專利名稱：靶向vegfr-1/nrp-1的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子醫(yī)學(xué)和治療劑的靶向遞送領(lǐng)域。本發(fā)明更具體涉及新肽序列的鑒定，所述肽選擇性地靶向VEGFR-I和NRP-I作為治療靶點(diǎn)，來治療和檢測(cè)新血管或血管生成 VEGF相關(guān)的病癥，包括但不限于癌癥，肥胖癥，糖尿病，哮喘，關(guān)節(jié)炎，硬化和眼病2.相關(guān)技術(shù)說明血管是身體的必要組分，向幾乎所有器官和組織輸送氧氣和營(yíng)養(yǎng)。大部分血管形成于胚胎發(fā)育時(shí)期，成年后新血管的形成(這一過程叫做血管生成)受到限制，主要在創(chuàng)傷愈合和女性生理周期時(shí)發(fā)生。這對(duì)一些疾病的治療來說是一個(gè)機(jī)遇，因?yàn)橐坏┛烧T導(dǎo)形成新的血管，一些疾病就會(huì)發(fā)展；開發(fā)血管生成抑制劑，可使包括癌癥，肥胖癥，糖尿病，哮喘， 關(guān)節(jié)炎，硬化和眼病在內(nèi)的許多疾病發(fā)展減緩或阻斷。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)被視為是血管生成中的核心分子控制因子，美國(guó)食品和藥物管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了 3種抗VEGF的藥物用于特定類型的癌癥的治療，取得了良好，但不理想的治療效果(Kambaand McDonald, 2007) 0因此，研制新一代靶向于VEGF通路的藥物對(duì)多種疾病的治療有著重大意義。VEGF是血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，其通過結(jié)合細(xì)胞表面 VEGF酪氨酸激酶受體(VEGFR-1和-2)和neuropil in (NRP)來刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂和遷移。 由于VEGFR-2是VEGF有絲分裂細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要介質(zhì)，現(xiàn)在臨床中大部分藥物直接或間接作用于該受體。另外，起初認(rèn)為VEGFR-I和NRP-I是VEGF(VEGFR-I)的誘餌或結(jié)合槽(sink)，或是VEGFR-2活性的調(diào)節(jié)物(NRP-I)。然而，過去幾年的研究表明它們有其他作用。這些受體在血管生成中作用巨大(Carmeliet等人，2001 ;Autiero等人，2003 ;Luttun 等人，2004 ；Kaplan等人，2005 ；脅等人，2006 ；Pan等人，2007)，并且是血管生成治療的重要靴點(diǎn)。例如，直接作用于VEGFR-I和NRP-I的單克隆抗體已經(jīng)被認(rèn)為是有前途的抗腫瘤劑，特別是和化學(xué)療劑聯(lián)用(Wu等人，2006 ；Pan等人，2007)。許多抗VEGF 藥物，如貝伐珠單抗(Avastin )和 ranibizumab(Lucentis )，已用于臨床，其對(duì)新血管生成病癥(包括各種類型的癌癥，及影響眼的新血管生成疾病(如老年性黃斑變性))的治療和調(diào)控有一定的功效。不幸的是，該非特異的VEGF治療有著潛在的嚴(yán)重的副作用，特別是心臟相關(guān)的毒副作用(如，胸痛，中風(fēng)，輕度中風(fēng) (ministrokes)，充血性心力衰竭和心臟病，出血，蛋白尿，高血壓，充血性心力衰竭，動(dòng)脈血栓栓塞和胃腸穿孔)。一些研究認(rèn)為這些副作用與這些直接靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF-A ；VEGF165)的藥物有關(guān)，與選擇性靶向受體相反，這些藥物對(duì)正常的VEGF通路有不利影響(Betsholtz等人，2006)。VEGF-A在眾多被認(rèn)為調(diào)控血管生成的分子中具有特殊地位。胚胎發(fā)育時(shí)期，它控制許多發(fā)育過程，從血管系統(tǒng)最早的細(xì)胞前體的擴(kuò)展到內(nèi)皮細(xì)胞的增生和遷移，血管重塑和動(dòng)靜脈特化O^rraraJO(M)15 VEGF-A蛋白的正確水平對(duì)血管發(fā)育極為關(guān)鍵，因?yàn)樗谋磉_(dá)量減半或翻倍都是會(huì)使小鼠胚胎致死的條件。VEGF定向療法相關(guān)毒性被認(rèn)為與正常毛細(xì)血管床和含VEGF的心臟細(xì)胞失去有關(guān)，VEGF是正常細(xì)胞功能和血管化所必須的。有趣的是，依賴VEGF的毛細(xì)血管床享有共同特征，即表現(xiàn)出高表達(dá)被稱為2型和3型受體的VEGF受體(分別為VEGFR-2和VEGFR-3)， 還表現(xiàn)出少或無VEGFR-I受體。然而，在那些與期望的疾病靶點(diǎn)(包括視網(wǎng)膜血管和腫瘤血管系統(tǒng))有關(guān)的組織中發(fā)現(xiàn)有VEGFR-I受體的表達(dá)。因此，極需開發(fā)特異性靶向VEGFR-I 受體的抗VEGF療法，這些治療方法有望能在保持所需治療活性的同時(shí)減少毒副作用。本發(fā)明涉及提供選擇性靶向VEGFR-I的肽配體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過使用靶向基序LPR(Leu-Pro-Arg)(更優(yōu)選為D(LP 提供選擇性靶向 VEGFR-I和NRP-I (以下稱為“VEGFR-I/NRP-1”)的方法和組合物來克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。 通過使用UR基序選擇性靶向VEGFR-1/NRP-1可用于例如治療癌癥或其他與血管生成或血管生長(zhǎng)有關(guān)的疾病(如肥胖癥，糖尿病，哮喘，關(guān)節(jié)炎、硬化和眼病)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及分離的Lra靶向肽，就是說，靶向肽結(jié)構(gòu)中包含連續(xù)的LPR序列的肽，例如，所述LPR序列位于所述肽的氨基端或羧基端或者內(nèi)部。盡管認(rèn)為 UR序列位于末端最好，但認(rèn)為L(zhǎng)PR位于內(nèi)部也有靶向VEGFR-1/NRP-1的能力。為了便于制備和操作，本發(fā)明的某些實(shí)施方式涉及10個(gè)氨基酸或更小尺寸的分離的肽，至少包含連續(xù)的氨基酸序列Leu Pro Argo因此，即使更短的短肽，例如，7個(gè)或5個(gè)氨基酸，或者更小尺寸的肽，甚至是UR三肽本身會(huì)甚至更優(yōu)選。因此，本發(fā)明的靶向肽可含3、4、5、6、7、8、9或 10個(gè)氨基酸，其中，連續(xù)的LPR序列或SEQ ID NO 1的序列位于其中。在另一些特定實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及合并了可被制成環(huán)形的UR序列的特定肽，例如兩端具有半胱氨酸殘基(“C”)的肽，如果需要，可例如通過形成二-半胱氨酸(即胱氨酸)將其以環(huán)形提供。該肽的一例為Cys Leu Pro Arg Cys (SEQ ID NO :1)。該環(huán)肽可能由于二硫鍵的作用使得它們對(duì)化學(xué)、溫度或酶解有顯著的穩(wěn)定性。考慮到可用性差，易受蛋白水解和體內(nèi)半衰期短這些問題，該環(huán)肽在治療和診斷中可能有特別的重要作用。另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及D氨基酸用于制備上述肽的全部或部分的用途。 與L型氨基酸構(gòu)成的肽相比，D氨基酸構(gòu)成的肽有特定的優(yōu)勢(shì)，D氨基酸的使用使本發(fā)明的靶向肽能抵抗蛋白酶和肽酶的作用。本發(fā)明這方面尤其優(yōu)選完全由D氨基酸構(gòu)成的靶向肽，如 D (LeuPro Arg)禾口 D (Cys Leu Pro Arg Cys) (SEQ ID NO :1)。某些實(shí)施方式中，UR靶向部分，如前所述，可與第二分子或物質(zhì)有效綴合。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該結(jié)合為共價(jià)結(jié)合，如化學(xué)綴合物(如，通過用化學(xué)接頭形成)或融合構(gòu)建體(如，通過將編碼融合肽的核酸編碼區(qū)與編碼期望靶向VEGFR-1/NRP-1的期望蛋白或肽的核酸編碼區(qū)框內(nèi)融合而形成)所例示。在靶向蛋白或肽中，靶向肽可位于或鄰近期望靶向的蛋白或肽的氨基端或羧基端(即頭20個(gè)或末20個(gè)氨基酸內(nèi))。在各選定的實(shí)施方式中，所述第二分子或物質(zhì)是診斷劑、藥物、化學(xué)治療劑、放射性同位素、抗血管生成劑、促凋亡劑、細(xì)胞毒性劑、肽、蛋白質(zhì)、激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、抗生素、抗體或片段或單鏈抗體、顯像劑、存活因子、抗凋亡劑、激素拮抗劑或抗原。這些分子或物質(zhì)僅為代表，實(shí)際上可將任何可在癌癥治療中產(chǎn)生治療或診斷益處的分子附著于LPR 靶向部分，且/或在本發(fā)明的范圍內(nèi)施用于受試者。因此，當(dāng)待靶向分子是促凋亡劑時(shí)，例示制劑包括依托泊苷、神經(jīng)酰胺鞘磷脂、 Bcl-2、Bax, Bid、Bik、Bad、細(xì)胞凋亡蛋白酶-3，細(xì)胞凋亡蛋白酶-8，細(xì)胞凋亡蛋白酶-9， fas, fas fadd> fap-l> tradd> faf> rip> reaper JJl￠: (apoptin)，^ΜΜ ΥΜ "2 轉(zhuǎn)化酶，膜聯(lián)蛋白 V、(KLAKLAK)2 (SEQ ID NO :2)、(KLAKKLA) 2 (SEQ ID NO :3)、(KAAKKAA) 2 (SEQ ID NO: 4)、或(KLGKKLG)3 (SEQ ID NO :5)。需知，對(duì)于本發(fā)明的全部肽，如上所述的序列可以 D型和L型提供。例如，對(duì)促凋亡肽(如，SEQ ID NO :2 5)而言，認(rèn)為D型和L型均有著相似的促凋亡活性，但D型由于其相關(guān)的蛋白酶抗性而有基本上更長(zhǎng)的半衰期。然而，某些情況下，L型由于潛在的降低的毒副作用(由于其較短的半衰期)而在實(shí)踐中更有優(yōu)勢(shì)。此外，在待靶向分子是抗血管生成劑的實(shí)施方式中，例示制劑包括凝血酶敏感蛋白、血管抑素(如血管抑素幻、血管緊張素、層粘連蛋白肽、纖維連接蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素12)、血小板因子4、 IP-10、Gro-β、2-甲氧基雌二醇、增生蛋白相關(guān)蛋白、羧基氨基三唑、CM101、馬立馬司他、 戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2 (Regeneron)，除莠霉素A，PNU145156E、16Κ催乳素片段、利諾胺、沙立度胺、己酮可可堿、染料木黃酮、ΤΝΡ-470、內(nèi)皮抑素(如內(nèi)皮抑素XVII和XV)、紫杉醇、多西紫杉醇)、多胺、蛋白酶抑制劑、激酶抑制劑、信號(hào)肽、accutin、西多福韋、長(zhǎng)春新堿、博來霉素、AGM-1470、米諾環(huán)素、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的C端血液結(jié)合素結(jié)構(gòu)域、人纖溶酶原kringle 5結(jié)構(gòu)域、內(nèi)皮抑素和血管抑素的融合蛋白、內(nèi)皮抑素和人纖溶酶原kringle 5結(jié)構(gòu)域的融合蛋白、干擾素-Y誘導(dǎo)的單核因子(Mig)、Mig和IPlO的融合蛋白、可溶性FLT-I (鰭樣酪氨酸激酶1受體)、激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)、色素上皮衍生因子、干擾素-α (第 4 線干擾素)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑(SU5416、SU6668，Sugen, South SanFrancisco, CA)。另一些優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)靶向分子是細(xì)胞因子時(shí)，例示細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素 1 (IL-I)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-IU IL-12、IL-18、IL-24、干擾素-y (INF- γ )、干擾素- α、干擾素-β、腫瘤壞死因子(如TNF-α )、或GM_CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)。上述例子僅為代表，并不旨在排除其他本領(lǐng)域中已知的促凋亡劑、抗血管生成劑或細(xì)胞因子。本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述分離的肽可附著于高分子復(fù)合物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述高分子復(fù)合物是病毒、噬菌體、細(xì)菌、脂質(zhì)體、微顆粒、納米顆粒(例如金納米顆粒)、磁珠、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。當(dāng)為病毒時(shí)，尤其優(yōu)選包括噬菌體、慢病毒、乳多空病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、AAV、牛痘病毒或皰疹病毒。這只是代表性例子，本發(fā)明范圍內(nèi)的高分子復(fù)合物可包括實(shí)際上任何可附著靶向肽并施用于受試者的高分子復(fù)合物。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，所述分離的肽可附著于真核表達(dá)載體，更優(yōu)選為基因治療載體。再一實(shí)施方式中，所述分離的肽可附著于固體支持物，優(yōu)選為磁珠，Sepharose珠、瓊脂糖珠、硝酸纖維素膜、尼龍膜、柱層析基質(zhì)、高效液相色譜(HPLC)基質(zhì)、快速高效液相色譜法(FPLC)基質(zhì)、微孔板或微芯片。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及蛋白融合構(gòu)建體，其含上述UR靶向肽中的任一種， 所述靶向肽融合選定蛋白融合形成蛋白融合構(gòu)建體，所得到的蛋白融合構(gòu)建體(其特征在于還包括UR靶向部分)優(yōu)選為人造的，而不是天然存在的蛋白。一般而言，在所述優(yōu)選的實(shí)施方式中，可用任何上述類別的分子來制備所述蛋白融合構(gòu)建體。另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及VEGFR-1/NRP-1靶向構(gòu)建體的制備，其包括獲得上述UR靶向肽，及將所述肽附著(優(yōu)選通過共價(jià)附著)于分子，以制備所述構(gòu)建體。如上所述，當(dāng)所述待靶向分子是蛋白或肽時(shí)，優(yōu)選的靶向構(gòu)建體將是所述靶向肽附著于所述分子的氨基端或羧基端的靶向構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及將分子或蛋白遞送靶向表達(dá)VEGFR-I或NRP-I的細(xì)胞的方法，其中所述方法包括獲得上述UR靶向肽或上述蛋白融合構(gòu)建體，或著如上所述制備的靶向構(gòu)建體，及將所述肽或蛋白融合構(gòu)建體施用于細(xì)胞群，由此將所述分子或蛋白遞送到所述細(xì)胞，其中所述群包括表達(dá)VEGFR-I或NRP-I的細(xì)胞。一般而言，當(dāng)所述綴合物或融合蛋白旨在應(yīng)用于受試者(如人受試者)的診斷和治療時(shí)，將所述綴合物或融合蛋白配于藥物可接受的組合物中，并將所述組合物施用于所述受試者。認(rèn)為在治療患有疾病或病癥的患者時(shí)，所述受試者一般會(huì)需要抗血管生成治療。 所述疾病或病癥包括過度增生疾病、體重失調(diào)、肥胖癥、糖尿病、哮喘、關(guān)節(jié)炎，硬化或眼病。認(rèn)為可用本發(fā)明的治療性綴合物治療例示過度增生疾病，所述過度增生疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、骨關(guān)節(jié)炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纖維瘤、血管閉塞、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、瘤前病變(如腺瘤性增生和前列腺內(nèi)上皮瘤)、原位癌、口腔毛狀白斑、 或牛皮癬。本發(fā)明還包括，本發(fā)明的綴合物可用于許多癌癥的治療，尤其是那些高度血管生成性癌癥。例示癌癥包括牙齦癌、舌癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、眼癌、腦癌、白血病、間皮瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、子宮頸癌、肝癌、子宮頸癌、頭頸部癌、骨癌、食道癌、子宮癌、膀胱癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌、肉瘤，胃癌、和膀胱癌。另一些實(shí)施方式中，認(rèn)為待治療受試者患有以眼內(nèi)細(xì)胞增生或新血管生成為特征的眼疾病或病癥。例示病癥包括老年性黃斑變性、增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變，眼部缺血綜合征引起的新血管生成、視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞引起的新血管生成、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞引起的新血管生成、或鐮狀細(xì)胞視網(wǎng)膜病變引起的新血管生成。另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括，本發(fā)明的綴合物可用于治療體重失調(diào)(如肥胖癥)。附圖簡(jiǎn)述

圖1A、IB. D (LPR)抑制體內(nèi)新血管生成。移植7天后含500 μ g/ml的D (LPR)或?qū)φ针牡幕|(zhì)膠填料的代表圖(a，下圖)。切斷基質(zhì)膠填料，并通過測(cè)量基質(zhì)膠填料中的血紅蛋白含量來定量血管形成。柱形圖表示同一實(shí)驗(yàn)中的代表性動(dòng)物(a，上圖)。(b)人von Willebrand因子血管陽性的數(shù)量(P < 0. 01)。
圖2A，2B，2C. D(LPR)抑制局部缺血誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管生成。(a)通過暴露于75%的氧，再用D (LPR)處理(每天以20mg/Kg進(jìn)行注射)來在 C57B6新生小鼠中誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新血管生成。(b)H&E視網(wǎng)膜切片(P19天)表明，與對(duì)照動(dòng)物相比，視網(wǎng)膜內(nèi)表面(箭頭所指) 新血管的形成顯著降低。(C)在P19天內(nèi)表面內(nèi)皮細(xì)胞核定量。圖3A，3B.用D(LPR)治療攜腫瘤小鼠降低腫瘤生長(zhǎng)。將攜帶源于EF43. fgf4的腫瘤的Balb/c小鼠分組(N = 7)，并每天用50mg/Kg的D (LPR)或其環(huán)狀形式D (CLPR)、對(duì)照肽或僅媒質(zhì)處理。(a)處理5天后，接收D (LPR)或其環(huán)狀形式D (CLPRC)的動(dòng)物與對(duì)照組相比腫瘤體積減小，(b)盒型圖代表中值和方差。接收D(LPR)或其環(huán)狀形式D(CLPRC)的動(dòng)物之間的腫瘤體積差異顯著(P < 0. 02)。兩組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果相似。圖4A，4B，4C.用VEGF模擬化合物D (CLPRC)對(duì)肥胖癥的治療。將喂了高熱量高脂肪的食物的肥胖癥小鼠(C57BL/6)(體重在40 50g之間)用于該研究。將動(dòng)物分成4組， 每天經(jīng)以下處理(a)腹膜內(nèi)注射 VEGF-模擬肽 D (CLPRC) (50mg/Kg)；(b)以 lmg/Kg 皮下注射脂肪除手(Fat-zapper)肽(CKGGRAKDC_GG_d (KLAKLAK) 2 ； Kolonin 等人，2004)，聯(lián)合以 50mg/Kg 注射 VEGF 模擬肽 D (CLPRC)；或(c):3mg/Kg 的脂肪除手。 對(duì)照組動(dòng)物僅注射媒質(zhì)(磷酸鹽緩沖溶液，PBS)。實(shí)施方式1.概述由組合庫(kù)鑒定的肽是藥物發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)的重要線索。他們易于合成，并易于經(jīng)各種官能團(tuán)修飾，為科學(xué)和醫(yī)學(xué)提供了有效的工具來合理地設(shè)計(jì)藥物和選擇性靶向。由于與高分子(如抗體)相比較小的分子量，這些肽在組織滲透性和生物分布上有優(yōu)勢(shì)，從而使它們成為藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的出色的潛在化合物(見!^lciani等人的總述，2005)。事實(shí)上，已將通過噬菌體展示鑒定的肽成功用于體內(nèi)靶向治療，以遞送化學(xué)治療物(Arap，1998#10)、促凋亡肽(Ellerby，1999#69)，或遞送病毒來成像和進(jìn)行基因治療(Hajitou，2006#6744)。然而，它們?cè)谒幬镩_發(fā)中的應(yīng)用受到各種困難的阻礙。肽通常不是合適的藥物，因?yàn)樗鼈兒芸毂坏鞍酌附到舛鴱难獫{中清除。在需要細(xì)胞增生、遷移和組織重塑(常見于大多數(shù)生理學(xué)過程，如血管生成)的生物過程中，蛋白酶表達(dá)經(jīng)常上調(diào)，導(dǎo)致局部蛋白水解活性上升和肽降解。從藥物設(shè)計(jì)的角度上看，肽常表現(xiàn)出廣泛的構(gòu)象變異，使得結(jié)構(gòu)研究非常困難(Giordano等人，2005)。因此，基于通過噬菌體展示鑒定的潛在肽的肽模擬化合物的設(shè)計(jì)是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，并且經(jīng)常局限于有合成能力和大量化合物庫(kù)的制藥公司和實(shí)驗(yàn)室。血管生成是從原有血管的新血管萌發(fā)，并且是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移(Folkman， 1971)及多種病理病癥(例如糖尿病、牛皮癬、肥胖癥、和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的必要因素 (Carmeliet,2005)o成年人的血管生成僅在傷口愈合、懷孕和月經(jīng)周期時(shí)發(fā)生，因此，靶向血管生成血管的藥物可對(duì)許多疾病有著重要的臨床應(yīng)用(Carmeliet等人，200 。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體是該領(lǐng)域關(guān)注的中心，因?yàn)樗鼈冊(cè)谘馨l(fā)育中用關(guān)鍵作用。VEGF通過結(jié)合酪氨酸激酶受體(VEGFR-1，VEGFR-2)和neuropilin_l (NRP-I)發(fā)揮作用(Olsson等人，2006)。VEGF對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和有絲分裂的大部分影響是由VEGFR-2介導(dǎo)的，多種靶向這一通路的藥物正在臨床中進(jìn)行研究(Cardones和Banez，2006 ；Schneider 和Sledge，2007)。雖然VEGFR-I和NRP-I是這一過程中重要的參與者，但起初并沒有得到足夠的重視，將其視為潛在的治療靶點(diǎn)。過去幾年已經(jīng)改變了這一看法，并且研究提示兩種受體在血管生成中有重要作用(Luttun等人，2004 ；脅等人，2006 ;Pan等人，2007)?；蛉笔а芯勘砻鱒EGFR-I和NPR-I是血管發(fā)育所必需的。兩種分子是VEGF和胎盤生長(zhǎng)因子 (PIGF)的受體，且后者與VEGFR-I綴合，參與病理性血管生成(Carmeliet等人，2001)、腫瘤生長(zhǎng)(Luttun等人，2002)，由VEGFR-1/VEGFR-2交叉激活的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)(Autiero等人，2003)、及新血管生成時(shí)源于骨髓的前體細(xì)胞募集(Jin et al,2006 ；Li等人，2006)。最近的報(bào)道已經(jīng)提示=VEGFRl+造血細(xì)胞前體的募集對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的起始很重要(Kaplan等人， 2005)。同樣，NRP-I不僅能增強(qiáng)VEGF和VEGFR-2的結(jié)合(Soker等人，2002)，還誘導(dǎo)不依賴于VEGFR-2活化的內(nèi)皮細(xì)胞附著和遷移(Wang等人，2003 ；Murga等人，2005)。針對(duì)NRP-I 的VEGF結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體和針對(duì)VEGFR-I的單克隆抗體都能抑制血管生成和降低腫瘤生長(zhǎng)(Wu等人，2006 ；Pan等人，2007)。因此，靶向VEGFR-I和NRP-I通路的藥物可能在臨床中有重要應(yīng)用。本發(fā)明提供了獨(dú)特的血管生成抑制劑和VEGFR-I靶向劑，LPR和D (LPR)，它們?cè)谌N不同檢測(cè)中表現(xiàn)出顯著降低血管生成。D(LPR)在全身施用后還能抑制兩種動(dòng)物模型中的新血管生成。由于D(LPR)具有抵抗胰酶混合物的降解的耐受性，這些數(shù)據(jù)表明，此化合物，及合并該序列的更大肽結(jié)構(gòu)可明顯存活于消化道中，并可口服施用于患者。因此，本發(fā)明通過鑒定UR基序來克服了現(xiàn)有技術(shù)中的困難，所述基序用于制備選擇性靶向VEGFR-I/ NRP-I的組合物、治療劑或診斷劑，如用于治療和/或檢測(cè)新血管或血管生成的VEGF相關(guān)的病癥，所述病癥包括但不限于癌癥、肥胖癥、糖尿病、哮喘、關(guān)節(jié)炎、硬化和眼病。在某些實(shí)施方式中，本明涉及靶向表達(dá)VEGFR-1/NPR-1的細(xì)胞的特定靶向部分， 包括最一般的肽，多肽和蛋白質(zhì)，它們經(jīng)修飾而包含UR基序，所述UR基序或位于內(nèi)部，或者更優(yōu)選位于或鄰近所述肽或蛋白的N端或C端。雖然由于基本上耐受蛋白酶的降解作用的抗性而優(yōu)選D氨基酸形式，但是本發(fā)明并不排除次優(yōu)選的L型氨基酸，或D氨基酸和L 氨基酸的混合物的使用。特定實(shí)施方式涉及與治療劑或診斷劑有效偶聯(lián)的VEGFR-1/NPR-1 靶向部分。某些實(shí)施方式中，治療劑是病毒，所述病毒可經(jīng)改造而表達(dá)VEGFR-1/NPR-1靶向肽，或者合并有VEGFR-1/NPR-1靶向肽，或所述病毒包膜或纖維蛋白結(jié)合有VEGFR-1/NPR-1 靶向肽。靶向病毒可用于包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的基因治療。用肽，經(jīng)修飾的肽，抗體， 病毒和/或其他親和制劑選擇性靶向腫瘤中和/或腫瘤附近的的血管中的VEGFR-1/NPR-1 的能力提供了治療癌癥的顯著優(yōu)勢(shì)，可得到提高的功效和潛力。2.定義說明書中所提到的“a”或“an”可表示一個(gè)或多個(gè)、一種或多種。如權(quán)利要求中所提到的，與“包含”結(jié)合使用的表述“a”或“皿”可表示一個(gè)或多于一個(gè)、一種或多于一種。 這里提到的“another”可表示至少有另一個(gè)或更多個(gè)、另一種或更多種。
“靶向部分”為包括各種類型的親和制劑的術(shù)語，可用來增強(qiáng)物質(zhì)向動(dòng)物特定部位的定位和結(jié)合，所述動(dòng)物特定部位包括器官、組織、特定細(xì)胞類型、病變組織或腫瘤。靶向部分可包括肽、肽模擬物、多肽、抗體、抗體樣分子、核酸、適體，及它們的片段。靶向部分還包括小分子。在某些實(shí)施方式中，靶向部分可增強(qiáng)物質(zhì)向胞外表達(dá)VEGFR-1/NRP-1 (即 VEGFR-1/NRP-1結(jié)合在細(xì)胞表面或結(jié)合在周圍的細(xì)胞外基質(zhì))的細(xì)胞的定位。本發(fā)明靶向部分(例如靶向肽及其變體和片段)的選擇性結(jié)合指所述靶向部分結(jié)合靶(如VEGFR-I/ NRP-1)而不顯著結(jié)合無關(guān)蛋白。即使靶向部分也結(jié)合其他不與所述靶基本上同源的蛋白， 只要所述蛋白與所述抗體肽靶的片段或結(jié)構(gòu)域享有同源性，則所述靶向部分仍被認(rèn)為是選擇性結(jié)合。在這種情況下，可知，盡管有一些交叉反應(yīng)，但靶向部分與靶的結(jié)合仍是選擇性的。通常，交叉反應(yīng)程度是可測(cè)定的，并可與結(jié)合靶區(qū)分開來。靶向部分是含一連續(xù)的UR氨基酸序列的肽，其特征在于選擇性定位于器官、組織或細(xì)胞類型，其包括特異性結(jié)合在特定組織或細(xì)胞類型中特異性表達(dá)或產(chǎn)生的細(xì)胞外蛋白或分子。選擇性定位是可用例如以下方法測(cè)定，其中將所述推定的靶向肽序列合并到在噬菌體外表面展示的蛋白?！笆茉囌摺币话阒覆溉閯?dòng)物。在某些實(shí)施方式中，所述受試者是小鼠、兔、豬、馬、 牛、貓、狗、綿羊、山羊、或靈長(zhǎng)類動(dòng)物。在特定實(shí)施方式中，所述受試者是人。3.蛋白和肽在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及至少包含一種蛋白或肽的新組合物。本文中所用的蛋白或肽通常(但不局限于此)是指大小約200個(gè)氨基酸至由基因翻譯出的全場(chǎng)序列的蛋白；大于約100個(gè)氨基酸的多肽；和/或約3個(gè) 約100個(gè)氨基酸的肽。方便起見，術(shù)語 “蛋白”、“多肽”和“肽”可互換使用。某些實(shí)施方式中，至少一種蛋白或肽的大小可包括，但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、約 110、約 120、約 130、約 140、約 150、約 160、約 170、約 180、約 190、約 200、約 210、約 220、約 230、約 240、約 250、約 275、約 300、約 325、約 350、約 375、約 400、約 425、約 450、約 475、約 500、約 525、約 550、約 575、約 600、約 625、約 650、約 675、約 700、約 725、約 750、約 775、約 800、約 825、約 850、約 875、約 900、約 925、約 950、約 975、約 1000、約 1100、約 1200、約 1300、約 1400、約 1500、約 1750、 約2000、約2250、約2500或更多氨基酸殘基，或介于它們中的任意氨基酸殘基范圍(如，約 200 約2500個(gè)氨基酸殘基)。本文所述“氨基酸殘基”指任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或本領(lǐng)域已知的任何氨基酸模擬物。在某些實(shí)施方式中，蛋白或肽的殘基是連續(xù)的，沒有任何非氨基酸隔斷所述氨基酸殘基序列。在另一些實(shí)施方式中，該序列可含一個(gè)或多個(gè)非氨基酸部分。在特定實(shí)施方式中，蛋白或肽的殘基序列可被一個(gè)或多個(gè)非氨基酸部分隔斷。因此，“蛋白或肽”涵蓋含天然存在的蛋白中發(fā)現(xiàn)的20種常見氨基酸中的至少一種，或者至少一種經(jīng)修飾的或不常見的氨基酸的氨基酸序列，所述經(jīng)修飾的或不常見的氨基酸包括但不限于Aad，2-氨基己二酸^tAsn, N-乙基天冬酰胺；Baad，3-氨基己二酸，Hyl，羥賴氨酸；Bala，β -丙氨酸，β _氨基-丙酸；AHyl，別羥賴氨酸；Abu，2-氨基丁酸； 3Hyp，3-羥脯氨酸；4Abu，4-氨基丁酸，哌啶酸；4Hyp，4_羥脯氨酸；Acp，6_氨基己酸，Ide, 異鎖鏈賴氨酸；Ahe，2-氨基庚酸；Alle，別異亮氨酸；Aib，2_氨基異丁酸；MeGly，N_甲基甘氨酸，肌氨酸；Baib，3_氨基異丁酸；Melle，N-甲基異亮氨酸；Apm，2_氨基庚二酸；MeLys， 6-N-甲基賴氨酸；Dbu，2，4-二氨基丁酸；MeVal，N-甲基纈氨酸；Des，鎖鏈賴氨酸；Nva，正纈氨酸；Dpm，2，2’ - 二氨基庚二酸；Nle，正亮氨酸；Dpr，2，3- 二氨基丙酸；Orn，鳥氨酸；和 EtGly, N-乙基甘氨酸?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意技術(shù)來制備蛋白或肽，所述技術(shù)包括用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白、多肽或肽，從天然源分離蛋白或肽，或者化學(xué)合成蛋白或肽。對(duì)應(yīng)于各基因的核酸和蛋白、多肽和肽序列已于上述，且可見于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)中。所述數(shù)據(jù)庫(kù)之一是美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的Genbank和GenP印t數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址是ncbi.nlm.nih.gov)。已知基因的編碼區(qū)可用本文所述技術(shù)或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的技術(shù)來擴(kuò)增和/或表達(dá)。另外，蛋白、多肽和肽的各種商業(yè)制劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。4.融合蛋白蛋白綴合的其他實(shí)施方式涉及融合蛋白。這些分子通常具有靶向肽(如UR靶向肽)的全部或?qū)嵸|(zhì)性部分，在N端或C端和第二多肽或蛋白的全部或部分相連。例如，融合可使用來自其他物種的前導(dǎo)序列，使蛋白在異源宿體中重組表達(dá)。另一種可用的融合包括添加免疫活性域(例如抗體表位)，來例如促進(jìn)融合蛋白的純化。包括位于或鄰近融合接頭的斷裂位點(diǎn)會(huì)促進(jìn)純化后外來多肽的去除。其他有用的融合包括功能結(jié)構(gòu)域的連接， 例如來自酶的活性位點(diǎn)、糖基化結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞靶向信號(hào)或跨膜區(qū)域。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白含與治療性蛋白或肽連接的UR靶向肽?？刹⑷肴诤系鞍椎牡鞍踪|(zhì)或肽例包括細(xì)胞生長(zhǎng)抑制蛋白、殺細(xì)胞蛋白、促凋亡劑、抗血管生成劑、激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、肽藥、抗體、Fab片段抗體、抗原、受體蛋白、酶、凝集素、MHC蛋白、細(xì)胞粘附蛋白和結(jié)合蛋白。這些例子不旨在限制，認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，實(shí)際上任何蛋白或肽均可并入含靶向肽的融合蛋白中。制備融合蛋白的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。所述蛋白可例如通過用雙官能團(tuán)交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)附著，從頭合成整個(gè)融合蛋白，或通過將編碼靶向肽的DNA序列附著于編碼第二蛋白或肽的DNA序列后再表達(dá)完整的融合蛋白來得到。5.蛋白純化一些實(shí)施方式中蛋白或肽可能要進(jìn)行分離或純化。蛋白純化技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。首先，這些技術(shù)包括對(duì)細(xì)胞，組織或器官的攪勻及粗分級(jí)分離成多肽和非多肽級(jí)分。可用層析和電泳技術(shù)進(jìn)一步分離目的蛋白或多肽，以達(dá)到部分或完全純化(或純化至均一)。尤其適于制備純肽的分析方法是離子交換層析、凝膠排阻層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、親和層析、免疫親和層析和等電聚焦。美國(guó)專利5，206，347公開了用親和層析純化受體蛋白的例子，將其全文通過引用并入本文。特別有效的純化肽的方法是快速液相色譜法 (FPLC)，或甚至是高效液相色譜(HPLC)。純化的蛋白或肽本來是指和其他組分分離的組合物，其中所述蛋白或肽被純化到相對(duì)其天然存在狀態(tài)的任意程度。因此，分離或純化的蛋白或肽還指從其天然存在環(huán)境游離的蛋白或肽。通常，“純化”意味著已經(jīng)分級(jí)分離而除去各種其他組分的蛋白或肽組合物，且該組合物基本上保留其表達(dá)的生物活性。術(shù)語“基本上純化的”是指蛋白或肽形成所述組合物的主要成分的組合物，例如所述所述蛋白占所述組合物的約50%、約60%、約70%、 約80%、約90%、約95%、或者更多。根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知各種用于定量蛋白或肽的純化程度的方法。這些包括例如，測(cè)定活性級(jí)分的比活，或用SDS/PAGE分析估計(jì)級(jí)分中多肽的量。估計(jì)級(jí)分純度的優(yōu)選方法是計(jì)算所述級(jí)分的比活，以將其與初始提取物的比活進(jìn)行比較，從而計(jì)算出純化的程度，估計(jì)為“_純化倍數(shù)”。當(dāng)然，實(shí)際用來表示活性的量的單位取決于用來純化的特定檢測(cè)技術(shù)，及表達(dá)的蛋白或肽是否表現(xiàn)出可檢測(cè)的活性。適合于蛋白純化的各種技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些包括例如，用硫酸銨、 PEG、抗體等，或用熱變性進(jìn)行沉淀，隨后進(jìn)行離心、層析步驟(如離子交換層析、凝膠過濾層析、反相層析、羥基磷灰石層析和親和層析)、等電聚焦、凝膠電泳、以及這些和其他技術(shù)的組合。本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，進(jìn)行各純化步驟的順序可改變，某些步驟可省去，仍然可得到合適的制備基本上純化的蛋白或肽的方法。一般并沒有要求蛋白或肽總是達(dá)到最純凈的狀態(tài)。事實(shí)上，某些實(shí)施方式中次基本上純化的產(chǎn)物也實(shí)用。組合使用較少純化步驟，或利用不同形式的同一純化方案可實(shí)現(xiàn)部分純化。例如，用HPLC設(shè)備進(jìn)行陽離子交換柱層析能比用低壓層析系統(tǒng)進(jìn)行的同一技術(shù)得到更高倍數(shù)的純化。表現(xiàn)出較低程度相對(duì)純化的方法在蛋白產(chǎn)物的總回收率，或在維持表達(dá)蛋白的活性方面有優(yōu)勢(shì)。親和層析是依賴于待分離物質(zhì)和其特異性結(jié)合的分子之間的特異親和性的層析方法。這是受體-配體型相互作用。柱材料通過共價(jià)偶聯(lián)結(jié)合偶體之一與不溶性基質(zhì)來合成。株材料則可特異性吸附溶液中的物質(zhì)。通過將條件變化為不發(fā)生結(jié)合的條件(例如， 改變的PH、離子強(qiáng)度、溫度等)來進(jìn)行洗脫。所述基質(zhì)本身應(yīng)為不以任何顯著程度吸收分子，并有廣泛的化學(xué)、物理和熱穩(wěn)定性的物質(zhì)。應(yīng)以不影響其結(jié)合特性的方式偶聯(lián)配體。配體也應(yīng)該提供相對(duì)緊密地結(jié)合。且它也應(yīng)該能在不損傷樣品或配體的前提下洗脫物質(zhì)。6.合成肽由于它們的體積較小，本發(fā)明的靶向肽可根據(jù)常規(guī)技術(shù)在溶液中或在固體支持物上合成。各種自動(dòng)合成儀已可商購(gòu)，且可根據(jù)移植操作方法使用。例如，見于Mewart and Young, 1984 ；Tam 等人，1983 ；Merrifield, 1986 ；Barany and Merrifield, 1979，將它們各通過引用并入本文?？捎盟龇椒ㄒ子诤铣啥坞男蛄?通常約6個(gè)到約35個(gè) 50個(gè)氨基酸)。另外，可用重組DNA技術(shù)，其中將編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列插入到表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞，并在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)。7.治療或診斷綴合物用這些方法鑒定的靶向部分可偶聯(lián)或附著于各種物質(zhì)(包括治療劑或診斷劑)， 用于將所述綴合物選擇性遞送到小鼠模型系統(tǒng)中期望的器官、組織或細(xì)胞類型中。例如， 在攜腫瘤的小鼠模型中，將化學(xué)治療劑和促凋亡肽靶向遞送到位于腫瘤血管生成血管系統(tǒng)中的受體，導(dǎo)致治療功效顯著提高，全身毒性顯著降低(Arap等人，1998 ；Ellerby等人， 1999)。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及與各種疾病狀態(tài)相關(guān)的新血管生成(如腫瘤血管系統(tǒng))的治療。除腫瘤生長(zhǎng)外，血管生成在其他疾病中也是重要的。不受控制的血管生成促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、子宮內(nèi)膜異位癥、老年性黃斑變性和牛皮癬的發(fā)展。血管的生長(zhǎng)引起血管瘤形成和動(dòng)靜脈畸形，其導(dǎo)致多種臨床問題，所述問題從化妝品并發(fā)癥到危及生命的出血。本發(fā)明的實(shí)施方式還涉及這些例示疾病狀態(tài)以及其他與新血管生成有關(guān)的疾病狀態(tài)的治療。另外，VEGFR-1/NRP-1的上調(diào)或促進(jìn)血管生成的物質(zhì)的靶向可用于促進(jìn)血管生成。 VEGFR-I/NRP-I的上調(diào)可通過VEGFR-I (即Flt-I)或NRP-I轉(zhuǎn)基因的遞送來實(shí)現(xiàn)，這轉(zhuǎn)而可用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的基因治療載體來遞送。A.細(xì)胞因子和趨化因子在某些實(shí)施方式中，期望將特異性生物活性劑偶聯(lián)到一種或多種靶向部分，用于靶向遞送至器官、組織或細(xì)胞類型。所述制劑包括但不限于細(xì)胞因子、趨化因子、促凋亡因子和抗血管生成因子?！凹?xì)胞因子”是由一種細(xì)胞群釋放的蛋白的總稱，其作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于其他細(xì)胞。所述細(xì)胞因子的例子是淋巴因子、單核因子、生長(zhǎng)因子和傳統(tǒng)的多肽激素。所包括的細(xì)胞因子中有生長(zhǎng)激素(如人生長(zhǎng)激素、N-甲硫胺?；松L(zhǎng)激素、和牛生長(zhǎng)激素)、 甲狀旁腺激素、甲狀腺素、胰島素、前胰島素、松弛素、前松弛素、糖蛋白激素(如卵泡刺激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH))、肝生長(zhǎng)因子、前列腺素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、催乳素、胎盤催乳素、OB蛋白、腫瘤壞死因子-α和_β、副中腎管抑制物質(zhì)、小鼠促性腺激素相關(guān)肽、抑制素、激活素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、整合素、血小板生成素(TPO)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(如NGF- β )、血小板生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)(如TGF- α和TGF- β )、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、骨誘導(dǎo)因素、干擾素(如干擾素-α、_β、 和-Y )、集落刺激因子(CSF)(如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF) 和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF))、白細(xì)胞介素(IL)(如 IL-UIL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、LIF、 G-CSF, GM-CSF、M-CSF、ΕΡ0、kit-配體或Flt_3、血管抑素、凝血酶敏感蛋白、內(nèi)皮抑素、腫瘤壞死因子、和LT。本文所述“細(xì)胞因子”包括天然來源的蛋白或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白和天然序列細(xì)胞因子的生物活性等同物的蛋白。趨化因子一般作為化學(xué)引誘物吸引免疫效應(yīng)細(xì)胞到達(dá)趨化因子的表達(dá)位點(diǎn)。這有利于特定趨化因子基因與例如細(xì)胞因子基因的聯(lián)合表達(dá)，以增加其他免疫系統(tǒng)成分募集到治療位點(diǎn)。趨化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIPl-a、MIPl-β、和ΙΡ-10。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到一些細(xì)胞因子也有化學(xué)吸引作用，并且也能稱之為趨化因子。B.顯像劑和放射性同位素在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的靶向部分可附著于顯像劑，所述顯像劑用于各種病變器官、組織或細(xì)胞類型的顯像和診斷。本領(lǐng)域已知到許多合適的顯像劑，它們附著于蛋白或肽的方法(見例如，美國(guó)專利5，021，236和4，472，509，均通過引用并入本文)。某些附著方法包括金屬螯合物復(fù)合物的使用，例如有機(jī)螯合劑(如DTPA)附著于蛋白或肽(美國(guó)專利4，472，509)。蛋白或肽還在偶聯(lián)劑(戊二醛或高碘酸鹽)的存在下與酶反應(yīng)。用這些偶聯(lián)劑存在下或與異硫氰酸酯反應(yīng)來制備具有熒光標(biāo)記物的綴合物。潛在用作顯像劑的順磁離子的非限制性例子包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵 (II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)和鉺(III)，尤其優(yōu)選為釓。有其他應(yīng)用(如X射線成像)的離子包括但不限于鑭(III)、金(III)、鉛(II)，特別是鉍(III)。作為顯像或治療劑的可用的放射性同位素包括211砹、14碳、51鉻、氯、57鈷J8鈷、 67 銅、152 銪、67 鎵、3 氫、123 碘、125 碘、131 碘、111 銦、59 鐵、32 磷、186 錸、188 錸、75 硒、35 硫、99m 锝和 90 釔。某些實(shí)施方式中常優(yōu)選125碘，且"m锝和111銦也常優(yōu)選，因?yàn)槠淠芰枯^低并適于長(zhǎng)期檢測(cè)。本發(fā)明的經(jīng)放射性標(biāo)記的蛋白或肽可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備。例如可通過與碘化鈉或碘化鉀和化學(xué)氧化劑(如次氯酸鈉)或酶氧化劑(如乳過氧化物酶)接觸來將它們碘化。本發(fā)明的蛋白或肽可通過配體交換過程用-锝進(jìn)行標(biāo)記，例如通過用二價(jià)錫溶液還原高锝酸鹽，將經(jīng)還原的锝螯合在kphadex柱上，并將所述肽應(yīng)用于所述柱上；或者通過直接標(biāo)記技術(shù)(例如通過溫育高锝酸鹽、還原劑(如SNCl2)、緩沖溶液(如酞酸鈉-鉀溶液)和肽)。通常用于將作為金屬離子存在的放射性同位素結(jié)合到肽的中間官能團(tuán)是二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。認(rèn)為使用的是熒光標(biāo)記物，包括羅丹明， 異硫氰酸熒光素和腎造影劑。在某些實(shí)施方式中，要求保護(hù)的蛋白或肽可連接于第二結(jié)合配體或酶(酶標(biāo)簽)，所述酶會(huì)在與生色底物接觸后產(chǎn)生著色產(chǎn)物。合適的酶的例子包括脲酶、堿性磷酸酶、(辣根)過氧化氫酶和葡萄糖氧化酶。優(yōu)選的第二結(jié)合配體是生物素和親和素或鏈霉親和素化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知所述標(biāo)記物的使用，如見于，美國(guó)專利3，817，837、 3，850，752,3, 939，350,3, 996，345,4, 277，437,4, 275，149 和 4，366，241，各通過引用并入本文。在又一實(shí)施方式中，靶向部分可與納米顆粒有效偶聯(lián)。納米顆粒包括但不限于膠體金和銀納米顆粒。金屬納米顆粒在可見光范圍內(nèi)顯示顏色。普遍認(rèn)為這些顏色是金屬顆粒的表面等離子體共振的結(jié)果，并且對(duì)所述顆粒的大小、形狀、和聚合狀態(tài)，周圍介質(zhì)的介電性能，顆粒表面的離子吸收極其敏感(見于例如美國(guó)專利申請(qǐng)20040023415，其通過引用并入本文)。C.交聯(lián)劑雙官能團(tuán)交聯(lián)劑已被廣泛用于各種目的，包括親和基質(zhì)的制備、不同結(jié)構(gòu)的修飾和穩(wěn)定、配體和受體結(jié)合位點(diǎn)的鑒定，和結(jié)構(gòu)研究。已證明，帶有兩個(gè)相同的官能團(tuán)的雙同官能團(tuán)試劑高效誘導(dǎo)相同或不同高分子或高分子亞基之間的交聯(lián)，多肽配體和它們的特異性結(jié)合位點(diǎn)的連結(jié)。雙異官能團(tuán)試劑含兩種不同的官能團(tuán)。利用兩種不同官能團(tuán)的不同的反應(yīng)性，可選擇性地和順序地控制交聯(lián)。雙官能團(tuán)交聯(lián)劑可根據(jù)它們的官能團(tuán)(例如，氨基、巰基、胍基、吲哚、羧基特異性基團(tuán))的特異性進(jìn)行分類。當(dāng)然，針對(duì)自由氨基基團(tuán)的制劑特備受歡迎，由于它們的商業(yè)可用率，易于合成，可應(yīng)用的反應(yīng)條件溫和。大部分雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑含主要的氨基反應(yīng)基團(tuán)和硫羥基反應(yīng)基團(tuán)。美國(guó)專利5，603，872和5，401，511描述了配體和脂質(zhì)體的交聯(lián)方法的例子，這兩個(gè)專利都通過引用整體并入本文?？赏ㄟ^氨基殘基的交聯(lián)將各種配體共價(jià)結(jié)合到脂質(zhì)體表面。根據(jù)已建立的方法制備了脂質(zhì)體，尤其是多層泡囊(MLV)或單層泡囊(如微乳化脂質(zhì)體(MEL))和大型單層脂質(zhì)體(LUVET)，各含磷脂酰乙醇胺(PE)。脂質(zhì)體中包含PE向脂質(zhì)體表面提供用于交聯(lián)目的的活性功能性殘基。已成功地將配體(如表皮生長(zhǎng)因子(EGF))與PE-脂質(zhì)體連結(jié)。將配體共價(jià)結(jié)合到脂質(zhì)體表面上的離散位點(diǎn)。這些位點(diǎn)的數(shù)量和表面密度決定于脂質(zhì)體配方和脂質(zhì)體類型。脂質(zhì)體表面也可具有非共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)。為形成配體和脂質(zhì)體的共價(jià)綴合物，研究了交聯(lián)劑的效用和生物相容性。交聯(lián)劑包括戊二醛(GAD)、 雙官能團(tuán)環(huán)氧乙烷(OXR)、乙二醇二縮水甘油醚(EOTE)和水溶性碳二亞胺，優(yōu)選為1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。通過復(fù)雜的交聯(lián)過程，建立了識(shí)別物質(zhì)的胺殘基和脂質(zhì)體的連結(jié)。另一些例子中，描述了雙異官能團(tuán)交聯(lián)劑和交聯(lián)劑使用方法(美國(guó)專利 5，889，155，通過引用特別整體并入本文)。交聯(lián)劑組合了親核酰胼殘基和親電馬來酰亞胺殘基，在一個(gè)例子中使醛和游離巰基偶聯(lián)。可將交聯(lián)劑修飾為交聯(lián)各種官能團(tuán)。8.核酸本發(fā)明的核酸可編碼靶向肽、靶向抗體、靶向抗體片段、治療性多肽、融合蛋白或其他蛋白和肽。所述核酸可源于基因組DNA、互補(bǔ)DNA(cDNA)或合成DNA。本文所述“核酸”包括單鏈和雙鏈分子，及DNA、RNA、經(jīng)化學(xué)修飾的核酸和核酸類似物。本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸可為幾乎任意大小，部分決定于編碼的蛋白或肽的長(zhǎng)度。靶向肽或融合蛋白可被編碼合適的氨基酸序列的任意核酸序列編碼。使用標(biāo)準(zhǔn)的密碼子表，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知編碼期望氨基酸序列的核酸的設(shè)計(jì)和制備。優(yōu)選的實(shí)施方式中，所選編碼各氨基酸的密碼子可經(jīng)修飾以使核酸在目的宿主細(xì)胞中的表達(dá)最優(yōu)化。9.基因治療載體的靶向遞送有許多方法可將基因治療載體導(dǎo)入細(xì)胞。本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，基因治療載體包括病毒。某些病毒的通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，而整合入宿主細(xì)胞基因組，或游離保持，并穩(wěn)定有效地表達(dá)病毒基因的能力使得病毒成為將外源基因轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的優(yōu)良候選物(Ridgeway，1988 ;Nicolas and Rubinstein, 1988. ；Baichwaland Sugden, 1986 ;Temin，1986)。優(yōu)選的基因治療載體通常是病毒載體。用作基因治療載體的DNA病毒包括乳多空病毒(如，猿猴病毒40、牛乳頭瘤病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988 ；Baichwal andSugden, 1986)和腺病毒(Ridgeway, 1988 ；Baichwal and Sugden，1986)。體內(nèi)遞送的優(yōu)選方法之一包括使用腺病毒表達(dá)載體。盡管已知的腺病毒載體的用于整合到基因組DNA中的運(yùn)力較低，但此特征被這些載體的高效基因轉(zhuǎn)染所平衡?！跋俨《据d體"包括但不限于含腺病毒序列的構(gòu)建體，其足以(a)支持構(gòu)建體的包裝，及(b)表達(dá)克隆于其中的反義或正義多核苷酸。腺病毒載體已用于真核基因表達(dá)(Levrero等人，1991 ；Gomez-Foix等人，1992)和疫苗開發(fā)(Grunhaus and Horwitz, 1992 ；Graham and Prevec，1991)。將重組腺病毒施用于不同組織的研究包括氣管灌注(Rosenfeld等人，1991 ；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射 (Ragot等人，199 、外周靜脈注射(Herz和Gerard，199 和立體定位接種到大腦(Le Gal La Salle 等人，1993)。一些優(yōu)選實(shí)施方式中，將治療性分子或物質(zhì)偶聯(lián)到靶向疾病組織(如腫瘤或新血管床)血管系統(tǒng)的UR靶向部分可得到特定優(yōu)勢(shì)。特別是，在攜帶腫瘤異種移植體的小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校褜⒍ň釉谀[瘤血管系統(tǒng)的部分與細(xì)胞毒性藥物或促凋亡肽偶聯(lián)而產(chǎn)生的化合物比原化合物更有效，并且毒性更小(Arap等人，1998 ；Ellerby et al，1999)。將RGDHi 插入到腺病毒表面蛋白，已產(chǎn)生了可用于靶向腫瘤的基因治療的腺病毒載體(Arap等人，1998)。本發(fā)明的"纖維蛋白"優(yōu)選包括腺病毒纖維蛋白。可將任意一種血清型的人或非人腺病毒(例如嵌合纖維蛋白)用作為纖維蛋白或纖維基因的來源。然而，所述腺病毒最好是Ad2或Ad5腺病毒(見美國(guó)專利6，649，407，其通過引用并入本文)。纖維蛋白是“嵌合的”，即其含不常見于從野生型腺病毒分離出來的蛋白(即， 包括天然蛋白或野生型蛋白)的氨基酸殘基。因此，所述纖維蛋白含"非天然氨基酸序列"?！胺翘烊坏陌被嵝蛄?指任意合適長(zhǎng)度的序列，優(yōu)選為約3 約200個(gè)氨基酸，最好是約3 約30個(gè)氨基酸。期望將非天然氨基酸序列以基因表達(dá)水平導(dǎo)入到纖維蛋白中 (例如通過"編碼非天然氨基酸序列的核酸序列"的導(dǎo)入)?？蓪⒎翘烊话被嵝蛄袑?dǎo)入到腺病毒序列或腺病毒序列外的位置。無論哪一種導(dǎo)入，其以DNA或蛋白水平整合到腺病毒纖維蛋白中，導(dǎo)致在得到的嵌合纖維蛋白中產(chǎn)生肽基序(即肽結(jié)合基序)。肽基序例如通過包含本發(fā)明的靶向部分和/或細(xì)胞表明結(jié)合位點(diǎn)的配體來允許靶向細(xì)胞。所述肽基序任選可包含用于細(xì)胞靶向的其他元件(例如單鏈抗體序列)。肽結(jié)合基序可通過插入例如天然和非天然序列而產(chǎn)生，且可包含例如天然和非天然序列，或者可完全由非天然序列構(gòu)成。通過將非天然氨基酸序列插入到嵌合纖維蛋白而得到的肽基序可為高親和性肽(即，當(dāng)以相對(duì)低濃度提供時(shí)結(jié)合其同源結(jié)合位點(diǎn)的肽，如VEGFR-1/NRP-1)， 或?yàn)榈陀H和性肽(即，當(dāng)以相對(duì)高濃度提供時(shí)結(jié)合同源其結(jié)合位點(diǎn)的肽，如VEGFR-I/ NRP-1)。然而，得到的肽基序優(yōu)選為高親和性基序，特別是由于其局限于腺病毒纖維蛋白中而對(duì)其同源結(jié)合位點(diǎn)有高親和性的基序。其他基因轉(zhuǎn)移載體可由逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建(Coffin，1990)。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼目的蛋白的核酸插入到病毒基因組中特定病毒序列的位置上，以產(chǎn)生復(fù)試缺陷型病毒。為了產(chǎn)生病毒顆粒，構(gòu)建了含gag、pol、和env基因，但沒有LTR和包裝成分的包裝細(xì)胞系(Marm等人，1983)。當(dāng)將含cDNA與逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列的重組質(zhì)粒導(dǎo)入該細(xì)胞系(例如通過磷酸鈣沉淀)時(shí)，包裝序列允許重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄本包裝進(jìn)病毒顆粒， 然后其被分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas 和 Rubenstein，1988 ；Temin, 1986 ；Mann 等人，1983)。 回收含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選經(jīng)濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能轉(zhuǎn)染廣泛類型的細(xì)胞。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)要求宿主細(xì)胞分裂(Paskind等人，1975)。其他病毒載體可用作靶向基因治療載體?？蓱?yīng)用源于下列病毒的載體，如牛痘病毒(Ridgeway，1988 ；Baichwal 和 Sugden, 1986)、腺相關(guān)病毒(AAV) (Ridgeway，1988 ； Baichwal 禾口 Sugden，1986 ；Hermonat 禾口 Muzycska，1984)禾口抱疫病毒。本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，可將基因治療構(gòu)建體包裹于脂質(zhì)體。脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸遞送和外源DNA的體外表達(dá)已非常成功。Wong等人(1980)在培養(yǎng)的雞胚、HeLa、和肝瘤細(xì)胞中證明了外源DNA的脂質(zhì)體介導(dǎo)的遞送和表達(dá)的可行性。Nicolau等人(1987.)在靜脈注射后在大鼠中成功地實(shí)現(xiàn)了脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的基因治療載體可包含各種轉(zhuǎn)基因，其一般是表達(dá)載體的編碼的DNA或 RNA?；蛑委熆捎糜谥委熜曰虻谋磉_(dá)，VEGFR-1/NRP-1的表達(dá)，以增強(qiáng)新血管生成，或用于VEGFR-1/NRP-1表達(dá)的抑制，用于治療與新血管生成相關(guān)的疾病狀態(tài)。DNA可為cDNA、 體外聚合的DNA、質(zhì)粒DNA、質(zhì)粒DNA的一部份、源于病毒的遺傳物質(zhì)、線性DNA、載體(P1、 PAC、BAC、YAC、人工染色體)、表達(dá)盒、嵌合序列、重組DNA、染色體DNA、寡核苷酸、反義DNA的形式、或這些群體的衍生物形式。RNA可為寡核苷酸RNA、tRNA(轉(zhuǎn)移RNA)、snRNA(核內(nèi)小 RNA)、rRNA(核糖體RNA)、mRNA(信使RNA)、體外聚合的RNA、重組RNA、嵌合序列、反義RNA、 siRNA(小干擾RNA)、核酶形式，或這些群體衍生物形式。反義多核苷酸干擾DNA或RNA的功能的多核苷酸。反義多聚核酸包括但不限于嗎啉代、2' -0-甲基多核苷酸、DNA、RNA等。 SiRNA包含通常含15 50個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選為21 25個(gè)堿基對(duì)，且具有與細(xì)胞中表達(dá)的靶基因或RNA相同或近乎相同的核酸序列的核苷酸序列的雙鏈結(jié)構(gòu)。干擾可引起表達(dá)抑制， 此外，DNA或RNA可為單鏈、雙鏈、三鏈或四鏈。10.藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物包含有效量的一種或多種包括本文所述的靶向部分的組合物，所述靶向部分溶解或分散于藥學(xué)可接受載體中?！八幬锏摹被颉八帉W(xué)可接受的"指當(dāng)施用于動(dòng)物(例如人，視情況而定)時(shí)，不產(chǎn)生副作用、過敏反應(yīng)或其他不利反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。根據(jù)本文所公開(如Remington，s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. MackPrinting Company，1990所例示，該文獻(xiàn)通過引用并入本文)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道藥物組合物的制備，所述藥物組合物含本發(fā)明的至少一種組合物(例如UR靶向部分) 或另外的活性成分。此外，用于動(dòng)物(如，人)治療時(shí)，制備過程應(yīng)該符合FDA生物標(biāo)準(zhǔn)品辦公室的無菌標(biāo)準(zhǔn)、致熱原性標(biāo)準(zhǔn)、普遍安全標(biāo)準(zhǔn)和純度標(biāo)準(zhǔn)。本文所述"藥學(xué)可接受載體"包括任意及所有溶劑、分散介質(zhì)、涂料、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(如，抗細(xì)菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、 藥物穩(wěn)定劑、凝膠劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料、類似材料及它們的組合，這些為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知(例如，見Remington' s Pharmaceutical kiences，第18版，1990，其通過引用并入本文)。除非任意傳統(tǒng)載體不與活性成分相容，考慮其作為治療或藥物組合物的用途。本發(fā)明的治療和診斷組合物可包含不同類型的載體，取決于其以液體、固體或氣溶膠形式中的哪種形式施用，及其在該施用途徑中是否需要無菌。認(rèn)為本發(fā)明的成分可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法施用，例如經(jīng)口施用、靜脈施用、皮內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用、鞘內(nèi)施用、眼內(nèi)施用、結(jié)膜下施用、視網(wǎng)膜下施用、玻璃體膜內(nèi)施用、施用于眼的前房、施用于眼的特農(nóng)下空間、局部施用、腹膜內(nèi)施用、損傷區(qū)內(nèi)施用、顱內(nèi)施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用、胸膜內(nèi)施用、氣管內(nèi)施用、瘤內(nèi)施用、肌內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、皮下施用、囊內(nèi)施用、吸入(如氣霧吸入)、注射、輸液、連續(xù)輸液、通過導(dǎo)管、通過灌洗直接以脂質(zhì)組合物(如脂質(zhì)體)局部灌注清洗靶細(xì)胞，或通過其他方法或上述方法的組合(如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知)(例如見 Remington' sPharmaceutical Sciences，第 18 片反，Mack Printing Company，1990，其通過引用并入本文)。施用于受試者的本發(fā)明的組合物的實(shí)際劑量可決定于身體和生理因素，例如體重、嚴(yán)重情況、所治療的疾病類型、以前或現(xiàn)在的治療干預(yù)、患者特發(fā)癥和施用途徑。無論如何，從業(yè)醫(yī)師決定組合物中活性成分的濃度和個(gè)體受試者的合適的劑量。某些實(shí)施方式中，藥物組合物可含，例如，至少約0. 的活性化合物。其他實(shí)施方式中，活性化合物可含單位體重的約2% 約75%，或約25% 約60%，例如，及從它們而來的任意范圍。在一些非限制性例子中，每次施用約Img肽/kg體重、約5mg/kg體重、約 10mg/kg體重、約50mg/kg/體重、約100mg/kg體重、約200mg/kg體重或更多，及從它們而來的任意范圍。從本文所列數(shù)值而來的范圍的非限制性例子中，每日多劑量?jī)?yōu)選范圍為約 lmg/kg體重 約100mg/kg體重，尤其優(yōu)選約20mg/kg 約50mg/kg之間(類似布洛芬、阿司匹林等，每4 8小時(shí)施用)。任何情況下，組合物可包含各種抗氧化劑來減緩一種或多種組分的氧化。另外，對(duì)微生物活性的抑制可使用防腐劑，例如各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，包括但不限于對(duì)羥基苯甲酸(例如，對(duì)羥基苯甲酸甲酯，對(duì)羥基苯甲酸丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及它們的組合。組合物是液體形式的實(shí)施方式中，載體可為溶劑或分散介質(zhì)，包括但不限于水、 乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)、脂(例如，甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)及它們的組合。許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖、氯化鈉或它們的組合。通過將UR靶向部分或其綴合物以所需量摻入含各種其他上述成分的合適的溶劑中，并根據(jù)需要進(jìn)行過濾除菌來制備無菌注射溶液。一般來說，通過將各種無菌的活性成分摻入到含基本分散介質(zhì)和/或其他活性成分的無菌媒質(zhì)中來制備分散劑。在用無菌粉末制備無菌注射溶液、懸濁液或乳化液時(shí)，優(yōu)選的制備方法是真空干燥或冷凍干燥技術(shù)，這些技術(shù)能制備添加任意額外所需成分(來自先前無菌過濾的液體介質(zhì))的活性成分粉末。如有必要，液體介質(zhì)應(yīng)該根據(jù)需要適當(dāng)緩沖，并且在注射足夠的鹽和葡萄糖之前使液體稀釋液等滲。還考慮到用于直接注射的組合物的制備，假設(shè)將DMSO用作溶劑，將導(dǎo)致極快地浸漬，將高濃度的活性劑遞送到小區(qū)域。這些組合物在制備和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的，并且能防止微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染。在安全水平下，內(nèi)毒素的污染也應(yīng)該最低控制在安全水平，例如，小于0.5ng/ mg蛋白。本文所述組合物可任選包含一種或多種的第二治療劑，所述第二治療劑針對(duì)本文所述任何疾病的治療或預(yù)防。11.治療劑某些實(shí)施方式中，可將治療劑有效偶聯(lián)于用于選擇性遞送到例如表達(dá)VEGFR-I/ NRP-I的腫瘤血管系統(tǒng)的靶向肽或融合蛋白上。合適使用的制劑或因子可包括任何誘導(dǎo)凋亡、細(xì)胞死亡、細(xì)胞停滯和/或抗血管生成的化合物。A.程序性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)劑凋亡或程序性細(xì)胞死亡是正常胚胎發(fā)育，維持成體組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和抑制癌癥發(fā)生的必要過程(Kerr等人，1972)。Bcl_2蛋白家族和ICE樣蛋白酶被證明是其他系統(tǒng)中重要的凋亡調(diào)節(jié)劑和效應(yīng)物。發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白與濾泡性淋巴瘤相關(guān)，在控制凋亡和促進(jìn)細(xì)胞響應(yīng)各種凋亡刺激而存活中有重要作用(Bakhshi等人，1985 ；Cleary和Sklar，1985 ；Cleary等人，1986 ；Tsujimoto 等人，1985 ；Tsujimoto 和 Croce，1986)?，F(xiàn)在認(rèn)為進(jìn)化保守的 Bcl_2 蛋白是相關(guān)蛋白家族的成員，這些蛋白被劃分為死亡激動(dòng)劑或死亡拮抗劑。隨后的發(fā)現(xiàn)表明Bcl-2發(fā)揮抑制各種刺激引發(fā)的細(xì)胞死亡的作用。同樣，現(xiàn)已知存在一個(gè)Bcl-2細(xì)胞死亡調(diào)控蛋白家族，這些蛋白有著共同的結(jié)構(gòu)和序列同源性。已發(fā)現(xiàn)這些不同的家族成員或與Bcl-2具有相似功能(BcIxl，Bclff, Bcls, Mcl-I, Al，Bfl-1)，或與 Bcl-2 功能相反而促進(jìn)細(xì)胞死亡(Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri)。B.血管生成抑制劑
本發(fā)明的某些實(shí)施方式中可涉及與抗血管生成劑有效偶聯(lián)的靶向部分的施用，所述抗血管生成劑例如血管緊張素、層粘連蛋白肽、纖維連接蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白細(xì)胞介素12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、凝血酶敏感蛋白、2-甲氧基雌二醇、增生蛋白相關(guān)蛋白、羧基氨基三唑、CM101、馬立馬司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2 (Regeneron)、α-干擾素、除莠霉素A、PNU145156E、16Κ催乳素片段、利諾胺、沙立度胺、己酮可可堿、染料木黃酮、ΤΝΡ-470、內(nèi)皮抑素、紫杉醇、accutin、血管抑素、西多福韋、長(zhǎng)春新堿、博來霉素、AGM-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。腫瘤細(xì)胞的增生嚴(yán)重依賴廣泛的腫瘤血管系統(tǒng)，其伴隨癌癥發(fā)展。因此，用抗血管生成劑來抑制新血管生成并靶向摧毀現(xiàn)存血管已被引入作為腫瘤治療的有效且相對(duì)無毒的方法(Arap等人，1998 ；Arap等人，1998 ；Ellerby等人，1999)。已經(jīng)知道很多抗血管生成劑和 / 或血管抑制劑(例如，F(xiàn)olkman, 1997 ；Eliceiri and Cheresh, 2001)。C.細(xì)胞毒件劑化學(xué)治療(細(xì)胞毒性)劑可用于治療包括癌癥在內(nèi)的各種疾病?？墒褂玫幕瘜W(xué)治療(細(xì)胞毒性)劑包括但不限于5-氟尿嘧啶、博來霉素、白消安、喜樹堿、卡鉬、苯丁酸氮芥、順鉬(⑶DP)、環(huán)磷酰胺、更生霉素、柔紅霉素、多柔比星、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊苷(VP16)、法呢基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、絲裂霉素、諾維本、亞硝基脲、plicomycin,甲卡巴胼、雷洛昔芬、他莫昔芬、紅豆杉醇、temazolomide (含水形式的DTIC)、反式鉬、長(zhǎng)春堿和甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿，或上述物質(zhì)的任何類似物或衍生變體。大部分化學(xué)治療劑可分為烷化劑、抗代謝劑、抗腫瘤抗生素、皮質(zhì)類固醇激素、有絲分裂抑制劑、和亞硝基脲、激素劑、雜劑，或任何上述物質(zhì)的類似物或衍生變體?；瘜W(xué)治療劑和施用方法，劑量等為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(例如見，“Wiysicians Desk Reference，，,Goodman 禾口 Gilman' s “ThePharmacological Basis of Therapeutics，， 和"Remington，sPharmaceutical Sciences” 15th ed.，pp 1035-1038 和 1570-1580，相關(guān)部分通過引用并入本文)，且可與本文公開的本發(fā)明組合。有必要根據(jù)受試者的狀況調(diào)整劑量。無論如何，負(fù)責(zé)給藥的人將決定對(duì)個(gè)體受試者合適的劑量。當(dāng)然，本文所述所有劑量和制劑只代表一些例子，并不限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可針對(duì)特定的患者或用途使用其他劑量或制劑。任何在這些點(diǎn)或從其而來的范圍之間的劑量都能用于本發(fā)明。P.烷化劑烷化劑是直接和基因組DNA相互作用而阻斷細(xì)胞增生的藥物。這類化學(xué)藥物代表影響細(xì)胞周期的所有階段的藥物，就是說它們不是階段特異性的。烷化劑包括但不限于氮芥、ethylenimene、烷基磺酸鹽、亞硝基脲或三嗪。它們包括但不限于白消安、苯丁酸氮芥、 順鉬、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、達(dá)卡巴嗪、異環(huán)磷酰胺、氮芥(mustargen)和美法侖。E.抗代謝劑抗代謝劑阻斷DNA或RNA的合成。與烷化劑不同，它們特異性影響細(xì)胞周期的S 期?？勾x劑可被分為不同的類別，例如葉酸類似物、嘧啶類似物和嘌呤類似物及相關(guān)抑制化合物?？勾x劑包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟達(dá)拉濱、吉西他濱和甲氨蝶呤。F.天然產(chǎn)物天然產(chǎn)物通常是指從天然來源分離出來的化合物，并且被定義為有藥物活性。所述化合物和它們的類似物或衍生物可分離自天然來源，化學(xué)合成或用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的任意技術(shù)來重組產(chǎn)生。天然產(chǎn)物可分成有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、酶和生物反應(yīng)修飾劑。有絲分裂抑制劑包括植物堿和其他可抑制細(xì)胞分裂所需的蛋白合成的或抑制有絲分裂的天然制劑。它們?cè)诩?xì)胞周期的特定時(shí)期發(fā)揮作用。有絲分裂抑制劑包括，例如，多烯紫杉醇、依托泊苷(VP16)、替尼泊苷、紫杉醇、紅豆杉醇、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春瑞濱。紫杉醇類化合物是從短葉紫杉(Taxus brevifolia)樹皮中分離出的一類相關(guān)化合物。紫杉醇類化合物包括但不限于化合物如多西紫杉醇和紫杉醇。紫杉醇結(jié)合微管蛋白(在異于長(zhǎng)春花堿使用的位點(diǎn))，并促進(jìn)微管裝配。長(zhǎng)春花堿是一類被鑒定為有藥物活性的植物堿。它們包括化合物，如長(zhǎng)春堿 (VLB)和長(zhǎng)春新堿。G.抗牛素某些抗生素兼有抗微生物或細(xì)胞毒性活性。這些藥物還通過化學(xué)抑制酶來干擾 DNA和有絲分裂或改變細(xì)胞膜。這些制劑并不是階段特異性的，因此他們作用于細(xì)胞周期的所有階段。細(xì)胞毒性抗生素的例子包括但不限于博來霉素、更生霉素、柔紅霉素、多柔比星 (阿霉素)、普卡霉素(光神霉素)和伊達(dá)比星。H.雜布丨不屬于上述種類的雜細(xì)胞毒性劑包括但不限于鉬配位絡(luò)合物、蒽二酮、經(jīng)取代的脲、甲基胼衍生物、安吖啶、L-天冬酰胺酶、和維甲酸。鉬配位絡(luò)合物包括化合物諸如卡鉬和順鉬(cis-DDP)。例示蒽二酮是米托蒽醌。例示的經(jīng)取代的脲是羥基脲。例示的甲基胼衍生物是并卡巴胼(N-甲基胼，MIH)。并不局限于這些例子，認(rèn)為將任何已知的細(xì)胞毒性劑，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑或殺細(xì)胞劑附著于靶向肽，并施用于靶器官、組織或細(xì)胞類型也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例包括下列實(shí)施例，以展示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道，下列實(shí)施例所揭示的技術(shù)代表實(shí)施本發(fā)明中表現(xiàn)良好的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的技術(shù)，并且因此認(rèn)為構(gòu)成其優(yōu)選實(shí)施方式。然而，根據(jù)本文公開的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，在已公開的特定實(shí)施方式中可在脫離分發(fā)明的精神的情況下做許多修改，并且仍可獲得一樣或相似的結(jié)果。實(shí)施例1 靶向VEGF通路的抗-血管生成化合物1.材料與方法制劑和肽。合成肽，并在經(jīng)HPLC純化達(dá)說明書的純度超 95 % =L-Arg-L-Pro-L-Leu(RPL) , D-Leu-D-Pro-D-ArgD(LPR)，
D-Cys-D-Ala-D-Pro-D-Ala-D-CysD(CAPAC) ;SEQ ID NO :6，來自多肽實(shí)驗(yàn)室 (Polypeptide Laboratories) (Torrence, CA)禾口 D-Ala-D-Pro—D—AlaD(ΑΡΑ)，來自 Genemed Synthesis Inc. (SanFrancisco, CA) 重組受體(VEGFR-1 和 NPR-1)和生長(zhǎng)因子(人 VEGF165)，來自 R&D System (Minneapolis, MN) 肝素、Drabkin 試劑、人血紅蛋白， brij-35 來自(Sigma-Aldrich，St. Louis, MO)。動(dòng)物。小鼠實(shí)驗(yàn)得到了 Texas Μ. D. Anderson大學(xué)癌癥中心的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。C57BL/6和Balb/c小鼠購(gòu)自(Harlan，Indianapolis)。本研究遵照視覺與眼科研究協(xié)會(huì)的聲明，用動(dòng)物進(jìn)行眼科和視覺研究。噬菌體實(shí)驗(yàn)。噬菌體通過感染大腸桿菌K91kan對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物來制備，并在 37°C和250rpm下，在添加了卡那霉素(100 μ g/ml)和四環(huán)素(20 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。用PEG/NaCl方法使噬菌體從培養(yǎng)基上清液中沉淀下來，噬菌體滴度通過連續(xù)稀釋和菌落計(jì)數(shù)來測(cè)定(Giordano，2001)。有關(guān)噬菌體結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，將VEGFR-I、NRP-I或 BSA(PBS中10yg/ml)固定在微滴孔上，4°C過夜。測(cè)試孔沖洗兩次，在室溫下用PBS(3% BSA)阻斷2小時(shí)，并和IO9TU的CPQPRPLC或陰性對(duì)照無插入(Fd-tet)噬菌體在PBS (3% BSA)中溫育。室溫下一小時(shí)后，用PBS洗滌孔10次，并通過細(xì)菌感染回收結(jié)合于固定受體的噬菌體(Giordano，2001)。蛋白酶抗性檢測(cè)。D(LPR)和RPL肽用PBS稀釋到500 μ g/ml，并在37°C下，在遞增濃度的胰酶中溫育2小時(shí)(Sigma-Aldrich，M. Louis，M0)。然后用質(zhì)譜(MALDI-T0F)分析樣品。血管生成檢測(cè)。發(fā)明人使用了體內(nèi)基質(zhì)膠血管生成實(shí)驗(yàn)(其中生長(zhǎng)因子降低用重組人 VEGF165 (1 μ g/ml)和肝素(10U/ml)浸漬的基質(zhì)膠基質(zhì)(BD Biosciences, Bedford, ΜΑ)(含或不含肽模擬化合物(500yg)))體內(nèi)皮下移植(0. 5ml)到Balb-c小鼠的背部區(qū)域。將D(CAPAC)用作對(duì)照肽模擬化合物。7天后，處死小鼠，切細(xì)基質(zhì)膠填料，照相，用杜恩斯勻化器使之在Brij 0. 35%溶液中攪勻，以13. OOOg離心5分鐘。上清液分成兩份，以用 Drabkin' s劑測(cè)量血紅蛋白(Hb)，并根據(jù)同時(shí)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)Hb來計(jì)算Hb濃度。人血管生成的SCID小鼠模型。將IO6個(gè)在基質(zhì)膠/支架中的人皮膚微內(nèi)皮細(xì)胞 (HDMEC)移植給小鼠，每個(gè)小鼠2個(gè)支架，每脅腹一個(gè)。移植后第12天，每天用D(LPR)或?qū)φ针哪M物D (APA)處理小鼠(腹腔內(nèi)注射100 μ L 2mg/ml溶液)。通過溶于DMSO至20mg/ ml的儲(chǔ)存濃度來配制藥物，每次注射時(shí)用PBS新鮮稀釋(1/10)。收獲支架，并用10%甲醛 /PBS 固定。用 von Willebrand 因子抗體(Neomarkers，F(xiàn)reemont, CA)標(biāo)記組織切片，用 AEC(DABCO)顯影，并用蘇木精復(fù)染。光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，在200倍放大倍數(shù)下每個(gè)支架6個(gè)視場(chǎng)(對(duì)于D (LPR)，η = 6 ；對(duì)于對(duì)照肽模擬物，η = 4)。在Sigmastat上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。視網(wǎng)膜新生血管生成實(shí)驗(yàn)。為進(jìn)行視網(wǎng)膜新生血管生成實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人使用了 C57BL/6小鼠幼崽和它們的代理母親。小鼠(Ρ7)暴露于75%氧氣5天，返回到室內(nèi)空氣 (20. 8% O2) (P 12)，并每天注射D(LPR)、對(duì)照肽模擬物D(CAPAC ；SEQ ID NO 6)(磷酸緩沖鹽水中20mg/Kg，作為媒質(zhì))或媒質(zhì)7天(P12 P18)。有關(guān)組織學(xué)分析，在P19天血管生成頂峰時(shí)處死小鼠，取出眼，固定，連續(xù)切片，用蘇木精和伊紅(H&E)染色。計(jì)量?jī)?nèi)界膜玻璃體側(cè)邊的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。每個(gè)眼至少評(píng)估10張H&E染色切片，各條件下計(jì)量4 6個(gè)眼的細(xì)胞核平均數(shù)。腫瘤生長(zhǎng)。在添加有胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的Dulbelco’ s改良的Eegles 培養(yǎng)基中培養(yǎng)EF43. fgf4細(xì)胞。在達(dá)到匯合前收獲細(xì)胞，并皮下注射到Balb/c小鼠的乳腺脂肪墊中。10天后，腫瘤達(dá)到 50 SOmm3將小鼠分成4組，每組7只動(dòng)物(N = 7)。每組動(dòng)物用僅媒質(zhì)(磷酸鹽緩沖溶液)或?qū)φ针腄 (CAPAC) (SEQ ID NO 6)或1) (LPR)(以50mg/ Kg)或環(huán)型D(CLPRC) (SEQ ID NO :7)(以25mg/Kg)處理。通過測(cè)量各腫瘤的長(zhǎng)軸(L)和短軸(S)的長(zhǎng)度來計(jì)算腫瘤體積(V = S2XLXO. 04)。
統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)的差異顯著性用克魯斯卡爾-瓦利斯檢驗(yàn)(非參數(shù)單因素ANOVA法)以每處理日ρ <0.05計(jì)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。用維爾科克森秩和檢驗(yàn)進(jìn)一步計(jì)算處理日的各成對(duì)研究組之間的差異，其由克魯斯卡爾-瓦利斯檢驗(yàn)顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。用Bejamini和Hochberg方法調(diào)整多重比較。全部統(tǒng)計(jì)分析均用The RO. 4. 1版) Project for Statistical Computing 計(jì)算。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果為評(píng)估肽模擬化合物D(LPR)是否表現(xiàn)出VEGFR-I和NRP-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。在存在遞增濃度的本發(fā)明的RPL肽或D(LPR)肽模擬物的情況下，進(jìn)行親本 CPQPRPLC(SEQ ID NO 8)噬菌體向固定的VEGF受體NRP-I和VEGFR-I的結(jié)合。正如我們先前工作所預(yù)期的那樣(Giordano等人，2005)，RPL肽完全消除CPQPRPLC (SEQ ID NO 8)噬菌體和兩種受體的結(jié)合。有趣的是，D(LPR)肽模擬物也與RPL非常相似的水平抑制噬菌體的結(jié)合。RPL*d(LPR)以劑量依賴性的方式抑制噬菌體結(jié)合，而即便使用高濃度(ΙΟΟμΜ) 的對(duì)照肽也不影響CPQPRPLC (SEQ ID NO 噬菌體的結(jié)合。由于抑制50%噬菌體結(jié)合的肽濃度(IC5tl)和所述肽對(duì)受體的親和性成反比，我們的數(shù)據(jù)提示，和CPQPRPLC(SEQ ID NO 8)肽相比，RPL和D (LPR)都對(duì)VEGFR-I和NRP-I有較高的親和性(Giordano等人，2001)。 D(LPR)對(duì)兩種受體的IC50 (1 IOpM)顯著低于前文所描述的CPQPRPLC (SEQ ID NO 8)對(duì) VEGFR-I ( InM)或 NRP-1 ( 50 IOOnM)的 IC5tl (Giordano 等人，2001)。然后，檢測(cè)了 D(LPR)對(duì)蛋白降解的抗性。將RPL*d(LPR)與遞增濃度的胰酶(胰腺產(chǎn)生的幾種消化酶的混合物)溫育，并用質(zhì)譜分析了降解產(chǎn)物。用D (LPR)肽模擬物在最高比例的酶/所檢測(cè)肽濃度(400pg/nmOl)下沒有發(fā)現(xiàn)分解產(chǎn)物。然而，RPL肽顯示出顯著降解，存在PL 二肽降解產(chǎn)物?？傊@些數(shù)據(jù)證明Td (LPR)是不易蛋白降解的RPL模擬物， 它以高親和性的結(jié)合VEGFR-I和NRP-I，是更好的研究RPL基序在血管生成中的作用的潛在藥物候選物。在已鑒定和表征了 D (LPR)肽模擬化合物的情況下，研究了 D (LPR)在新血管形成中的作用。為此，用了兩種血管生成動(dòng)物模型體內(nèi)基質(zhì)膠和人內(nèi)皮細(xì)胞在鼠宿主中的生長(zhǎng) (Nor等人，2001)。先用體內(nèi)基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行研究，其中，給小鼠皮下注射含VEGF165和 D(LPR)肽模擬物的基質(zhì)膠。移植7天后，和只含VEGF165的陽性對(duì)照人工基質(zhì)膠填料相比， 已浸漬D(LPR)的基質(zhì)膠填料表現(xiàn)出降低的血管生成；在含對(duì)照肽模擬物的填料中沒有觀察到其對(duì)新血管生成有影響(圖1A)。接下來研究了人血管生成SCID小鼠模型中D(LPR)的作用。在此模型中，將人內(nèi)皮細(xì)胞體內(nèi)培養(yǎng)于聚合物移植物中，并生長(zhǎng)至形成微血管，其然后與小鼠毛細(xì)血管融合。這些新生血管是有功能的，和表達(dá)血管生成標(biāo)志物的人內(nèi)皮細(xì)胞并排，并轉(zhuǎn)運(yùn)鼠血細(xì)胞。為了評(píng)估八⑶！ )在血管生成動(dòng)物模型中的作用，給小鼠移植含人內(nèi)皮細(xì)胞的支架，并使之生長(zhǎng)12 天。這12天期間，內(nèi)皮細(xì)胞形成無功能的含空腔的管狀結(jié)構(gòu)，其緩慢成熟成為功能完全的含鼠血細(xì)胞的血管(Nor等人，2001)。然后從第12天 第21天用D(LPR)或?qū)φ针哪M物處理小鼠(25mg/Kg/天)。每天腹腔內(nèi)注射肽模擬化合物，在治療結(jié)束時(shí)，除去支架，并測(cè)定形成有功能的血管的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。在第21天，全部動(dòng)物發(fā)育出具有預(yù)期細(xì)胞密度的功能性血管；這些血管是有功能的，并對(duì)血管生成標(biāo)記物呈陽性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與用對(duì)照肽模擬物處理的動(dòng)物相比，用D(LPR)肽處理的動(dòng)物組的血管形成降低了 36. 7% (在每個(gè)放大視野中32. 1血管對(duì)D (LPR)存在下的20. 3)(圖1B)?？傊@些數(shù)據(jù)表明了 D (LPR)肽模擬物在兩種不同的血管生成動(dòng)物模型中都抑制體內(nèi)血管的形成和成熟。然后，進(jìn)行研究以回答D(LPR)肽模擬化合物是否可作為治療病理生理性血管生成的藥物的問題。為此，選擇兩種疾病用動(dòng)物模型，已知血管生成在疾病發(fā)展中起重要作用， 所述疾病如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)和癌癥。為進(jìn)行ROP研究，使用了氧氣誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病的小鼠模型(Smith等人，1994 ^ahdenranta等人，2001)。該模型中，將新生小鼠(7日齡)暴露于高水平氧(75%)中5天，然后放回到室內(nèi)空氣氧)中。氧水平變化導(dǎo)致動(dòng)物相對(duì)缺氧，內(nèi)皮細(xì)胞通過激活氧應(yīng)答元件(例如低氧誘導(dǎo)因子-I(HIF-I)和VEGF) 做出響應(yīng)(Smith等人，1994 ^ahdenranta等人，2001)?；氐绞覂?nèi)空氣中(第12天)后， 每天用D(LPR)或?qū)φ针哪M物處理動(dòng)物7天(20mg/Kg)。在處理結(jié)束時(shí)(第19天)，取出眼，并通過計(jì)量從視網(wǎng)膜伸出的血管和內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)來測(cè)定新血管生成的水平(圖2A)。發(fā)現(xiàn)和只用媒質(zhì)或?qū)φ针哪M物處理的動(dòng)物相比，用D(LPR)處理的動(dòng)物的血管生成顯著下降 (68.5%)(圖2B，2C)(只用媒質(zhì)處理的動(dòng)物中為四.8士3.8核/視網(wǎng)膜；用對(duì)照肽模擬物處理的動(dòng)物中為29. 3士6. 0核/視網(wǎng)膜；用D(LPR)處理的動(dòng)物中為9. 4士 1. 0核/視網(wǎng)膜)。接下來，進(jìn)行研究以確定D (LPR)肽是否對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的新血管生成起作用。為此研究，選擇了高度血管生成的乳腺癌EF43. fgf4小鼠模型(Deroarme等人，1997 ；Hajitou et al, 1998)。在此模型中，癌癥細(xì)胞產(chǎn)生并分泌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子_4(FGF-4)，其誘導(dǎo)生成導(dǎo)致高度血管化腫瘤的VEGF的自分泌產(chǎn)生。向動(dòng)物乳腺脂肪墊皮下注射乳腺癌細(xì)胞，并使腫瘤生長(zhǎng)達(dá)小尺寸(50 80mm3)。每天分別向攜腫瘤的動(dòng)物腹腔內(nèi)注射D (LPR) (50mg/Kg)、 對(duì)照肽模擬物或僅媒質(zhì)來處理所述動(dòng)物。處理5天后，在用D(LPR)處理的動(dòng)物中檢測(cè)到腫瘤體積明顯減小(圖幻。為這些研究，利用了 D(LPR)肽模擬物的環(huán)狀變體D (CLPRC)。用 D(CLPRC) (25mg/Kg)處理攜腫瘤動(dòng)物也顯著減小了腫瘤體積(圖3)。未觀察到對(duì)用對(duì)照肽模擬物處理的動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)有影響。總之，這些數(shù)據(jù)表明D(LPR)肽模擬物及其環(huán)狀形式是一類新的血管生成抑制劑和靶向劑，其在臨床及后期(如管形成和成熟)中有重要應(yīng)用(人血管生成的SCID小鼠模型)。當(dāng)給小鼠全身施用D(LPR)時(shí)，顯著減少病理性血管生成(R0P小鼠模型)和腫瘤誘導(dǎo)的血管生成中的血管形成。實(shí)施例2 靶向脂肪的研究/肥胖癥研究在發(fā)達(dá)國(guó)家，飲食和生活方式是肥胖癥高發(fā)的原因。美國(guó)約65%成年人群超重，體重指數(shù)大于或等于25kg/m2，且超過30%是肥胖(體重指數(shù)大于或等于30kg/m2)。肥胖癥與糖尿病、癌癥和心臟病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，并且常使人壽命變短。肥胖癥治療的進(jìn)展迄今相當(dāng)有限，局限于一些控制非正常脂肪堆積的藥物(Clapham等人，2001)。大部分抗肥胖癥劑基于改變能量平衡通路和通過作用于腦內(nèi)的受體來影響食欲。這類藥物(如芬氟拉明)中有一些已經(jīng)由于無法預(yù)期的毒性而從市場(chǎng)上退出。近來嘗試開發(fā)通過作用于胃腸道為來抑制脂肪吸收的藥物(如奧利司他，商品名Xenieal ，Roche)，可增強(qiáng)抗肥胖癥治療。然而，即使最有效的藥物，最多也只能降低5%的體重，進(jìn)一步體重減輕需要嚴(yán)格限制飲食(Clapham 等人，2001 ；Padwal 和 Majumdar，2007)。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到非瘤組織(即脂肪組織)的生長(zhǎng)還依賴于新血管的形成(新血管生成)。例如，不同的接受抗血管生成劑的肥胖癥模型的小鼠出現(xiàn)治療劑量依賴的可逆的體重減少和脂肪組織消失(Rupnick等人，200 。這些研究表明脂肪組織質(zhì)量對(duì)血管生成抑制劑敏感。因此本發(fā)明人進(jìn)行研究以評(píng)估本發(fā)明的LPR VEGFR-I靶向肽靶向脂肪組織，進(jìn)而降低飲食導(dǎo)致的肥胖癥小鼠的體重的能力。為此，將飲食導(dǎo)致肥胖癥的小鼠分組，并用 VEGFR-I/NRP-I 靶向肽處理。C57BL/6J-60 % DIO 小鼠(36 周齡)購(gòu)自 The Jackson 實(shí)驗(yàn)室。給這些動(dòng)物喂高熱量食物(J-60% )，以產(chǎn)生飲食導(dǎo)致的肥胖癥(DIO)表型。將動(dòng)物分組，并每天用以下組1
組4處理組1D(CLPRC) (SEQ ID NO 7) (N = 5)；組2CKGGRAKDC-GG-d (KLAKLAK)2 (SEQ ID NO 9) (N = 3)；組3D(CLPRC)聯(lián)合 CKGGRAKDC_GG_d(KLAKLAK)2(SEQ ID NO 10) (N = 4)；組4僅媒質(zhì)(N= 4)。所有動(dòng)物都通過在治療前30分鐘經(jīng)腹膜內(nèi)施用Iml鹽溶液(0.9%氯化鈉溶液，美國(guó)藥典質(zhì)量)來給水。每天用溶解于磷酸緩沖鹽水媒質(zhì)(PBS)中的D(CLPRC)以 50mg/Kg/體重的劑量處理(組1和組3)小鼠(共注射ΙΟΟμΙ)；或用溶于PBS中的 CKGGRAKDC-GG-d (KLAKLAK)2 (SEQ ID NO 9)以:3mg/Kg 的劑量皮下施用(100 μ 1 總體積)(組 2)；或當(dāng)與D(CLPRC)聯(lián)用時(shí)以lmg/Kg的劑量施用(組3)，一周5天(周一 周五)。小鼠一周稱重一次。研究結(jié)果示于圖4A 4C。在每天經(jīng)腹膜內(nèi)注射D(CLPRC) (50mg/Kg)治療的肥胖癥小鼠組中，可發(fā)現(xiàn)在處理期約3克(約體重的6% )的相當(dāng)實(shí)質(zhì)性的體重減輕，而對(duì)照組的小鼠表現(xiàn)為體重相對(duì)增加(圖4A)。接下來，為了證實(shí)D(CLPRC)降低體重的作用，設(shè)計(jì)了聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)。用VEGFR-1/NRP-1靶向肽和脂肪除手(fat-zapper)抗肥胖癥化合物一起處理肥胖癥小鼠。在先前的研究中，本發(fā)明人已經(jīng)證明，可通過用綴合了的導(dǎo)向肽(homing peptide) CKGGRAKDC (SEQ ID NO :11)和促凋亡肽 D (KLAKLAK) 2 (SEQID NO :2)選擇性靶向月旨肪血管系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)白色脂肪消融(Kolonin等人，2004)。此化合物，命名為“脂肪除手”(序列CKGGRAKDC-GG-d (KLAKLAK)2) (SEQ ID NO :9)，在治療劑量等于或高于3mg/Kg/體重時(shí)引起脂肪消融。然而，在聯(lián)合實(shí)驗(yàn)中，將VEGFR-1/NRP-1靶向肽D (CLPRC) (SEQ ID NO 7)與亞治療劑量的脂肪除手(lmg/Kg)聯(lián)合，期望D (CLPRC)的抗血管生成作用會(huì)與脂肪除手的組織消融作用相協(xié)同。當(dāng)動(dòng)物接受這兩種藥物時(shí)，觀察到體重確實(shí)顯著減少了約8克(至約體重的 16% )(圖4B)。接受聯(lián)合治療的動(dòng)物表現(xiàn)出與只接受脂肪除手(以最佳治療劑量3mg/Kg) 的小鼠組(圖4C)(其減輕約10克(20%的體重))類似的體重減輕。總之，這些數(shù)據(jù)證明 VEGFR-1/NRP-1靶向肽引起肥胖癥小鼠體重下降，并且它們可與其他抗肥胖癥治療協(xié)同作用。VEGFR-1/NRP-1靶向肽可在治療人肥胖癥中發(fā)揮重要作用?！鶕?jù)本文公開，無需過多實(shí)驗(yàn)就可制備和實(shí)施本文公開及權(quán)利要求要求保護(hù)的所有組合物和方法。盡管通過優(yōu)選實(shí)施方式描述了本發(fā)明的組合物和方法，但本領(lǐng)域技術(shù)人員明晰，在不脫離本發(fā)明的概念，精神和范圍的前提下，可對(duì)本文所述組合物、方法、步驟或方法步驟的順序做出改變。更具體而言，明顯可用某些化學(xué)和生理學(xué)上相關(guān)的制劑代替本文所說的制劑，并取得相同或類似的結(jié)果。所有本領(lǐng)域技術(shù)人員明晰的類似替代和修飾都在隨附的權(quán)利要求中定義的本發(fā)明的精神，范圍和概念之內(nèi)。
0175]參考文獻(xiàn)
0176]下列參考文獻(xiàn)在一定程度上提供了例示過程或其他對(duì)本文上述的補(bǔ)充性細(xì)節(jié)，將
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權(quán)利要求
1.大小為10個(gè)氨基酸或更小的分離的肽，至少含連續(xù)的氨基酸序列LeuPro Argo
2.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽的大小為7個(gè)氨基酸或更小。
3.權(quán)利要求2的分離的肽，其中所述肽的大小為5個(gè)氨基酸或更小。
4.權(quán)利要求1的分離的肽，還被定義為含CysLeu Pro Arg Cys (SEQ ID NO :1)。
5.權(quán)利要求4的分離的肽，還被定義為由SEQID N0:1構(gòu)成。
6.權(quán)利要求5的分離的肽，還被定義為環(huán)肽。
7.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽由序列LeuPro Arg構(gòu)成。
8.權(quán)利要求7的分離的肽，其中所述肽由D(LeuPro Arg)構(gòu)成。
9.權(quán)利要求1的分離的肽，還被定義為含一個(gè)或多個(gè)D氨基酸。
10.權(quán)利要求9的分離的肽，其中所述肽由D氨基酸構(gòu)成。
11.權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)的分離的肽，其中所述肽附著于分子。
12.權(quán)利要求11的分離的肽，其中所述分子是蛋白，且所述肽與所述蛋白綴合形成蛋白綴合物。
13.權(quán)利要求12的分離的肽，其中所述肽位于所述蛋白末端。
14.權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)的分離的肽，其中所述分子是藥物、化學(xué)治療劑、診斷齊U、放射性同位素、促凋亡劑、抗血管生成劑、激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞毒性劑、肽、蛋白質(zhì)、抗生素、抗體或其片段或單鏈抗體，顯像劑，存活因子，抗凋亡劑，激素拮抗劑，抗原。
15.權(quán)利要求14的分離的肽，其中所述分子是選自下列的促凋亡劑短桿菌肽、馬加寧、蜂毒素、防御素、殺菌肽、(KLAKLAK)2(SEQ ID NO :2)、(KLAKKLA)2(SEQ ID NO 3)； (KAAKKAA) 2 (SEQ ID NO :4)、(KLGKKLG) 3 (SEQ ID NO :5)、Bcl_2、Bad、Bak、Bax、和 Bik。
16.權(quán)利要求14的分離的肽，其中所述分子是選自下列的抗血管生成劑凝血酶敏感蛋白、血管抑素、色素上皮衍生因子、血管緊張素、層粘連蛋白肽、纖維連接蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白細(xì)胞介素-12、血小板因子4、IP-10、 Gro-β、凝血酶敏感蛋白、2-甲氧基雌二醇、增生蛋白相關(guān)蛋白、羧基氨基三唑、CM101、馬立馬司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素2、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利諾胺、 沙立度胺、己酮可可堿、染料木黃酮、TNP-470、內(nèi)皮抑素、紫杉醇、多烯紫杉醇、多胺、蛋白酶體抑制劑、激酶抑制劑、信號(hào)肽、accutin、西多福韋、長(zhǎng)春新堿、博來霉素、AGM-1470、血小板因子4、米諾環(huán)素、內(nèi)皮抑素XVIII、內(nèi)皮抑素XV、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的C端血液結(jié)合素結(jié)構(gòu)域、人纖溶酶原的kringle 5結(jié)構(gòu)域、內(nèi)皮抑素和血管抑素的融合蛋白、內(nèi)皮抑素和人纖溶酶原的kringle 5結(jié)構(gòu)域的融合蛋白、干擾素-γ誘導(dǎo)的單核因子(Mig)、Mig和IPlO的融合蛋白、可溶性FLT-I (鰭樣酪氨酸激酶1受體)、和激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)。
17.權(quán)利要求14的分離的肽，其中所述分子是選自下列的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-I(IL-I)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-IU IL-12、IL-18、干擾素-γ (IFi )、IF-α、IF-β、 腫瘤壞死因子、和GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)。
18.權(quán)利要求11的分離的肽，其中所述肽附著于高分子復(fù)合物。
19.權(quán)利要求18的分離的肽，其中所述復(fù)合物是病毒、噬菌體、細(xì)菌、脂質(zhì)體、微顆粒、 磁珠、酵母細(xì)胞、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的分離的肽，其中所述肽與病毒連接。
21.權(quán)利要求20的分離的肽，其中所述病毒是慢病毒、乳多空病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、AAV、牛痘病毒或皰疹病毒。
22.權(quán)利要求1 21中任一項(xiàng)的分離的肽，其中所述肽附著于固體支持物。
23.權(quán)利要求22的分離的肽，其中所述固體支持物是微孔盤或微芯片。
24.蛋白融合構(gòu)建體，其含權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)的分離的肽，所述肽融合選定蛋白形成蛋白融合構(gòu)建體，其中所述蛋白融合構(gòu)建體不是天然存在的蛋白。
25.權(quán)利要求對(duì)的融合構(gòu)建體，其中所述選定蛋白是促凋亡劑、抗血管生成劑、激素、 細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞毒性劑、蛋白抗生素、抗體或其片段或單鏈、抗凋亡劑、激素拮抗劑、或抗原。
26.權(quán)利要求25的融合構(gòu)建體，其中所述選定蛋白是選自下列的促凋亡劑短桿菌肽、 馬加寧、蜂毒素、防御素、殺菌肽、(KLAKLAK)2 (SEQ ID NO :2)、(KLAKKLA)2 (SEQ ID NO :3)、 (KAAKKAA) 2 (SEQ ID NO :4)、(KLGKKLG) 3 (SEQ ID NO :5)、Bcl_2、Bad、Bak、Bax、和 Bik。
27.權(quán)利要求25的融合構(gòu)建體，其中所述選定蛋白是選自下列的抗血管生成劑凝血酶敏感蛋白、血管抑素、色素上皮衍生因子、血管緊張素、層粘連蛋白肽、纖維連接蛋白肽、 纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白細(xì)胞介素-12、血小板因子4、 IP-10、2-甲氧基雌二醇、增生蛋白相關(guān)蛋白、血管生成素2、16K催乳素片段、內(nèi)皮抑素、內(nèi)皮抑素XVIII、內(nèi)皮抑素XV、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的C端血液結(jié)合素結(jié)構(gòu)域、人纖溶酶原的 kringle 5結(jié)構(gòu)域、內(nèi)皮抑素和血管抑素的融合蛋白、內(nèi)皮抑素和人纖溶酶原的kringle 5 結(jié)構(gòu)域的融合蛋白、干擾素-Y誘導(dǎo)的單核因子(Mig)、Mig和IPlO的融合蛋白、可溶性 FLT-I (鰭樣酪氨酸激酶1受體)、和激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)。
28.權(quán)利要求25的融合構(gòu)建體，其中所述選定蛋白是選自下列的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-I(IL-I)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-IU IL-12、IL-18、干擾素-γ (IFi )、IF-α、IF-β、 腫瘤壞死因子、和GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)。
29.制備VEGFR-1/NRP-1靶向構(gòu)建體的方法，其包括 獲得權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)的肽，及眷將所述肽附著于分子，以制備所述構(gòu)建體。
30.將分子或蛋白遞送靶向表達(dá)VEGFR-I或NRP-I的細(xì)胞的方法，所述方法包括下列步驟(a)獲得 權(quán)利要求11 21中任一項(xiàng)的肽， 權(quán)利要求M 28中任一項(xiàng)的蛋白融合構(gòu)建體，或 根據(jù)權(quán)利要求四的方法制備的靶向構(gòu)建體；及(b)將所述肽或蛋白融合構(gòu)建體施用于細(xì)胞群，由此將所述分子或蛋白遞送到所述細(xì)胞，其中所述群包括表達(dá)VEGFR-I或NRP-I的細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30的方法，其中， 所述表達(dá)VEGFR-I或NRP-I的細(xì)胞在受試者中， 將所述肽或蛋白融合構(gòu)建體配于藥學(xué)可接受的組合物中，及 將所述組合物施用于所述受試者。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述受試者是人受試者。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述方法還被定義為檢測(cè)方法，且所述方法還包括檢測(cè)已遞送到所述細(xì)胞的所述肽或蛋白。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述受試者患有疾病或病癥，且所述方法還被定義為治療方法。
35.權(quán)利要求34的方法，受試者患有血管生成組分上的疾病或病癥，且所述受試者需要抗血管生成治療。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述疾病或病癥是過度增生疾病、體重失調(diào)、肥胖癥、糖尿病、哮喘、關(guān)節(jié)炎、硬化、或眼病。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述受試者患有過度增生疾病。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述過度增生疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、骨關(guān)節(jié)炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纖維瘤、血管閉塞、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、瘤前病變 (如腺瘤性增生和前列腺上皮內(nèi)瘤)、原位癌、口腔毛狀白斑、或牛皮癬。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述過度增生疾病是癌癥。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述癌癥選自牙齦癌、舌癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、 眼癌、腦癌、白血病、間皮瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、頭癌、頸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、子宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦癌、結(jié)腸癌、肉瘤和膀胱癌。
41.權(quán)利要求36的方法，其中所述受試者患有以眼內(nèi)細(xì)胞增生或新血管生成為特征的眼疾病或病癥。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述眼病選自老年性黃斑變性、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、青光眼、和增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變。
43.權(quán)利要求34的方法，其中所述受試者患有體重失調(diào)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子醫(yī)學(xué)和治療劑靶向遞送的領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及新肽序列的鑒定，所述新肽序列包含氨基酸Leu-Pro-Arg(LPR)，尤其是D(LPR)，它們選擇性靶向表達(dá)VEGFR-1和NRP-1的細(xì)胞。本發(fā)明的靶向分子可用于治療和檢測(cè)新血管生成或血管生成VEGF相關(guān)病癥，所述病癥包括但不限于癌癥、肥胖癥、糖尿病、哮喘、關(guān)節(jié)炎、硬化和眼病。
文檔編號(hào)C07K5/08GK102264755SQ200880110564
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2008年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月8日
發(fā)明者A·P·瓦倫特, F·塞尼維瓦拉塞爾達(dá)德埃爾梅達(dá), M·卡爾多-維拉, R·喬爾達(dá)諾, R·帕斯奎利尼, W·阿拉普 申請(qǐng)人:得克薩斯大學(xué)體系董事會(huì), 里約熱內(nèi)盧聯(lián)合大學(xué)