chǎn)生目的異源多肽的方法，其包括(a)在有益于表達由第一和第二核酸序列編碼的多肽的條件下培養(yǎng)包含所述第一和第二核酸序列的曲霉屬宿主細胞，并且其中第一核酸序列編碼目的異源多肽，而第二核酸編碼本發(fā)明的抑制劑多肽，并且其中抑制劑多肽由重組核酸構(gòu)建體表達，導(dǎo)致與不包含重組核酸構(gòu)建體的曲霉屬宿主細胞相比，抑制劑多肽水平增加；和(b)回收所述異源多肽。在第三方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽用于枯草桿菌蛋白酶類型(subtilisin-type)的絲氨酸蛋白酶的體外或體內(nèi)抑制的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明提供去除不理想的蛋白酶活性的替代方法，其不涉及編碼蛋白酶的基因的操作，例如通過突變或缺失蛋白酶基因。取而代之的是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌并且特別是曲霉屬具有能抑制絲氨酸蛋白酶如P印C的內(nèi)源抑制劑活性。根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)源P印C抑制劑與任何已知的蛋白酶抑制劑不具有任何實質(zhì)的同一性程度。與酵母蛋白酶yscB抑制劑PB12相比(Schu,P.Wolf,D.H.；Eur.J.Biochem.1971-7(1991))，曲霉屬P印C抑制劑只表現(xiàn)出19%的同一性。此外，分泌抑制劑，并且因此能在宿主細胞的生長培養(yǎng)基的上清中發(fā)現(xiàn)抑制劑。如果與幾乎唯一地定位于細胞質(zhì)的yscB抑制劑(Schu等，見上文)相比，這本不是所期望的。P印C抑制活性術(shù)語“抑制活性”在本文中定義為可作為P印C的抑制劑的多肽。抑制劑是可逆或不可逆地防止酶正常作用而又不破壞酶的物質(zhì)；通過與活性位點結(jié)合并防止結(jié)合底物而起作用的競爭性抑制劑；和通過與酶的其它部分結(jié)合而起作用的非競爭性抑制劑。根據(jù)實例中描述的過程，如材料與方法中所述，由徑向擴散分析確定P印C抑制活性。本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO:6的成熟多肽的P印C抑制活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”用于本文中指，如通過SDS-PAGE測定的，其為至少20%純，優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，最優(yōu)選至少90%純，并且甚至最優(yōu)選至少95%純的多肽?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選為基本上純的形式。具體地，優(yōu)選的是多肽為“基本上純的形式”，即，多肽制備物基本上不含與其天然結(jié)合的其它多肽材料。這可以通過如下實現(xiàn)例如，通過公知的重組方法或經(jīng)典的純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為具有P印C抑制活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO6的氨基酸1至17是信號肽的SignalP預(yù)測程序，成熟多肽是SEQIDNO6的氨基酸18至89。這與顯示N-末端為SPIVVTYPID的純化的抑制劑一致。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有P印C抑制活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)信號序列的長度和EST序列、SEQIDNO:3與基因組DNA序列SEQIDNO17的比對，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:17的核苷酸64至141，204至228，306至315，和416至481。因此，SEQIDN0:17的核苷酸13至63編碼預(yù)測的信號肽。同一性參數(shù)“同一性”描述兩個氨基酸序列之間之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度通過Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443_453)使用EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276_277)的Needle程序來測定，優(yōu)選3.0.0版本或更高版本。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gappenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(同樣的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度通過Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上文)使用EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見上文)的Needle程序來測定，優(yōu)選3.0.0版本或更高版本。使用的可選為參數(shù)缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))同源序列術(shù)語“同源序列”在本文中定義為在用SEQIDNO:6中包含的米曲霉PepC白勺tfasty(Pearson,W.R.，1999,ψBioinformaticsMethodsandProtocols中，S.Misener和S.A.Krawetz編，pp.185-219)中E值(或期望值)小于0.001的預(yù)測蛋白質(zhì)。多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從SEQIDNO:6的成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有P印C抑制活性。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO17的5，和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列；其中所述亞序列編碼具有P印C抑制活性的多肽片段。等位變體(allelicvariant)術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指由其來源分離的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，多核苷酸為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純的多核苷酸。基本上純的多核苷酸術(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用于本文時術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成或重組的核苷酸序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段。當所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達。表達術(shù)語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術(shù)語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)0修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對由SEQIDNO6的成熟多肽組成的多肽或其同源序列的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當用在本文時，術(shù)語“人工變體”的意思是具有P印C抑制活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的多核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(yù)(humanintervention)，通過修飾公開于SEQIDNO:17或它的同源序列的多核苷酸序列來獲得。具有P印C抑制活性的多肽在第一方面，本發(fā)明涉及包含氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO6的成熟多肽具有優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多肽具有P印C抑制活性(下文中的“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，其與SEQIDNO:6的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO6的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有P印C抑制活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:6的成熟多肽。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸18至89，或其等位變體；或它們的具有P印C抑制活性的片段。在另一個優(yōu)選方面，多肽包含SEQIDNO6的氨基酸18至89(對應(yīng)于由純化抑制劑的N-末端測序確認的預(yù)測成熟多肽)。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO6的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有P印C抑制活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:6的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:6的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO:6的氨基酸18至89或其等位變體；或它們的具有P印C抑制活性的片段組成。在另一個優(yōu)選方面，多肽由SEQIDNO6的氨基酸18至89組成。本發(fā)明涉及具有P印C抑制活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優(yōu)選低嚴緊條件下，更優(yōu)選中嚴緊條件下，更優(yōu)選中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:17的序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)⑴、(ii)或(iii)的互補鏈(J.Sambrook，Ε·F.Fritsch,禾口Τ·Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor，NewYork)。SEQIDNO:17的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有P印C抑制活性的多肽片段。在一個具體的實施方案中，SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列包含SEQIDNO17的核苷酸64至141，204至228，306至315，和416至481。在另一個具體的實施方案中，SEQIDNO17中包含的cDNA序列包含SEQIDNO17的核苷酸13至141，204至228，306至315，和416至481。SEQIDNO17的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO6的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有P印C抑制活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針長度是至少100個核苷酸。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，或更優(yōu)選至少400個核苷酸。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有P印C抑制活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO17或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列；包含于SEQIDNO17中的cDNA序列；其全長互補鏈；或它們的亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO17的核苷酸13至141，204至228，306至315，和416至481(cDNA).在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:6的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴緊性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴緊性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍谰o性為50%的甲酰胺，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在450C(非常低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在50°C(低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴緊性)，更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴緊性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴緊性)，并且最優(yōu)選至少在70°C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比牛艮據(jù)Bolton禾口McCarthy計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ΙπιΜ舞酸二Mi內(nèi)(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP禾口0·2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在另一個方面，本發(fā)明涉及由包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的多核苷酸編碼的具有P印C抑制活性的分離的多肽，所述核苷酸序列與SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%或99%的同一性程度，其編碼活性多肽。在進一步的方面，本發(fā)明涉及人工變體，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的SEQIDNO:6的成熟多肽；或其同源序列。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/lle、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells，1989，Science244:1081_1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，P印C抑制活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899_904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59_64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(sbuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson禾ΠSauer,1988，Science241:53_57；Bowie禾ΠSauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；WO95/17413；或W095/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利號5，223，409；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速測定目的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO6的成熟多肽，如SEQIDNO6的氨基酸18至89的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有P印C抑制活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是分泌的。本發(fā)明的多肽可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、,廉抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、^^ffiβ(Aspergillusawamori)Λffiβ(Aspergillusfumigatus)、1ffiβ(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、桿抱狀,廉抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱,廉抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓,廉抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、^■€β(Mucormiehei)、口f%罾M胃(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、哈茨木毒(Trichodermaharzianum)、康寧木毒(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是米曲霉或黑曲霉多肽。在更優(yōu)選的方面，所述多肽是米曲霉多肽，并且最優(yōu)選米曲霉(NBRL4177)多肽，例如SEQIDNO6的多肽或SEQIDNO6中包含的成熟多肽?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物禾口細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)、農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)禾口國立技術(shù)與評價ff胃ML罾(NationalInstituteofTechnologyandEvaluationBiologicalResourceCenter)(NBRC)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。多核苷酸本發(fā)明的具有P印C抑制活性的多肽由下述分離的多核苷酸編碼。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO17或由SEQIDNO17組成。在另一個優(yōu)選方面，核苷酸序列包含SEQIDN0:17的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列組成。在另一個優(yōu)選方面，核苷酸序列包含SEQIDN0:17中所包含的cDNA序列，或由SEQIDNO17中所包含的cDNA序列組成，具體為由SEQIDN0:17的核苷酸13至141，204至228，306至315和416至481組成的cDNA。本發(fā)明還包含核苷酸序列，其編碼的多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO:6的氨基酸序列或其成熟多肽組成，由于遺傳密碼的簡并性，所述氨基酸序列不同于SEQIDN0:17或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDN0:17的亞序列，所述亞序列編碼具有P印C抑制活性的SEQIDNO6的片段。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO171的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，或由具有至少一個突變的SEQIDNO:171的成熟多肽編碼序列組成，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:6的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork0可以使用其它核酸擴增方法，如連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)?？梢詮那箤倬?，或其它或相關(guān)生物體克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDN017的成熟多肽編碼序列具有至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的同一性程度，其編碼活性多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:17的成熟多肽編碼區(qū)存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2一107。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能重要的區(qū)域之外進行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，見上文)來鑒定。在后一技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，并且測試所得突變分子的P印C抑制活性，以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測定，通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術(shù)來測定(參見，例如，deVos等，1992，見上文；Smith等，1992，見上文；Wlodaver等，1992，見上文)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴緊條件下，優(yōu)選低嚴緊條件，更優(yōu)選中等嚴緊條件，更優(yōu)選中_高嚴緊條件，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，()包含于SEQIDNO:17中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在一個優(yōu)選的方面，互補鏈是SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下獲得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴緊條件下，將DNA的群體與以下序列雜交(i)SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:17中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有P印C抑制活性的多肽。在一個優(yōu)選的方面，互補鏈是SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是適當?shù)膯幼有蛄?，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992,Yeast8:423_488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉IAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列異源的信號肽編碼區(qū)。異源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區(qū)時可為必需的?；蛘?，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以增強多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。在一個優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO17的氨基酸13至63，其編碼SEQIDNO6的氨基酸1至17。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼區(qū)由Romanos等，1992，見上文，描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應(yīng)化學或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達本發(fā)明的核苷酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使得該編碼序列與適當?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。條件必需的基因可以作為非抗生素選擇性標記。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase),PyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序15列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator)，其在細胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。用于酵母宿主細胞中的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復(fù)制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或?qū)⒖蓴U增的選擇性標記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝和由此含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細胞本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其包括本發(fā)明的多核苷酸，所述多核苷酸可以有利地用于P印C抑制劑和任選的另一種目的多肽的重組生產(chǎn)中。具體而言，這另一種目的多肽是對P印C降解易感的異源多肽。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細胞，使載體如前所述保持為染色體整合體或自復(fù)制的染色體外載體。術(shù)語“宿主細胞”包括親本細胞的任何祖先，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不同。宿主細胞的選擇很大程度上依賴于編碼多肽的基因和它的來源。宿主細胞可以真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UKtPPJf^JC)U及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢^^^(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995,)。在更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。“酵母”用在本文包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.，Passmore,S.Μ.，禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述。在甚至更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)細胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母(Saccharomycescar1sbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是Yarrowialipolytics細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta),Ceriporiopsisaneirina>Ceriporiopsisaneirina>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa或Ceriporiopsissubvermispora，灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺序側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉、Trametesvillosa、Trametesversicolor、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞?？梢詫⒄婢毎ㄟ^涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton^,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194，pp182—187，AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983，JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述細胞是曲霉屬的細胞。在更優(yōu)選的方面，所述細胞是米曲霉。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽可以如前所述從核酸構(gòu)建體重組產(chǎn)生。因此在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的宿主細胞；和(b)回收所述多肽。具體地，P印C抑制劑可以在共表達目的異源多肽的宿主細胞中表達。更具體地，目的異源多肽易由P印C降解，從而與不表達P印C抑制劑的宿主細胞相比，增加異源多肽的產(chǎn)量。產(chǎn)生異源多肽的這種方法可為使用P印C基因突變體如缺失突變體的替換方案。就這個具體目的而言，本發(fā)明的P印C抑制劑多肽應(yīng)優(yōu)選以比正常更高的水平表達。P印C抑制劑通常存在于宿主細胞中，除此之外，在表達某些異源多肽時，P印C仍然是個問題。在一個優(yōu)選的實施方案中，因此應(yīng)過表達P印C抑制劑，優(yōu)選由強啟動子過表達。為了能控制表達水平，可以從誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子表達P印C抑制劑。在一個具體實施方案中，可以失活編碼P印C抑制劑的基因的內(nèi)源拷貝。優(yōu)選地，因此P印C抑制劑由重組核酸構(gòu)建體表達。在這個實施方案中，控制P印C抑制劑表達的啟動子是外源啟動子。通過“外源”，表示通常不調(diào)控P印C表達的啟動子。在進一步的實施方案中，本發(fā)明因此涉及用于在曲霉屬宿主細胞中產(chǎn)生目的異源多肽的方法，包括(a)在有益于表達由第一和第二核酸序列編碼的多肽的條件下培養(yǎng)包含所述第一和第二核酸序列的曲霉屬宿主細胞，并且其中第一核酸序列編碼目的異源多肽，第二核酸編碼本發(fā)明的抑制劑多肽，并且其中抑制劑多肽由重組核酸構(gòu)建體表達，導(dǎo)致與不包含重組核酸構(gòu)建體的曲霉屬宿主細胞相比，抑制劑多肽的水平增加；和(b)回收所述異源多肽。用于控制P印C抑制劑表達的特別合適的啟動子是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。為了將上清中P印C失活而需要的P印C抑制劑的確切水平可以不同。技術(shù)人員了解如何選擇合適的啟動子并如本文所述測定P印C活性。當目的異源多肽由P印C降解時，技術(shù)人員能測試可用的啟動子，以找到提供必需抑制的表達水平。這可以依賴于目的多肽和生長條件而不同。在具體的實施方案中，異源多肽是抗體。具體地，抗體是IgG，更具體為IgGl。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden編)。實施例材料與方法材料菌株大腸桿菌DB6507(ATCC35673)米曲霉NBRC4177(IF04177)可由Instituteforfermentation,Osaka；17_25JusoHammachi2-ChomeYodogawa-Ku,Osaka,Japan獲得。JaL507在W020060211089，實施例2中描述。JaL601在實施例3中描述。JaL909在實施例5中描述。JaL940在實施例7中描述。JaL942在實施例7中描述。PM-8在W02001051646實施例7中描述JaLl182在實施例12中描述。JaLl157和JaLl158在實施例13中描述?；騪yrG該基因編碼乳清苷_5’-磷酸脫羧酶，這個酶與尿苷的生物合成有關(guān)。niaD:該基因編碼硝酸還原酶，這個酶與硝酸(鹽)的代謝有關(guān)。V039蛋白在W02006069290實施例4表5中描述。這是由微小根毛霉(Rhizomucurpusillus)α-淀粉酶催化域、黑曲霉淀粉葡糖苷酶接頭序列和碳結(jié)合模塊(CBM)組成的融合蛋白。此外，專利W08901969權(quán)利要求17中所述的黑曲霉α-淀粉酶信號用作信號序列。表達構(gòu)建體pHUda667的完整序列，及其中個體元件的解釋在實施例11中描述。質(zhì)粒pJaL485在專利W02003008575實施例3中描述。pJaL1030在實施例6中描述。pJaL1035在實施例2中描述。pJaL790在W02005070962實施例1中描述。pNZ-3在W02005070962實施例2中描述。pNZ-4在W02005070962實施例3中描述。ρJaLlOOO在實施例8中描述。pHUda737在實施例9中描述。pHUda753在實施例10中描述。pHUda667在實施例11中描述。質(zhì)粒與DNA序列ESTZY029357(SEQIDNO1)ESTZY097797(SEQIDNO2)ESTZY106022(SEQIDNO3)AAZY029357(SEQIDNO4)AAZY097797(SEQIDNO5)AAZY106022(SEQIDNO6)引物ZY106022_b(SEQIDNO7)引物ZY106022_c(SEQIDNO8)ZY106022DNA(SEQIDNO9)IgGl氨基酸(SEQIDNO:10)引物8653(SEQIDNO11)引物FG_30(SEQIDNO12)引物FG_31(SEQIDNO13)引物8654(SEQIDNO14)IgGlDNA(SEQIDNO15)引物ZY106022_d(SEQIDNO16)ZY106022基因組DNA(SEQIDNO17)引物opyrGF(SEQIDNO18)引物opyrGR(SEQIDNO19)pHUda667(SEQIDNO20)方法PCR、克隆、連接核苷酸等常用方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且可以在例如"Molecularcloning:Alaboratorymanual，，，Sambrook等(1989),ColdSpringHarborlab.,ColdSpringHarbor,NY；Ausube1,F.M等(編)；“Currentprotoco1sinMolecularBiology”，JohnWiley和Sons，(1995)；Harwood,C.R.和Cutting，S.M.(編)；"DNACloning:APracticalApproach,VolumesIandII",D.N.Glovered.(1985)；"OligonucleotideSynthesis",M.J.Gait編(1984)；"NucleicAcidHybridization",B-D-HiimesfeHHigginsII(1985)；"APracticalGuideToMolecularCloning",B.Perbal，(1984)中找到。DNA雜交簡而言之，所有DNA雜交在5XDenhart溶液，5xSSC、0.02MEDTAU%SDS,0.15mg/ml多聚ARNA和0.05mg/ml酵母tRNA的標準雜交緩沖液中在65°C進行16小時。雜交后，將濾膜在2XSSC加0.SDS中在65°C洗滌兩次，并暴露于X-射線片。PCR擴增所有PCR擴增在100微升體積中進行，其中在反應(yīng)緩沖液中包含2.5單位Taq聚合酶，IOOngpS02，250nM各種dNTP，和IOpmol上述兩種引物中的每一種，反應(yīng)緩沖液為50mMKClUOmMTris-HClρΗ8.0，1.5mMMgC12。擴增在Perkin-ElmerCetusDNATermal480中進行，由下述組成94°C3分鐘的一個循環(huán)，之后為94°C1分鐘，55°C30秒和72°C1分鐘的25個循環(huán)。曲霉屬轉(zhuǎn)化如Christensen等；Biotechnology1988，61419-1422所述進行曲霉屬轉(zhuǎn)化。簡言之，米曲霉菌絲在富營養(yǎng)培養(yǎng)液中生長。通過過濾從培養(yǎng)液分離菌絲體。向滲透壓穩(wěn)定緩沖液中的菌絲體加入50mgβ-葡聚糖酶(GLUCANEXTM，NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)，所述緩沖液如用磷酸鈉緩沖至ρΗ5.O的1.2MMgSO40在37°C攪拌溫育懸浮液60分鐘。通過mira-cloth濾布過濾原生質(zhì)體，去除菌絲體碎片。收獲原生質(zhì)體并用STC(1.2M山梨醇，IOmMCaCl2,IOmMTris-HClρΗ7.5)洗滌兩次。最后將原生質(zhì)體重懸于200-1000微升STC中。為了進行轉(zhuǎn)化，向100微升原生質(zhì)體懸浮液中加入5微克DNA，然后加入200微升PEG溶液(60%PEG4000,IOmMCaCl2,IOmMTris-HClρΗ7.5)，并在室溫溫育混合物20分鐘。收獲原生質(zhì)體并用1.2M山梨醇洗滌兩次。最后將原生質(zhì)體重懸于200微升1.2M山梨醇中。根據(jù)在基本平板上使用硝酸鹽為唯一氮源的能力選擇包含完整niaD基因的轉(zhuǎn)化子(CoveD.J.1966.Biochem.Biophys.Acta.113:51_56)，所述平板包含1.OM蔗糖為碳源，IOmM硝酸鈉為氮源。在37°C生長4-5天后，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)為生長旺盛并萌發(fā)孢子的菌落。通過分生孢子將轉(zhuǎn)化子純化兩次。LB脫脂乳瓊脂平板為包含脫脂乳(Difco232100)和1.5%細菌用瓊脂的LB-培養(yǎng)基。通過徑向擴散進行蛋白酶抑制劑測試將待分析的樣品(20μ1)載入LB脫脂乳瓊脂平板上的鉆孔中。在37°C溫育平板20小時。然后測定暈圈(halo)。包含PepC蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)液包含P印C蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)液如W02005070962，實施例15，發(fā)酵方法J3所述制備。用于測定完整人I甙的ELISA使用ELISA測定完整IgG，所述方法使用羊抗人IgG(Fe特異性)作為捕獲抗體，與堿性磷酸酶綴合的羊抗人kappa鏈作為檢測抗體。使用純化自人細胞質(zhì)的人骨髓瘤IgGl，kappa作為標準。ELISA過程為標準規(guī)程。21抗體穩(wěn)定件測試在室溫溫育發(fā)酵培養(yǎng)液24小時，并通過ELISA測定完整抗體。培養(yǎng)基和試劑Cove-N342.3g/L蔗糖，20ml/LCOVE鹽溶液，3g/LNaNO3,30g/Lnoble瓊脂。COVE鹽溶液每升26gKCl、26gMgSO4·7H20、76gKH2PO4和50mlCOVE痕量金屬。Cove痕量金屬每升0.04gNa2B4O7·10Η20、0·4gCuS04·5Η20、1·2gFeSO4·7Η20、0·7gMnSO4·H20,0.7gNa2MoO2·2H20和0.7gZnSO4·7H20。YPG:4g/L酵母提取物，lg/LKH2PO4,0.5g/LMgS04_7H20，5g/L葡萄糖，pH6.0。STC:0.8M山梨醇，25mMTrispH8,25mMCaCl20STPC:STC緩沖液中的40%PEG4000。Cove-N頂層瓊脂糖342.3g/L蔗糖，20ml/LCOVE鹽溶液，3g/LNaNO3,lOg/L低熔點瓊脂糖。MLC(葡萄糖40g/L，大豆粉50g/L，檸檬酸4g/L，pH5.0)。MU-I(麥芽糊精260g/L，MgSO4.7H203g/L，K2SO46g/L，KH2PO45g/L，痕量金屬溶液0.5m/L，脲2%(w/v),pH4.5)。實施例1米曲霉DeoC抑制劑的鑒定用釀酒酵母蛋白酶yscB抑制劑(PBI2)氨基酸(aa)序列(UNIPR0T:P01095)對米曲霉EST數(shù)據(jù)庫進行tBLASTn搜索，將三個不同的EST鑒定為酵母yscB抑制劑推定的同源物。三個EST，ZY029357(SEQIDNO1)、ZY097797(SEQIDNO2)和ZY106022(SEQIDNO:3)分別是長70aa(SEQIDNO:4)、71aa(SEQIDNO5)和89aa(SEQIDNO6)的編碼蛋白。同源性示于表1中。表1%相同位置(X)%共有位置比較3個米曲霉EST，表明ZY106022根據(jù)signalP(BendtsenJD,NielsenH,vonHeijneG禾口BrunakS(2004)Improvedpredictionofsignalpeptides-SignalP3.0.J.Mol.Biol.，340783-795)，在23個氨基酸(SEQIDNO4中的位置1-23)上具有推定的信號序列。這表明分泌了蛋白(抑制劑)。對于其它兩個推定的抑制劑，沒有發(fā)現(xiàn)信號序列，表明它們位于胞內(nèi)。實施例2用于ZY106022p.TaL1035的曲霉屬表汰盒的構(gòu)津以如下方法構(gòu)建曲霉屬表達盒pJaL1035，其適合在黑曲霉中性淀粉酶啟動子(NA2)和黑曲霉葡糖淀粉酶終止子的控制下表達目的基因，并且具有米曲霉niaD基因的截短型3’部分，其允許與只具有niaD基因的5’部分的曲霉屬niaD突變體發(fā)生單交換事件，由此產(chǎn)生完整的niaD，用于在硝酸鹽上生長的篩選(可與GomiK，IimuraY和HaraS(1987)IntegrativetransformationofAspergillusoryzaewithaplasmidcontainingtheAspergillusnidulansargBgene.Agric.Boil.Chem.51:2549_2555中所述可比的系統(tǒng))。通過PCR，用米曲霉基因組DNA為模板，使用引物ZY106022-b(SEQIDNO7)和ZY106022-c(SEQIDNO8)擴增719bp片段。這用BamHI和XhoI消化，得到715bp片段(SEQIDNO9)。將715BamHI-XhoI片段克隆入pJaL485的BamHI-SalI位點，得到質(zhì)粒pJaL1035。實施例3DyrG陰件米曲霉菌株TaL601的構(gòu)津為了去除位于米曲霉菌株JaL507中堿性蛋白酶基因中的缺陷pyrG基因，進行下述步驟根據(jù)對5-氟-乳清酸(FOA)的抗性篩選米曲霉菌株JaL507，在補加1.0M蔗糖作為碳源，IOmM硝酸鈉作為氮源和0.5mg/mlFOA的基本平板(CoveD.J.1966.Biochem.Biophys.Acta.113:51_56)上鑒定自發(fā)的pyrG突變體。將一株菌株JaL601鑒定為pyrG陰性。JaL601為尿苷依賴型，因此能用野生型pyrG基因轉(zhuǎn)化，并且通過在缺少尿苷時生長的能力篩選轉(zhuǎn)化子。實施例4ZY106022在米曲霉中的表達如方法部分所述，用表達質(zhì)粒pJaL1035轉(zhuǎn)化菌株JaL601。用來自10個轉(zhuǎn)化子和母體菌株JaL601的孢子接種含10mlYPM培養(yǎng)基(2g/l酵母提取物，2g/l蛋白胨和2%麥芽糖)的搖瓶，并在30°C，200rpm溫育4天。實施例5通過抑制PepC蛋白酶進行抑制劑ZY106022表達的檢測通過在脫脂乳瓊脂平板上ρ印C蛋白酶不產(chǎn)生暈圈或產(chǎn)生更小的暈圈，檢測推定的P印C蛋白酶抑制劑的表達。如下進行蛋白酶抑制劑測試將10μ1PepC發(fā)酵培養(yǎng)液與來自由pJaL1035表達P印C抑制劑的轉(zhuǎn)化子的10μ1上清混合(參見實施例4)，并且作為對照，將10μ1P印C發(fā)酵培養(yǎng)液與ομ1發(fā)酵培養(yǎng)液(YPM培養(yǎng)基)混合。在室溫進行30分鐘溫育。將20μ1載入LB脫脂乳瓊脂平板的鉆孔中。平板在37°C溫育20小時。然后測定暈圈。這些結(jié)果顯示，ZY106022是米曲霉P印C抑制劑。選擇一個可產(chǎn)生足夠的抑制劑ZY106022而見不到暈圈的轉(zhuǎn)化子(JaL909)進行進一步的實驗。實施例6天然IgGl重鏈曲霉屬表達質(zhì)粒p.TaL1030的構(gòu)建修飾人IgGl重鏈氨基酸序列SEQIDNO10，使位置236處的精氨酸通過SOEPCE改變成賴氨酸。使用質(zhì)粒PNZ-3作為模板，使用正向引物8653(SEQIDNO=Il)和反向引物FG-30(SEQIDNO12)，通過PCR擴增第一序列，可產(chǎn)生805bp產(chǎn)物。使用質(zhì)粒pNZ_3作為模板，使用正向引物re-31(SEQIDNO13)和反向引物8654(SEQIDNO14)，通過PCR擴增第二序列，可產(chǎn)生795bp產(chǎn)物?；旌蟽蓚€PCR片段，并使用正向引物8653和反向引物8654進行第三次PCR，可產(chǎn)生1600bp產(chǎn)物。純化1600bp的PCR產(chǎn)物，并用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI剪切。將得到的1419bp片段(SEQIDNO15)克隆進pJaL790的相應(yīng)位點中以產(chǎn)生pJaL1030。pJaL1030中插入的序列通過測序驗證。實施例7IgGl抗體在米曲霉菌株TaL909中的表汰以一比一的比例用表達質(zhì)粒pJaL1030和NZ-4，如Christensen等；Biotechnology198861419-1422所述轉(zhuǎn)化米曲霉菌株JaL909。用來自產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子和宿主JaL909的孢子接種包含IOmlYPM培養(yǎng)基(2g/l酵母提取物，2g/l蛋白胨和2%麥芽糖)的搖瓶，并在30°C震蕩(200rpm)溫育4天。如方法部分所述描述通過ELISA在上清中篩選完整IgGl。選擇兩個名為JaL940和JaL942的轉(zhuǎn)化子進行實驗室-發(fā)酵罐發(fā)酵。如W02005070962，實施例15，方法J3中所述進行發(fā)酵。如方法部分所述，在脫脂乳瓊脂平板上檢查來自發(fā)酵物最后一部分的樣品的蛋白酶活性。結(jié)果顯示，JaL940展示的暈圈和對照一樣大小，而JaL942則沒有見到暈圈，與母體菌株JaL909相似。這表明JaL940已經(jīng)丟失了抑制劑ZY106022的基因拷貝。使用Southern印跡證實這一結(jié)果。印跡結(jié)果顯示，JaL909在niaD基因座具有多于一個整合拷貝，并且JaL942保留了這一基因數(shù)目，而JaL940只保留了一個拷貝。來自菌株JaL942、JaL940和表達抗體的對照菌株JaL601的完整抗體的穩(wěn)定性分別為100%、50%和50%。實施例8用于ZY106022p.TaLlOOO的曲霉屬表達盒的構(gòu)建以如下方法構(gòu)建曲霉屬表達盒pJaLlOOO，其適合在黑曲霉中性淀粉酶啟動子(NA2)和黑曲霉葡糖淀粉酶終止子的控制下表達目的基因，并且具有構(gòu)巢曲霉amdS基因，其用于選擇曲霉屬中的轉(zhuǎn)化子。用米曲霉基因組DNA為模板，使用引物ZY106022-b(SEQIDNO7)和ZY106022-d(SEQIDNO16)通過PCR擴增487bp片段。用BamHI和XhoI消化PCR產(chǎn)物，得到481bp片段(SEQIDN0:17)。將481bpBamHI-XhoI片段克隆進入pJaL790的BamHI-SalI位點，得到質(zhì)粒pJaLlOOO。實施例9構(gòu)建pHUda737表達載體質(zhì)粒pHUda737包含表達盒，其基于與構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶非翻譯前導(dǎo)序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II啟動子(Na2/tpi啟動子)和黑曲霉淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶終止子(AMG終止子)，來自米曲霉使pyrG缺陷宿主能生長的選擇性標記pyrG，和來自釀酒酵母使PyrF缺陷型大腸桿菌菌株DB6507能生長的URA3標記。以下述方式構(gòu)建曲霉屬表達載體pHUda737使用分別引入XbaI和SphI位點的引物opyrGF和opyrGR，擴增米曲霉pryG，其編碼乳清苷-5’_磷酸脫羧酶，該酶參與尿苷的生物合成。所述引物根據(jù)黑曲霉基因組數(shù)據(jù)庫的核苷酸序列信息而設(shè)計。opyrGF:tttctagacccaagccgctgctggaa(SEQIDNO18)opyrGRtttgcatgccgagcgtaaccgctgcctca(SEQIDNO19)用米曲霉IF04177的基因組DNA作為模板，使用opyrGF和opyrGR，用ExpandTMPCR系統(tǒng)(RocheDiagnostics,Japan)進行PCR反應(yīng)。擴增反應(yīng)物(50μ1)由IX緩沖液(RocheDiagnostics,Japan)中的Ing模板DNA每μ1，250mM各種dNTP，250ηΜ引物opyrGF，250nM引物opyrGR，0.IUTaq聚合酶每μ1組成。在DNAEnginePTC-200(MJ-Research,Japan)中溫育反應(yīng)物，程序如下94°C2分鐘的1個循環(huán)；92°C1分鐘，55°C1分鐘和72°C2分鐘的30個循環(huán)；72°C10分鐘的1個循環(huán)；并保持在4°C。使用TAE緩沖液在1.0%瓊脂糖凝膠上分離反應(yīng)產(chǎn)物，從凝膠切除2.5kb的產(chǎn)物條帶，并使用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.，Valencia,CA)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。用XbaI和SphI消化2.5kb擴增的DNA片段，并連接入用XbaI和SphI消化的曲霉屬表達盒pJaL790中。使用釀酒酵母URA3基因作為選擇性標記，將連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DB6507(ATCC35673)，產(chǎn)生表達質(zhì)粒pHUda737。使用QIAprepSpinMinipr印試劑盒(QIAGEN，Chatsworth,CA)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明回收擴增的質(zhì)粒。將得到的質(zhì)粒測序并與公共序列數(shù)據(jù)庫比較，表明克隆編碼米曲霉pyrG基因。實施例10PHUda753表達載體的構(gòu)建構(gòu)建表達載體pHUda753，用于來自米曲霉的蛋白酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)錄。用BamHI和XhoI消化攜帶蛋白酶抑制劑的質(zhì)粒pJaLlOOO。將481bp片段凝膠純化并連接入用BamHI和XhoI消化的曲霉屬表達盒pHUda737中。使用釀酒酵母URA3基因作為選擇性標記，將連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DB6507(ATCC35673)，以產(chǎn)生表達質(zhì)粒pHUda753。使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(QIAGEN，Chatsworth,CA)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明回收擴增的質(zhì)粒。質(zhì)粒pHUda753包括表達盒，其基于與構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶非翻譯前導(dǎo)序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II啟動子(Na2/tpi啟動子)和黑曲霉淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶終止子(AMG終止子)，來自米曲霉可使pyrG缺陷突變體生長的選擇性標記pyrG，和來自釀酒酵母可使PyrF缺陷大腸桿菌菌株DB6507生長的URA3標記。實施例11用于表達V039蛋白的曲霉屬質(zhì)粒pHUda667的說明為了表達和分泌蛋白V039，黑曲霉α-淀粉酶信號與V039融合。然后將基因克隆入曲霉屬表達盒pJaL790，產(chǎn)生質(zhì)粒pHUda667(SEQIDNO:20)。序列中的不同元件在下面的表2中描述。質(zhì)粒PHUda667是表達盒，其基于與構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶非翻譯前導(dǎo)序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II啟動子(Na2/tpi啟動子)和黑曲霉淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶終止子(AMG終止子)，來自構(gòu)巢曲霉可以以乙酰胺(aceteamid)作為唯一氮源生長的選擇性標記amdS，和來自釀酒酵母可使pyrF缺陷大腸桿菌菌株DB6507生長的URA3標記。25表2Pna2是來自黑曲霉的經(jīng)過修飾的中性淀粉酶II啟動子。tpi是構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)啟動子的5’非翻譯區(qū)。AA是微小根毛霉α-淀粉酶。Tamg是黑曲霉的淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶終止子。pUC19是包括復(fù)制起點的PUC19載體的片段。復(fù)制起始位點的起點(colEl起點)在位置7357。amdS是來自構(gòu)巢曲霉的乙酰胺基因(包括啟動子和終止子)。Pura3、URA3和Tura3分別是釀酒酵母URA3啟動子、編碼序列和終止子。實施例12&ΡΜ-8Φ表汰α-浦隨隨CBM艦舶隱隨纖白_聿如方法中所述用質(zhì)粒pHUda667轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株ΡΜ-8，方法進行如下修改用IOmM乙酰胺代替硝酸鈉，用于選擇能使用乙酰胺作為氮源的轉(zhuǎn)化子，并向選擇平板加入20mM尿苷，用于補足PM-8的pyrG陰性基因型。選擇一個可產(chǎn)生α-淀粉酶CBM融合蛋白的轉(zhuǎn)化子，并命名為JaL1182。實施例13自雜_舶__細白腫汰禾口α-浦ISCBM艦舶HffiSΡΜ-8如方法中所述用質(zhì)粒pHUda667和pHUda753轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株P(guān)M_8，方法進行如下修改用IOmM乙酰胺代替硝酸鈉，用于選擇能使用乙酰胺作為氮源的轉(zhuǎn)化子。選擇兩個可產(chǎn)生α-淀粉酶CBM融合蛋白和米曲霉抑制劑的轉(zhuǎn)化子，并命名為JaL1157和1158。實施例14曲霉屬菌株TaLl157、TaLl158和TaLl182中α-淀粉酶CBM融合蛋白的穩(wěn)定件將菌株JaL1157、JaL1158和JaL1182接種入100mlMLC培養(yǎng)基中并在30°C溫育2天。將十毫升MLC培養(yǎng)基接種入100mlMU-1培養(yǎng)基中并在30°C溫育7天。通過在3，OOOxg離心10分鐘而獲得上清。通過加入幾滴0.05MNaOH使上清的pH升高至pH6.5-7.0，并在40°C溫育7天。對溫育樣品進行SDS-PAGE分析。使用商業(yè)化的e-PAGEL凝膠E-T7.5L(ATT0Corporation)進行SDS聚丙烯酰胺電泳。將10μ1溫育的樣品懸浮于2Χ濃度的樣品緩沖液中(1%SDS，1%β-巰基乙醇，Img/ml溴酚藍，10%甘油，50mMTris-HCl{pH6.8})并煮沸5分鐘。將所有樣品載入到聚丙烯酰胺凝膠上，并在IXTrix/甘氨酸/SDS電泳緩沖液(25mMTris_HCl，0.1%SDS，192mM甘氨酸)中以20mA進行90分鐘電泳。用染料溶液(lg/L考馬斯亮藍，10%乙酸，30%甲醇)將得到的凝膠染色30分鐘，然后用脫色溶液(10%乙酸，30%甲醇)脫色，直至條帶清晰可見。對凝膠的觀察顯示，在不產(chǎn)生額外的ρ印C抑制劑的菌株JaL1182中，分別對應(yīng)于α-淀粉酶和CBM的降解產(chǎn)物清晰可見，而在菌株JaL1157和JaL1158中，觀察到的降解非常少。權(quán)利要求具有PepC抑制活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO6的成熟多肽具有至少85％，優(yōu)選至少90％，并且最優(yōu)選至少95％同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由在優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下序列雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO17中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由下述多核苷酸編碼所述多核苷酸包含與SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少至少85％，更優(yōu)選至少90％，并且最優(yōu)選至少95％同一性的核苷酸序列；(d)變體，包含取代、缺失和/或插入一個或幾個氨基酸的SEQIDNO6的成熟多肽。2.權(quán)利要求1的多肽，其包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或其具有P印C抑制活性的片段，或由SEQIDNO:6的氨基酸序列或其具有P印C抑制活性的片段組成。3.權(quán)利要求2的多肽，其包含SEQIDNO6的成熟多肽或由SEQIDNO6的成熟多肽組成。4.權(quán)利要求1-3中任一項的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:6的氨基酸18至89。5.用于在曲霉屬(Aspergillus)宿主細胞中產(chǎn)生目的異源多肽的方法，其包括(a)在有益于表達由第一和第二核酸序列編碼的多肽的條件下培養(yǎng)曲霉屬宿主細胞，所述細胞包含所述第一和第二核酸序列，并且其中第一核酸序列編碼目的異源多肽，而第二核酸編碼權(quán)利要求1-4的抑制劑多肽，并且其中抑制劑多肽由重組核酸構(gòu)建體表達，導(dǎo)致與不包含所述重組核酸構(gòu)建體的曲霉屬宿主細胞相比，抑制劑多肽的水平增加；和(b)回收所述異源多肽。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述曲霉屬宿主包括泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、棘抱(Aspergillusaculeatus)>HftI^JHftβ(Aspergillusnidulans)(Aspergillusoryzae)。7.根據(jù)權(quán)利要求5-6中任一項的方法，其中由所述重組核酸構(gòu)建體表達所述抑制劑受到組成型啟動子的控制。8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項的方法，其中所述異源多肽是抗體，優(yōu)選IgG。9.權(quán)利要求1-4中任一項的多肽用于枯草桿菌蛋白酶類型的絲氨酸蛋白酶的體外或體內(nèi)抑制的用途。10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述絲氨酸蛋白酶選自下組P印C和P印D，或它們的同源物。全文摘要本發(fā)明涉及具有PepC抑制活性的分離的多肽以及用于在曲霉屬宿主細胞中產(chǎn)生目的異源多肽的方法，包括(a)在有益于表達由第一和第二核酸序列編碼的多肽的條件下培養(yǎng)包含所述第一和第二核酸序列的曲霉屬宿主細胞，并且其中第一核酸序列編碼目的異源多肽，而第二核酸編碼本發(fā)明的抑制劑多肽，并且其中抑制劑多肽由重組核酸構(gòu)建體表達，所述核酸構(gòu)建體可使與不包含重組核酸構(gòu)建體的曲霉屬宿主細胞相比，抑制劑多肽的水平增加；和(b)回收所述異源多肽。文檔編號C07K14/38GK101889020SQ200880119501公開日2010年11月17日申請日期2008年12月2日優(yōu)先權(quán)日2007年12月6日發(fā)明者宇田川?；?簡·萊姆貝克申請人:諾維信公司