專利名稱：瘦蛋白融合蛋白的制作方法
瘦蛋白融合蛋白本發(fā)明涉及瘦蛋白融合多肽和二聚體；所述多肽編碼的核酸分子和使用所述多肽或二聚體的治療方法。細(xì)胞因子受體可分為三個(gè)單獨(dú)的組。1類(稱為造血生成素(haemotopoietin)或 生長激素家族)受體特征在于其胞外結(jié)構(gòu)域的氨基末端部分有四個(gè)保守的半胱氨酸殘基， 并且在C末端部分存在保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序。受體由兩個(gè)多肽鏈組成。1類 受體可被再分為GM-CSF亞家族(該亞家族包括IL-3、IL-5、GM-CSF、GCSF)和IL-6亞家族 (該亞家族包括IL-6、IL-Il和IL-12)。在IL-6亞家族中，存在與一個(gè)或兩個(gè)不同的細(xì)胞 因子亞基締合的共同的轉(zhuǎn)導(dǎo)(tranduscing)亞基(gpl30)。還存在稱為IL-2亞家族(包括 IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15)的亞家族。重復(fù)的半胱氨酸基序也存在于2類(干擾素 受體家族)中，其配體為α、β和Y干擾素，但是缺少保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序。人類瘦蛋白是由人類的1印基因和小鼠的ob基因編碼的16kD蛋白激素。瘦蛋白 通過瘦蛋白受體發(fā)揮作用，該受體是細(xì)胞因子家族中的單跨膜受體。在人類中，存在編碼瘦 蛋白的單一基因，其包括三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子，并橫跨大約18kb的基因組DNA。瘦蛋 白把營養(yǎng)狀態(tài)和免疫系統(tǒng)聯(lián)系在一起來控制尤其是食欲和免疫功能。瘦蛋白或其受體出現(xiàn) 突變可導(dǎo)致肥胖的表型，并伴有肥胖相關(guān)的次級(jí)癥狀(例如心臟病、II型糖尿病)。瘦蛋白 主要由與體重指數(shù)(BMI)成比例的脂肪組織產(chǎn)生，而由器官如胃和胎盤產(chǎn)生的瘦蛋白水平 較低。瘦蛋白通過抑制食物的攝取和刺激能量消耗來調(diào)節(jié)體重。此外，瘦蛋白影響先天免 疫性和適應(yīng)免疫性兩方面。對(duì)于先天免疫性，瘦蛋白調(diào)控嗜中性粒細(xì)胞活性，增加單核細(xì)胞 /巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并增強(qiáng)急性期應(yīng)答的炎性調(diào)節(jié)物的分泌。對(duì)于適應(yīng)免疫性，瘦蛋白 促進(jìn)幼稚T細(xì)胞的增殖和白細(xì)胞介素2 (IL-2)分泌；而對(duì)于記憶T細(xì)胞，它通過增加干擾 素-Y (INF- γ )和腫瘤壞死因子-α (TNF- α分泌)促進(jìn)向輔助T細(xì)胞1 (Thl)免疫應(yīng)答的 轉(zhuǎn)換。如果瘦蛋白的表達(dá)和/或生成被擾亂，那么疾病的病理學(xué)表現(xiàn)會(huì)因?qū)δ芰看x和 免疫狀態(tài)的影響而變得復(fù)雜。除了已確定的與肥胖的聯(lián)系以外，瘦蛋白的減少也與不育、骨 質(zhì)疏松和免疫抑制有關(guān)。本公開涉及具有改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)和活性的瘦蛋白重組形式的鑒定。 新的瘦蛋白分子具有生物活性，形成二聚體，并具有改進(jìn)的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了核酸分子，該核酸分子包含編碼具有瘦蛋白活性 的多肽的核酸序列，所述多肽包含直接或間接地連接到瘦蛋白受體多肽的至少一個(gè)瘦蛋白 結(jié)合域的瘦蛋白多肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了融合多肽，該融合多肽包含直接或間接地連接到 瘦蛋白受體多肽的至少一個(gè)瘦蛋白結(jié)合域的瘦蛋白多肽或其活性部分的氨基酸序列。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含兩個(gè)瘦蛋白結(jié)合域。在本發(fā)明的另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含一個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu) 域。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含至少一個(gè)細(xì)胞因子樣同源性結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地兩個(gè)細(xì)胞因子樣同源性結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明又另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含至少一個(gè)纖維連接蛋白III結(jié)合域；優(yōu)選地兩個(gè)纖維連接蛋白III結(jié)合域。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸殘基 428-535。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸殘基 536-635。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸殘基 326-437。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸殘基 62-178。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸殘基 235-325。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸殘基 639-732。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸殘基 734-829。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸殘基 428-635。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述瘦蛋白多肽連接到瘦蛋白受體的至少一個(gè)瘦蛋 白結(jié)合域，其中在所述融合多肽中，所述瘦蛋白多肽被置于所述瘦蛋白結(jié)合域的氨基末端。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述瘦蛋白多肽連接到瘦蛋白受體的至少一個(gè)瘦蛋 白結(jié)合域，其中在所述融合多肽中，所述瘦蛋白多肽被置于所述瘦蛋白結(jié)合域的羧基末端。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述瘦蛋白多肽通過肽連接體、優(yōu)選地柔性連接體 連接到瘦蛋白受體多肽的至少一個(gè)結(jié)合域。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽連接分子包含至少一個(gè)拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽連接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)拷貝 的肽 Gly Gly Gly Gly Ser0優(yōu)選地所述肽連接分子由6個(gè)拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser組成。優(yōu)選地所述肽連接分子由8個(gè)拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser組成。在本發(fā)明可選的實(shí)施方案中，所述多肽不包含肽連接分子，而是瘦蛋白多肽和瘦 蛋白受體多肽的至少一個(gè)瘦蛋白結(jié)合域的直接融合體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了核酸分子，所述核酸分子包含選自下列的核酸序 列i)SEQ ID NO 3所示的核酸序列；ii)SEQ ID NO 5所示的核酸序列；iii)SEQ ID NO 7所示的核酸序列；iv) SEQ ID NO 9所示的核酸序列；
ν) SEQ ID NO 11所示的核酸序列；vi) SEQ ID NO 13所示的核酸序列；vii) SEQ ID NO 15所示的核酸序列；viii)SEQ ID NO 17 所示的核酸序列；ix) SEQ ID NO 19所示的核酸序列；x) SEQ ID NO 21所示的核酸序列；xi) SEQ ID NO 23所示的核酸序列；xii) SEQ ID NO 25所示的核酸序列；xiii)SEQ ID NO 27 所示的核酸序列；核酸分子，該核酸分子包含在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ IDN0:3、5、7、9、11、13、15、 17、19、21、23、25或27雜交的核酸序列并且編碼具有瘦蛋白受體調(diào)節(jié)活性的多肽。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼瘦蛋白激動(dòng)劑。在本發(fā)明可選的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼瘦蛋白拮抗劑。當(dāng)兩條互補(bǔ)的核酸分子經(jīng)歷一定數(shù)量的氫鍵鍵合時(shí)，即發(fā)生核酸分子的雜交。雜 交的嚴(yán)格性可根據(jù)核酸分子周圍的環(huán)境條件、雜交方法的特性和所使用的核酸分子的組成 和長度而變化。關(guān)于獲得特定程度嚴(yán)格性所需的雜交條件的計(jì)算方法在Sambrook等人， Molecular Cloning :A LaboratoryManual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY,2001)；禾口 Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes (生 物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)一核酸探針雜交)，第I部分，第2章(Elsevier，NewYork， 1993)中被論述。Tm是核酸分子的50%的給定鏈與其互補(bǔ)鏈雜交時(shí)的溫度。下列是雜交條 件的示例性設(shè)定并且是非限制性的超高嚴(yán)格性(允許共有至少90%同一性的序列雜交)雜交5x SSC 在 65 °C 16 小時(shí)漂洗兩次 2x SSC在室溫(RT)每次15分鐘漂洗兩次 0.5x SSC在65°C每次20分鐘高嚴(yán)格性(允許共有至少80%同一性的序列雜交)雜交5x_6x SSC 在 65 °C -70 °C 16-20 小時(shí)漂洗兩次 2x SSC在室溫每次5-20分鐘漂洗兩次 Ix SSC在55°C _70°C每次30分鐘低嚴(yán)格性(允許共有至少50%同一性的序列雜交)雜交6x SSC在室溫至55 °C 16-20小時(shí)漂洗至少兩次2x-3x SSC在室溫至55°C每次20_30分鐘。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ IDNO 3所示的核酸序列或 由其組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 5所示的核酸序列或 由其組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 7所示的核酸序列或
由其組成。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 9所示的核酸序列或
由其組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :11所示的核酸序列或
由其組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :13所示的核酸序列或
由其組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :17所示的核酸序列或
由其組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :19所示的核酸序列或
由其組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :21所示的核酸序列或
由其組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :23所示的核酸序列或
由其組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :25所示的核酸序列或
由其組成。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :27所示的核酸序列或
由其組成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了多肽，該多肽由根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了多肽，該多肽包含SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 所示的氨基酸序列或
由其組成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了同型二聚體，所述同型二聚體由兩個(gè)多肽組成，其 中每個(gè)所述多肽包含i)包含瘦蛋白或其受體結(jié)合域的第一部分，該第一部分任選地通過肽連接分子連 接到ii)包含瘦蛋白受體的至少一個(gè)瘦蛋白結(jié)合域或其部分的第二部分。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39
或40或者由其組成。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了載體，該載體包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體是適于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的表達(dá) 載體。包括根據(jù)本發(fā)明的核酸的載體不必包括啟動(dòng)子或其它調(diào)控序列，特別是當(dāng)所述載 體被用于將核酸引入細(xì)胞以重組到基因組用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)。優(yōu)選地載體中的核酸被可操作 地連接到適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或其它調(diào)控元件以在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。該載體可能是在多個(gè)宿主中 發(fā)揮作用雙功能表達(dá)載體。通過“啟動(dòng)子”意指轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的核苷酸序列，并且該序 列含有轉(zhuǎn)錄所需的全部調(diào)控區(qū)域。適合的啟動(dòng)子包括用于在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的組成 型的、組織特異性的、可誘導(dǎo)的、發(fā)育的或其它啟動(dòng)子?！翱刹僮鞯剡B接”意指作為相同核酸分子的部分連接，適當(dāng)?shù)囟ㄎ徊⒍ㄏ蛞詮膯?dòng)子起始轉(zhuǎn)錄?？刹僮鞯剡B接到啟動(dòng)子的DNA 是啟動(dòng)子“轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控下的”。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是組成型的、可誘導(dǎo)的或可調(diào)控的啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了細(xì)胞，該細(xì)胞用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或載體 轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地所述細(xì)胞是真核細(xì)胞?？蛇x地所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自由下列組成的組真菌細(xì)胞(例如畢 赤酵母屬(Pichia spp)、酵母屬(Saccharomyces spp)、鏈孢霉屬(Neurospora spp))；昆 蟲細(xì)胞(例如灰翅夜蛾屬(Spodoptera spp))；哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞)； 植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了藥物組合物，該藥物組合物包含根據(jù)本發(fā)明的 多肽，包含賦形劑或載體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物與另外的治療劑組合。施用時(shí)本發(fā)明的藥物組合物以藥學(xué)上可接受的制品施用。此類制品可常規(guī)地含有 藥學(xué)上可接受的濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容的載體和任選地其它治療劑。本發(fā)明的藥物組合物可以通過任何常規(guī)的路線施用，包括注射。施用和應(yīng)用可以 例如是口服的、靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、腔內(nèi)的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、皮下的、局部的(眼睛)、 皮膚的(例如乳膏狀脂溶性插入物，插入皮膚或粘膜)、透皮的或鼻內(nèi)的。本發(fā)明的藥物組合物按有效量施用?！坝行Я俊笔侵竼为?dú)或與另外的劑量或協(xié)同的 藥物一起產(chǎn)生預(yù)期的反應(yīng)的藥物/組合物的量。這可包括僅暫時(shí)地減緩疾病的進(jìn)展，盡管 更優(yōu)選地是，它包括永久地終止疾病的進(jìn)展。這可以通過常規(guī)方法監(jiān)測或者可以根據(jù)診斷 方法監(jiān)測。受治療者施用的藥物組合物的劑量可以依照不同的參數(shù)進(jìn)行選擇，特別是依照使 用的施用方式和受治療者的狀態(tài)(即年齡、性別)。施用時(shí)，本發(fā)明的藥物組成以藥學(xué)上可 接受的量和藥學(xué)上可接受的組合物應(yīng)用。當(dāng)在藥品中使用時(shí)，鹽應(yīng)該是藥學(xué)上可接受的，但 是非藥學(xué)上可接受的鹽可被方便地用于制備其藥學(xué)上可接受的鹽，并且不被排除在本發(fā)明 的范圍之外。此類藥理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于從下列酸制備的那些鹽鹽酸、 氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸及類似酸。而 且，藥學(xué)上可接受的鹽可以被制成堿金屬鹽或堿土鹽，例如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。如果需要，藥物組合物可以與藥學(xué)上可接受的載體組合。在此處用到的術(shù)語“藥學(xué) 上可接受的載體”意指適于施用于人類的一種或多種相容的固體或液體填充物、稀釋劑或 包封物質(zhì)。術(shù)語“載體”意指天然的或合成的有機(jī)或無機(jī)的成分，其與活性成分組合以助應(yīng) 用。藥物組合物的成分也能夠以沒有將顯著損害所期望的藥物功效的相互作用的方式與本 發(fā)明的分子以及與彼此共混。藥物組合物可能含有適當(dāng)?shù)木彌_劑，包括鹽形式的乙酸；鹽形式的檸檬酸；鹽形 式的硼酸；和鹽形式的磷酸。藥物組合物也可含有任選地適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，如氯化苯甲烴銨、氯丁醇、對(duì)羥基苯 甲酸酯類和硫柳汞。藥物組合物可能方便地被制成單位劑型，并可能被通過藥劑學(xué)領(lǐng)域熟知的任一方法制備。所有的方法包括將活性劑與組成一種或多種的助劑的載體聯(lián)合的步驟。通常，該組合物通過以下制備將活性化合物與液態(tài)載體、精細(xì)分離的固態(tài)載體、或者兩者均勻并緊 密地聯(lián)合，然后，如有需要，塑形該產(chǎn)品。適于口服施用的組合物可被制備為離散的單元，例如膠囊、片劑、錠劑，每種都包 含預(yù)定量的活性化合物。其它的組合物包括于含水液體或不含水液體中的懸浮液如糖漿 齊U、酏劑或乳劑。適于腸胃外施用的組合物方便地包含無菌的含水或非含水制品，優(yōu)選地與受者 (recipient)的血液等滲。此制品可根據(jù)使用適當(dāng)?shù)姆稚┗驖駶檮┮约皯腋┑囊阎?方法制備。無菌的可注射的制品還可是溶于無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無 菌的可注射的溶液或懸浮液，例如溶于1，3_ 丁二醇中的溶液?？杀皇褂玫目山邮艿娜軇?是水、林格溶液和等滲的氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)油被常規(guī)地用作溶劑或懸浮介 質(zhì)。對(duì)于此為目的，任何溫和的不揮發(fā)油可被使用，包括合成的甘油單酯或二酯。此外，月旨 肪酸如油酸，可能被用于制備注射劑。適于口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等施用的載體配方可 在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物禾斗學(xué))，Mack Publishing Co., Easton，PA 中找到。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了治療患有將從施用瘦蛋白激動(dòng)劑受益的病況的 人類受治療者的方法，其包括施用有效量的至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述病況是肥胖。在本發(fā)明的另外的優(yōu)選的方法中，所述病況是肥胖相關(guān)的病況。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述肥胖相關(guān)的病況是II型糖尿病。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述肥胖相關(guān)的病況是心臟病。在本發(fā)明可選擇的優(yōu)選的方法中，所述病況是免疫抑制。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了治療患有將從施用瘦蛋白拮抗劑受益的病況的 人類受治療者的方法，其包括施用有效量的至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述病況是厭食癥。在本發(fā)明的另外的優(yōu)選的方法中，所述病況是自身免疫疾病。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述自身免疫疾病選自由以下組成的組多發(fā)性硬 化、I型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病、自身免疫性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性 結(jié)腸炎、克隆氏病、乳糜瀉、自身免疫性腎炎、自身免疫性神經(jīng)病(guillan Barre)、腦病 (Rasmussen)、纖維性肺泡炎。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述多肽通過靜脈內(nèi)施用。在本發(fā)明可選擇的優(yōu)選的方法中，所述多肽通過皮下施用在本發(fā)明的另外的優(yōu)選的方法中，所述多肽以兩天的間隔施用；優(yōu)選地所述多肽 以每周、每2周或每月的間隔施用。根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了單克隆抗體，該單克隆抗體結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的 多肽或二聚體。優(yōu)選地所述單克隆抗體是結(jié)合所述多肽或二聚體但不具體地特異性結(jié)合瘦蛋白 或瘦蛋白受體的抗體。所述單克隆抗體結(jié)合通過本發(fā)明的多肽或包含本發(fā)明的多肽的二聚體而呈遞的構(gòu)象抗原。在本發(fā)明的另外的方面，提供了制備產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的方法，該方法包含下列步驟i)使用含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽的免疫原使免疫活性的哺乳動(dòng)物免疫；ii)將免疫的免疫活性的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì) 胞；iii)根據(jù)對(duì)(i)中的多肽的結(jié)合活性，篩選通過步驟(ii)的雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單 克隆抗體；iv)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞以增殖和/或分泌所述單克隆抗體；以及ν)從培養(yǎng)上清液回收單克隆抗體。優(yōu)選地，所述免疫活性的哺乳動(dòng)物是小鼠?？蛇x擇地，所述免疫活性的哺乳動(dòng)物是 大鼠。用雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體是本領(lǐng)域所共知的。用來產(chǎn)生單克隆抗體的方法 由 Kohler 和 Milstein 在 Nature 256,495-497(1975)上公開，并且也被 Donillard 和 Hoffman ^ Basic Facts about Hybridomas ( ^Τ^^^^^ ^^ ), T Compendium of Immunology (免疫學(xué)概要)第VII版，Schwartz, 1981公開，其通過引用并入。根據(jù)本發(fā)明另外的方面，提供了雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系通過根據(jù)本發(fā)明 的方法獲得或是可獲得的。遍及本說明書的描述和權(quán)利要求，詞“包含”(comprise)和“含有”以及所述詞的 變體例如“包含”(comprising)和“包含”(comprises)意指“包括但不限于”，并且不意圖 (并且不)排除其他的部分、添加劑、成分、整數(shù)或步驟。遍及本說明書的描述和權(quán)利要求，除非上下文另外要求，單數(shù)包含復(fù)數(shù)。尤其是當(dāng) 使用不定冠詞時(shí)，除非上下文另外要求，說明書應(yīng)被理解為考慮復(fù)數(shù)以及單數(shù)。連同本發(fā)明的特定的方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅奶卣?、整?shù)、特性、化合物、化 學(xué)部分或組應(yīng)被理解為除非與其矛盾，則可用于本文描述的任何其他的方面、實(shí)施方案或 實(shí)施例?，F(xiàn)在將僅通過實(shí)施例并引用下列附圖來描述本發(fā)明的實(shí)施方案表ILR融合體的命名；表2瘦蛋白LR-融合體的表達(dá)水平，使用抗瘦蛋白受體的抗體通過ELISA檢測(nd =未檢測到)；圖Ia是細(xì)菌表達(dá)的瘦蛋白的核酸序列；圖Ib是氨基酸序列；圖2a是LR 2A1的核酸序列；圖2b是LR 2A1的氨基酸序列；圖3a是LR 2A1的核酸序列；圖3b是適合細(xì)菌表達(dá)的LR 2A1的氨基酸序列；圖4a是LR 2B1的核酸序列；圖4b是LR 2B1的氨基酸序列；圖5a是LR 2D1的核酸序列；圖5b是LR 2D1的氨基酸序列；圖6a是LR 2E1的核酸序列；圖6b是LR 2E1的氨基酸序列；圖7a是LR 2F1的核酸序列；圖7b是LR 2F1的氨基酸序列；圖8a是LR 2G1的核酸序列；圖8b是LR 2G1的氨基酸序列；圖9a是LR 2H1的核酸序列；圖9b是LR 2H1的氨基酸序列；
圖IOa是LR 211的核酸序列；圖IOb是LR 211的氨基酸序列；圖Ila是LR 2Jl的核酸序列；圖lib是LR 2Jl的氨基酸序列；

圖12a是LR 2K1的核酸序列；圖12b是LR 2K1的氨基酸序列；圖13a是LR 2L1的核酸序列；圖13b是LR 2L1的氨基酸序列；
圖14a是LR 2M1的核酸序列；圖14b是LR 2M1的氨基酸序列；圖15a)將瘦蛋白結(jié)合域(LBD)連接到表達(dá)載體pSecTag以產(chǎn)生 pSecTaglinkSSLBD。b)將瘦蛋白連接到 pSecTaglinkSSLBD 以產(chǎn)生 pSecTag2Al (Im)。c)合 成DNA并將其連接到PSecTag2Al (Im)以引入(G4S)5 ；圖16表達(dá)瘦蛋白LR-融合體的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)印跡。各泳道的內(nèi) 容為:12A1 表達(dá)；2. 2B1 表達(dá)；3. 2D1 表達(dá)；4.分子量標(biāo)記(20、25、37、50、75、100、150、 200kDa)。蛋白質(zhì)印跡以抗瘦蛋白的抗體為探針檢測。圖17a)將瘦蛋白受體胞外結(jié)構(gòu)域(ObRex)連接到表達(dá)載體pSecTag以產(chǎn)生 pSecTaglinkSSObRex。b)將瘦蛋白連接到 pSecTaglinkSSObRex 以產(chǎn)生 pSecTag2Bl (Im)。 c)合成DNA并將其連接到PSecTag2Bl (Im)以引入(G4S)5 ；圖18a)使用PCR產(chǎn)生由側(cè)翼為適合的限制性位點(diǎn)(包含在引物Rl_4中)的感興 趣的基因組成的DNA。b)將PCR產(chǎn)物連接至適合的載體中的連接體區(qū)域的任一側(cè)。c)之后 修飾構(gòu)建體以引入正確的連接體，其不含有任何不需要的序列(即非天然的限制性位點(diǎn))；圖19a)設(shè)計(jì)寡核苷酸以形成具有獨(dú)特的重疊的部分雙鏈區(qū)域，并且當(dāng)被退火和 加工時(shí)，所述寡核苷酸將編碼將退火至配體和受體的具有側(cè)翼區(qū)的連接體，b)使用“大引 物” (megaprimer)和末端引物(Rl和R2)進(jìn)行PCR以產(chǎn)生LR-融合體基因。Rl和R2引物 被設(shè)計(jì)為引入用于連接至靶載體的有用的側(cè)翼限制性位點(diǎn)；圖20是全長瘦蛋白受體的氨基酸序列；圖21是瘦蛋白LR-融合體構(gòu)建體的概略圖。圖22是表達(dá)2A1、2B1和2D1構(gòu)建體的CHO Flp-In穩(wěn)定細(xì)胞系的免疫印跡分析。 泳道 M =分子量標(biāo)記(250、150、100、75、50、37、25 和 20kDa)；泳道 1 = CHO Flp-In 對(duì)照細(xì) 胞，泳道2 = 2A1表達(dá)培養(yǎng)基，泳道3 = 2B1表達(dá)培養(yǎng)基，泳道4 = 2D1表達(dá)培養(yǎng)基；圖23是2AlEcopt的表達(dá)。A)顯示2AlEcopt的表達(dá)的考馬斯(Coomassie)染色 膠。泳道M=分子量標(biāo)記(250、150、100、75、50、37、25、20和15kDa)；泳道1 =誘導(dǎo)時(shí)的表 達(dá)；泳道2 =誘導(dǎo)后4小時(shí)的表達(dá)；泳道3 =誘導(dǎo)后并孵育過夜的表達(dá)；泳道4 = 2AlEcopt 表達(dá)細(xì)胞的不可溶級(jí)分；泳道5 = 2AlEcopt表達(dá)細(xì)胞的可溶級(jí)分。B)2AlEcopt表達(dá)的免 疫印跡。泳道M=分子量標(biāo)記(250、150、100、75、50、37、25、20和15kDa)；泳道1 =誘導(dǎo)時(shí) 的表達(dá)；泳道2 =誘導(dǎo)后4小時(shí)的表達(dá)；泳道3 =誘導(dǎo)后孵育過夜的表達(dá)；圖24是2A1 Ecopt的包涵體制備物的考馬斯染色的SDS-PAGE膠。泳道M =分 子量標(biāo)記(250、150、100、75、50、37、25 和 20kDa)；泳道 1 =大腸桿菌(E. coli)BL21 (DE3) 2AlEcopt的全細(xì)胞；泳道2 =細(xì)胞裂解物一可溶級(jí)分；泳道3 =細(xì)胞裂解物一不可溶級(jí) 分；泳道4-7 = 2%的脫氧膽酸鈉漂洗1-4次；泳道8-9 =水漂洗1-2次；泳道10 =包涵體 制備物。圖25是表達(dá)2A1的CHO Flp-In細(xì)胞的粗培養(yǎng)基的體外生物測定。在瘦蛋白體外 生物測定中，表達(dá)2A1的CHO Flp-In細(xì)胞的粗培養(yǎng)基(IOx濃縮物)被用于刺激細(xì)胞。培養(yǎng)基具有激動(dòng)劑活性，來自王表達(dá)2A1的細(xì)胞的培養(yǎng)基無活性(黑色柱)；和圖26是純化的2AlEcopt的體外生物測定。在免疫印跡中在2AlEcopt正確大小的 位置顯示單一條帶的再折疊的2A1 Ecopt樣品被用于在瘦蛋白體外生物測定中刺激細(xì)胞。 樣品顯示激動(dòng)劑活性。材料與方法體外檢騎檢測和評(píng)估瘦蛋白活性的體外方法是本領(lǐng)域已知的。例如參見 Liu ^ 人(Endocrinology (1997) 138,8 :p3548-3554) , White ^ 人(J. Biol Chemistry (1997) 272 (7) :p4065_4071)和 Maamra 等人(Endocrinology (2007) 142(10) 4389-4393)，上述每篇文章描述了尤其是在基于細(xì)胞的分析中瘦蛋白受體的表達(dá)。此外，用雙螢光素酶生物測定檢測瘦蛋白LR-融合體的體外活性。簡要地，用表 達(dá)SIE誘導(dǎo)的螢火蟲螢光素酶、瘦蛋白受體(ObR)、STAT3和海腎(Renilla)螢光素酶(后 三種蛋白是組成型表達(dá))的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7哺乳動(dòng)物細(xì)胞。24小時(shí)以后，該細(xì)胞被瘦蛋白 LR-融合體刺激6小時(shí)。裂解細(xì)胞并測定螢火蟲螢光素酶活性，這與LR-融合體對(duì)瘦蛋白受 體的刺激成比例。將此值除以組成型表達(dá)的海腎螢光素酶的活性給出修正了實(shí)驗(yàn)誤差的活 性。體內(nèi)檢騎體內(nèi)動(dòng)物模型是本領(lǐng)域中已知的。ob/ob小鼠模型(Zhang等人Nature (1994) 372 425-432)是瘦蛋白突變的純合體，并已被用于評(píng)估瘦蛋白激動(dòng)劑和拮抗劑的活性；參 見 Chehab 等人(Nature Genetics(1996) 12 :318_320) ；Lord 等人(Nature(1998)394 897-901)；和 Pellymounter 等人(Science (1995) 269 :540_542)。免疫學(xué)檢驗(yàn)測量配體或受體與多克隆和單克隆抗體的結(jié)合的免疫測定是本領(lǐng)域中已知的。商 業(yè)可得的抗體可用于檢測樣品中的配體或受體，并且也能用于競爭性抑制研究。例如，參見 http//www, abeam, com/index, html，AbcamPLC0融合蛋白的重組生產(chǎn)融合蛋白的組件通過PCR產(chǎn)生，所述PCR使用設(shè)計(jì)為與配體或受體退火和引入用 于克隆至靶載體的適合的限制性位點(diǎn)的引物(圖Xla)。PCR的模板包含靶基因并且從IMAGE 克隆、cDNA文庫或從定制合成的基因獲得。一旦合成具有適當(dāng)?shù)膫?cè)翼限制性位點(diǎn)的配體和 受體基因合成，之后將這些基因連接到靶載體中連接體區(qū)域的任何一側(cè)(圖Xlb)。之后通 過將定制合成長度的DNA插入連接體區(qū)域任一側(cè)的兩個(gè)獨(dú)特的限制性位點(diǎn)之間、通過經(jīng)由 ssDNA修飾技術(shù)的連接體區(qū)域的突變、通過將引物雙鏈體/多鏈體插入適合的限制性位點(diǎn) 之間或通過PCR修飾將構(gòu)建體修飾為含有無側(cè)翼限制性位點(diǎn)的正確的連接體(圖Xlc)?？蛇x地，設(shè)計(jì)為與所選擇的配體或受體結(jié)構(gòu)域退火的具有側(cè)翼序列的連接體通過 產(chǎn)生寡核苷酸雙鏈體來初始合成，并且其被加工以產(chǎn)生雙鏈的DNA (圖X2a)。之后進(jìn)行PCR， 所述PCR使用所述連接體序列作為“大引物”，設(shè)計(jì)為針對(duì)與“大引物”退火配體和受體的相 反末端的引物，并用配體和受體作為模板。末端引物被設(shè)計(jì)為具有用于連接至所選擇的表 達(dá)載體的適合的限制性位點(diǎn)(圖X2b)。融合蛋白的表達(dá)和純化
在適當(dāng)?shù)捏w系(例如哺乳動(dòng)物CHO細(xì)胞、大腸桿菌等)中進(jìn)行表達(dá)并且這取決于 產(chǎn)生LR-融合體基因的載體。之后使用不同的方法分析表達(dá)，這可包括SDS-PAGE、非變性 PAGE、蛋白質(zhì)印跡、ELISA中的一種或多種。一旦達(dá)到合適的表達(dá)水平，就以更大規(guī)模表達(dá)LR-融合體以產(chǎn)生足夠的蛋白用于 純化和而后的分析。使用適當(dāng)組合的一種或多種色譜手段進(jìn)行純化，如離子交換色譜法、疏水相互作 用色譜法、硫酸銨沉淀法、凝膠過濾法、尺寸排阻色譜法和/或親和色譜法(利用鎳/鈷樹 月旨、抗體固定的樹脂和/或配體/受體固定的樹脂)。使用不同方法對(duì)純化的蛋白進(jìn)行分析，這些方法可包括Bradford測定、 SDS-PAGE、非變性PAGE、蛋白質(zhì)印跡、ELISA中的一種或多種。LR-融合體的特件變性PAGE、非變性PAGE膠和蛋白質(zhì)印跡被用于分析融合多肽，并且使用對(duì)LR-融 合體非構(gòu)象地(non-conformationally)敏感的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。非變性溶解狀態(tài)分 子量信息可以通過例如使用Superose G200分析柱的尺寸排阻色譜法和分析型超速離心的 技術(shù)獲得。LR-融合體的構(gòu)津通過產(chǎn)生在任一端具有獨(dú)特的相容的限制性位點(diǎn)的0b、LBD、ObREc和連接體組 件，并將它們連接到一起形成完整的基因，來合成2A1、2B1和2D1基因。隨后通過將定制合 成的DNA片段(Genecust，F(xiàn)rance)連接到0b、LBD和ObREc基因的獨(dú)特的限制性位點(diǎn)之間 除去2B1和2D1中的外來序列(即限制性位點(diǎn))，這樣產(chǎn)生了 2B2和2D2。2AlEcopt基因通 過定制DNA合成并連接到pET21a+來產(chǎn)生。2A1 Ecopt序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌 中表達(dá)，并具有C末端His標(biāo)簽。LR-融合體的表達(dá)哺乳動(dòng)物表達(dá)使用修飾的Invitrogen 載體 pSecTag-V5/FRT_Hist 在 6 孔板中使用 Fugene-6 作 為轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。用表達(dá)載體和P0G44共轉(zhuǎn)染CHO Flp-In細(xì)胞，pOG44是表 達(dá)導(dǎo)致LR-融合體基因重組到細(xì)胞染色體“熱點(diǎn)”的flp重組酶的質(zhì)粒。潮霉素B被用于 選擇具有陽性重組體的細(xì)胞。一旦建立了穩(wěn)定細(xì)胞系，它們在75cm2培養(yǎng)皿中生長達(dá)到50_70%融合度 (confluency)時(shí)，培養(yǎng)基被換成無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)物再孵育2_4天，此后采集培養(yǎng)基樣 品。樣品在13% SDS-PAGE膠上分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜用于免疫印跡。在溶于PBS+0.05% (ν/ν)吐溫20的5% (w/v)乳蛋白中封閉后，使用特異性抗瘦蛋白抗體與軛合第二抗體的 辣根過氧化物酶(HRP) —起進(jìn)行樣品檢測。使用HRP檢測試劑盒通過照相膠片的化學(xué)發(fā)光 來顯影顯示來自哺乳動(dòng)物體系的LR-融合體表達(dá)的免疫印跡如圖22所示。大腸桿菌表達(dá)將pET21a+ :2AlEcopt轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞。而后表達(dá)2A1 Ecopt的克隆在補(bǔ)充了羧芐青霉素(100yg/ml)的LB培養(yǎng)基中生長，并于室溫在平板搖床 上生長。用ImM IPTG在OD6tltl為0.4時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，并且使培養(yǎng)物生長過夜。而后收集并裂解細(xì)胞，在SDS-PAGE膠上分離樣品，并進(jìn)行考馬斯染色或免疫印跡。顯示來自大腸桿菌體系的LR-融合體表達(dá)的免疫印跡如圖23所示。LR-融合體的純化大腸桿菌表汰的LR-融合體的純化(2AlEcoDt)在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中表達(dá)來自質(zhì)粒pET21a+:2A1 Ecopt的2A1 Ecopt0使用Ni-Probond樹脂柱純化2A1 Ecopt。將裂解細(xì)胞的不溶級(jí)分用2%脫氧膽酸 鈉漂洗四次，并用蒸餾水漂洗兩次，從而獲得包涵體制備物。該步驟去除了大多數(shù)的污染蛋 白，得到純度> 80%的2A1 Ecopt ；圖24。Mt如果兩組的方差是正態(tài)分布，用學(xué)生檢驗(yàn)(Student' s test)進(jìn)行比較；或者如 果不是正態(tài)分布，用學(xué)生-薩脫斯威特檢驗(yàn)(Student-Satterthwaite' stest)進(jìn)行比較。 用F檢驗(yàn)來檢驗(yàn)分布。使用單向ANOVA比較3組或更多組的平均值，并且如果顯著性水平 為ρ < 0. 05，用鄧奈特檢驗(yàn)(Durmett' s tests)進(jìn)行個(gè)體比較。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)在5%顯 著性水平是雙側(cè)的，并且不對(duì)漏失值進(jìn)行填補(bǔ)(imputation)。實(shí)施例1 :2A1側(cè)翼為BamHI和HindIII的編碼瘦蛋白受體(ObR)的瘦蛋白結(jié)合域(LBD)的DNA 通過PCR產(chǎn)生。該DNA而后被連接到修飾過的pSecTag-FRT-V5-His TOPO載體以產(chǎn)生 PSecTagLinkSSLBD (圖15a)。側(cè)翼為NheI和BamHI的編碼瘦蛋白的DNA由使用引物Nh eObssF (5‘ -gggaaagctagccaccatgcattggggaaccctgtgcg-3‘)和ObBamR(5‘ -gggaaagga tccgcacccagggctgaggtcc-3 ‘)的 PCR 產(chǎn)生。該 DNA 被連接到 pSecTagLinkSSLBD 以產(chǎn)生 PSecTag2Al (Im)(圖15b)。在AleI和NsiI限制性位點(diǎn)之間定制合成連接體區(qū)域，并且將 其插入到 pSecTag2Al (Im)以獲得 pSecTag2Alstop (圖 15c)。將 pSecTag2Alstop 轉(zhuǎn)染到中 國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，并開發(fā)瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞系和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。然而使用抗瘦蛋白抗 體進(jìn)行的表達(dá)培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)印跡顯示2A1被表達(dá)(圖16)。2A1也在大腸桿菌細(xì)胞中表 達(dá)。反向翻譯2A1的氨基酸序列并進(jìn)行大腸桿菌密碼子使用優(yōu)化。定制基因合成密碼子優(yōu) 化的基因(2AlEcopt)，而后將其插入到pET21a+表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中 表達(dá)蛋白。實(shí)施例2 :2B1側(cè)翼為BamHI和HindIII的編碼瘦蛋白受體胞外域(ObRex)的DNA通過 PCR產(chǎn)生。該DNA而后被連接到修飾過的pSecTag-FRT-V5-His TOPO載體以產(chǎn)生 PSecTagLinkSSObRex(圖17a)。側(cè)翼為NheI和HindIII的編碼瘦蛋白的DNA由使用引物 NheObssF (5‘ -gggaaagctagccaccatgcattggggaaccctgtgcg-3‘)和ObBamR(5‘ -gggaaag gatccgcacccagggctgaggtcc-3 ‘)的 PCR 產(chǎn)生。該 DNA 而后被連接到 pSecTagLinkSSObRex 以產(chǎn)生pSecTag2Bl (Im)(圖17b)。在AleI和BstBI限制性位點(diǎn)之間定制合成連接體區(qū)域， 并且將其插入到 pSecTag2Bl(Im)以獲得 pSecTag2Blstop (圖 17c)。將 pSecTag2Blstop 轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，并開發(fā)瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞系和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。如通過使用 抗ObR的抗體進(jìn)行的ELISA測量的，表達(dá)水平確定為低ng/ml水平(表2)。然而這些表達(dá) 水平可能被ELISA低估了，因?yàn)楸磉_(dá)培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)印跡顯示已經(jīng)達(dá)到了更高的表達(dá)水平 (圖 16)。
實(shí)施例3 :2D1pSecTag2Dlstop 以與上述 pSecTag2Blstop 類似的方式合成。將 pSecTag2Dlstop 轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，并開發(fā)瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞系和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。如通過使用 抗ObR的抗體進(jìn)行ELISA測量的，表達(dá)水平確定為低ng/ml水平(表2)。然而這些表達(dá)水平 可能被ELISA低估了，因?yàn)楸磉_(dá)培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)印跡顯示已經(jīng)達(dá)到了更高的表達(dá)水平(圖 16)。實(shí)施例4 體外牛物測定結(jié)果體外生物測定使用雙螢光素酶報(bào)告體系測量受刺激的MCF-7細(xì)胞的活性。用表達(dá)0bR、STAT5、SIE和海腎螢光素酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞。ObR的活化經(jīng)由 STAT3和SIE引發(fā)了螢火蟲螢光素酶可誘導(dǎo)的、成比例的表達(dá)；海腎螢光素酶組成型表達(dá)并 作為歸一化螢火蟲螢光素酶活性測量的對(duì)照。螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶二者都使用 雙螢光素酶報(bào)告子測定體系(Promega)和光度計(jì)(luminometer)測量。將螢火蟲螢光素酶 測量值除以海腎螢光素酶測量值給出了修正的活性(即修正樣品間的差異，如細(xì)胞密度和 轉(zhuǎn)染效率的差異)。而后將修正的活性除以未受刺激的細(xì)胞的活性以獲得“誘導(dǎo)倍數(shù)”值。
2A1 (IOx濃縮)和2AlEcopt (純化的)的生物活性分別如圖25和26所示。
權(quán)利要求
一種核酸分子，該核酸分子包含編碼具有瘦蛋白活性的多肽的核酸序列，所述多肽包含直接或間接地連接到瘦蛋白受體多肽的至少一個(gè)瘦蛋白結(jié)合域的瘦蛋白多肽。
2.一種融合多肽，該融合多肽包含直接或間接地連接到瘦蛋白受體多肽的至少一個(gè) 瘦蛋白結(jié)合域的瘦蛋白多肽或其活性部分的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合多肽，其中所述多肽包含兩個(gè)瘦蛋白結(jié)合域。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含至少一個(gè)細(xì)胞因子 樣同源性結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含兩個(gè)細(xì)胞因子樣同 源性結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含至少一個(gè)纖維連接 蛋白III結(jié)合域。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含兩個(gè)纖維連接蛋白 III結(jié)合域。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-8中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸殘基425-535。
10.根據(jù)權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸殘基536-635。
11.根據(jù)權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸殘基326-427。
12.根據(jù)權(quán)利要求2-11中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸殘基62-178。
13.根據(jù)權(quán)利要求2-12中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸殘基235-325。
14.根據(jù)權(quán)利要求2-13中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸殘基636-733。
15.根據(jù)權(quán)利要求2-14中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸殘基734-829。
16.根據(jù)權(quán)利要求2-15中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸殘基428-635。
17.根據(jù)權(quán)利要求2-16中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述瘦蛋白多肽連接到瘦蛋白 受體的至少一個(gè)瘦蛋白結(jié)合域，其中在所述融合多肽中，所述瘦蛋白多肽被置于所述瘦蛋 白結(jié)合域的氨基末端。
18.根據(jù)權(quán)利要求2-16中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述瘦蛋白多肽連接到瘦蛋白 受體的至少一個(gè)瘦蛋白結(jié)合域，其中在所述融合多肽中，所述瘦蛋白多肽被置于所述瘦蛋 白結(jié)合域的羧基末端。
19.根據(jù)權(quán)利要求2-18中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述瘦蛋白多肽通過肽連接體 連接到瘦蛋白受體多肽的至少一個(gè)結(jié)合域。
20.根據(jù)權(quán)利要求19中所述的融合多肽，其中所述肽連接分子包含至少一個(gè)拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0
21.根據(jù)權(quán)利要求20中所述的融合多肽，其中所述肽連接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9 或10個(gè)拷貝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0
22.根據(jù)權(quán)利要求21中所述的融合多肽，其中所述肽連接分子由6個(gè)拷貝的肽GlyGly Gly Gly Ser 組成。
23.根據(jù)權(quán)利要求21中所述的融合多肽，其中所述肽連接分子由8個(gè)拷貝的肽GlyGly Gly Gly Ser 組成。
24.根據(jù)權(quán)利要求2-18中任一項(xiàng)所述的融合多肽，其中所述融合多肽是瘦蛋白多肽和 瘦蛋白受體多肽的至少一個(gè)瘦蛋白結(jié)合域的直接融合體。
25.一種核酸分子，該核酸分子包含選自以下的核酸序列i)SEQID NO 3所示的核酸序列；ii)SEQID NO 5所示的核酸序列；iii)SEQID NO :7所示的核酸序列；iv)SEQ ID NO :9所示的核酸序列；v)SEQ ID NO 11所示的核酸序列；vi)SEQ ID NO 13所示的核酸序列；vii)SEQ ID NO :15所示的核酸序列；viii)SEQ ID NO :17所示的核酸序列；ix)SEQ ID NO 19所示的核酸序列；x)SEQ ID NO 21所示的核酸序列；xi)SEQ ID NO 23所示的核酸序列；xii)SEQ ID NO :25所示的核酸序列；xiii)SEQ ID NO :27所示的核酸序列；核酸分子，該核酸分子包含在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、17、 19、21、23、25或27雜交的核酸序列并編碼具有瘦蛋白受體調(diào)節(jié)活性的多肽。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的核酸分子，其中所述核酸分子編碼瘦蛋白激動(dòng)劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的核酸分子，其中所述核酸分子編碼瘦蛋白拮抗劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO: 3所示的核酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO: 5所示的核酸序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO 7所示的核酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO :9所示的核酸序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO: 11所示的核酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO 13所示的核酸序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO: 15所示的核酸序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO: 17所示的核酸序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO 19所示的核酸序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO 21所示的核酸序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO 23所示的核酸序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO :25所示的核酸序列。
40.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO 27所示的核酸序列。
41.一種多肽，該多肽由根據(jù)權(quán)利要求1或25-40中任一項(xiàng)所述的核酸分子編碼。
42.一種多肽，該多肽包含 SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 所示的氨基酸序列。
43.一種同型二聚體，該同型二聚體由兩個(gè)多肽組成，其中每個(gè)所述多肽包含i)包含瘦蛋白或其受體結(jié)合域的第一部分，該第一部分任選地通過肽連接分子連接到 )包含瘦蛋白受體的至少一個(gè)瘦蛋白結(jié)合域或其部分的第二部分。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個(gè)多肽，所述多 肽包含 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39 或 40。
45.一種載體，該載體包含根據(jù)權(quán)利要求1或25-40中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
46.一種細(xì)胞，該細(xì)胞用根據(jù)權(quán)利要求1、25-40或45中任一項(xiàng)所述的核酸分子或載體 轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
49.一種藥物組合物，該藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求2-24或41或42中任一項(xiàng)所述 的多肽，包含賦形劑或載體。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的藥物組合物，其中該組合物與另外的治療劑組合。
51.一種治療患有將從施用瘦蛋白激動(dòng)劑受益的病況的人類受治療者的方法，該方法 包括施用有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求2-24或41或42中任一項(xiàng)所述的多肽。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述病況是肥胖。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述病況是肥胖相關(guān)的病況。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述肥胖相關(guān)的病況是II型糖尿病。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述肥胖相關(guān)的病況是心臟病。
56.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述病況是免疫抑制。
57.一種治療患有將從施用瘦蛋白拮抗劑受益的病況的人類受治療者的方法，該方法包括施用有效量的至少一種根據(jù)權(quán)利要求2-24或40或41中任一項(xiàng)所述的多肽。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述病況是厭食癥。
59.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述病況是自身免疫疾病。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述自身免疫疾病選自由下列組成的組多發(fā) 性硬化、1型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病、自身免疫性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫 性結(jié)腸炎、克隆氏病、乳糜瀉、自身免疫性腎炎、自身免疫性神經(jīng)病、腦病、纖維性肺泡炎。
61.根據(jù)權(quán)利要求51-60中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽通過靜脈內(nèi)施用。
62.根據(jù)權(quán)利要求51-60中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽通過皮下施用。
63.根據(jù)權(quán)利要求51-62中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽以兩天的間隔施用。
64.根據(jù)權(quán)利要求51-62中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽以每周的間隔施用。
65.根據(jù)權(quán)利要求51-62中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽以每2周的間隔施用。
66.根據(jù)權(quán)利要求51-62中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽以每月的間隔施用。
67.一種單克隆抗體，該單克隆抗體結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求2-24或40、41或43或44中任 一項(xiàng)所述的多肽或二聚體。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的抗體，其中所述單克隆抗體是結(jié)合所述多肽或二聚體、但 不具體地特異性結(jié)合瘦蛋白或瘦蛋白受體的抗體。
69.一種制備產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的方法，該方法包括下列 步驟i)使用含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽的免疫原使免疫活性的哺乳動(dòng)物免疫； )將免疫的免疫活性的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞；iii)根據(jù)對(duì)(i)中的多肽的結(jié)合活性，篩選步驟(ii)的雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體；iv)培養(yǎng)所述雜交瘤細(xì)胞以增殖和/或分泌所述單克隆抗體；以及 ν)從培養(yǎng)上清液中回收單克隆抗體。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述免疫活性的哺乳動(dòng)物是小鼠或大鼠。
71.一種雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系通過根據(jù)權(quán)利要求69或70所述的方法獲得或 是可獲得的。
72.—種在生物樣品中檢測根據(jù)本發(fā)明的多肽的診斷檢驗(yàn)，該診斷檢驗(yàn)包括 i)提供分離的樣品以供檢驗(yàn)； )用結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求2-24或40或41或43或44中任一項(xiàng)所述的多肽或二聚體的 配體接觸所述樣品；和iii)檢測所述樣品中所述配體的結(jié)合。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中所述配體是抗體。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
全文摘要
本公開涉及瘦蛋白融合多肽；編碼所述多肽的核酸分子和使用所述多肽的治療方法。
文檔編號(hào)C07K14/715GK101827858SQ200880110351
公開日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2008年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月3日
發(fā)明者喬恩·塞耶斯, 彼得·阿蒂米克, 理查德·羅斯 申請(qǐng)人:埃斯特瑞恩有限公司