專(zhuān)利名稱(chēng)：胰島素樣生長(zhǎng)因子融合蛋白的制作方法
胰島素樣生長(zhǎng)因子融合蛋白本發(fā)明涉及胰島素樣生長(zhǎng)因子融合多肽和二聚體；編碼所述多肽的核酸分子和使 用所述多肽/二聚體的治療方法。IGF-I是一種70個(gè)氨基酸的多肽，分子量為7. 6kD。與其它細(xì)胞相比，IGF-I刺激 軟骨細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致骨骼生長(zhǎng)。IGF-I還牽涉在肌肉的發(fā)育中。IGF-I是與受體酪氨 酸激酶(RTK)超家族的成員相互作用的蛋白配體的實(shí)例。大約98%的IGF-I結(jié)合于六種結(jié) 合蛋白(IGF-BP)中的一種。IGF-BP3是最大量的，占IGF-I結(jié)合的80%。IGF-I結(jié)合兩種 受體IGF-1受體(IGFR)和胰島素受體(IR)；其中前者與IGF-I以較高的親和力結(jié)合。除 了 IGFlR外，RTK超家族的其它成員包括胰島素受體(IR)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR，也稱(chēng) 作ErbBl)和相關(guān)的ErbB受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGFR)。這 些受體的胞外結(jié)構(gòu)域各含有各種不同結(jié)構(gòu)的多個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，包括免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、富 含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、EGF樣結(jié)構(gòu)域。這些細(xì)胞因子受體家族的激活認(rèn)為是由配體介導(dǎo)的 寡聚化引起的，大多數(shù)情況下可能是二聚化作用。
其它激素系統(tǒng)可與IGF-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用。比如，人類(lèi)生長(zhǎng)激素，也稱(chēng)作生長(zhǎng)激 素，是一種大約190個(gè)氨基酸的蛋白激素/細(xì)胞因子，由垂體前葉的細(xì)胞合成并分泌。生長(zhǎng) 激素具有控制幾種復(fù)雜的生理過(guò)程的功能，這其中包括生長(zhǎng)和代謝。生長(zhǎng)激素可具有通過(guò) 結(jié)合響應(yīng)細(xì)胞表達(dá)的生長(zhǎng)激素受體的直接作用，和主要通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)介 導(dǎo)的間接作用。因此，生長(zhǎng)激素的一種主要作用是刺激肝臟產(chǎn)生IGF-1。缺少I(mǎi)GF-I的產(chǎn)生或者IGF-I不敏感導(dǎo)致的病理學(xué)是本領(lǐng)域已知的。嚴(yán)重的原發(fā) 性IGF-I缺乏的一個(gè)實(shí)例是拉倫侏儒癥。因?yàn)榛颊卟槐磉_(dá)生長(zhǎng)激素受體，這種疾病對(duì)于生 長(zhǎng)激素的治療不響應(yīng)。嚴(yán)重原發(fā)性IGF-I缺乏的其它類(lèi)型包括帶有生長(zhǎng)激素受體突變和 IGF-I或者IGFR突變的患者。除此之外，已經(jīng)評(píng)估了重組IGF-I在治療大量疾患，例如I型 和II型糖尿病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、嚴(yán)重?zé)齻蛷?qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良中的作用。眾所 周知IGF-I在腫瘤的維持中起作用，所以IGF-I的拮抗劑將對(duì)癌癥治療具有治療價(jià)值。本公開(kāi)涉及IGF-I的重組形式的鑒定，該形式具有改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)和活性。新的IGF-I分子具有生物學(xué)活性，形成二聚體，并且具有改進(jìn)的穩(wěn)定 性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種核酸分子，該核酸分子包含一種核酸序列，該 核酸序列編碼具有胰島素樣生長(zhǎng)因子的活性的多肽，所述多肽包含胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽 直接或者間接連接的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種融合多肽，該融合多肽包含胰島素樣生長(zhǎng)因 子多肽或者其活性部分直接或者間接與胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽受體多肽的至少一個(gè)胰島 素樣生長(zhǎng)因子多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的氨基酸序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含富含亮氨酸的氨基酸基序 或者由富含亮氨酸的氨基酸基序組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述富含亮氨酸的氨基酸基序包含SEQID NO 14的 氨基酸31-179或者由SEQ ID NO 14的氨基酸31-179組成。
在本發(fā)明的替代優(yōu)選實(shí)施方案中，所述富含亮氨酸的氨基酸基序包含SEQ ID NO 14的氨基酸229-487或者由SEQ ID NO 14的氨基酸229-487組成。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含至少一個(gè)纖維粘連蛋白 (fibronectirOlII結(jié)合結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地所述結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :14的氨基酸殘基 494-606或者由SEQ ID NO 14的氨基酸殘基494-606組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽連接于所述富含亮氨酸的結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽位于所述融合多肽中所述富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域 的氨基末端。
在本發(fā)明的替代優(yōu)選實(shí)施方案中，胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽連接于所述富含亮氨酸 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽位于所述融合多肽中所述富含亮氨酸的結(jié) 構(gòu)域的羧基末端。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽連接于所述纖維粘連蛋白 III結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽位于所述融合多肽中所述纖維粘連蛋白 III結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基末端。在本發(fā)明的替代優(yōu)選實(shí)施方案中，胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽連接于所述纖維粘連蛋 白III結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽位于所述融合多肽中所述纖維粘連蛋 白III結(jié)合結(jié)構(gòu)域的羧基末端。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽由肽連接序列，優(yōu)選地柔性 肽連接序列連接于胰島素樣生長(zhǎng)因子受體多肽的富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽連接分子包含至少一份拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽連接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9或者10份拷 貝的肽 Gly Gly Gly Gly Ser0在本發(fā)明的替代實(shí)施方案中，所述多肽不包含肽連接分子，且所述多肽是胰島素 樣生長(zhǎng)因子多肽與胰島素樣生長(zhǎng)因子受體多肽的富含亮氨酸的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的直接融合多 肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種核酸分子，包括選自以下的核酸序列i)SEQ ID NO 1所表示的核酸序列；ii)SEQ ID NO 3所表示的核酸序列；iii)SEQ ID NO 5所表示的核酸序列；iv) SEQ ID NO 7所表示的核酸序列；v) SEQ ID NO 9所表示的核酸序列；vi) SEQ ID NO 11所表示的核酸序列；或者包含如下核酸序列的核酸分子，該核酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下與SEQ ID NO :1、 3、5、7、9或者11雜交并編碼具有胰島素樣生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)活性的多肽。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼具有激動(dòng)劑活性的多肽。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼具有拮抗劑活性的多肽。當(dāng)兩個(gè)互補(bǔ)的核酸分子形成相當(dāng)數(shù)量的氫鍵彼此結(jié)合時(shí)，核酸分子的雜交就會(huì)發(fā) 生。雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性會(huì)因?yàn)楹怂岱肿又車(chē)沫h(huán)境條件、雜交方法的性質(zhì)、所用的核酸分子的組成和長(zhǎng)度而變化。關(guān)于獲得具體程度的嚴(yán)謹(jǐn)性所要求的雜交條件的計(jì)算在Sambrook等 人，Molecular Cloning :ALaboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))(Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor，NY,2001)；禾口 Tijssen，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic AcidProbes Part I，Chapter 2 (生物化學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)-與核酸探針雜交，第I部分第2章) (Elsevier, New York, 1993)中討論。Tm是指50%的核酸分子給定鏈與其互補(bǔ)鏈雜交時(shí)的 溫度。以下是雜交條件的示例性設(shè)置，不意為限制驢細(xì)，謎(介Λ午辟Φ 90%_—性請(qǐng)歹丨丨棘)雜交5XSSC在65°C雜交16小時(shí)洗滌兩次2 X SSC在室溫(RT)進(jìn)行，每次15分鐘洗滌兩次0· 5 X SSC在65°C進(jìn)行，每次20分鐘細(xì)，謎(介Λ午辟Φ 80%細(xì)一性請(qǐng)歹丨丨棘)雜交5X_6XSSC在 65°C _70°C雜交 16-20 小時(shí)洗滌兩次2 X SSC在RT進(jìn)行，每次5-20分鐘洗滌兩次1 X SSC在55°C -70°C進(jìn)行，每次30分鐘低經(jīng)謝牛(介Λ午辟Φ 50%細(xì)一性請(qǐng)歹丨辦)雜交6XSSC在 RT_55°C雜交 16-20 小時(shí)洗滌最少兩次2 X -3 X SSC在RT_55°C進(jìn)行，每次20_30分鐘在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 1所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO 1所表示的核酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 3所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO :3所表示的核酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 5所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO :5所表示的核酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 7所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO :7所表示的核酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 9所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO :9所表示的核酸序列組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :11所表示的核酸序列 或者由SEQ ID NO 11所表示的核酸序列組成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了由根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼的多肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供了包含選自SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、 15、16、17、18、19或者20組成的組的氨基酸序列或者由選自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、 15、16、17、18、19或者20組成的組的氨基酸序列組成的多肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了由兩種多肽組成的同源二聚體，其中每種多肽包 括i)第一部分，包含胰島素樣生長(zhǎng)因子或者其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，任選地由肽連接分 子連接到ii)第二部分，包含胰島素樣生長(zhǎng)因子受體的至少一個(gè)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其部分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述同源二聚體包含兩種包括SEQ IDN0:2、4、6、8、 10、12、15、16、17、18、19 或者 20 或者由 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、15、16、17、18、19 或者 20組成的多肽。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體是適于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)載體。包含根據(jù)本發(fā)明的核酸的載體不需要包含啟動(dòng)子或者其它調(diào)節(jié)序列，尤其是在該 載體用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞來(lái)整合到基因組中進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的時(shí)候。優(yōu)選地，為了在宿主細(xì) 胞中轉(zhuǎn)錄，載體中的核酸可操作地連接合適的啟動(dòng)子或者其它調(diào)節(jié)元件。載體可以是雙功 能表達(dá)載體，可以在多種宿主起作用。“啟動(dòng)子”是指在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，包含轉(zhuǎn)錄所需 要的所有調(diào)節(jié)區(qū)域的核苷酸序列。合適的啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、誘 導(dǎo)型啟動(dòng)子、發(fā)育型啟動(dòng)子或者用于在真核細(xì)胞或者原核細(xì)胞表達(dá)的其它啟動(dòng)子?！翱刹僮?地連接”表示連接為同一核酸分子的一部分，對(duì)于將從啟動(dòng)子起始的轉(zhuǎn)錄合適地定位和定 向?？刹僮鞯剡B接到啟動(dòng)子的DNA是在啟動(dòng)子的“轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)下”。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或者可調(diào)節(jié)的啟 動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供了轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子 或者載體的細(xì)胞。優(yōu)選地所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。替代地所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自下組真菌細(xì)胞(比如畢赤酵母屬 (Pichia spp)、酵母菌屬(Saccharomyces spp)、鏈孢霉屬(Neurosporaspp))；昆蟲(chóng)細(xì)胞 (比如灰翅夜蛾屬(Spodoptera spp))；哺乳動(dòng)物細(xì)胞(比如COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞)；植物細(xì) 胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的多肽并包含賦形劑或 者載體的藥物組合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物組合有進(jìn)一步的治療劑。當(dāng)給藥時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物以藥學(xué)上可接受的制劑給藥。這些制劑通?？砂?含制藥學(xué)上可接受的濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容的載體和任選地其它治療劑。本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)包括注射的任何常規(guī)路徑給藥。給藥和施用可以是， 例如口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、局部(眼睛、皮膚(比如膏狀脂質(zhì)可溶 插入物插入到皮膚或者粘膜)、經(jīng)皮或者鼻內(nèi)的。本發(fā)明的藥物組合物以有效量給藥?！坝行Я俊笔侵竼为?dú)或者與進(jìn)一步劑量或協(xié)同 作用的藥物聯(lián)用時(shí)產(chǎn)生期望的反應(yīng)的藥物/組合物的量。這種反應(yīng)可能僅包括暫時(shí)延緩疾 病的發(fā)展，當(dāng)然更優(yōu)選地包括永久性地停止疾病的發(fā)展。這可以通過(guò)常規(guī)方法監(jiān)測(cè)或者按 照診斷方法監(jiān)測(cè)。向受治療者給藥的藥物組合物的劑量可以按照不同的參數(shù)來(lái)選擇，特別是按照所 用的給藥方式和受治療者的狀態(tài)(比如年紀(jì)、性別)。當(dāng)給藥時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物以藥 學(xué)上可接受的量和藥學(xué)上可接受的組合物來(lái)施加。當(dāng)用作藥物時(shí)，鹽類(lèi)應(yīng)該是藥學(xué)上可接受的；但藥學(xué)上不可接受的鹽類(lèi)可方便地用于制備其藥學(xué)上可接受的鹽類(lèi)，不排除在本發(fā) 明范圍之外。這些藥理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽類(lèi)包括但不限于從以下酸制備的鹽類(lèi)鹽酸、 氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來(lái)酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、蟻酸、丙二酸、琥珀酸和類(lèi)似酸。藥 學(xué)上可接受的鹽類(lèi)還可制備為堿金屬鹽類(lèi)或者堿土金屬鹽類(lèi)，比如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。如果需要的話(huà)，藥物組合物可以與藥學(xué)上可接受的載體組合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥 學(xué)上可接受的載體”是指適合用于人體給藥的一種或者多種相容的固態(tài)或者液態(tài)填充劑、 稀釋劑、或包封物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“載體”指的是自然產(chǎn)生的或者是合成的無(wú)機(jī)或者有機(jī)的成分， 活性成分與其混合有利于施用。藥物組合物的成分還能夠以不會(huì)產(chǎn)生大致上損害預(yù)期的藥 效的相互作用的方式與本發(fā)明的分子共同混合，和互相共同混合。藥物組合物可以含有合適的緩沖劑，包括乙酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽和 磷酸鹽。藥物組合物還可以任選地含有合適的防腐劑，比如苯扎氯銨、三氯叔丁醇、對(duì)羥苯 甲酸酯、硫柳汞。藥物組合物可以方便地以單位劑量形式存在，可以用藥學(xué)上眾所周知的任何方法 制備。所有的方法包括將活性劑與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體組合的步驟。一般來(lái) 講，藥物組合物是如下制備的通過(guò)將活性化合物與液態(tài)載體、磨碎的固態(tài)載體或兩者均一 地和緊密地組合，隨后如果需要的話(huà)，將產(chǎn)品成型。適于口服給藥的藥物組合物可以制備為分散的單位，比如膠囊、片劑、錠劑，這些 劑型各含有預(yù)先確定量的活性化合物。其它組合物包括含水液態(tài)懸浮物和非含水液態(tài)懸浮 物，后者比如糖漿、酏劑或乳劑。適于腸胃外給藥的藥物組合物合適地包括無(wú)菌的含水或者非含水制劑，該制劑優(yōu) 選地與接受者的血液等滲。這種制劑可以按照已知的方法選用合適的分散劑或濕潤(rùn)劑和懸 浮劑制備。無(wú)菌的可注射的制劑還可以是在無(wú)毒的腸胃外可接受的稀釋劑或者溶劑中的無(wú) 菌的溶液或者懸浮液，比如1，3_ 丁二醇中的溶液?？刹捎玫目梢越邮艿娜軇┌ㄋ⒘指?氏溶液和等滲的氯化鈉溶液。除此以外，常規(guī)地采用無(wú)菌的不揮發(fā)油作為溶劑或者懸浮介 質(zhì)。為此目的，任何性質(zhì)溫和的不揮發(fā)油都可以應(yīng)用，包括合成的單甘油酯或者二甘油酯。 除此以外，脂肪酸比如油酸可以用來(lái)制備注射制劑。適于口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等給藥方 式的載體制劑可參考Remington' sPharmaceutical Sciences (雷明登氏制藥科學(xué))，Mack Publishing Co. , Easton, ΡΑ。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了治療患有與嚴(yán)重的原發(fā)性胰島素樣生長(zhǎng)因子 缺乏相關(guān)的疾病或者疾患的人類(lèi)受治療者的方法，包括給藥有效量的至少一種根據(jù)本發(fā)明 的多肽。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述嚴(yán)重的原發(fā)性缺乏是拉倫侏儒癥。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選方法中，所述疾病是對(duì)于生長(zhǎng)激素治療不響應(yīng)的疾病。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選方法中，所述疾病是I型糖尿病。在本發(fā)明的替代優(yōu)選方法中，所述疾病是II型糖尿病。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選方法中，所述疾病是肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選方法中，所述疾病是強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良。
在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選方法中，所述疾患是嚴(yán)重?zé)齻?根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了一種治療患有癌癥患者的人類(lèi)受治療者的方法，包括給藥有效量的根據(jù)本發(fā)明的多肽拮抗劑。本文所用的術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指具有自主生長(zhǎng)能力的細(xì)胞，即以細(xì)胞的快速增殖生長(zhǎng)為特征的一種非正常的狀態(tài)或情況。該術(shù)語(yǔ)意為包括所有類(lèi)型的癌性生長(zhǎng)和致癌過(guò)程、轉(zhuǎn) 移的組織或者惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，不論組織病理學(xué)的類(lèi)型或者侵襲的階段。術(shù)語(yǔ) “癌癥”包括各種器官系統(tǒng)的惡性腫瘤，比如影響肺、乳腺、甲狀腺、淋巴組織、胃腸、生殖泌 尿道的癌，也包括腺癌，腺癌包括諸如大多數(shù)的結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌和/或睪丸腫 瘤、非小細(xì)胞肺癌、小腸癌和食管癌。術(shù)語(yǔ)“腺癌”是領(lǐng)域公認(rèn)的，指上皮或者內(nèi)分泌組織的 惡性腫瘤，包括呼吸系統(tǒng)癌、胃腸系統(tǒng)癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌、睪丸癌、乳腺癌、前列腺癌、內(nèi)分 泌系統(tǒng)癌、和黑素瘤。示例性癌包括從宮頸、肺、前列腺、乳腺、頭和頸、結(jié)腸和卵巢組織形成 的癌。術(shù)語(yǔ)“癌”還包括癌肉瘤，如包括癌性組織和肉瘤樣組織構(gòu)成的惡性腫瘤?！跋侔笔?指癌來(lái)源于腺體組織或者其中腫瘤細(xì)胞形成可辨別的腺體結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“肉瘤”是領(lǐng)域公認(rèn) 的，指來(lái)源于間充質(zhì)的惡性腫瘤。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述多肽靜脈內(nèi)給藥。在本發(fā)明的替代優(yōu)選方法中，所述多肽皮下給藥。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選方法中，所述多肽以每?jī)商斓拈g隔給藥；優(yōu)選地所述多肽 以每周、兩周或者每月的間隔給藥。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽或者二聚體的單克隆 抗體。優(yōu)選地，所述單克隆抗體是結(jié)合多肽或者二聚體但不特異性地單獨(dú)結(jié)合胰島素樣 生長(zhǎng)因子或者胰島素樣生長(zhǎng)因子受體的抗體。該單克隆抗體結(jié)合本發(fā)明的多肽或者包含本發(fā)明的多肽的二聚體呈遞的構(gòu)象抗 原。在本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供了制備生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤 細(xì)胞系的方法，包括如下步驟i)用包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽或者其片段的免疫原對(duì)免疫活性的哺乳動(dòng) 物進(jìn)行免疫；ii)將所述免疫后免疫活性的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合從而形成雜 交瘤細(xì)胞；iii)篩選步驟(ii)中所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體對(duì)(i)中所述多肽的結(jié) 合活性；iv)培養(yǎng)所述雜交瘤細(xì)胞使其增殖和/或分泌所述單克隆抗體；并ν)從培養(yǎng)物的上清液回收所述單克隆抗體。優(yōu)選地，所述免疫活性的哺乳動(dòng)物是小鼠?？蛇x地，所述免疫活性的哺乳動(dòng)物是大鼠。用雜交瘤細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生單克隆抗體是領(lǐng)域公知的。產(chǎn)生單克隆抗體的方法由 Kohler 和 Milstein 在 Nature 256. 495-497 (1975)公開(kāi)，也由 Donillard 和 Hoffman 在 Schwartz，1981 編著的 Immunology V. II (免疫學(xué)第七版)摘要中的 “Basic Facts about Hybridomas (關(guān)于雜交瘤的基本事實(shí))”公開(kāi)，通過(guò)引用并入。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的或者可獲得的雜交瘤細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了檢測(cè)生物樣品中的根據(jù)本發(fā)明的多肽的診斷檢 測(cè)方法，包括以下步驟i)提供分離的待檢的樣品；ii)使所述樣品接觸結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽或者二聚體的配體；并iii)檢測(cè)所述樣品中所述配體的結(jié)合。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述配體是抗體；優(yōu)選地是單克隆抗體。本申請(qǐng)中遍及說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)的用語(yǔ)“包含(comprise) ”和“含有 (contain) ”和它們的衍生詞匯，比如“包含(comprising) ”和“包含(comprises) ”表示“包 括但并不局限于”，而且并不意為(和并不)排除其它部分、添加物、組分、整體或者步驟。除非上下文另外地要求，否則本申請(qǐng)中遍及說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中的單數(shù)形式涵 蓋復(fù)數(shù)形式。特別是，除非上下文另外地要求，否則當(dāng)使用不定冠詞時(shí)，該描述應(yīng)理解為涵 蓋單數(shù)形式和復(fù)數(shù)形式。除非與其不相容，否則結(jié)合本發(fā)明的具體方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅男再|(zhì)、整 體、特征、化合物、化學(xué)部分或者基團(tuán)應(yīng)理解為可應(yīng)用于本文描述的任何其它方面、實(shí)施方 案或?qū)嵤├?。本發(fā)明的實(shí)施方案將僅以示例的方式參考以下圖來(lái)描述表1概括了融合蛋白的命名；圖Ia表示LR 5A1的核酸序列，圖Ib表示LR 5A1的氨基酸序列；圖2a表示LR 5B1的核酸序列，圖2b表示LR 5B1的氨基酸序列；圖3a表示LR 5C1的核酸序列，圖3b表示LR 5C1的氨基酸序列；圖4a表示LR 5D1的核酸序列，圖4b表示LR 5D1的氨基酸序列；圖5a表示LR 5E1的核酸序列，圖5b表示LR 5E1的氨基酸序列；圖6a表示LR 5F1的核酸序列，圖6b表示LR 5F1的氨基酸序列；圖7表示人類(lèi)IGF-IA的氨基酸序列；圖8表示人類(lèi)IGF-I受體的氨基酸序列；圖9PCR用于產(chǎn)生由側(cè)翼為合適的限制性酶切位點(diǎn)的目標(biāo)基因組成的DNA(限制性酶切位點(diǎn)包含在引物R1-4中)。b)將PCR產(chǎn)物連接到合適的載體的連接區(qū)域的各一側(cè)。 c)隨后修飾構(gòu)建體以引入正確的連接序列，該序列不含任何不需要的序列(即，非自身的 限制性酶切位點(diǎn))；

圖10寡核苷酸設(shè)計(jì)為形成具有獨(dú)特重疊區(qū)的部分雙鏈區(qū)域，當(dāng)退火和加工時(shí)該 寡核苷酸將編碼將退火到受體和配體的帶有側(cè)翼區(qū)的連接序列。b)用“megaprimer”和末 端引物(Rl和R2)進(jìn)行PCR方法來(lái)產(chǎn)生LR-融合基因。Rl和R2引物設(shè)計(jì)為引入有用的側(cè) 翼限制性酶切位點(diǎn)用于連接到目標(biāo)載體；圖IlA展示了 CHO細(xì)胞表達(dá)的5A1的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。在DTT存在下如所述地制 備樣品。泳道1 分子量標(biāo)記，泳道2 :5A1(從穩(wěn)定細(xì)胞系100X濃縮的培養(yǎng)基)，泳道3 5A1的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(DNA :fugene 6按照3:2)，泳道4 :5A1的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(DNA :fugene 6按照 3:1)，泳道5 :5A1的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(DNA+TranslT)，泳道6 載體對(duì)照(從lB7stop穩(wěn)定細(xì)胞系 100X濃縮的培養(yǎng)基)，泳道7 陽(yáng)性對(duì)照，IOOng rh-IGF-1。圖IlB 展示了用5A1以較長(zhǎng)曝光時(shí)間再次進(jìn)行探測(cè)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果泳道1 標(biāo)準(zhǔn)物；泳道2 :5A1(從穩(wěn)定細(xì)胞系IOOX 濃縮的培養(yǎng)基)，5A1作為75和40kDa的主要的兩條帶分離出。非糖基化的分子量大約為 28. 4kDa, IGF-I對(duì)照蛋白分子量為17kDa。圖IlC展示了 5A1培養(yǎng)基樣品在非還原條件下 的電泳結(jié)果。大多數(shù)5A1電泳到250kDa標(biāo)記之上，表示該分子可能通過(guò)二硫鍵連接；圖12A表示重組IGF-I刺激在1 %胎牛血清中生長(zhǎng)3天后的MG63細(xì)胞的酸性磷 酸酶活性的生物學(xué)活性；圖12B表示重組IGF-I刺激在胎牛血清中生長(zhǎng)4天后的MG63 細(xì)胞的酸性磷酸酶活性的生物學(xué)活性；圖12C表示重組IGF-I刺激在2mg/ml BSA中生長(zhǎng)4 天后的MG63細(xì)胞的酸性磷酸酶活性的生物學(xué)活性；圖12D表示重組IGF-I刺激在胎牛 血清中生長(zhǎng)4天后的NIH3T3細(xì)胞的酸性磷酸酶活性的生物學(xué)活性；且圖13A展示了衍生自不表達(dá)5A1的細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)基和衍生自表達(dá)5A1的細(xì)胞的 培養(yǎng)基經(jīng)連續(xù)稀釋后對(duì)在1 %胎牛血清中生長(zhǎng)3天后的MG63細(xì)胞的酸性磷酸酶活性的作用 的比較；圖13B展示了衍生自不表達(dá)5A1的細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)基和衍生自表達(dá)5A1的細(xì)胞的 培養(yǎng)基經(jīng)連續(xù)稀釋后對(duì)在胎牛血清中生長(zhǎng)4天后的MG63細(xì)胞的酸性磷酸酶活性的作用 的比較；圖13C展示了衍生自不表達(dá)5A1的細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)基和衍生自表達(dá)5A1的細(xì)胞的 培養(yǎng)基經(jīng)連續(xù)稀釋后對(duì)在2mg/ml BSA中生長(zhǎng)4天后的MG63細(xì)胞的酸性磷酸酶活性的作用 的比較；圖13D展示了衍生自不表達(dá)5A1的細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)基和衍生自表達(dá)5A1的細(xì)胞的 培養(yǎng)基經(jīng)連續(xù)稀釋后對(duì)在胎牛血清中生長(zhǎng)4天后的OTH3T3細(xì)胞的酸性磷酸酶活性的作 用的比較。材料和方法
體外檢測(cè)用于檢測(cè)和評(píng)價(jià)IGF-I的活性的體外檢測(cè)是本領(lǐng)域已知的。比如Pietrzkowski 等(Molecular and Cellular Biology (分子和細(xì)胞生物學(xué))(1992)第 12 卷，no 9 P3883-3889)闡述了在BALB 3T3細(xì)胞中表達(dá)IGF-I受體，并且暴露于IGF-I導(dǎo)致刺激細(xì)胞 增殖和IGF-I受體的自磷酸化。還參見(jiàn)Flier等人(PNAS(1986)83 :664_668)，闡述了用拮 抗性單克隆抗體來(lái)阻斷IGF-I引起的IGF-I受體激活。體內(nèi)檢測(cè)各種IGF-I的動(dòng)物模型都可以用來(lái)檢測(cè)IGF-I的活性。比如Lembo等人 (J. Clinical Investigation (1999) 98，2648-2655)闡述了一種 IGF-I 突變小鼠攜帶突 變的等位基因?qū)е乱吧虸GF-I水平有30%的降低，但是小鼠可以存活到成年。Liu等 人(Cell(1993) 75 :59_72)和 Powell-Braxton 等人(Genes and Development(1993)7 2609-2617)闡述了純合小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的胚胎和產(chǎn)后生長(zhǎng)缺陷。免疫檢測(cè)測(cè)量IGF-I對(duì)多克隆抗體和單克隆抗體的結(jié)合的免疫測(cè)定是本領(lǐng)域已知的?？?購(gòu)買(mǎi)獲得的IGF-I抗體可用來(lái)檢測(cè)樣品中的IGF-1，也可用于競(jìng)爭(zhēng)抑制研究。比如參見(jiàn) http//www, abeam, com/index, html，Abeam PLC0融合蛋白的重組生產(chǎn)融合蛋白的組成部分由PCR產(chǎn)生，使用的引物設(shè)計(jì)為能夠與配體或者受體退火并 且為了克隆到目標(biāo)載體引入合適的限制性酶切位點(diǎn)(圖9a)。用于PCR的模板包含目標(biāo)基 因，從IMAGE克隆、cDNA文庫(kù)或者從定制合成的基因獲得。合成帶有合適的側(cè)翼限制性酶切位點(diǎn)的配體和受體基因后，隨后將其連接到目標(biāo)載體中連接區(qū)域的各一側(cè)(圖9b)。然后 修飾構(gòu)建體使其含有不帶有側(cè)翼限制性酶切位點(diǎn)的正確的連接序列，這是通過(guò)在連接區(qū)域 的各一側(cè)的兩個(gè)獨(dú)特限制性酶切位點(diǎn)之間插入定制合成長(zhǎng)度的DNA，通過(guò)ssDNA修飾技術(shù) 來(lái)突變連接區(qū)域，和通過(guò)插入引物二聚體/多聚體到合適的限制性酶切位點(diǎn)間或者PCR修 飾來(lái)實(shí)現(xiàn)的(圖9c)?？蛇x地，設(shè)計(jì)為退火到所選配體或者受體區(qū)域的帶有側(cè)翼序列的連接序列，通過(guò) 產(chǎn)生寡核苷酸二聚體來(lái)初始合成，對(duì)其加工來(lái)產(chǎn)生雙鏈DNA(圖IOa)。然后使用連接序列作 為“megaprimer”來(lái)進(jìn)行PCR，引物設(shè)計(jì)為針對(duì)“megaprimer”退火到的配體和受體的相對(duì)末 端，受體和配體作為模板。末端引物設(shè)計(jì)為帶有合適的限制性酶切位點(diǎn)用于連接到選擇的 表達(dá)載體中(圖IOb)。
融合蛋白的表汰和純化在合適的表達(dá)系統(tǒng)(比如哺乳動(dòng)物CHO細(xì)胞、大腸桿菌)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)取決于在 其中產(chǎn)生LR融合基因的載體。隨后用多種方法來(lái)分析表達(dá)，包括SDS-PAGE、非變性PAGE、 蛋白質(zhì)印跡法、ELISA的一種或者多種。達(dá)到合適的表達(dá)水平后，以更大規(guī)模表達(dá)LR融合蛋白以產(chǎn)生足夠用于純化和接 下來(lái)的分析的蛋白。純化采用合適組合的一種或者多種層析過(guò)程，比如離子交換層析、疏水 相互作用層析、硫酸銨沉淀、凝膠過(guò)濾、尺寸排阻和/或者親和層析(使用鎳鈷樹(shù)脂、固定化 的抗體樹(shù)脂和/或者固定化的配體/受體樹(shù)脂)。使用很多方法來(lái)分析純化的蛋白，可包括 Bradford測(cè)定、SDS-PAGE、非變性PAGE、蛋白質(zhì)印跡法、ELISA的一種或者多種。LR融合蛋白的表征用變性PAGE、非變性PAGE凝膠和蛋白質(zhì)印跡法來(lái)分析融合多肽，蛋白質(zhì)印跡法以 對(duì)LR融合蛋白非構(gòu)象敏感性的抗體來(lái)進(jìn)行。非變性溶液狀態(tài)的分子量信息可從諸如使用 Superose G200分析柱的尺寸排阻層析和分析性超速離心等技術(shù)獲得。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如果兩組數(shù)據(jù)的方差是正常分布則采用Student檢驗(yàn)來(lái)比較，如果不是正常分布 則采用Student-Satterthwaite檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)分布采用F檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)。采用單因素ANOVA 來(lái)比較3組或者更多組的平均值，如果顯著性水平的ρ值小于0. 05，則用Durmett檢驗(yàn)進(jìn) 行單獨(dú)比較。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)在5%顯著性水平均是雙側(cè)檢驗(yàn)，對(duì)漏測(cè)值不進(jìn)行填補(bǔ) (imputation)。嵌合克隆的構(gòu)建所有的克隆均采用限制性?xún)?nèi)切酶Nhel/HindlII連接到哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒 PSecTag-Iink中。為了能夠有效分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中，將克隆連接到人類(lèi)IGF-I的分泌信 號(hào)。5A1的全基因是使用基因合成克隆的，并克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pSecTag-link中形 成 pIGFsecTag_5Alο哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)應(yīng)用修飾的Invitrogen公司的載體pSecTag-V5/FRT_Hist建立哺乳動(dòng)物表達(dá)系 統(tǒng)。InvitroRen 公司的 Flp-In 系統(tǒng),這個(gè)系統(tǒng)允許為了高表達(dá)快速地產(chǎn)生克隆到宿主基因組中特定位點(diǎn)中的穩(wěn)定的克隆。分泌的蛋白和在胞質(zhì)表達(dá)的蛋白都可以用這個(gè)系統(tǒng)。Flp-In宿主細(xì)胞系(flp-In CHO)具有位于轉(zhuǎn)錄活躍的基因組位點(diǎn)的單個(gè)Flp重組酶目標(biāo)(FRT)位點(diǎn)。通過(guò)共同轉(zhuǎn)染載 體(含有FRT靶位點(diǎn))和pOG44 (瞬時(shí)表達(dá)f Ip重組酶的質(zhì)粒)到Flp-in細(xì)胞系中得到穩(wěn) 定細(xì)胞系。用潮霉素B進(jìn)行選擇。對(duì)于克隆的選擇是不必要的，因?yàn)镈NA的整合是定向的。 Flp-In細(xì)胞系的培養(yǎng)使用基本的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)按照制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用Fugene-6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 CHO Flp-In 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染進(jìn)行的前一天，將CHO Flp-In細(xì)胞以6X 105/100mm皮氏培 養(yǎng)皿接種到包含 10% (ν/ν)胎牛血清、青霉素/鏈霉素和4mM L-谷氨酰胺的總體積IOml的Hams F12 培養(yǎng)基。第二天，將570μ1無(wú)血清(無(wú)抗生素)培養(yǎng)基加入到1.5ml聚丙烯管中。然后 加入30 μ 1 fugene-6,輕輕搖晃混合。對(duì)每種轉(zhuǎn)染，建立組合2 μ g感興趣的質(zhì)粒和18 μ g pOG44(包含對(duì)于質(zhì)粒正確整合到宿主基因組必需的重組酶的質(zhì)粒)的單獨(dú)的質(zhì)?；旌衔铩?對(duì)照平板不接受質(zhì)粒。通過(guò)輕輕搖晃與fugene-6混合，在室溫放置15分鐘，隨后逐滴加到 包含F(xiàn)12培養(yǎng)基+10% FCS中CHO Flp-In細(xì)胞的每個(gè)皮氏培養(yǎng)皿表面。輕輕搖晃平板以確 保充分混合，在37°C、5% C02的條件下放置24小時(shí)。第二天，更換培養(yǎng)基為含有600 μ g/ ml的潮霉素B的選擇培養(yǎng)基。常規(guī)地將細(xì)胞保持為60%匯合或者更少匯合。將細(xì)胞保持 在600 μ g/ml潮霉素B存在下生長(zhǎng)，直到對(duì)照平板細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)死亡(S卩，沒(méi)有潮 霉素抗性)。穩(wěn)定CHO細(xì)胞系的試驗(yàn)表達(dá)將表達(dá)目標(biāo)蛋白的匯合的CHO Flp-In細(xì)胞系培養(yǎng)在75cm2的培養(yǎng)瓶的無(wú)血清培 養(yǎng)基中大約3-4天，此時(shí)取樣并用丙酮沉淀來(lái)濃縮樣品。將樣品與等體積的Iaemmli上樣 緩沖液混合，分別加入或者不加入25mM DTT,煮沸5分鐘。樣品用SDS-PAGE分析，并轉(zhuǎn)移 到PVDF膜上。在PBS-0.05% (v/v) Tween 20中的5% (w/v)乳蛋白中封閉后，用特異性抗 IGF-I抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)共軛的二抗進(jìn)行樣品檢測(cè)。用HRP檢測(cè)試劑盒在感光 膠片上通過(guò)化學(xué)發(fā)光顯影。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的試驗(yàn)表達(dá)將CHO Flp-In細(xì)胞以0. 25 X IO6細(xì)胞/孔接種在6孔板中的終體積2ml培 養(yǎng)基(DMEM、F12、10% FCS+P/S+L-谷氨酰胺+Zeocin)。放置細(xì)胞以生長(zhǎng)過(guò)夜。然后用 TranslT-CHO試劑(Mirus)或者fugene-6按照表1中指定的具體反應(yīng)物比例轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對(duì) 照轉(zhuǎn)染以lB7stop (包含嵌合分子的GH)建立。簡(jiǎn)單來(lái)講，如果用TranslT試劑，對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn) 染反應(yīng)將200 μ 1無(wú)血清培養(yǎng)基(OPTI MEM)加入到1. 5ml eppendorf管中，隨后加入2 μ g DNA。將管在室溫放置15分鐘。隨后加入1 μ 1 CHO Mojo試劑，混合并放置另外15分鐘。 將培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物用移液管逐滴加入到適當(dāng)孔的表面。簡(jiǎn)單來(lái)講， 如果用Fugene-6試劑，對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)染反應(yīng)將94 μ 1無(wú)血清培養(yǎng)基(0ΡΤΙ MEM)加入到1. 5ml eppendorf管中，隨后加入2 μ gDNA。將管在室溫放置15分鐘。將轉(zhuǎn)染混合物用移液管逐 滴加入到含有無(wú)血清培養(yǎng)基的適當(dāng)孔的表面。將所有平板在37°C、5% C02放置2-3天。IGF-I生物活性測(cè)定測(cè)定培養(yǎng)基MG63細(xì)胞EMEM加入10% FCS、青霉素/鏈霉素、5mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸 (NEAA)=完全 EMEM。NIH 3T3 細(xì)胞DMEM+glutamax (4. 5g/L 葡萄糖)+10% FCS、青霉素 /鏈霉素、2mM丙酮酸鈉、5mM L-谷氨酰胺=完全DMEM。MG63 細(xì)胞EMEM (Gibco)加入 2mg/ml BSA 或者 1 % FCS、5mML_ 谷氨酰胺、青霉素 / 鏈霉素、NEAA。NIH 3T3 細(xì)胞:DMEM+glutamax (Gibco ；Cat#61956，Lot#357700)+1 % FCS (或 者2mg/ml BSA)、5mML_谷氨酰胺(Gibco)、青霉素/鏈霉素(Gibco)、2mM丙酮酸鈉(Gibco)。測(cè)定方法1.對(duì)于測(cè)定用TE處理細(xì)胞并計(jì)數(shù)。調(diào)整密度到50 μ 1 DMEM+1 % FCS (或者2mg/ ml BSA)中含有 5X103細(xì)胞(1 X IO5細(xì)胞/ml)。鋪板到96孔板。2.在DMEM中(加入1 % FCS或者2mg/ml BSA)制備一系列的IGF-1稀釋液，向含 有細(xì)胞的各孔加入50 μ 1每種稀釋液(O-IOOng/孔)。同樣處理培養(yǎng)基樣品。
3.在IGF-I或者待檢測(cè)的樣品存在下將細(xì)胞在37°C、5% C02培養(yǎng)3和4天。4.對(duì)于測(cè)定從各孔除去培養(yǎng)基，每孔用200 μ 1 PBS緩沖液漂洗一次。5.對(duì)堿性磷酸酶的測(cè)定在測(cè)定緩沖液中使用ρΝΡΡ。每孔加入100 μ 1。6.在37°C培養(yǎng)2小時(shí)。7.每孔加入10 μ 1 IM NaOH終止反應(yīng)。8.在室溫培養(yǎng)平板5-20分鐘以允許顯色。9.在微孔板讀板器記錄每孔的A405nm。艦1.添加底物的測(cè)定培養(yǎng)基(沒(méi)有生物活性因子)確定非酶水解底物的量。從每 個(gè)實(shí)驗(yàn)值中減去這些值。2.僅添加底物的細(xì)胞(沒(méi)有生物活性因子)這代表在生長(zhǎng)因子不存在時(shí)細(xì)胞能 夠生長(zhǎng)的量。實(shí)施例檢測(cè)細(xì)胞系MG63和NIH 3T3在IGF-1或者是嵌合體(5A1)存在時(shí)的增殖能力。 這一檢測(cè)基于使用底物磷酸對(duì)硝基苯酯來(lái)測(cè)定內(nèi)源的酸性磷酸酶活性。MG63細(xì)胞(人類(lèi) 骨肉瘤細(xì)胞系Cat#86051601，lot#05F008, ECACC)，NIH3T3細(xì)胞系，小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞 系(來(lái)自 Simon Smith, ARCBioserv, Sheffield University,管子日期1993 年 6 月 24 日)。MG63和NIH 3T3細(xì)胞對(duì)重組IGF-I的存在響應(yīng)良好，獲得良好的劑量響應(yīng)曲線(xiàn)；參見(jiàn) 圖12A、12B、12C和12D。這些數(shù)據(jù)顯示，在5A1培養(yǎng)基存在時(shí)細(xì)胞增殖，在較低的稀釋度產(chǎn) 生淺的劑量響應(yīng)(shallow dose response) 0 5A1培養(yǎng)基的樣品一致地產(chǎn)生比對(duì)照培養(yǎng)基 高程度的增殖，參見(jiàn)圖13A、13B、13C或者13D。
權(quán)利要求
一種核酸分子，該核酸分子包含一種核酸序列，該核酸序列編碼具有胰島素樣生長(zhǎng)因子的活性的多肽，所述多肽包含胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽直接或者間接連接的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體的至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
2.一種融合多肽，該融合多肽包含胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽或者其活性部分直接或者 間接與胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽受體多肽的至少一個(gè)胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域連 接的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合多肽，其中所述多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含富含亮氨酸的氨基酸基序。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合多肽，其中所述富含亮氨酸的氨基酸基序包含SEQID NO 14的氨基酸31-179。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或者3所述的融合多肽，其中所述富含亮氨酸的氨基酸基序包含SEQ ID NO 14 的氨基酸 229-487。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含至少一個(gè)纖維粘連蛋 白III結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的融合多肽，其中優(yōu)選地所述結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO: 14的氨基 酸殘基494-606。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽連接于 所述富含亮氨酸的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽位于所述融合多肽中所述 富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域的氨基末端。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽連接于 所述富含亮氨酸的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽位于所述融合多肽中所述 富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域的羧基末端。
10.根據(jù)權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽連接 于所述纖維粘連蛋白III結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽位于所述融合多肽 中所述纖維粘連蛋白III結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基末端。
11.根據(jù)權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽連接 于所述纖維粘連蛋白III結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽位于所述融合多肽 中所述纖維粘連蛋白III結(jié)合結(jié)構(gòu)域的羧基末端。
12.根據(jù)權(quán)利要求2-11任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽由肽 連接序列連接于所述胰島素樣生長(zhǎng)因子受體多肽的所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的融合多肽，其中所述肽連接分子包含至少一份拷貝的肽 Gly Gly Gly Gly Ser0
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的融合多肽，其中所述肽連接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9或 者10份拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0
15.根據(jù)權(quán)利要求2-11任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽不包含肽連接分子，且 所述多肽是所述胰島素樣生長(zhǎng)因子多肽與所述胰島素樣生長(zhǎng)因子受體多肽的所述結(jié)合結(jié) 構(gòu)域的直接融合多肽。
16.一種核酸分子，包括選自以下的核酸序列i)SEQ ID NO 1所表示的核酸序列；ii)SEQID NO 3所表示的核酸序列；iii)SEQID NO 5所表示的核酸序列；iv)SEQ ID NO 7所表示的核酸序列；v)SEQ ID NO 9所表示的核酸序列；vi)SEQ ID NO 11所表示的核酸序列；或者包含如下核酸序列的核酸分子，該核酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下與SEQ ID N0:l、3、5、 7、9或者11雜交并編碼具有胰島素樣生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)活性的多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有激動(dòng)劑活性的多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有拮抗劑活性的多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)所述的核酸分子，包含SEQID NO :1所表示的核酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)所述的核酸分子，包含SEQID NO :3所表示的核酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)所述的核酸分子，包含SEQID NO :5所表示的核酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)所述的核酸分子，包含SEQID NO :7所表示的核酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)所述的核酸分子，包含SEQID NO :9所表示的核酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)所述的核酸分子，包含SEQID NO :11所表示的核酸序列。
25.一種多肽，由根據(jù)權(quán)利要求1或者16-24任一項(xiàng)的核酸編碼。
26.一種多肽，包含選自 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、15、16、17、18、19 或者 20 組成的 組的氨基酸序列或者由選自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、15、16、17、18、19或者20組成的組的氨基酸序列組成。
27.一種由兩種多肽組成的同源二聚體，其中每種所述多肽包含i)第一部分，包含胰島素樣生長(zhǎng)因子或者其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，任選地由肽連接分子連接到 )第二部分，包含胰島素樣生長(zhǎng)因子受體的至少一個(gè)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域 或者其部分。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的同源二聚體，其中所述同源二聚體包含兩種包括SEQID NO :2、4、6、8、10、12、15、16、17、18、19 或者 20 的多肽。
29.—種載體，包含根據(jù)權(quán)利要求1或者16-24任一項(xiàng)的核酸分子。
30.一種細(xì)胞，是轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化有根據(jù)權(quán)利要求1、16-24或者29任一項(xiàng)的核酸分子或 者載體的細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
33.一種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求2-15、25或者26任一項(xiàng)的多肽，并包含賦形劑 或者載體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其中所述組合物組合有進(jìn)一步的治療劑。
35.一種治療患有與嚴(yán)重的原發(fā)性胰島素樣生長(zhǎng)因子缺乏相關(guān)的疾病或疾患的人類(lèi)受 治療者的方法，包括給藥有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求2-15、25或者26任一項(xiàng)的多肽。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述嚴(yán)重的原發(fā)性缺乏是拉倫侏儒癥。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述疾病是對(duì)于生長(zhǎng)激素治療不響應(yīng)的疾病。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述疾病是I型糖尿病。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述疾病是II型糖尿病。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述疾病是肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥。
41.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述疾病是強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良。
42.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述疾患是嚴(yán)重?zé)齻?br> 43.一種治療患有癌癥的人類(lèi)受治療者的方法，包括給藥有效量的根據(jù)權(quán)利要求 2-15,25或者26任一項(xiàng)的多肽拮抗劑。
44.根據(jù)權(quán)利要求35-43任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽靜脈內(nèi)給藥。
45.根據(jù)權(quán)利要求35-43任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽皮下給藥。
46.根據(jù)權(quán)利要求35-45任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽以每?jī)商斓拈g隔給藥。
47.根據(jù)權(quán)利要求35-45任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽以每周的間隔給藥。
48.根據(jù)權(quán)利要求35-45任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽以每?jī)芍艿拈g隔給藥。
49.根據(jù)權(quán)利要求35-45任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽以每月的間隔給藥。
50.一種單克隆抗體，該單克隆抗體結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求2-15、25或者26或者27或者 28任一項(xiàng)的多肽或者二聚體。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是結(jié)合所述多肽或者二 聚體但不特異性地單獨(dú)結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子或者胰島素樣生長(zhǎng)因子受體的抗體。
52.一種制備產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的方法，包括如下步驟 i)用包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求2-15或者25或者26或者27或者28任一項(xiàng)的多肽或者二聚體的免疫原對(duì)免疫活性的哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫； )將所述免疫后免疫活性的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合從而形成雜交瘤 細(xì)胞；iii)篩選步驟(ii)中所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體對(duì)(i)中所述多肽的結(jié)合活性；iv)培養(yǎng)所述雜交瘤細(xì)胞使其增殖和/或分泌所述單克隆抗體；并 ν)從培養(yǎng)物的上清液回收所述單克隆抗體。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述免疫活性的哺乳動(dòng)物是小鼠或者大鼠。
54.一種雜交瘤細(xì)胞系，是根據(jù)權(quán)利要求52或者53的方法獲得的或者可獲得的雜交瘤 細(xì)胞系。
55.一種檢測(cè)生物樣品中的根據(jù)本發(fā)明的多肽的診斷檢測(cè)方法，包括以下步驟 i)提供分離的待檢的樣品； )使所述樣品接觸結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求2-15、25或者26或者27或者28任一項(xiàng)的多肽或者二聚體的配體；并ii)檢測(cè)所述樣品中所述配體的結(jié)合。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的檢測(cè)方法，其中所述配體是抗體。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的檢測(cè)方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
全文摘要
本公開(kāi)涉及胰島素樣生長(zhǎng)因子融合多肽；編碼所述多肽的核酸分子和使用所述多肽的治療方法。
文檔編號(hào)C07K14/65GK101827859SQ200880110332
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2008年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月6日
發(fā)明者喬恩·塞耶斯, 彼得·阿蒂米克, 理查德·羅斯 申請(qǐng)人:埃斯特瑞恩有限公司