專利名稱：：提供疾患特異性結(jié)合分子和靶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及識別蛋白的疾患相關(guān)表位(包括新表位)的新的特異性結(jié)合分子，特別是人抗體及其片段、衍生物和變體，所述蛋白來自天然的內(nèi)源蛋白，并且在患者體內(nèi)以變體形式和/或脫離其正常生理環(huán)境普遍存在。另夕卜，本發(fā)明涉及包含此類結(jié)合分子、抗體及其模擬物的藥物組合物和篩選治療各種疾病、特別是神經(jīng)疾病(諸如阿爾茨海默病、淀粉樣蛋白病和(3-淀粉樣蛋白病變)的新的結(jié)合分子(可以是或可以不是抗體)、靶和藥物的方法。
背景技術(shù)：
：成功產(chǎn)生單克隆抗體依賴于抗原刺激的B細胞與鼠骨髓瘤細胞系的有效和選擇性融合，然后選擇產(chǎn)生雜交體的穩(wěn)定的抗體，最初描述于K6hler和Milstein,Nature256(1975),495-497。然而，鑒于其非人來源，基于鼠的抗體在人中的治療效用受限于人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。通過遺傳工程可獲得用于制備人或類人單克隆抗體的方法。然而，迄今可用的方法具有以下缺點它們不適合用來此外，由于在具有正常生理功能的情況下與其4也蛋白和/或輩巴蛋白的交叉反應(yīng)性，此類抗體可能不夠特異。例如，在阿爾茨海默病或帕金才t病中，i人為還以高親和力與淀并分才羊前體蛋白(APP)或a突觸核蛋白的生理書f生物交叉反應(yīng)的抗體表現(xiàn)出與生理輩巴結(jié)構(gòu)的正常功能相關(guān)的副作用。在這方面，不希望的自身免疫病將完全一皮i秀導(dǎo)-一種在釆用生理上也存在變體形式的蛋白結(jié)構(gòu)的主動免疫實-驗的方案設(shè)計中幾乎不可估算的危險。與靶結(jié)構(gòu)無關(guān)的副作用是例如過敏反應(yīng)，其被預(yù)期為系統(tǒng)性施用外源蛋白的不希望的和可怕的副作用。才艮據(jù)近來的發(fā)現(xiàn)，在最初來自非人生物(通常來自小鼠)的所謂人源化抗體中也能發(fā)生這種情況。另一方面，病理相關(guān)抗原的主動免疫具有相當(dāng)大的患者發(fā)展也識別此類蛋白的生理變體的抗體和T細胞應(yīng)答的危險，并且因此導(dǎo)致危險的和不可控制的自身免疫應(yīng)答。因此，需要提供特異于疾病涉及的靶并被人體耐受的物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是一種用于鑒定、-瞼i正和產(chǎn)生i貪斷上和治療上有用的結(jié)合分子，特別是針對內(nèi)源蛋白的病理變體的抗體的方法。更具體地，本發(fā)明涉及分離疾患相關(guān)蛋白特異性結(jié)合分子的方法，其包括(a)使獲自無癥狀，或臨床上異常穩(wěn)定，但患有疾病或處于發(fā)展疾病危險的患者的樣品經(jīng)受具有預(yù)定病理特征的病理改變的細月包或組織的試4f;和(b)鑒定并任選地分離與所述試樣結(jié)合，4旦不與可來自1^康對象的沒有此類病理特征的對應(yīng)細胞或組織結(jié)合的結(jié)合分子。已知的事實是，在自身免疫病中，抗體針對自體細胞和由所述細胞表達的蛋白或諸如糖脂的其他化合物，同時避開已知的耐受機制。同樣已知的事實是，在內(nèi)源贅生性發(fā)展中，贅生性細胞的細胞和體液免疫可發(fā)展，并且因此可影響針對贅生性組織變性的內(nèi)源免疫4呆護一幾制。本發(fā)明利用抗體也可針對內(nèi)源蛋白的病理生理相關(guān)變體，特別是針對新表位的驚人發(fā)現(xiàn)，所述新表^[立是由于病理改變的轉(zhuǎn)錄、翻譯、或轉(zhuǎn)錄后或翻i奪后修飾、或蛋白酶解加工、或聚集而形成的。此類抗體針對由于其偏離正常生理的新結(jié)構(gòu)通過發(fā)展病理效應(yīng)而變;f尋與病理生j里相關(guān)的內(nèi)源蛋白。然而，由于免疫耐受，在》匕類病對生理功能性蛋白的任何交叉反應(yīng)，這與自身免疫病中的情況相反。這是因為潛在交叉反應(yīng)性抗體的形成被已知的耐受機制特異地抑制，而對病理新表位的免疫應(yīng)答的發(fā)展可逃避耐受。因此，本發(fā)明涉及通過與可識別病理結(jié)構(gòu)的相互作用而從臨床上預(yù)選的人類對象中鑒定診斷上、治療上和預(yù)防上有活性的結(jié)合分子，特別是抗體和抗體片4殳的新方法。因此，本發(fā)明涉及能識別疾患相關(guān)蛋白的表位(包括新表位)的抗體或抗原結(jié)合片段和相似的抗原結(jié)合分子，所述疾患相關(guān)蛋白來自天然的內(nèi)源蛋白，并且在患者體內(nèi)以變體形式(例如作為病理蛋白)和/或脫離其正常生理環(huán)境普遍存在。此外，本發(fā)明涉及包含所述抗體的組合物，以及使用該組合物的免疫治療和免疫診斷方法。此外，在抗體鑒定中，才艮據(jù)本發(fā)明的方法可無需事先々l/i殳其分子耙結(jié)構(gòu)的身份，而只是通過其與病理相關(guān)結(jié)構(gòu)的結(jié)合來4丸行。除了因此可能鑒定迄今未知的、特定疾患的分子靶結(jié)構(gòu)外，專門針對病理結(jié)構(gòu)的抗體的進一步優(yōu)勢基于它們的藥物動力學(xué)有效性不受與非疾患組織結(jié)合以使抗體的濃度和吸收效應(yīng)#皮緩沖因此妨礙治12療有效濃度的確定的方式負面影響的事實。此外，本發(fā)明的抗體和結(jié)合分子優(yōu)選特征在于它們分別在體內(nèi)與疾患相關(guān)蛋白的變體形式或與細月包或細月包力莫反應(yīng)，并且在具有病理特4正的疾患《且織的切片上，^旦不與或顯著更少程度地與同族蛋白的生理變體反應(yīng)；還參見，例如，實施例2。由于本發(fā)明允許在疾患細胞和組織中鑒定和分離分子耙結(jié)構(gòu)，進一步的實施方案分別涉及由本發(fā)明的新表位特異抗體結(jié)合的抗原和病理蛋白(即疾患相關(guān)蛋白)。特別優(yōu)選的實施方案是證明特征為下文表2和3所述的可變區(qū)VH和/或Vl的任一抗體的免疫結(jié)合特征的人抗體或其抗原結(jié)合片段?？蛇x地，抗體是人源化、異源、或嵌合人-鼠抗體，后者特別用于動物的診斷方法和研究。包括抗體或其活性片段、或激動劑和同力矣分子、或可選地(alternately)其拮抗劑的治療性組合物、此類組合物在使用這些組合物預(yù)防、診斷或治療疾患中的用途方法也包括在本發(fā)明中，其中將有效量的組合物施用于需要此類治療的患者?？贵w的抗原結(jié)合片段可以是單鏈Fv片段、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段、或任何其他抗原結(jié)合片段。在下文特定的實施方案中，抗體或其片,殳是人IgG同種型抗體。自然地，本發(fā)明分別擴展至產(chǎn)生具有下文限定的特殊和獨特特征的抗體的永生化人類B記憶淋巴細胞和B細胞。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的抗體的免疫5求蛋白鏈的至少可變區(qū)的多核普酸。優(yōu)選地，所述可變區(qū)包括下文表2和3所述的VH和/或Vt可變區(qū)的至少一個互補決定區(qū)(CDR)。CDR的對應(yīng)組在下文表4中*合出。相應(yīng)地，本發(fā)明還包括包含所述多核苦酸的載體和用其轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以及它們用于產(chǎn)生特異于指示和/或引起疾病(特別是腦疾病，諸如阿爾茨海默病和帕金森病)的新表位的抗體和等效結(jié)合分子的用途。抗體、免疫球蛋白鏈、其結(jié)合片段和與所述抗體結(jié)合的抗原可分別用在藥物組合物和診斷組合物中用于免疫治療和診斷。然而前述組合物在制備藥劑中的用途是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明的特定目的是提供用于治療或預(yù)防特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中蛋白的異常積累和/或沉積并且不干擾相應(yīng)蛋白的天然功能的神經(jīng)疾病的方法。該方法包括將有效濃度的抗體或抗體4汙生物施用于對象，其中抗體與蛋白的病理形式或蛋白沉積物的結(jié)合親和力顯著高于與蛋白的正常生理形式的結(jié)合親和力。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防或減緩對象中與淀粉樣蛋白P肽的積累和沉積相關(guān)疾患的發(fā)病的方法，所述疾患-諸如阿爾茨海默病、唐氏綜合征、輕度認知損害、腦淀粉樣蛋白血管病、血管性癡呆、多發(fā)性梗死性癡呆。該方法包括將有效濃度的抗體或抗體衍生物施用于對象，其中抗體與蛋白的病理形式或蛋白沉積物的結(jié)合親和力高于與蛋白的正常生理形式的結(jié)合親和力。相似的治療性方法預(yù)計用于治療帕金才架病、亨廷頓病、克雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease).嚢'〖生纖纟1M匕、高雪病(Gaucher，sdisease)詳口類4以疾病。根據(jù)以下的說明書，本發(fā)明的其他實施方案將是明顯的。附圖簡述圖1:針對P-淀4分樣蛋白的抗體。A:人抗體。B:用針對人卩-淀粉樣蛋白的已知抗體的對照染色。患有阿爾茨海默病的臨床上異常穩(wěn)定的患者含有針對P-淀粉樣蛋白斑塊的抗體。用來自臨床上異常穩(wěn)定的患者的抗體對獲自患有病理上確^人的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織化學(xué)染色揭示了與由針對人P-淀粉樣蛋白的已知抗體確認的P-淀4分樣蛋白斑塊結(jié)合的抗體。圖2:針對神經(jīng)原纖維纏結(jié)的抗體。A:人抗體。B:用針對人tau的已知抗體的對照染色。健康的人類對象含有針對神經(jīng)原纖維纏結(jié)的抗體。用來自健康對象的抗體對獲自患有病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織化學(xué)染色揭示了與由4十對人tau的已知抗體確i^的神經(jīng)原纖維纏結(jié)結(jié)合的抗體。圖3:針對營養(yǎng)不良性軸突的抗體。A:人抗體。B:用針對人tau的已知抗體的對照染色。健康的人類對象含有針對營養(yǎng)不良性軸突的抗體。用來自健康對象的抗體對獲自患有病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織學(xué)染色揭示了與營養(yǎng)不良性軸突結(jié)合的抗體。圖4:針對(3-淀粉樣蛋白的抗體。該圖顯示從臨床上異常穩(wěn)定的阿爾茨海默病患者中分離的重組人NI-lOl.ll抗體與腦(3-淀粉樣蛋白斑塊的特異性結(jié)合。獲自患有神經(jīng)病理上確i人的阿爾茨海默病的患者的腦切片用指示濃度的重組人抗體染色。50pM濃度的抗體與P-淀粉樣蛋白斑塊的結(jié)合暗示了高親和力的結(jié)合。圖5:線性的合成N-末端A(3多肽不竟?fàn)幹亟M人NI-101.11抗體與(3-淀粉樣蛋白斑塊的結(jié)合。代表位置1至16的可達1nM濃度的N-末端Ap-衍生多肽不能竟?fàn)庒槍δX(3-淀粉樣蛋白的重組抗體(0.5nM)的結(jié)合。圖6:重組人NI-101.11抗體識別單體Ap中不存在的構(gòu)象A卩表位。Api-42原纖維而不是線性的合成AP1-42單體可竟?fàn)幠X切片上NI-lOl.ll與P-淀4分樣蛋白斑塊的結(jié)合。15圖7:蛋白質(zhì)印跡上重組人NI-lOl.ll抗體不與線性、單體的合成AP結(jié)合。單體Ap制品通過非變性PAGE分離。印跡蛋白用針對(3-淀粉樣蛋白的人重組抗體和針對N-末端線性Ap序列的對照抗體(6E10)來#笨測。沒有才企測到NI-101.11與單體Ap的結(jié)合。這一觀察暗示該抗體識別構(gòu)象AP表位。圖8:人NI-lOl.ll抗體結(jié)合乂人合成的Api-42肽制備的人工淀粉樣蛋白原纖維。以同樣包被密度包被于ELISA板上的合成的Ap原纖維或單體的合成A(3與指示濃度的針對腦P-淀粉樣蛋白的重組人抗體一起孵育。針對腦(3-淀粉樣蛋白的人抗體與人工淀粉樣蛋白原纖維的結(jié)合活性(空心方塊)比單體A(3(實心方塊)高100多倍。對照抗體22C4優(yōu)先與單體A(3(實心圓圈)結(jié)合，而與原纖維(空心圓圈)結(jié)合得不太好。這暗示NI-101.11識別也存在于乂人合成的A卩肽制備的人工淀粉樣蛋白原纖維上的構(gòu)象表位。圖9:重組人NI-101.11抗體與細胞全長APP或者存在于i咅養(yǎng)細月包中的4壬何其生理書f生物沒有交叉反應(yīng)性。與結(jié)合細月包表面APP的對照抗體(6E10)相反，NI-101.11不與存在于細月包表面的全長APP結(jié)合。這些凄t據(jù)i兌明NI-101.11與生理的細胞全長APP沒有交叉反應(yīng)性。圖IOA-C:通過大小排阻層析NI-101.11不與單體AP結(jié)合。圖10A和10B顯示NI-101.11或不相關(guān)的乂十照4元體不與單體FITC-才示i己的Api-42結(jié)合，而圖10C顯示識別存在于A|3的C-末端的線性表位的抗體22C4的顯著結(jié)合。圖11:竟?fàn)幮訣LISA顯示與過量濃度的單體Ap肽預(yù)孵育后，抗體6E10(針對Ap的N-末端的線性表位的抗體)的結(jié)合可被完全阻抑，而與過量濃度的這些單體AP肽制品的預(yù)孵育沒有》皮壞NI-101.11的結(jié)合。圖12:NI-101.13A和NI-101.13B與獲自阿爾茨海,默病的Tg2676轉(zhuǎn)基因小鼠模型的腦切片的結(jié)合。圖13:ELISA顯示與單體Ap相比，NI-101.13A和NI-101.13B優(yōu)先結(jié)合人工淀粉樣蛋白原纖維。圖14A-B:圖14A顯示ELISA中重組NI-101.12與合成的A卩l(xiāng)-42肽的結(jié)合。圖14B顯示過量的A卩l(xiāng)-42肽竟?fàn)嶯I-101.12的結(jié)合。圖15:在阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，針對腦p-淀粉樣蛋白的重組人NI-101.11抗體穿越血腦屏障，并在體內(nèi)與腦p-淀斗分樣蛋白斑塊結(jié)合。圖16A-B:在阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因小鼠才莫型中，重組人NI-101.11^t體改善了異常i人知^f亍為。24個月大的arcAp小鼠每周用3mg/kg抗體i.p.治療2個月。在治療完成之前和之后進4亍Y-迷宮4亍為測-試。圖17:通過外周施用NI-101.11的淀粉樣蛋白斑塊的血腦屏障穿透和》務(wù)飾(decorationX在NI-101.11治療小鼠中(左圖)，NI-101.11可穿越血腦屏障，并與P-淀4分樣蛋白沉積物結(jié)合，而在用人對照抗體治療的動物中(右圖)，沒有此類染色可見。在系統(tǒng)性治療兩個月之后，重組人NI-101.11抗體減少了腦P-淀粉樣蛋白斑塊的負載。圖18:用NI-101.11的被動免疫減少了arcA卩小鼠中P-淀4分樣蛋白的負載。(A,B)硫代黃素S和剛果紅斑塊負載分析揭示了與對照抗體治療的動物相比超過50%的顯著減少(曼-惠特尼U;ThioS:皮層p=0.02，海馬p=0.009,和剛果紅分析皮層p=0.009,海馬p=0.04)。比例尺200pm。(C-E)石克代黃素S分析揭示了與對照治療的動物相比，NI-101.11治療的arcAp小鼠中p-淀賴^羊蛋白負荷(C)、P-淀粉樣蛋白斑塊的數(shù)目(D)和平均斑塊大小(E)的顯著減少。曼-惠特尼U統(tǒng)計皮層斑塊面積p=0.02;海馬斑塊面積p=0.009;皮層斑塊數(shù)目p=0.047;海馬斑塊lt目p=0.047;皮層斑塊大小p=0.009;海馬斑塊數(shù)目p=0,009。圖19:減少的P-淀粉樣蛋白負載伴隨著減少的星形膠質(zhì)細胞增生和小"交質(zhì)細胞增生。A)抗GFAP染色的定量揭示，當(dāng)與對照治療的轉(zhuǎn)基因動物相比時，NI-lOl.ll治療的arcA卩小鼠皮層中反應(yīng)性星形力交質(zhì)細胞lt目的顯著減少。B)Iba-1染色的定量顯示在NI-101.11治療的小鼠皮層和海馬中傾向于減少數(shù)目的活化小膠質(zhì)纟田月包。t匕Y列&:200(im。圖20:用重組人NI-101.11抗體治療兩個月后，腦樣吏出血沒有增加?；加幸炎C實的塊狀嗜剛果紅淀粉樣蛋白血管病的24個月大的arcAp小鼠每周用3mg/kg抗體i.p.治療2個月。arcA(3小鼠腦凝:出血的代表圖片由Perl氏普魯士藍染色顯示(左側(cè))。定量分析說明與其野生型同窩小鼠相比，arcAp轉(zhuǎn)基因小鼠中顯著增加的微出血(micorhemorrhages)頻率。用NI-101.11的'f曼性治療沒有導(dǎo)致樣t出血(micorhemorrhages)步貞率的i曾力口。比侈寸尺20pm。圖21:重組人NI-101.11抗體在體外抑制合成的AP原纖維的形成。重組人NI-101.11抗體對A(3原纖維形成的影響通過熒光分析測量與聚集的A(3結(jié)合的碌u代黃素S來測定。18圖22:BV-2小膠質(zhì)細胞中抗體-介導(dǎo)的劑量依賴性的FITC-Api-42原纖維的吞噬作用在抑制了清除受體系統(tǒng)后測量。NI-101.11觸發(fā)強有力的劑量依賴性的Fey受體-介導(dǎo)的A(3原纖維的吞噬作用。發(fā)明詳述I.定義應(yīng)注意，術(shù)語"一個(a)"或"一個(an)"實體指一個或多個該實體；例如，"一個抗體(anantibody)"理解為代表一個或多個抗體。因此，術(shù)語"一個(a)"(或"一個(an)")、"一個或多個"和"至少一個"在本文可互換J吏用。如本文所用，術(shù)語"多肽"預(yù)期包括單個"多肽(polypeptide)"以及兩個以上"多肽(polypeptides)，，，并且指主要由通過酰胺4走(也稱為肽4定)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術(shù)語"多肽"指兩個或多個氨基酸的任一條或幾條鏈，并且不指特定長度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、"蛋白質(zhì)"、"氨基酸鏈"或用來指兩個或多個氨基酸的一條或幾條鏈的任何其他術(shù)語都包括在定義"多肽"內(nèi)，并且術(shù)語"多肽"可代替或與任何這些術(shù)語互換4吏用。術(shù)語"多肽"也意指多肽的表達后^f'務(wù)飾產(chǎn)物，包括-f旦不限于已知保護/封閉基團的糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白酶剪切、或非天然存在的氨基酸的修飾。多肽可來自天然生物來源或通過重組技術(shù)產(chǎn)生，但不是必然地從指定的核酸序列翻譯而來。多肽可以任何方式產(chǎn)生，包括通過化學(xué)合成。本發(fā)明的多肽的大小可以是約3個或更多、5個或更多、10個或更多、20個或更多、25個或更多、50個或更多、75個或更多、100個或更多、200個或更多、500個或更多、IOOO個或更多、2000個或更多個氨基s吏。多肽可以具有確定的三維結(jié)構(gòu)，盡管它們不必然地具有這才羊的結(jié)構(gòu)。具有確定三維結(jié)構(gòu)的多肽一皮稱為4斤疊的，而不具有確定三維結(jié)構(gòu)而是可采用多種不同構(gòu)象的多肽一皮稱為未4斤疊的。如本文所用，術(shù)語糖蛋白指與通過氨基酸殘基(例如，絲氨酸殘基或天冬酰胺殘基)的含氧或含氮側(cè)《連與蛋白相連的至少一個碳水化合物部分偶聯(lián)的蛋白。"分離"多肽或其片段、變體或衍生物意指不處于其天然環(huán)境的多肽。不需要特定水平的純化。例如，分離多肽可,人其天然或自然環(huán)境脫離。為了本發(fā)明的目的，在宿主細月包中表達的重《且產(chǎn)生的多肽和蛋白被認為是分離的，通過任何適合的技術(shù)而分離、分級分離、或部分或基本純化的天然或重組多肽也凈皮i人為是分離的。本發(fā)明的多肽還包括前述多肽的片段、衍生物、類似物或變體及其任何組合。當(dāng)指本發(fā)明的抗體或抗體多肽時，術(shù)語"片段"、"變體"、"衍生物"和"類似物"包括保留對應(yīng)的天然結(jié)合分子、抗體或多肽的抗原結(jié)合特性的至少一些的任何多肽。本發(fā)明的多肽片段包括蛋白水解片段和缺失片段，以及在本文其他地方討論的特定抗體片段。本發(fā)明的抗體和抗體多肽的變體包括上述片段，還包括由于氨基酸置換、缺失或插入而具有改變的氨基酸序列的多肽。變體可以天然存在或者是非天然存在的。非天然存在的變體可使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。變體多肽可包含保守或非保守的氨基酸置換、缺失或添加。新表位特異性結(jié)合分子(例如本發(fā)明的抗體和抗體多肽)的衍生物是已被改變以便表現(xiàn)出未發(fā)現(xiàn)于天然多肽的其他特點的多肽。實例包括融合蛋白。變體多肽在本文也稱為"多肽類似物"。如本文所用，結(jié)合分子或其片段、抗體或抗體多肽的"汙生物"指具有通過功能性側(cè)基的反應(yīng)而化學(xué)書于生^^的一個或多個殘基的主題多肽。"衍生物"還包括含有20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一種或多種天然存在20的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羥脯氨酸可置換脯氨酸；5-羥賴氨酸可置換賴氨酸；3-曱基組氨酸可置換組氨酸；同型絲氨酸可置換絲氨酸；鳥氨酸可置換賴氨酸。術(shù)語"多核苦酸，，預(yù)期包括單個核酸以及兩個以上的核酸，并且指分離核酸分子或構(gòu)建體，例如，信4吏RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA(pDNA)。多核苦酸可包含常規(guī)的磷酸二酯鍵或非常規(guī)的鍵(例如，酰胺鍵，諸如發(fā)現(xiàn)于肽核酸(PNA)中)。術(shù)語"核酸"指存在于多核苦酸的任一個或多個核酸區(qū)^殳，例如，DNA或RNA片I殳。"分離"核酸或多核苷酸意指乂人其天然環(huán)境脫離的核酸分子(DNA或RNA)。例如，為了本發(fā)明的目的，包含于載體中的編碼抗體的重組多核苷酸^皮i^為是分離的。分離多核苷酸的其他實例包括^f呆持于異源宿主細胞中的重組多核苷酸或溶液中的純化(部分或基本純化的)多核苷酸。分離的RNA分子包括本發(fā)明的多核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。4艮據(jù)本發(fā)明的分離多核苷酸或核酸進一步包括合成產(chǎn)生的此類分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包4舌調(diào)節(jié)元件，諸如啟動子、核糖體結(jié)合位點、或轉(zhuǎn)錄終止子。如本文所用，"編碼區(qū)"是由翻譯成氨基酸的密碼子組成的核酸的一部分。盡管"終止密碼子"(TAG、TGA或TAA)不翻譯成氨基酸，其可一皮認為是編碼區(qū)的一部分，但是例如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子以及類似序列的任何側(cè)翼序列不是編碼區(qū)的一部分。本發(fā)明的兩個或多個編碼區(qū)可存在于單個多核苷酸構(gòu)建體中(例如，在單個載體上)，或在分開的多核苷酸構(gòu)建體中(例如，在分開的(不同的)載體上)。此外，任何載體可含有單個編碼區(qū)，或可包含兩個或多個編碼區(qū)，例如，單個載體可分別編碼免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和免疫J求蛋白的輕鏈可變區(qū)。另外，本發(fā)明的載體、多核香酸、或核酸可編碼與編碼結(jié)合分子、抗體、或其片段、變體、或衍生物的核酸融合或不融合的異源編碼區(qū)。異源編碼區(qū)包括但不限于特定的元件或基序，諸如分泌信號肽或異源功能性結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情況中，包含編碼多肽的核酸的多核苷酸正常可包括啟動子和/或可"t喿作地與一個或多個編碼區(qū)相連的其4也轉(zhuǎn)錄或翻i斧控制元件?？刹艈鬃鬟B才妻是基因產(chǎn)物(例如，多肽)的編碼區(qū)與一個或多個調(diào)節(jié)序列以^f吏基因產(chǎn)物的表達置于調(diào)節(jié)序列的影響或控制下的方式相連。如果啟動子功能的誘導(dǎo)引起編碼需要的基因產(chǎn)物的mRNA的轉(zhuǎn)錄，以及如果兩個DNA片段之間的鍵合性質(zhì)不干擾表達調(diào)節(jié)序列指引基因產(chǎn)物表達或不干擾DNA模板被轉(zhuǎn)錄的能力，那么兩個DNA片段(諸如多肽編碼區(qū)和與其結(jié)合的啟動子)是"可才喿作連4妻"。因此，如果啟動子能影響該核酸的轉(zhuǎn)錄，那么啟動子區(qū)將與編碼多肽的核酸可操作連接。啟動子可以是指引DNA僅在預(yù)定細胞中基本轉(zhuǎn)錄的細胞特異性啟動子。除啟動子外，其他轉(zhuǎn)錄控制元件(例如增強子、才喿縱子、阻遏子和轉(zhuǎn)錄終止信號)可與多核苷酸可才乘作地連4妻以指引細胞特異性轉(zhuǎn)錄。適合的啟動子和其他轉(zhuǎn)錄控制區(qū)公開于本文。多種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。這些轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括但不限于在脊推動物細胞中起作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，諸如但不限于，來自巨細胞病毒(即時早期啟動子，連同內(nèi)含子-A)、猿猴病毒40(早期啟動子)、和反轉(zhuǎn)錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒)的啟動子和增強子區(qū)段。其他轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括來自脊推動物基因(諸如肌動蛋白、熱激蛋白、牛生長激素和兔P-珠蛋白)的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，以及能在真核細胞中控制基因表達的其他序列。其他適合的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動子和增強子，以及淋巴因子誘導(dǎo)型啟動子(例如，可由干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動子)。22相似地，多種翻譯控制元件對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。這些翻i奪控制元件包括-f旦不限于核糖體結(jié)合位點、翻i奪起始和終止密碼子和來自小RNA病毒的元件(特別是內(nèi)部核糖體進入位點或IRES,也稱為CITE序列)。在其他實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是RNA，例如，以信4吏RNA(mRNA)的形式。本發(fā)明的多核苷酸和核酸編碼區(qū)可與編碼指引由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的分泌的分泌或信號肽的其他編碼區(qū)締合。根據(jù)信號假說，哺乳動物細胞分泌的蛋白具有信號肽或分泌前導(dǎo)序列，一旦正在生成的蛋白鏈起始了穿過粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的輸出，信號肽或分泌前導(dǎo)序列/人成熟蛋白上切下。本領(lǐng)域普通才支術(shù)人員了解，脊坤,動物細胞分泌的多肽一般具有與多肽的N-末端融合的信號肽，信號肽從完整或"全長"多肽上切下以產(chǎn)生分泌的或"成熟"形式的多肽。在某些實施方案中，4吏用天然信號肽(例如，免疫^求蛋白重《連或輕《連的信號肽)，或者保留了指引與其可操作連接的多肽的分泌的能力的那些序列的功能性衍生物?？蛇x地，可^f吏用異源哺乳動物信號肽或其功能性書f生物。例如，可用人組織纖卩容酶原激活物(TPA)或小鼠p-葡糖醛酸酶的前導(dǎo)序列來置換野生型前導(dǎo)序列。除非另外指明，術(shù)語"疾病"和"疾患"在本文可互換使用。在本發(fā)明上下文使用的"結(jié)合分子"主要涉及抗體及其片段，但也可指與新表位結(jié)合的其他非抗體分子，包括但不限于激素、受體、配體、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子、諸如熱激蛋白(HSP)的分子伴倡，以及細胞-細胞粘著分子，諸如4丐粘著蛋白、整聯(lián)蛋白(intergrin)、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成員。因此，Y又為清楚起見，并且不限制本發(fā)明的范圍，下述實施方案的大多翁:是就代表用于治療和診斷劑開發(fā)的優(yōu)選結(jié)合分子的抗體和類抗體分子而討i侖的。術(shù)語"抗體"和"免疫J求蛋白"在本文可互換使用?？贵w或免疫5求蛋白是包含重鏈的至少可變結(jié)構(gòu)域、并且正常包含重鏈和輕鏈的至少可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子。脊推動物系統(tǒng)的基本免疫^求蛋白結(jié)構(gòu)了解4尋相》于清楚。參見，例3口，Harlow等，Antibodies:ALaboratoryManual(抗體實驗指南)，(ColdSpringHarborLaboratoryPress,第二版，1988)。如下文將更詳細地討論，術(shù)語"免疫球蛋白"包含可生化地區(qū)別的多種類別的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，重鏈分為y、p、a、S或￡(Y,a,S，￡)，其中有一些亞類(例如，yl-y4)。鏈的性質(zhì)確定了抗體的"類別"分別為IgG、IgM、IgAIgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl等，表征得4艮清楚，并且已知其賦予功能專門化。鑒于本公開內(nèi)容，這些類別和同種型的每一個的修飾形式對熟練的技術(shù)人員來說是容易辨別的，并且相應(yīng)地在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所有的免疫球蛋白類別都清楚地在本發(fā)明的范圍內(nèi)，下述討論一般將針對免疫球蛋白分子的IgG類。關(guān)于IgG,標(biāo)準(zhǔn)的免疫球蛋白分子包含兩條相同的分子量大約23,000道爾頓的輕《連多肽和兩條相同的分子量53,000-70,000的重鏈多肽。四條鏈一般以"Y"構(gòu)型由二硫鍵相連，其中輕鏈支持重鏈，在"Y"的口處開始并延續(xù)經(jīng)可變區(qū)。輕鏈分為K或X(K，X)。每重鏈類別可與K或X輕鏈結(jié)合。一般而言，當(dāng)免疫球蛋白通過雜交瘤、B細胞或遺傳改造的宿主細胞產(chǎn)生時，輕鏈和重鏈彼此共價鍵合，并且兩條重鏈的"尾"部通過共價二硫鍵合或非共價鍵合彼此鍵合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構(gòu)型叉末端的N-末端延伸到每條鏈底部的C-末端。輕鏈和重鏈都分成結(jié)構(gòu)和功能同源區(qū)。術(shù)語"恒定"和"可變"功能地/使用。在這方面，應(yīng)理解，輕鏈(VL)和重《連(VH)部分的可變結(jié)構(gòu)域決定抗原的識別和特異性。相反地，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恒定結(jié)構(gòu)域賦予重要的生物學(xué)特性，諸如分泌、經(jīng)胎盤的遷移率、Fc受體結(jié)合、補體結(jié)合及類似特性。按照慣例，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編號隨著它們變得與抗體的抗原結(jié)合位點或氨基末端更遠而增加。N-末端部分是可變區(qū)，而C-末端部分是恒定區(qū)；CH3和CL結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包括重鏈和輕鏈的羧基末端。如上文所示，可變區(qū)允許抗體選4奪性地識別和特異地結(jié)合抗原上的表位。也就是i兌，抗體的VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)i或、或互補決定區(qū)(CDR)的亞型組合形成確定三維抗原結(jié)合位點的可變區(qū)。這種四級抗體結(jié)構(gòu)形成了存在于Y的每個臂末端的抗原結(jié)合位點。更具體地，該抗原結(jié)合4立點由每條VH和VL《連上的三個CDR定義。含有足以特異結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)的任何抗體或免疫5求蛋白片,史在本文可交換表示為"抗原結(jié)合片段"或"免疫特異性片段"。在天然存在的抗體中，每個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中存在的六個"互補決定區(qū)"或"CDR，，是特異地定位以便當(dāng)抗體在水環(huán)境中采取其三維構(gòu)型時形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的短的、不相鄰的氨基酸序列。抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中剩余的氨基酸(稱為"構(gòu)架"區(qū))顯示更低的分子間可變性。構(gòu)架區(qū)主要采耳又p4斤疊構(gòu)象，而CDR形成連接的環(huán)，在一些情況中，CDR形成(3-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。因此，構(gòu)架區(qū)的作用是形成提供CDR通過鏈間非共價相互作用以正確取向定位的支架結(jié)上的表位互補的表面。該互補表面促進抗體與其同族表位的非共價結(jié)合。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地鑒定任何特定重鏈或輕鏈可變區(qū)的分別包含CDR和構(gòu)架區(qū)的氨基酸，因為這些氨基酸已被精確定義(參見,"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,"(具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列)Kabat,E.等，美國衛(wèi)生及公共服務(wù)部，(1983);和Chothia和Lesk,5/o/.，796:901-917(1987)，其通過引用整體并入本文)。在本領(lǐng)域4吏用和/或4妄受的術(shù)i吾有兩種或多種定義的情況中，本文所用的術(shù)語的定義預(yù)期包括所有這些含義，除非明確指明為相反的意思。具體實例是使用術(shù)語"互補決定區(qū)"("CDR")來描述重鏈和輕《連多肽可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的不相鄰的抗原組合4立點。這一特定區(qū)&戈已描述于Kabat等，美國衛(wèi)生及^>共月良務(wù)部，"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest"(具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列)(1983)和Chothia等,J:她/.腸/.796:901-917(1987),其通過引用并入本文，其中當(dāng);f皮此比舉交時，定義包4舌重疊的氨基酸殘基或氨基酸殘基的亞型。然而，指抗體或其變體的CDR的任一定義的應(yīng)用預(yù)期在本文定義和4吏用的術(shù)i吾的范圍內(nèi)。由上文引用的每個參考文獻定義的包含CDR的適當(dāng)氨基酸殘基描述于下文的表I中作為比較。包含特定CDR的確切殘基數(shù)將根據(jù)CDR的序列和大小而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地可根據(jù)抗體的可變區(qū)氨基酸序列來確定哪些殘基包含凈爭定的CDR。表l:CDR定義1KabatChothiaVHCDR131-3526-32VHCDR250-6552-58VHCDR395-10295-102VLCDR124-3426-32VLCDR250-5650-52VLCDR389-9791-961表1中所有CDR定義的編號是根據(jù)Kabat等描述的編號慣例(參見下文)。26統(tǒng)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可明確地將該"Kabat編號"系統(tǒng)分配于任何可變結(jié)構(gòu)域序列，而不依賴于除序列本身外的任何實驗數(shù)據(jù)。如本文所用，"Kabat編號，，指Kabat等，美國衛(wèi)生及7>共月良務(wù)部，"SequenceofProteinsofImmunologicalInterest"(具有免疫學(xué)重要性的蛋白序列)(1983)描述的編號系統(tǒng)。除非另外指定，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物中所指的特定氨基酸殘基位置的編號是才艮據(jù)Kabat編號系統(tǒng)。本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、免疫特異性片段、變體、或衍生物包括但不限于，多克隆、單克隆、多特異性、人、人源化、靈長源化、或嵌合抗體、單鏈抗體、表位結(jié)合片段，例如，F(xiàn)ab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、單鏈Fv(scFv)、單4連抗體、二辟blt相連的Fv(sdFv)、包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的片,史、Fab表達文庫產(chǎn)生的片段和抗獨特型(抗-Id)抗體(包括，例如，針對本文公開的抗體的抗-Id抗體)。ScFv分子是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如，美國專利5，892，019。本發(fā)明的免疫球蛋白或抗體分子可以是免疫球蛋白分子的4壬<可類型(侈'B。，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體不是具有五^介結(jié)構(gòu)的IgM或其書f生物。特別地，在本發(fā)明的特定應(yīng)用、特別是治療性應(yīng)用中，IgM不如IgG和其他二〗介抗體或?qū)?yīng)的結(jié)合分子有效，因為由于其五1介結(jié)構(gòu)和^:少親和力成熟，IgM通常顯示非特異性交叉反應(yīng)性和非常^氐的親和力?？贵w片段(包括單鏈抗體)可包含單獨或與以下的整體或部分的組合的可變區(qū)鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還包括也包含可變區(qū)與4交鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的4壬何組動物來源，包括鳥類和哺乳動物。優(yōu)選地，抗體是人、鼠、驢、兔、山羊、天竺鼠、-格駝、美洲駝、馬或雞的抗體。在另一個實施方案中，可變區(qū)可以是condricthoid來源(例3口，來自罝魚)。3口本文所用，"人"抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體，并且包括乂人人類患者、人免疫J求蛋白文庫或具有一種或多種人免疫^求蛋白并且不表達內(nèi)源免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物分離的抗體，如下文和例如美國專利第5,939,598號(Kucherlapati等)所述。人4元體仍舊是"人的"，即使抗體中進行了氨基酸置換，例如以便改善結(jié)合特征。如本文所用，術(shù)語"重鏈部分"包括來自免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。包含重《連部分的多肽包括以下的至少一個CH1結(jié)構(gòu)域、4交4連(例如，上部、中部和/或下部4交《連區(qū))結(jié)構(gòu)i或、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域、或其變體或片段。例如，本發(fā)明使用的結(jié)合多肽可包括包含CH1結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分和CH2結(jié)構(gòu)i或的多肽4連；包含CH1結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈，或包含CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽包括包含CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。進一步，本發(fā)明使用的結(jié)合多月太可缺少CH2結(jié)構(gòu)i或的至少一部分(例3。，CH2結(jié)構(gòu)i或的所有或一部分)。如上文所述，本領(lǐng)i或普通4支術(shù)人員將理解，這些結(jié)構(gòu)域(例如重鏈部分)可被修飾，以致它們與天然存在的免疫球蛋白分子在氨基酸序列上不同。在本文/>開的某些抗體、或其抗原結(jié)合片,史、變體、或書f生物中，多聚體的一條多肽鏈的重鏈部分與多聚體的第二條多肽鏈的重鏈部分相同?？蛇x地，本發(fā)明的含有重《連部分的單體不相同。例如，每單體可包含不同的耙結(jié)合位點，形成例如雙特異性抗體。本文公開的診斷和治療方法中使用的結(jié)合多肽的重鏈部分可來自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重鏈部分可包含來自IgGl分子的CH1結(jié)構(gòu)域和來自IgG3分子的鉸鏈區(qū)。在另一個實例中，重《連部分可包含部分來自IgGl分子和部分來自IgG3分子的鉸鏈區(qū)。在另一個實例中，重鏈部分可包含部分來自IgGl分子和部分來自IgG4分子的嵌合鉸鏈。如本文所用，術(shù)語"輕鏈部分"包括來自免疫J求蛋白輕《連的氨基酸序列。優(yōu)選地，輕《連部分包含VL或CL結(jié)構(gòu)域的至少一個。認為抗體的肽或多肽表位的最小大小是約4至5個氨基酸。肽或多肽表位優(yōu)選地含有至少7個、更優(yōu)選地至少9個和最優(yōu)選地在至少約15個至約30個之間的氨基^^。由于CDR可識別以其三級形式的抗原肽或多肽，包含表位的氨基酸不需要相鄰，并且在一些情況中，可能甚至不在同一條肽鏈上。在本發(fā)明中，本發(fā)明的抗體識別的肽或多肽表位含有AP的至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、更〗尤選;也至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個或約15個至約30個相鄰或不相鄰的氨基酸的序列。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"新表位"表示獨特于疾患模式并且包含于疾病相關(guān)蛋白或由疾病相關(guān)蛋白形成的表^f立，所述疾病相關(guān)蛋白是其他非病理蛋白的病理變體和/或偏離健康狀態(tài)生理。所述病理生理變體可通過以下手,殳形成病理改變的轉(zhuǎn)錄、病理改變的翻i,、翻i斧后^f務(wù)飾、病理改變的蛋白酶解加工、病理改變的與生理或病理生理的相互作用配偶體或細胞結(jié)構(gòu)形成復(fù)合體(從改變的共定位意義上說)、或病理改變的結(jié)構(gòu)構(gòu)象-比如例如聚集、寡聚化或原纖維形成-其三或四維結(jié)構(gòu)不同于生理活性分子的結(jié)構(gòu)。此外，病理生J里變體也特;f正在于它不處于其通常的生理環(huán)境或亞細力包區(qū)室。作為實例，2新表位可位于顯然經(jīng)歷或已經(jīng)歷功能損傷的腦組織區(qū)域的病理明顯的結(jié)構(gòu)中。特定結(jié)構(gòu)(例如細胞或組織、或蛋白)是否展示新表^立可通過逆4爭下文描述的用于分離和表4正疾病相關(guān)蛋白特異性結(jié)合分子的方法來證實，因為結(jié)合分子(例如通過所述方法鑒定的抗體)用來篩選與抗體結(jié)合的才羊品，因此確定新表位的存在。短語"疾患相關(guān)蛋白特異的"和"新表位特異的"在本文可與術(shù)語"特異識別新表位，，互換使用。如本文所用諸如"沒有交叉反應(yīng)性"、"特異的"、"特異識別"、"特異結(jié)合"、"優(yōu)先結(jié)合"和類似術(shù)語指結(jié)合分子區(qū)分疾病相關(guān)蛋白的新表位和以其野生型形式和天然環(huán)境下的天然蛋白的能力。因此，本發(fā)明的結(jié)合分子對新表位的優(yōu)先結(jié)合親和力為天然蛋白抗原的至少2倍、優(yōu)選地至少5倍、通常超過10倍、特別優(yōu)選地50倍和甚至更優(yōu)選地高于IOO倍。此外，結(jié)合分子的相對KD(例如，抗體對特定的靶表位，例如新表位)是該抗體與其他配體或與疾患相關(guān)蛋白的天然對應(yīng)物的結(jié)合KD的優(yōu)選地至少1/10、更優(yōu)選地至少1/100倍或更^f氐。在本文可互換使用的"特異結(jié)合"或"特異識別"一般意指結(jié)合分子(例如，抗體)通過其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與表位結(jié)合，并且結(jié)合需要抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和表位之間一定的互補性。根據(jù)這一定義，當(dāng)抗體通過其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與該表位的結(jié)合比其與隨機的不相關(guān)表位的結(jié)合更容易時，可以說抗體"特異結(jié)合"表位。術(shù)語"特異性"在本文用來明確某一抗體與某一表位結(jié)合的相對親和力。例如，可認為抗體"A，，對特定表位的特異性高于抗體"B",或者可以說抗體"A"與表位"C"結(jié)合特異性高于其與相關(guān)表位"D"的結(jié)合。"優(yōu)先結(jié)合"意指與結(jié)合相關(guān)、相似、同源或類似表位相比，結(jié)合分子(例如，抗體)更容易特異地結(jié)合某表位。因此，"優(yōu)先結(jié)30合，，特定表位的抗體將更可能結(jié)合該表位而不是相關(guān)表位，盡管此類抗體可與相關(guān)表位交叉反應(yīng)。作為非限制性實例，如果結(jié)合分子(例如，抗體)與第一個表位結(jié)合的解離常數(shù)(KD)小于抗體對第二個表位的KD，可認為所述結(jié)合分子優(yōu)先結(jié)合所述第一個表位。在另一個非限制性實例中，如果抗體與第一個表位的結(jié)合親和力比抗體對第二個表位的KD小至少一個數(shù)量級，可認為抗體優(yōu)先結(jié)合第一個抗原。在另一個非限制性實例中，如果抗體與第一個表位的結(jié)合親和力比抗體對第二個表位的KD小至少兩個凄t量級，可認為抗體優(yōu)先結(jié)合第一個表位。在另一個非限制性實例中，如果結(jié)合分子(例如，抗體)與第一個表位結(jié)合的解離率(k(off))小于抗體對第二個表位的k(off),可認為所述結(jié)合分子優(yōu)先結(jié)合第一個表位。在另一個非限制性實例中，如果抗體與第一個表位的結(jié)合親和力比抗體對第二個表位的k(off)小至少一個lt量級，可i/v為所述抗體〗尤先結(jié)合第一個表位。在另一個非限制性實例中，如果抗體與第一個表位的結(jié)合親和力比抗體對第二個表位的k(off)小至少兩個H量纟及，可iL為所述抗體優(yōu)先結(jié)合第一個表位。可以說本文公開的結(jié)合分子(例如，抗體或抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物)與本文公開的靶多肽或其片段或變體以小于或等于5x10.2sec-1、1(T2sec"、5x10.3sec-1或10—3sec"的解離率(k(off))纟*合。更優(yōu)選地，可以說本發(fā)明的抗體與本文公開的靶多肽或其片段或變體以小于或等于5xl0-4sec陽1、l(T4sec-1、5xl0-5sec-1或l(T5sec-1、5x10—6sec"、10-6sec"、5x10-7sec"或1(T7sec"的解離率(k(off))結(jié)合?？梢哉f本文公開的結(jié)合分子(例如，抗體或抗原結(jié)合片^殳、變體或衍生物)與本文7>開的草巴多肽或其片,殳或變體以大于或等于103M.1sec-1、5x103M.1sec"、104M—1sec-1或5x104M.1sec-16勺纟*合率(k(on))結(jié)合。更優(yōu)選地，可以說本發(fā)明的抗體與本文7>開的把多月太或其片,殳或變體以大于或等于105M"sec"、5xl05M-1sec"、106M—1sec"或5xl06NT1sec"或107M"sec"的結(jié)合率(k(on))結(jié)合。如果結(jié)合分子(例如，抗體)以某種程度上阻抑參考抗體與表位結(jié)合的程度與該表位優(yōu)先結(jié)合，可以說所述結(jié)合分子竟?fàn)幮砸种茀⒖伎贵w與特定表位的結(jié)合。可通過本領(lǐng)域已知的任何方法(例如，竟?fàn)幮訣LISA測定)來確定竟?fàn)幮砸种??？梢哉f抗體至少90%、至少80%、至少70°/。、至少60%、或至少50%地竟?fàn)幮砸种茀⒖伎贵w與特定表位結(jié)合。如本文所用，術(shù)語"親和力"指單個表位與結(jié)合分子(例如，免疫球蛋白分子)的CDR的結(jié)合強度的量度。參見，例如，Harlow等，Antibodies:ALaboratoryManual(^元體實馬全4旨南)(ColdSpringHarborLaboratoryPress,第二X反，1988)第27-28頁。如本文所用，術(shù)語"親和性(avidity)"指免疫球蛋白群體和抗原的復(fù)合體的總體穩(wěn)定性，即免疫球蛋白與抗原的混合物的功能性結(jié)合強度。參見，例如，Harlow,第29-34頁。親和性既與群體中單個免疫^求蛋白分子與特定表位的親和力相關(guān)，也與免疫球蛋白和抗原的效價相關(guān)。例如，二價單克隆抗體和具有高度重復(fù)的表位結(jié)構(gòu)的抗原(諸如聚合體)之間的相互作用將是高親和性相互作用。還可乂人交叉反應(yīng)性方面描述或詳細說明本發(fā)明的結(jié)合分子，例如抗體或其抗原結(jié)合片,殳、變體或書f生物。如本文所用，術(shù)i吾"交叉反應(yīng)性"指特異于一種抗原的抗體與第二種抗原反應(yīng)的能力；是兩個不同抗原物質(zhì)之間相關(guān)性的量度。因此，如果抗體與除誘導(dǎo)其形成的表位之外的其他表位結(jié)合，則抗體是交叉反應(yīng)性的。交叉反應(yīng)性表位一^殳含有與誘導(dǎo)表位相同的許多互補結(jié)構(gòu)特征，并且在一些情況中，實際上可能比最初的表4立更適合。例如，某些抗體具有一定程度的交叉反應(yīng)性，因為它們結(jié)合相關(guān)l旦不相同的表^f立，例如，與參考表^立具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、和至少50%同一'I"生的表位U吏用本領(lǐng)域已知和本文描述的方法來計算)。如果抗體不與和參考表位具有低于95%、低于90%、低于85%、低于80%、低于75%、低于70%、低于65%、低于60%、低于55%、和低于50%同一性的表位(使用本領(lǐng)域已知和本文描述的方法來計算)結(jié)合，可以i兌抗體具有4艮少或沒有交叉反應(yīng)性。如果抗體不與該表>[立的任4可其他類似物、直向同源物或同系物結(jié)合，則可認為該抗體"高度特異"于某表位。也可乂人與本發(fā)明的多肽的結(jié)合親和力方面描述或詳細說明本發(fā)明的結(jié)合分子，例如抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物。優(yōu)選的結(jié)合親和力包4舌具有j氐于5xl(T2M、1(T2M、5xl(T3M、l(T3M、5xlO-4M、1(T4M、5xl0-5M、10-5M、5xl(T6M、1(T6M、5><10-7M、10—7M、5x10.8M、10-8M、5x10—9M、1(T9M、5xl01()M、1010M、5xlO-uM、10"M、5xl012M、10-12M、5xlO-13M、1013M、5xl(T"M、IO-"M、5xl(T15M或IO"5M的解離常ft或Kd的結(jié)合親和力。如前所示，各種免疫球蛋白類別的恒定區(qū)的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的。如本文所用，術(shù)語"VH結(jié)構(gòu)域"包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域，而術(shù)語"CH1結(jié)構(gòu)域"包括免疫球蛋白重鏈的第一個(最靠近氨基末端)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。CHI結(jié)構(gòu)域鄰近VH結(jié)構(gòu)域，位于免疫球蛋白重鏈分子的鉸鏈區(qū)的氨基末端。33如本文所用，術(shù)語"CH2結(jié)構(gòu)域"包括^吏用常^見編號方案例如乂人抗體的約殘基244延伸至殘基360的重4連分子部分(殘基244至360,Kabat編號系統(tǒng)；殘基231-340,EU編號系統(tǒng)；參見KabatEA等，上文。CH2結(jié)構(gòu)域是獨特的，因為它不與另一個結(jié)構(gòu)域緊密成對。更確切的說，兩個N-連接的分支碳水化合物鏈插入完整的天然IgG分子的兩個CH2結(jié)構(gòu)域之間。也有文獻清楚記載CH3結(jié)構(gòu)i或/人CH2結(jié)構(gòu)域延伸至IgG分子的C-末端，并且包含大約108個殘基。如本文所用，術(shù)語"鉸鏈區(qū)"包括連接CH1結(jié)構(gòu)域與CH2結(jié)構(gòu)域的重鏈分子部分。該鉸鏈區(qū)包含大約25個殘基，并且是柔性的，因此允許兩個N-末端抗原結(jié)合區(qū)獨立地移動。鉸鏈區(qū)可細分為三個不同的結(jié)構(gòu)i或上部、中部和下部4H連結(jié)構(gòu)i或(Roux等，乂/wmw"o/.M7:4083(1998))。如本文所用，術(shù)語"二硫4建"包括兩個硫原子之間形成的共價鍵。氨基酸半胱氨酸包含可與第二個硫醇基形成二硫鍵或橋的硫醇基。在大多數(shù)天然存在的IgG分子中，CH1和CL區(qū)通過二石克4建相連，并且兩條重《連在對應(yīng)于4吏用Kabat編號系統(tǒng)的239和242^f立置U立置226或229,EU編號系統(tǒng))通過兩個二石克4定相連。如本文所用，術(shù)語"改造抗體"指其中重鏈和輕4連或兩者的可變結(jié)構(gòu)域通過已知特異性的抗體的一個或多個CDR的至少部分替換和如果需要通過部分構(gòu)架區(qū)替換和序列變化而被改變的抗體。盡管CDR可來自與衍生構(gòu)架區(qū)的抗體同一類別或甚至亞類的抗體，預(yù)計CDR將來自不同類別的抗體，并且優(yōu)選地來自不同物種的抗體。其中來自已知特異性的非人抗體的一個或多個"供體"CDR被移植到人重鏈或輕鏈構(gòu)架區(qū)的改造抗體在本文稱為"人源化抗體"。可能不需要用來自供體可變區(qū)的完整CDR來替換所有的CDR,以將一個可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移至另一個可變結(jié)構(gòu)域。更確切的說，只需要轉(zhuǎn)移保持靶結(jié)合位點活性所需的那些殘基?？紤]到在例如美國專利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370號中所述的內(nèi)容，通過進行常規(guī)的實驗或通過嘗試與誤差試驗，獲得功能如本文所用，術(shù)語"正確折疊的多肽"包括其中包含多肽的所有功能性結(jié)構(gòu)域都有明顯活性的多肽。如本文所用，術(shù)語"不正確折疊的多肽"包括其中多肽的功能性結(jié)構(gòu)域的至少一個沒有活性的多肽。在一個實施方案中，正確折疊的多肽包含通過至少一個二石克4建連接的多肽鏈，相反地，不正確折疊的多肽包含沒有通過至少一個二石克4建連接的多肽鏈。如本文所用，術(shù)語"改造"包4舌通過合成方法的核酸或多肽分子的才喿作(例如通過重組4支術(shù)、體外肽合成、通過肽的酶或化學(xué)偶聯(lián):或這些技術(shù)的一些組合)。如本文所用，術(shù)語"連接"、"融合(fused)"或"融合(fusion)"可互換使用。這些術(shù)語指通過任何手段(包括化學(xué)軛合或重組手段)將兩個或多個元件或組分連接到一起。"按閱讀框架融合"指兩個或多個多核苷酸開》文閱讀框(ORF)以保持最初ORF的正確翻i奪閱讀框架的方式相連以形成連續(xù)的更長的ORF。因此，重組融合蛋白是含有與最初ORF編碼的多肽對應(yīng)的兩個或多個區(qū)段(所述區(qū)段正常不是天然如此連接的)的單個蛋白。盡管閱讀框架因此在整個融合區(qū)段是連續(xù)的，該區(qū)段可由例如按閱讀框架的接頭序列物理上或空間上分開。例如，編碼免疫5求蛋白可變區(qū)CDR的多核苷酸可4姿閱讀框架融合，但由編碼至少一個免疫3求蛋白構(gòu)架區(qū)或其他CDR區(qū)的多核苷酸分開，只要"融合"的CDR作為連續(xù)多肽的一部分共翻譯。在多肽的上下文中，"線性序列"或"序列"是以氨基到羧基末端方向的多肽的氨基酸次序，其中序列中彼此鄰近的殘基在多肽的一級結(jié)構(gòu)中是相鄰的。術(shù)語"表達"在本文用來指基因產(chǎn)生生4匕物質(zhì)(例如RNA或多肽)的過程。該過程包括細胞內(nèi)基因的功能性存在的任何表現(xiàn)形式，包括4旦不限于，基因敲減以及瞬時表達和穩(wěn)定表達。該過程包括4旦不限于基因轉(zhuǎn)錄為信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、小發(fā)夾RNA(shRNA)、小干4尤RNA(siRNA)或^f壬何其^也RNA產(chǎn)物，和此類mRNA翻i奪為多肽。如果最終需要的產(chǎn)物是生化物質(zhì)，表達包括該生化物質(zhì)和任何前體的產(chǎn)生?；虻谋磉_產(chǎn)生"基因產(chǎn)物"。如本文所用，基因產(chǎn)物可以是核酸(例如通過基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使RNA)、或從轉(zhuǎn)錄物翻譯的多肽。本文所述的基因產(chǎn)物進一步包括具有轉(zhuǎn)錄后修飾的核酸(例如多聚腺苷化作用)、具有翻譯后修飾(例如，曱基化、糖基化、添加脂類、與其他蛋白亞基締合、蛋白酶剪切和類似4務(wù)飾)的多肽。如本文所用，術(shù)語"治療(treat)"或"治療(treatment)"指治療寸生治療禾口子貞防'l"生(prophylactic)或預(yù)防寸生(preventative)4晉施，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)不希望的生理改變或疾病，諸如癌癥的發(fā)展或擴散。有益的或希望的臨床結(jié)果包括但不限于，癥狀的緩和、疾患程度的減弱、疾患的穩(wěn)定(即不惡化)狀態(tài)、疾患進展的延遲或減纟爰、疾患4犬態(tài)的文善或減4圣和減退(部分或完全)，無"i侖可檢測或不可檢測。"治療"還可意指與如果不接受治療的預(yù)期存活相比延長的存活。需要治療的那些包括已經(jīng)患有病況或疾病的那些，以及易患病況或疾病的那些，或者病況或疾病的表現(xiàn)要一皮預(yù)防的那些。"對象"或"個體"或"動物"或"患者"或"哺乳動物"意指需要i貪斷、預(yù)測、預(yù)防或治療的任何對象，特別是哺乳動物對象，例如人類患者。II.鑒定結(jié)合分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及用于從臨床預(yù)選的人類對象中發(fā)現(xiàn)治療上有效的抗體的手,史和方法。如在實施例中i正明，4十對人腦疾患中異常結(jié)構(gòu)的人抗體可從表型上健康、或臨床上異常穩(wěn)定的患者中分離，并且對應(yīng)的重組抗體可成功地用于治療、改善病理和預(yù)防腦功能的損害而沒有顯著的副作用。疾患的臨床穩(wěn)定性或不進展可通過以下作為實例的方法來鑒定隨時間測量臨床(例如認知)狀態(tài)(例如通過神經(jīng)心理測試)；評〗介綜合功能水平；評估每日生活能力或4亍為缺損；腦結(jié)構(gòu)的容量分析；體內(nèi)測量腦中異常蛋白的病理沉積物(例如PETp乃定4分才羊蛋白成^f象)或體液的生4匕變量(例:^tau蛋白或A(3肽)；以及通過與疾患的天然進程/歷史的比較。因此，本發(fā)明提供了能識別疾患相關(guān)蛋白新表位的抗體和結(jié)合分子，所述疾患相關(guān)蛋白來自天然的內(nèi)源蛋白，并且在患者體內(nèi)以變體形式(例如作為病理蛋白)和/或脫離其正常生理環(huán)境普遍存在。特別地，提供了抗體及其抗原結(jié)合片段，證明了針對實施例中例證的抗體所概述的免疫結(jié)合特征和/或生物學(xué)特性。在存在的情況中，所有語法形式的術(shù)語"免疫結(jié)合特征"或抗體與抗原的其他結(jié)合特征指抗體的特異性、親和力、交叉反應(yīng)性和其他結(jié)合特征。自然地，本發(fā)明還擴展至產(chǎn)生抗體的細胞系和重組細胞。本發(fā)明進一步涉及包含本發(fā)明的結(jié)合分子的i貪斷測定和試劑盒，并且涉及基于其的治療方法和治療評估。本發(fā)明基于以下觀察在根據(jù)特定臨床標(biāo)準(zhǔn)預(yù)選的、由于其年齡具有發(fā)展比如阿爾茨海默病的神經(jīng)疾病的危險的人類對象和患者中，也可發(fā)現(xiàn)與體液防推卩相關(guān)的4十對內(nèi)源病理生理變體比如Ap肽聚集體、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、營養(yǎng)不良性軸突和其他細胞結(jié)構(gòu)的抗體，這些是疾病的神經(jīng)病理特征。這些結(jié)構(gòu)可單獨或與其他病理結(jié)構(gòu)組合纟皮發(fā)現(xiàn)，并且在Ap聚集體和神經(jīng)原纖維纏結(jié)前體情況中可發(fā)展病理效應(yīng)。然而，特異識別所述結(jié)構(gòu)的那些抗體沒有表現(xiàn)出或表現(xiàn)出顯著更低的與作為病理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的蛋白的正常生理功能形式的交叉反應(yīng)性，這與自身免疫應(yīng)答中已知的情況相反。不希望受理論所限，基于根據(jù)本發(fā)明進行的實驗，相信疾病不必變得表現(xiàn)和表型上可察覺(如在感染中)，以便引起實驗可測量的體液免疫系統(tǒng)的活性，比如特定B細"包或B記憶細月包的產(chǎn)生或活化。在必須被生理清除的肺瘤細胞或分化細胞中，機制是已知的，其中比如細月包免疫系統(tǒng)的T4輔助細月包和細月包毒性T細月包和天然殺傷細胞的配偶體協(xié)同誘導(dǎo)凋亡。必須假定，在健康的人中，腫瘤細月包或其前體也通過突變每天形成。然而，這些"中瘤細月包或前體通過體液和細胞機制4皮迅速促使凋亡，以致4企測不到肺瘤。在這個意義上，"健康、或臨床上異常穩(wěn)定的患者"不理解為表示其中沒有疾患事件發(fā)生的個體，而是表示其中多種疾患事件在它們表型上表現(xiàn)出來之前通過阻抑或防御機制^皮控制的個體。筌于上述，根據(jù)本發(fā)明假定，從根據(jù)臨床標(biāo)準(zhǔn)已被預(yù)選的特定患者集合或健康的對象中鑒定抗體或產(chǎn)生抗體的細月包應(yīng)該是可能的，而無需預(yù)知靶結(jié)構(gòu)表位(例如新表位)的分子性質(zhì)，其中在供體生物中耐受已經(jīng)占優(yōu)勢的情況中(即例如由缺少自身免疫所證實)，以重組產(chǎn)生的物質(zhì)形式的抗體可成功地j皮用來4氐抗疾患。因此鑒定此類抗體可無需預(yù)知靶結(jié)構(gòu)的分子表位，而是〗又通過與在臨床病理上清楚表征的、來自人類患者或來自相應(yīng)疾患的動物一莫型的組織切片中病理上明顯結(jié)構(gòu)的新表4立的結(jié)合來實施。相應(yīng)地，在第一個方面，本發(fā)明涉及分離疾病相關(guān)蛋白特異性結(jié)合分子的方法，其包括(a)使獲自沒有癥狀，或臨床上異常穩(wěn)定，但患有疾病或處于發(fā)展疾病的危險或有效抑制了疾病的表現(xiàn)或暴發(fā)的患者的樣品經(jīng)受具有預(yù)定臨床特征的病理或生理改變的細胞或組織的試樣；和(b)鑒定并任選地分離與所述試樣優(yōu)先結(jié)合，〗旦不與或以顯著更{氐的親和力與可來自i^康的對象的沒有此類病理特4正的對應(yīng)細月包或組織結(jié)合的結(jié)合分子。本發(fā)明的方法可如實施例部分概述使用本領(lǐng)域技術(shù)人員7>知的手段來進行。例如，獲自患者的液體樣品可穿過與穩(wěn)固地固定于樣品固定器的試樣靶結(jié)構(gòu)接觸的導(dǎo)管的第一個孔，因此允許分別以可溶形式或在細月包表面和膜上表達而存在于樣品中的推定結(jié)合分子結(jié)合所述耙結(jié)構(gòu)。液體樣品可含有例如淋巴細胞和/或抗體，而試樣可以是組織切片或用不同于病理靶結(jié)構(gòu)的分子或分子組合包凈皮的膜。任4可未結(jié)合的物質(zhì)可通過第二個導(dǎo)管孔#:去除。同時，可通過樣品固定器恒溫器來控制樣品固定器的溫度，例如推定的結(jié)合分子與特異于試才羊的抗原新表位在人體內(nèi)發(fā)生天然結(jié)合的溫度。通過流動運動，例如使含有結(jié)合分子的液體樣品優(yōu)選地以體溫通過靶結(jié)構(gòu)，可才莫擬結(jié)合相互作用的天然系統(tǒng)。然而，也可j吏用i者如通過搖床或旋轉(zhuǎn)臺使樣品與試樣一起孵育的其他方法。上文提到的系統(tǒng)的特定優(yōu)勢是它通過用樣品固定器恒溫器降低樣品固定器的溫度而允許代謝過程在任何時間中斷。通過這樣啦文，樣品固定器的溫度可降低至例如2-10°C,特別是4°C?？筛鶕?jù)本發(fā)明的方法使用的對應(yīng)裝置描述于歐洲專利申i青EP1069431A2。因此，本發(fā)明的方法^1奪允許結(jié)合配偶體的鑒定和表征，同時允許鑒定和表征迄今未知的結(jié)合過程所需的分子類別、分子組和/或分子部分，即試樣的靶結(jié)構(gòu)。這將不僅開發(fā)了新的可能的診斷方式，而且還將提供用于分子水平的治療方法的#斤的測i式系纟充。如果特定的替代標(biāo)志物預(yù)測了疾患狀態(tài)的高概率，但令人驚訝地(可能是由于特定的內(nèi)源免疫應(yīng)答)沒有變得臨床上表現(xiàn)，那么根據(jù)本發(fā)明患者可能有資格成為健康的志愿者群體。這樣，與多種疾患相關(guān)的健康的老年人將是這樣的個體，其中比如阿爾茨海默病或帕金森病的神經(jīng)退行性病仍未臨床上表現(xiàn)，但其中病理生理蛋白變體(即疾病相關(guān)蛋白)的潛伏期發(fā)展，在上述意義上通過涉及或不涉及免疫系統(tǒng)細月包組分的體液免疫系統(tǒng)的早期干預(yù)，在一定程度上被限制或延遲，直至健康而不是潛伏期的患者參與研究的時刻疾患的臨床表現(xiàn)仍未出現(xiàn)。優(yōu)選地，其中既未被診斷具有自身免疫過程也未出現(xiàn)作為副作用的其他可能的病理病況的不明顯的志愿者被招募為第一種情況的樣品供體。一關(guān)殳而言，可〗吏用來自經(jīng)受生理蛋白或肽變體主動免疫的患者的樣品，其中抗體的發(fā)展通過免疫接種被加強。例如，抗體可從已被接種A(3肽疫苗的阿爾茨海默病患者中鑒定和分離。參見例如，Hock等，淑臟臉血/we&1280-1275(2002),Hock等，臉w謂3&547-554(2003)和WO2004/095031，每個通過引用整體并入本文。然而，使用來自未接受涉及與變體病理蛋白相關(guān)或以變體病理蛋白為病因的疾病的此類免疫4妄種或?qū)?yīng)用藥的志愿者的樣品可能是優(yōu)選的。才艮據(jù)本發(fā)明，例如，在來自臨床病理上表4正的人類患者或動物模型(比如例如轉(zhuǎn)基因小鼠)的離體組織中，或在體外細胞結(jié)構(gòu)，或在病理同種異體或異種組織中，分析例如已被臨床預(yù)選的患者個優(yōu)選地，所述患者和/或所述提供試樣的對象是人，最優(yōu)選地兩者都是人。特征的病理或生理改變的樣品、細胞或組織試樣優(yōu)選地在與結(jié)合分子(例如，本發(fā)明的抗體)反應(yīng)后通過光學(xué)^r測來顯示。試樣可作為M人細胞樣品、組織切片、細胞涂片測試、人類疾患的動物才莫型的細胞或組織樣品、或體外培養(yǎng)的細胞和組織材料獲得。優(yōu)選地，所述試樣的至少一種以掃描位置的形式存在于樣品固定器中，其中每個掃描位置對應(yīng)于特定的病理結(jié)構(gòu)，并且掃描位置的至少兩個同時暴露于與抗體反應(yīng)的檢測。作為實例，針對諸如阿爾茨海默病、帕金森病或tau蛋白病(tauopathies)的神經(jīng)退4亍性病的神經(jīng)病理標(biāo)志(包括P-淀粉樣蛋白斑塊、Lewy小體、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和營養(yǎng)不良性軸突(neuritis))的抗體可在獲自具有相應(yīng)疾患實體的臨床病理上確認的診斷的人死后腦組織的切片上4企測。這是通過將石蠟包埋的組織小桿封固于載玻片上然后用患者或健康供體的樣品探測完成的。與抗體反應(yīng)的檢測是根據(jù)免疫組織化學(xué)和顯微掃描的標(biāo)準(zhǔn)禾呈序完成的。含有各種人類疾患組織的多組織顯微切片可裝配到載玻片上以形成多組織樣吏陣列。相似地，來自人類疾患的動物才莫型的組織才羊品、細胞涂片或細胞的其他試樣可包埋于石蠟中，并單獨或與上述人死后阿爾茨海默病腦組織或組織陣列組合封固于載^皮片上。因此，載玻片上的單個測試位置可包含顯示病理上明顯結(jié)構(gòu)的組織和其他試樣的混合陣列。為了增加測定的通量，將不止一個測試位置封固于載玻片上。優(yōu)選地，8個測試位置以適合96孔或微量滴定形式的2x4的形式封固于載玻片上。該微量滴定-相容的組織微陣列的更詳細的描述可在下文的補充方法部分發(fā)現(xiàn)。如才是到，待分析的樣品可包括體液、細胞樣品或細胞樣品的上清液或其書f生物。諸如腰腦脊液(CSF)、血漿或尿的體液可在患者知情同意后才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)臨床禾呈序收集。最優(yōu)選地，才羊品包4舌或來自B-細月包或記憶B-細月包和/或包4舌抗體。優(yōu)選地，所述患者通過有或沒有替代標(biāo)志物、或通過異常穩(wěn)定的疾患進程而^皮確定患有仍未表現(xiàn)的疾病或處于發(fā)展該疾病的危險。結(jié)合替代標(biāo)志物考慮臨床標(biāo)準(zhǔn)，4艮據(jù)本發(fā)明疾患在潛伏期病況中具有增加的發(fā)病或表現(xiàn)概率，或反之，證明當(dāng)例如促進疾患的遺傳星座(geneticconstellation)存在或極度暴露或生活方式使疾患表型發(fā)展成為可能時未必已經(jīng)發(fā)生此類疾患。在阿爾茨海默病中，這意味著，根據(jù)本發(fā)明，搜索這些人類志愿者中針對神經(jīng)病理相關(guān)的蛋白復(fù)合體(比如P-淀粉樣蛋白斑塊中的Ap聚集體、寡聚A(3種和(3-淀粉樣蛋白原纖維)的B細胞或記憶B纟田胞、神經(jīng)原纖維纏結(jié)的tau纖絲、Lewy小體的a突觸核蛋白或迄今未一皮分子鑒定的組分，根據(jù)年齡，這些人類志愿者屬于其中阿爾茨海默病的發(fā)病率特別高或者遺傳上來自具有阿爾茨海默病高危險的群體的個體組。這些人是例力o,大于75歲、不具有或^f又具有輕:;徵的^申經(jīng)心5里上可測量的認知損害的人，或者在腫瘤征候中，具有高度指示的腫瘤標(biāo)志物(例如遺傳腫瘤標(biāo)志物)^f旦未患有疾患的人(Alloul等，Arch.GerontologyGeriatrics27(1998)，189;Dunn等，Immunity21(2004)137-148)。在輕度認知損害中，這些人是數(shù)年來保持臨床上、神經(jīng)心理上或i人知上穩(wěn)、定的患者，盡管^f也們每年統(tǒng)計的發(fā)展臨床上表現(xiàn)并在進一步的進程中進展的神經(jīng)退行性病的危險超過20%。因此，在一個實施方案中，所述替代標(biāo)志物選自由老年、腦淀粉樣蛋白負載、ApoE基因型、APP基因型、PS1基因型、體液中A卩肽的水平、異前列月泉素(isoprostane)、Tau禾口石粦酉吏畫Tau纟且成的纟且。采用才艮據(jù)本發(fā)明的方法的一個特定途徑是用完全不同或相關(guān)的原發(fā)性疾患的病理上明顯組織的試樣陣列測試來自臨床上預(yù)選的志愿者的B細^^和B記憶細^^的樣品。特另y地，此類病理組織來自患有神經(jīng)退行性病、蛋白錯折疊病、組織淀粉樣蛋白病和與病理沉積物相關(guān)的其他疾患、自身免疫病、炎性疾患、過度增殖和贅生性病(例如腫瘤)、積l&病和包涵體病的人類患者，以及來自人類疾病的動物才莫型，特別來自,皮改變具有病理相關(guān)的人類基因的小鼠。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明關(guān)注于阿爾茨海默病。在該實施方案中，樣品獲自優(yōu)選地滿足以下標(biāo)準(zhǔn)的對象a)年齡為65歲，優(yōu)選地70歲，更優(yōu)選地75歲或更大；b)具有完全的認知能力和良好的健康；和c)沒有癡呆的臨床體征；或d)具有異常緩慢的疾患進展速率，盡管存在可能的阿爾茨海默病的確定的臨床i貪斷；或e)具有異常低的從輕度認知損害(MCI)向完全暴發(fā)的阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)化率。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括以下步驟a)從已一皮鑒定含有優(yōu)先結(jié)合所述試樣、但不結(jié)合或以顯著更4氐的親和力結(jié)合健康對象的對應(yīng)細胞或組織的結(jié)合分子(例如抗體)的才羊品中純化B細月包或B記憶細月包；b)從所述B細胞或B記憶細胞獲得編碼所述抗體的免疫球蛋白基因i普系(repertoire);禾口c)使用所述譜系表達所述抗體，并且任選地其中步驟(b)包括以下步-驟d)/人所述B細胞或記憶B細胞獲得mRNA;e)乂人步吝聚(iv)的mRNA獲得cDNA;和f)^f吏用引物延伸反應(yīng),人所述cDNA擴增對應(yīng)于所述抗體的重鏈(HC)和k/X輕鏈(LC)的片段。產(chǎn)生永生化人類B細胞和B記憶淋巴細胞的克隆的方法包括在多克隆B細胞激活物存在時使用埃巴病毒(EBV)轉(zhuǎn)化人類B記憶淋巴細胞的步驟，所述方法概述于國際申請WO2004/076677。該國際申請還描述了用于獲得編碼感興趣的抗體的核酸序列的方法，該方法包括下述步驟制備永生化B細胞克隆、從編碼感興趣的抗體的B細胞克隆獲得/測序核酸、進一步將該核酸插入或〗吏用該核酸來制備可表達感興趣的抗體的表達宿主、在感興趣的抗體表達的條件下培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)表達宿主和任選地純化感興趣的抗體。毫無疑問，核酸可^皮才喿作以在其間引入限制酶切位點、改變密碼子4吏用和/或加入或優(yōu)化轉(zhuǎn)錄和/或翻i奪調(diào)節(jié)序列。例如，核酸序列可通過本發(fā)明的多肽序列的回譯產(chǎn)生，使用諸如載體NTI軟件的軟件來產(chǎn)生密碼子優(yōu)化和優(yōu)化RNA穩(wěn)、定性的核酸序列。所有這些纟支術(shù)在本4頁域的技術(shù)發(fā)展水平內(nèi)，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員執(zhí)行而無需過度的負擔(dān)。永生化人類B細胞的其他方法是本領(lǐng)域7>知的，例如，構(gòu)建人雜交瘤或人-鼠嵌合雜交瘤。在進一步的方面，本發(fā)明涉及能選^H生識別疾患相關(guān)蛋白的表位(包括疾患相關(guān)蛋白的新表位)的結(jié)合分子，結(jié)合分子優(yōu)選地可通過前文所述和實施例中例證的本發(fā)明的方法來獲得或證實。有利地，本發(fā)明的結(jié)合分子基本不識別以其非疾病相關(guān)形式的所述蛋白；也參見上文。用于重組產(chǎn)生結(jié)合分子，特別是抗體及其模擬物的手段和方法，以及篩選竟?fàn)幗Y(jié)合分子(可以是或可以不是抗體)的方法在本領(lǐng)域是已知的，并且關(guān)于針對p-淀粉樣蛋白的抗體和阿爾茨海默病的治療/診斷概述于例如，國際申請WO2006/103116,其7>開內(nèi)容為了用于治療或診斷應(yīng)用的抗體工程和施用目的通過引用并入本文。然而，如本文所述，特別是關(guān)于在人中的治療性應(yīng)用，本發(fā)明的抗體是人抗體。在這方面，抗體識別的變體病理蛋白優(yōu)選地與神經(jīng)疾病(^尤選:l也月畝疾病)相關(guān)。此外，如在實施例3至5中證明，本發(fā)明的結(jié)合分子特別是抗體具有幾種有利的生物學(xué)特性，其中一種或多種是由本發(fā)明首次實現(xiàn)的，例如結(jié)合分子能(i)穿越血腦屏障，例如在病理事件的位點；(ii)結(jié)合p-淀粉樣蛋白斑塊、腦血管淀粉樣蛋白、彌散性A(3沉積物、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、過度磷酸化的tau、a-突觸核蛋白陽性Lewy-小體或與營養(yǎng)不良性軸突結(jié)合的蛋白聚集體；(iii)去除腦中p-淀4分才羊蛋白斑塊和/或防止腦中淀4分才竽蛋白扭王塊的形成；(iv)基本恢復(fù)正常的4于為；和/或(v)不引起農(nóng)i出血。在特定的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體或等效結(jié)合分子可通過以下特性的一種或多種與其他抗體區(qū)別，例如它們能1.在病理事件的位點至少小量穿過血腦屏障；2.與一種或多種病理生理相關(guān)的月包外或細月包結(jié)構(gòu)結(jié)合；3.在體外或體內(nèi)導(dǎo)致病理生理相關(guān)結(jié)構(gòu)的減少；4.導(dǎo)致病理生理相關(guān)結(jié)構(gòu)的減少和與其相關(guān)的毒性的降《氐；5.導(dǎo)致阻止或延遲疾患的過禾呈；6.導(dǎo)致細胞和器官特異性和生物功能的再生，并且可能導(dǎo)致繼而防止在與病理生理相關(guān)結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)的毒性降解之后最初病理生理的復(fù)發(fā)；和/或7.不伴有增加的微出血此外，與生理前體或書f生物沒有交叉反應(yīng)性導(dǎo)致以下結(jié)果首先，濃度是可預(yù)測的，因為避免了Y建康組織結(jié)構(gòu)的^炎^t^，其次，不想要的副作用意義上的自身免疫應(yīng)答基本上消失。另外，先前的報道暗示在患有CAA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，腦淀粉樣蛋白血管病(CAA)與損害的血管反應(yīng)性的相關(guān)性(Mueggler等，JNeurosci22(2002)，7218-24.)。在年老的arcA(3小鼠中出5見的嚴(yán)重CAA(Knobloch等，Neurobiol.Aging28:1297-1306(2007)2006年7月31日電子出版)可能因此限制了損傷血管的血管舒張柔性。根據(jù)本發(fā)明，謹(jǐn)慎地預(yù)期使用本發(fā)明的抗體的治療可改善年老的APP轉(zhuǎn)基因小鼠的血管反應(yīng)性和腦血流。這可通過4吏用描述于Knobloch等(2006)，上文和公開于美國申請"阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因動物模型(TransgenicanimalmodelforAlzheimer'sdisease)，，(Grimm等,序號60/934,291，2007年6月11曰提交，其公開內(nèi)容通過引用并入本文)的arcAp小鼠沖莫型而一皮證實。III.抗體本發(fā)明進一步涉及顯示于表2和3的結(jié)合分子例如抗體及其結(jié)合片段、變體和衍生物。本發(fā)明更具體地涉及抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，其中抗體特異結(jié)合與選自由NI-lOl.lO、NI畫101,11、NI畫101.12、NI-101.13、NI畫101.12F6A、NI-101.13A和NI-101.13B組成的組的參考抗體相同的疾病相關(guān)蛋白的新表位。本發(fā)明進一步涉及抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物，其中抗體竟?fàn)幮砸种七x自由NI-lOl.lO、NI-101.11、NI-101.12、NI-101.13、NI-101.12F6A、NI誦101.13A和NI-101.13B組成的組的參考抗體與疾病相關(guān)蛋白的新表位的結(jié)合。本發(fā)明還涉及抗體、或其抗原結(jié)合片,殳、變體或書f生物，其中抗體包含與選自由NI-lOl.lO、NI-lOl,ll、NI-101.12、NI隱101.13、NI-101.12F6A、NI-101.13A和NI畫101.13B纟且成的組的抗體相同的4元原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明進一步示例了幾種此類結(jié)合分子(例如抗體及其結(jié)合片段)，其可通過在其可變區(qū)(例如結(jié)合結(jié)構(gòu)域)包含Vh和/或Vl可變區(qū)(包含表2(VH)和表3(VL)中所述氨基酸序列的任一個)的至少一個互4卜決定區(qū)(CDR)而凈皮表4i。表2:新表位特異抗體的VH區(qū)的氨基酸序列?？贵w可變重鏈序列EVQLVQSGGGWQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGT隨YTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQIDNO:4〉EVQLVQSGGGWQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLB/WA蘭FDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQIDNO:6)EVQLVESGPGLVKPAETLSLTCTVSGGSIRSGSICWYWIRQPPGKGLEWIGYFCYSGATFYTPSLRGRLTISVDASKNQLSLSLSSVTAADTAVYYCARRAGENSGGIEPYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:10)NI-101.13QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISRRSYYWGWIRQSPGKGLEWSGSIHYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSRWGSSWVFDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:14)NI-101.12F6AQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA菌FDGTKKYYTDSVKGRFnSRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQIDNO:39〉NI-101J3AQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISRRSYYWGWIRQSPGKGLEWSGSIHYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSRWGSSWVFDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:42)NI-101.13BQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISRRSYYWGWIRQSPGKGLEWSGSIHYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSRWGSSWVFDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:43)48表3:新表位特異抗體的VL區(qū)的氨基酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表2和3中所述的Vh和/或VL區(qū)的上述氨基S吏序列的CDR的示例纟且在表4中纟會出。然而，3口在下文"i寸i侖，本4貞i或才支術(shù)人員；罙殺口長口下事實在CDR2和CDR3情況中可以另外或可選地-使用與表4所示的氨基酸序列有1個、2個、3個或甚至更多個氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。表4:在Kabat命名中新表位特異抗體的VH和VL區(qū)的CDR蛋白序列的名稱。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是包含表2和3中所述的Vh和/或VL區(qū)的氨基酸序列的抗體的任一種?？蛇x地，本發(fā)明的抗體是與具有表2和3中所述的VH和/或VL區(qū)的抗體的至少一種竟?fàn)幣c新表位(neoeptitope)的結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。上述抗體還可以是鼠的，然而人源化、異源、或嵌合人-鼠抗體是優(yōu)選的，特別是用于治療性應(yīng)用?？贵w的抗原結(jié)合片段可以是例如，單鏈Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段。對一些應(yīng)用，<又需要抗體的可變區(qū)，其可通過用適合的試劑處理抗體以<更產(chǎn)生Fab'、Fab或F(ab")2部分來獲得。這些片段足夠用于例如，涉及將免疫3求蛋白的免疫特異性部分與諸如》文射性同位素的4全測試劑偶聯(lián)的免疫診斷程序。本發(fā)明進一步涉及構(gòu)成本發(fā)明的抗體的分離多肽。本發(fā)明的抗體包含例如編碼來自免疫球蛋白分子的特定抗原結(jié)合區(qū)的氨基酸序列的多肽。多肽或氨基酸序列"來自"指定蛋白指具有某一氨基酸序列的多肽的來源。在某些情況中，來自特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列的氨基酸序列與起始序列或其部分的氨基酸序列基本相同，其中所述部分由至少10-20個氨基酸、至少20-30個氨基S吏、至少30-50個氨基酸組成，或者可由本領(lǐng)域普通4支術(shù)人員另外鑒定，因為其來自起始序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)、主要由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)組成、或由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)組成的分離多肽，其中重鏈可變區(qū)的VH-CDR的至少一個或重《連可變區(qū)的VH-CDR的至少兩個與來自本文7>開的抗體的參考重《連VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3的氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%是相同的?？蛇x地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3區(qū)與來自本文/>開的抗體的參考重4連VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3的氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%是相同的。因此，根據(jù)該實施方案，本發(fā)明的重鏈可變區(qū)具有與上文表4所示的組相關(guān)的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。盡管表4顯示了由Kabat系統(tǒng)定義的VH-CDR,其他CDR定義(例如，由Chothia系統(tǒng)定義的VH-CDR)也包括于本發(fā)明，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可使用表2和3所示的數(shù)據(jù)容易地鑒定。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)、主要由免疫J求蛋白重《連可變區(qū)(VH)組成、或由免疫球蛋白重《連可變區(qū)(VH)組成的分離多肽，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3區(qū)的多肽序列與表4所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3組相同。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)、主要由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)組成、或由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)組成的分離多肽，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3區(qū)的多肽序列與表4所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3組相同，除了在^f壬一個VH-CDR中的1個、2個、3個、4個、5個或6個氨基酸置換。在某些實施方案中，氨基酸置才灸是保守的。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)、主要由免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)組成、或由免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)組成的分離多肽，其中輕鏈可變區(qū)的VL-CDR的至少一個或輕4連可變區(qū)的VL-CDR的至少兩個與來自本文7>開的抗體的參考輕《連VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3的氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%是相同的?？蛇x地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3區(qū)與來自本文7>開的抗體的參考輕4連VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3的氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%是相同的。因此，才艮據(jù)該實施方案，本發(fā)明的輕鏈可變區(qū)具有與上文表4所示的多肽相關(guān)的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。盡管表4顯示了由Kabat系統(tǒng)定義的VL-CDR，其他CDR定義(例如，由Chothia系統(tǒng)定義的VL-CDR)也包4舌于本發(fā)明。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)、主要由免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)組成、或由免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)組成的分離多肽，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3區(qū)的多肽序列與表4所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3組相同。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VL)、主要由免疫J求蛋白重《連可變區(qū)(VL)組成、或由免疫^求蛋白重《連可變區(qū)(VL)組成的分離多肽，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3區(qū)的多肽序列與表4所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3組相同，除了在任一個VL-CDR中的1個、2個、3個、4個、5個或6個氨基酸置換。在某些實施方案中，氨基酸置換是保守的免疫球蛋白或其編碼cDNA可被進一步修飾。因此，在進一步的實施方案中，本發(fā)明的方法包4舌產(chǎn)生嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab-片孚殳、乂又特異性抗體、融合抗體、標(biāo)記抗體或上述抗體的任一個的類似物的任一步驟。對應(yīng)方法是本領(lǐng)域:技術(shù)人員已知6々,并JlU苗述于^f列^!口,Harlow禾口Lane"Antibodies,ALaboratoryManual(抗體實—險指南)"，CSHPress,ColdSpringHarbor,1988。當(dāng)所述抗體的衍生物通過噬菌體展示技術(shù)獲得時，可使用在BIAcore系統(tǒng)中采用的表面等離子共^展來增加與本文所述的抗體的4壬一種結(jié)合才目同表^f立的p笪菌體4元體的歲文率(Schier,HumanAntibodiesHybridomas7(1996)，97-105;Malmborg,J.Immunol.Methods183(1995),7-13)。嵌合抗體的產(chǎn)生描述于例如，國際申請WO89/09622。人源〗匕抗體的產(chǎn)生方法描述于例如，歐洲申請EP-A10239400和國際申請WO90/0786L才艮據(jù)本發(fā)明使用的抗體的其他來源是所謂的異源抗體。產(chǎn)生異源抗體(諸如在小鼠中產(chǎn)生人抗體)的一般原理描述于例如，國際申請WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO96/33735。如上文討-論，本發(fā)明的抗體可以除完整抗體外的多種形式存在；包4舌例如，F(xiàn)v、Fab和F(ab)2，以及以單《連的形式；參見例如國際申請WO88/09344。本發(fā)明的抗體或其對應(yīng)的免疫球蛋白鏈可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)被進一步修飾，例如通過使用氨基酸缺失、插入、置換、添加和/或重組和/或單獨或組合的本領(lǐng)域已知的任何其他修飾。在產(chǎn)生免疫球蛋白鏈的氨基酸序列的DNA序列中引入此類修飾的方法是本^貞i或才支術(shù)人員公4口的；參見，例3口，Sambrook,MolecularCloningALaboratoryManual(分子克隆實'驗指南)，ColdSpringHarborLaboratory(1989)N.Y.和Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology(最#斤分子生物學(xué)實馬全沖支術(shù))，GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.(1994)。本發(fā)明的4元體的包括一個或多個組成氨基酸的化學(xué)和/或酶衍生化，包括側(cè)鏈》務(wù)飾、主鏈修飾和N-和C-末端修飾，包括乙?；⒘u基化、甲基化、酰胺化和碳水化合物或脂部分、輔因子和類似物的連4妻。同樣地，本發(fā)明包括包含與位于羧基末端的異源分子(諸如免疫刺激配體)融合的位于氨基末端的所述抗體或其某一片段的嵌合蛋白的產(chǎn)生；對應(yīng)的4支術(shù)細節(jié)參見，例如，國際申請WO00/30680。另夕卜，本發(fā)明包括小肽，包括含有上文所述結(jié)合分子的那些小肽，例如含有所述的抗體的任一種的可變區(qū)的CDR3區(qū)，特別是重鏈的CDR3,因為經(jīng)常觀察到重鏈CDR3(HCDR3)是具有更大程度可變性，并且主要參與抗原-抗體的相互作用的區(qū)域。此類肽可通過重組手段容易地合成或產(chǎn)生以便產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明有用的結(jié)合劑。54此類方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。肽可例如使用可商業(yè)獲得的自動肽合成4義來合成。肽可通過將表達肽的DNA纟參入表達載體并用表達載體轉(zhuǎn)化細J包以產(chǎn)生肽的重組寺支術(shù)來產(chǎn)生。因此，本發(fā)明涉及根據(jù)上述手段可獲得并顯示所述特性(即特異識別新表位)的任何結(jié)合分子例如抗體或結(jié)合片段。此類抗體和結(jié)合分子可通過例如使用前文所述的分離新表位特異性結(jié)合分子的方法來測試其結(jié)合特異性和親和力。作為直4妄/人永生化B細月包或B記憶細月包的培養(yǎng)物中獲4尋免疫J求蛋白的替代方案，永生化細胞可用作重排的重鏈和輕鏈基因座的來源，用于隨后的表達和/或遺傳才喿作。重4非的抗體基因可乂人適當(dāng)?shù)膍RNA反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA。3。果需要，重《連恒定區(qū)可一皮交才灸為不同同種型的重鏈恒定區(qū)或被完全消除?？勺儏^(qū)可被連接以編碼單鏈Fv區(qū)。多個Fv區(qū)可連接以便賦予對不止一個靶的結(jié)合能力，或者可采用嵌合重鏈和輕鏈的組合。一旦遺傳材料可用，如上文所述保持其結(jié)合需要的靶的能力的類似物的設(shè)計是簡單的。用于克隆抗體可變區(qū)和產(chǎn)生重組抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且描述于例如，Gilliland等，TissueAntigens47(1996),1-20;Doenecke等，Leukemia11(1997),1787-1792。一旦獲得了適當(dāng)?shù)倪z傳材料，并且如果需要被修飾以編碼類似物，包括編碼至少重^t連和輕鏈的可變區(qū)的編碼序列在內(nèi)的編碼序列可4皮插入包含于可,皮轉(zhuǎn)染進標(biāo)準(zhǔn)的重組宿主細胞的載體上的表達系統(tǒng)。多種此類宿主細月包可用于有歲丈的加工，然而，哺乳動物細月包是優(yōu)選的。用于此目的的一般哺乳動物細胞系包括但不限于CHO細萬包、HEK293細月包或NSO細萬包。然后抗體或類似物的產(chǎn)生通過在適合宿主細胞生長和編碼序列表達的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)修飾的重組宿主來進行。然后通過乂人培養(yǎng)物中分離抗體來回收抗體。表達系統(tǒng)優(yōu)選地i殳計為包括-信號肽，以1更得到的抗體一皮分泌到培養(yǎng)基中；然而胞內(nèi)產(chǎn)生也是可能的。一旦耙結(jié)構(gòu)(例如疾患相關(guān)蛋白)被樣品和其中相應(yīng)的結(jié)合分子標(biāo)記，其可通過本領(lǐng)域/>知的手段和方法來鑒定，例如^f吏用質(zhì)譜(MS)4支術(shù)，諸如描述于國際申請WO00/11208的4支術(shù)和特別是描述于Hock等，NatMed8(2002)，1270-1275;Hock等，Neuron38(2003)，547-554的技術(shù)。因此，在體外產(chǎn)生的根據(jù)本發(fā)明鑒定的抗體與病理結(jié)構(gòu)(例如病理腦區(qū)域切片上的P-淀粉樣蛋白斑塊)結(jié)合但不顯著地與健康組織結(jié)合的情況中，有希望的候選抗體被鑒定，其分子把結(jié)構(gòu)隨后可通過其與來自病理組織的抗體的結(jié)合特性而被富集并純化，因此可通過蛋白分析和例如MALDI/TOF的質(zhì)譜方法(Williams,MethodsCell.Biol.62(2000),449-453;Yates,J.Mass.Spectrom.33(1998),1-19)來鑒定和表征。相應(yīng)地，在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及由結(jié)合分子特別是前文所述的本發(fā)明的抗體識別的、并且優(yōu)選地是疾病相關(guān)蛋白的至少一部分的纟;i原。苷酸，在抗體的情況中優(yōu)選地編碼至少上文所述的抗體的免疫J求蛋白鏈的可變區(qū)的多核普酸。多核普酸編碼的所述可變區(qū)一般包含所述抗體的Vh和/或V^可變區(qū)的至少一個互補決定區(qū)(CDR)。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解抗體的每個可變結(jié)構(gòu)域(重鏈VH和輕鏈VL)包含三個高變區(qū)，有時稱為互補決定區(qū)或"CDR"，其側(cè)翼為四個相對寸呆守的構(gòu)架區(qū)或"FR，，，并且指負責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。人IgG亞型抗體的高變區(qū)或CDR包含來自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的殘基5624-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)和重嗜連可變結(jié)構(gòu)i或的31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3)的氨基酸殘基(如Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(具有免疫學(xué)重要'I"生的蛋白序列)，第五版，公共衛(wèi)生部，美國國立衛(wèi)生研究院，Bethesda,Md(1991)所述)和/或來自高變環(huán)的那些殘基，例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3)(長口Chothia等，J,Mol.Biol.196(1987),901-917所述)。構(gòu)架或FR殘基是高變區(qū)之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基并支持(bracket)高變區(qū)。術(shù)語"特異結(jié)合"指抗體與預(yù)定抗原的結(jié)合?？贵w一般以1(^M或更低的解離常數(shù)(KD)結(jié)合，并且以比與除預(yù)定抗原外的非特異抗原(例如，BSA、酪蛋白或^壬^可其^也特定多肽)的結(jié)合Ko低至少兩倍的KD與預(yù)定抗原結(jié)合。短語"識別抗原的抗體"和"特異于抗原的抗體"在本文可與術(shù)語"特異結(jié)合抗原的抗體"互換使用。如本文所用，"高度特異"結(jié)合意指抗體對特異靶表位(例如新表位)的相對KD比該抗體與其他配體或與疾患相關(guān)蛋白的天然對應(yīng)物的結(jié)合KD^f氐至少10倍?？贵w對抗原的親和力或親和性可使用任何適合的方法實—驗地確定；參見，例,Berzofsky等，基礎(chǔ)免疫學(xué)(FundamentalImmunology)中的"Antibody-AntigenInteractions(4元體畫#元原、4目互4乍用)"，Paul,W.E.，編輯，RavenPressNewYork,NY(1984)，Kuby,JanisImmunology,W.H.FreemanandCompanyNewYork,NY(1992)和本文所述的方法。用于測量抗體對抗原的親和力的一般技術(shù)包括ELISA、RIA和表面等離子共l展。如果在不同條件下(例如，鹽濃度、pH)測量，特定抗體-抗原相互作用的測量親和力可能不同。因此，親和力和其他抗原結(jié)合參凌t(例如，KD、IC5Q)的測量優(yōu)選地4吏用抗體和抗原的標(biāo)準(zhǔn)〉容液和標(biāo)準(zhǔn)纟爰沖液來進4亍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，具有上述可變結(jié)構(gòu)域的抗體的可變結(jié)構(gòu)域可用于構(gòu)建具有需要的特異性和生物學(xué)功能的其他多肽或抗體。因此，本發(fā)明還包括包含上述可變結(jié)構(gòu)域的至少一個CDR、特性的多肽和抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，4吏用本文所述的可變結(jié)構(gòu)域或CDR，可才艮據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來構(gòu)建抗體，例如，3口歐洲專矛J申i青EP0451216Al禾口EPO549581Al戶斤述。jt匕夕卜，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解結(jié)合親和力可通過在CDR內(nèi)或在與Kabat定義的CDR部分重疊的高變環(huán)內(nèi)進^f亍氨基酸置才灸而^皮增強(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196(1987)，901-917)。因此，本發(fā)明還涉及其中上述CDR的一個或多個包含一種或多種優(yōu)選地不超過兩個氨基酸置4灸的抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體在其免疫^求蛋白《連的一條或兩條中包含表4所示的可變區(qū)的兩個或所有三個CDR。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，本發(fā)明的結(jié)合分子(例如，抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物)可包含介導(dǎo)一種或多種效應(yīng)物功能的恒定區(qū)。例:^，^卜體的Cl《且分與#元體恒定區(qū)的結(jié)合可活4匕補體系統(tǒng)。補體的活化在細胞病原體的調(diào)理作用和裂解中是重要的。補體的活化還刺激炎性反應(yīng)，并且也可參與自身免疫超每文。進一步，抗體通過Fc區(qū)與各種細胞的受體結(jié)合，其中抗體Fc區(qū)的Fc受體結(jié)合位點與細胞的Fc受體(FcR)結(jié)合。有許多Fc受體特異于不同類別的抗體，包括IgG(y受體)、IgEU受體)、IgA(a受體)和IgM((i受體)。抗體與細胞表面Fc受體的結(jié)合觸發(fā)許多重要和多樣的生物應(yīng)答，包括抗體包被顆粒的吞沒和破壞、免疫復(fù)合體的清除、殺傷細胞對抗體包被的靶細胞的裂解(稱為抗體依賴性的細胞介導(dǎo)的細胞毒性或ADCC)、炎性介體的釋放、胎盤轉(zhuǎn)移和控制免疫球蛋白的產(chǎn)生。相應(yīng)地，本發(fā)明的某些實施方案包4舌抗體、或其抗原結(jié)合片孚殳、變體或衍生物，其中恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的一個或多個的至少一部分被缺失或用其他方法改變，以便提供需要的生化特征，諸如與完整的、二聚化的能力、增加的定位于肺瘤位點的能力、縮短的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，用于本文所述的i貪斷和治療方法的某些抗體是包含與免疫球蛋白重《連相似^旦缺少一個或多個重鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分的多肽《連的結(jié)構(gòu)域缺失抗體。例如，在某些抗體中，修飾抗體的恒定區(qū)的一個完整結(jié)構(gòu)域?qū)⒈蝗笔?，例如，CH2結(jié)構(gòu)域的所有或部分將一皮在夬失。在其他實施方案中，用于本文所述的i貪斷和治療方法的某些抗體具有一皮改變以消除斗唐基化的恒定區(qū)(例如，IgG重鏈恒定區(qū))，這些抗體在本文其他地方一皮稱為無糖基化或"agly"抗體。此類"agly"抗體可酶促地制備，以及通過改造恒定區(qū)的共有糖基化位點來制備。然而不受理i侖所限，相信"agly"抗體可在體內(nèi)具有改善的安全和穩(wěn)定性特征。產(chǎn)生具有需要的效應(yīng)物功能的無糖基化抗體的方法發(fā)現(xiàn)于例如WO2005/018572，其通過引用整體并入。在本文所述的某些抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物中，F(xiàn)c部分可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)被突變以減弱效應(yīng)物的功能。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的缺失或失活(通過點突變或其他手^殳)可減弱Fc受體與循環(huán)的修飾抗體的結(jié)合，因此增加了腫瘤的定位。在其他情況中，可以是根據(jù)本發(fā)明的恒定區(qū)修飾調(diào)控補體的結(jié)合，因此縮短了血清半衰期和減少了扼合的細力包毒素的非特異性締合。然而恒定區(qū)的其他修飾可用來修飾二石克4建合或寡糖部分，由于增加的抗原特異性或抗體柔性而允許增強的定位。得到的生理特征、生物利用率和^修飾的其他生化作用(諸如腫瘤定位、生物分布和血清半衰期)可使用公知的免疫技術(shù)容易地測定和定量，而無需過多的實驗。本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的修飾形式可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從完整前體或母抗體制備。示例性技術(shù)在本文被更詳細地討論。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的可變區(qū)和恒定區(qū)全部是人的。全人抗體可使用本領(lǐng)域已知和本文所述纟支術(shù)制備。例如，針對特異抗原的全人抗體可通過將抗原施用于纟皮^修飾以1更響應(yīng)于4元原;敫發(fā)而產(chǎn)生it匕類^t體、<旦其內(nèi)源基因座已失效的轉(zhuǎn)基因動物來制備。可用來制備此類抗體的示例性才支術(shù)描述于美國專利6,150,584;6,458,592;6,420,140。其他4支術(shù)是本領(lǐng)域已知的。全人抗體可通過各種展示技術(shù)(例如，噬菌體展示或其他病毒展示系統(tǒng))同樣地產(chǎn)生，如本文其他地方更詳細地描述。本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可使用本領(lǐng)域已知4支術(shù)來產(chǎn)生或制備。在某些實施方案中，抗體分子或其片,殳尋皮"重組地產(chǎn)生"，即4吏用重組DNA4支術(shù)產(chǎn)生。用于產(chǎn)生抗體分子本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物還包括通過任何類型的分子與抗體共價連接以致共價連接不阻止抗體特異性結(jié)合其同族表位而被修飾的書f生物。例如但不限于，抗體書f生物包括例如通過已知保護/封閉基團的糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白酶剪切、與細胞配體或其他蛋白的鍵:合等而被修飾的抗體。多種化學(xué)修飾的任一種可通過已知技術(shù)來執(zhí)-f亍，包括〃f旦不限于特異的化學(xué)切割、乙酰化、甲酰4匕、衣霉素的^i射合成等。另外，4汙生物可含有一種或多種非經(jīng)典氨基酸。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物將不在待治療的動物中(例如在人中)引發(fā)有害的免疫應(yīng)答。在某些實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)來自患者(例如，人類患者)，并且隨后用于衍生其的同一物種(例如，人)中以減輕或降低有害免疫應(yīng)答的出現(xiàn)。去免疫化作用可用來降低抗體的免疫原性。如本文所用，術(shù)語"去免疫化作用"包括修飾T細胞表位的抗體的改變(參見，例如，W09852976A1、WO0034317A2)。例如，分沖斤來自起始抗體的VH和VL序列，來自每個V區(qū)的人T細胞表位"圖"顯示了與互補決定區(qū)(CDR)相關(guān)的表位和序列內(nèi)其他關(guān)鍵殘基的位置。分析T細胞表位圖中單個的T細胞表位，以便鑒定具有改變最終抗體活性的低危險的可選氨基酸置換。許多可選VH和VL序列被設(shè)計包含氨基酸置換的組合，并且這些序列隨后被摻入許多結(jié)合多肽(例如，新表位特異的抗體或其免疫特異性片段)以用于本文公開的診斷和治療方法，然后測試其功能。一般產(chǎn)生和測試12和24個之間的變體抗體。然后，將包含修飾的V區(qū)和人C區(qū)的完整重鏈和輕鏈基因克隆進表達載體，隨后的質(zhì)粒引入用于產(chǎn)生完整抗體的細胞系。然后在適當(dāng)?shù)纳蜕餃y定中比較抗體，并鑒定最佳的變體。單克隆抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種4支術(shù)來制備，包括4吏用雜交瘤、重組和，，藍菌體展示纟支術(shù)、或其組合。例如，單克隆抗體可4吏用雜交瘤技術(shù)來產(chǎn)生，包括本領(lǐng)域已知的技術(shù)和例如Harlow等，^4w&6od/e5v爿丄a6on3/or少Mawwa/f戎#J—^^/f/^夕ColdSpringHarborLaboratoryPress,第二版，(1988);Hammerling等，Mowoc/owa/爿w"Zw(i/esr-Ce〃//yZ)nWowasf卓乂發(fā)在伴^f口ri/5^^染爻請y>Elsevier,N.Y"563-681(1981)(所述參考文獻通過引用整體并入)教導(dǎo)的技術(shù)。如本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。術(shù)語"單克隆抗體"指來自單個克隆(包括任何真核、61方法。因此，術(shù)語"單克隆抗體"不限于通過雜交瘤4支術(shù)產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體可4吏用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來制備。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體來自已通過埃巴病毒轉(zhuǎn)化被永生化的人B細胞，如本文所述。在公知的雜交瘤方法中(Kohler等，淑置256:495(1975)),相對短壽或致死的來自哺乳動物的淋巴細胞(例如來自如本文所述的人類對象的B細胞)與永生的腫瘤細胞系(例如，骨髓瘤細胞系)融合，因此產(chǎn)生永生的并且能產(chǎn)生B細胞的遺傳編碼抗體的雜交細胞或"雜交瘤"。得到的雜交體通過選纟奪、稀釋和與包含用于單個抗體形成的特定基因的每個單個4^重新生長而分離為單個遺傳4朱。這些單個遺傳林產(chǎn)生針對需要的抗原均質(zhì)的抗體，在指它們的純遺傳家系時一皮稱為"單克隆"。這樣制備的雜交瘤細胞被接種并生長在優(yōu)選地含有抑制未融合的親代骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)的適合i咅養(yǎng)基中。本領(lǐng)域才支術(shù)人員將理解，用于雜交瘤的形成、選擇和生長的試劑、細胞系和介質(zhì)可從許多來源商業(yè)獲得，并且標(biāo)準(zhǔn)的方案是完善的。一i&測定雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)基中針對需要的抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。雜交瘤細力包產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過諸如免疫沉淀、放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、或本文所述的新表位結(jié)合測定的體外測定來確定。產(chǎn)生具有需要的特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞被鑒定后，克隆通過有P艮稀釋禾呈序萍皮亞克隆，并通過才示準(zhǔn)方法生長(Goding，Mo"oc/o"or/AcademicPress,第59-103頁(1986))。應(yīng)進一步理解，亞克隆分泌的單克隆抗體可通過常少見純化程序,人培養(yǎng)基、腹水或血清中分離，所述程序諸如，例如，蛋白-A、羥磷灰石層析、凝月交電泳、透析或親和層析。識別特異表位的抗體片段可通過已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，F(xiàn)ab和F(ab')2片段可重組地產(chǎn)生，或者可使用諸如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab')2片段)的酶通過免疫球蛋白分子的蛋白酶剪切來產(chǎn)生。F(ab')2片,殳含有可變區(qū)、輕《連恒定區(qū)和重《連的CH1結(jié)構(gòu)域。諸如本文所述的完整的人抗體對人類患者的治療性治療是特別需要的。人抗體可通過本領(lǐng)域已知的多種方法來制備，包括上文所述的4吏用來自人免疫^求蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示方法。美國專利第4,444,887和4,716,111號；和PCT7>布WO98/46645、WO98/50433、W098/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741;其每個通過引用整體并入本文。本發(fā)明的人抗體是例如從沒有癥狀但受發(fā)展疾病(例如，阿爾茨海默病)的危險影響的患者、或患有疾病^f旦具有異常穩(wěn)定的疾患進程的患者中分離的。在另一個實施方案中，編碼需要的單克隆抗體的DNA可<吏用常頭見程序容易地分離并測序(例如，通過4吏用能特異結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。分離和亞克隆的雜交瘤細胞作為此類DNA的優(yōu)選來源。一旦被分離，DNA可被置于表達載體中，然后轉(zhuǎn)染進原核或真核宿主細月包，諸如^f旦不限于否則不產(chǎn)生免疫球蛋白的大腸桿菌(五.co/O細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卯巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞。更特別地，分離DNA(如本文所述可以是合成的)可用來克隆用于制備抗體的恒定區(qū)和可變區(qū)序列，描述于Newman等，1995年1月25日4是交的美國專利第5,658,570號，其通過引用并入本文。本質(zhì)上，這需要從選擇細胞中提取RNA、轉(zhuǎn)變成cDNA、并使用Ig特異引物通過PCR擴增。適合此目的的引物也描述于美國專利第5,658,570號。如下文將更詳63細地討論，表達需要的抗體的轉(zhuǎn)化細胞可以相對大的量生長，以便提供免疫球蛋白的臨床和商業(yè)供給。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含抗體分子的至少一個重鏈或輕鏈CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含來自一個或多個^t體分子的至少兩個CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含來自一個或多個抗體分子的至少三個CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的4元體包含來自一個或多個抗體分子的至少四個CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含來自一個或多個抗體分子的至少五個CDR。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含來自一個或多個抗體分子的至少六個CDR。包含可包括于主體抗體的至少一個CDR的示例性抗體分子描述于本文。在特定實施方案中，重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可通過本領(lǐng)域/>知的方法來#:—驗以鑒定互補決定區(qū)(CDR)的序列，例如，通過與其他重鏈和輕鏈可變區(qū)的已知氨基酸序列比較來確定序列高變性的區(qū)域。使用常規(guī)重組DNA技術(shù)，CDR的一個或多個可^皮插入構(gòu)架區(qū)內(nèi)，例如插入人構(gòu)架區(qū)。構(gòu)架區(qū)可以是天然存在的或共有構(gòu)架區(qū)，優(yōu)選地人構(gòu)架區(qū)(人構(gòu)架區(qū)的列表參JE,#/如，Chothia等，乂Mo/.所o/.27&457-479(1998))。在某些實施方案中，由構(gòu)架區(qū)和CDR的組合產(chǎn)生的多核苷酸編^碼特異結(jié)合需要的多肽的至少一個表位的抗體。在某些實施方案中，一種或多種氨基酸置換可在構(gòu)架區(qū)內(nèi)產(chǎn)生，以便例如改善抗體與其抗原的結(jié)合。另外，此類方法可用來產(chǎn)生參與《連內(nèi)二石克4建的一個或多個可變區(qū)半胱氨酸殘基的氨基酸置換或缺失，以便產(chǎn)生缺少一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。多核苷酸的其他改變包含于本發(fā)明，并且在本領(lǐng)域的4支術(shù)范圍內(nèi)?？蛇x地，描述單鏈抗體產(chǎn)生的沖支術(shù)(美國專利第4,694,778號；Bird,Sc/置e2":423-442(1988);Huston等，尸亂淑/.^cadS5:5879-5883(1988);和Ward等，7Va~"33^:544-554(1989))可適以產(chǎn)生單4連4元體。單《連抗體通過由氨基S臾橋連才妄Fv區(qū)的重《連和輕鏈片段產(chǎn)生單鏈抗體而形成。用于在大腸桿菌中裝配功能性Fv片孚殳的寺支術(shù)也可4吏用(Skerra等，5We"ce242:1038-1041(1988))。在另一個實施方案中，可通過顯微才喿作選4奪淋巴細胞，并分離動物(例如，人)中分離，并在體外培養(yǎng)約7天。培養(yǎng)物可用來篩選滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)的特定IgG。分離陽性孔的細胞。單個產(chǎn)生Ig的B細胞可通過FACS或通過在補體介導(dǎo)的溶血噬斑測定中鑒定這些細胞而被分離。產(chǎn)生Ig的B細胞可通過顯微操作放入管內(nèi)，并使用例如RT-PCR來擴增VH和VL基因。VH和VL基因可^皮克隆到抗體表達載體中，并轉(zhuǎn)染進細胞(例如真核或原核細胞)用于表達。可選地，產(chǎn)生抗體的細胞系可使用熟練的技術(shù)人員公知的技術(shù)來選擇和培養(yǎng)。此類技術(shù)描述于多種實驗指南和主要出版物中。在這方面，^口下文所述適合用于本發(fā)明的4支術(shù)4笛述于Cw廳e^尸ratoco/s/"/wwimo/ogy^處4l6《夢^^^戎^義Coligan等，編4專，GreenPublishingAssociatesandWiley-Interscience，JohnWileyandSons,NewYork(1991),其通過引用整體并入本文，包括附錄。本發(fā)明的抗體可通過本領(lǐng)域已知的用于抗體的合成的任^T方法產(chǎn)生，特別是通過^i學(xué)合成或優(yōu)選地通過本文所述的重組表達寺支術(shù)來產(chǎn)生。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片^:、變體或書f生物包含合成的恒定區(qū)，其中一個或多個結(jié)構(gòu)域蜂皮部分或完全缺失("結(jié)構(gòu)域缺失抗體")。在某些實施方案中，相容的修飾抗體將包含結(jié)構(gòu)域缺失構(gòu)建體或變體，其中完整的CH2結(jié)構(gòu)域;故去除(ACH2構(gòu)建體)。對其他實施方案，短連接肽可取^缺失結(jié)構(gòu)域來提供可變區(qū)的柔性和自由移動。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，由于CH2結(jié)構(gòu)域?qū)贵w分解代謝率的調(diào)節(jié)特性，此類構(gòu)建體是特別優(yōu)選的。結(jié)構(gòu)域缺失構(gòu)建體可使用編碼IgGt人恒定結(jié)構(gòu)域的載體來衍生(^JE，#/:^，WO02/060955A2和WO02/096948A2)。該載體一皮改造為缺失CH2結(jié)構(gòu)域，并且提供了表達結(jié)構(gòu)域缺失IgG!恒定區(qū)的合成載體。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物是微抗體。微抗體可使用本領(lǐng)域描述的方法來制備(夢/:知，美國專利5,837,821或WO94/09817A1)。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物包含具有幾個或甚至單個氨基酸的缺失或置換的免疫球蛋白重鏈，只要其允許單體亞基之間的締合。例如，在CH2結(jié)構(gòu)域的選才奪區(qū)域的單個氨基酸的突變可足以明顯降低Fc的結(jié)合，并因此增加腫瘤定位。相似地，可能需要僅缺失一個或多個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域中控制待調(diào)控的效應(yīng)物功能(例如補體結(jié)合)的那部分。此類恒定區(qū)的部分缺失可改善抗體的選4奪特征(血清半衰期)，同時保持與主體恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域相關(guān)的其他需要的功能的完整。此外，如上文所示，公開的抗體的恒定區(qū)可以是通過增強得到的構(gòu)建體的特征的一個或多個氨基酸的突變或置換合成的。在這方面，可能破壞了保守結(jié)合位點提供的活性(例如Fc的結(jié)合)，同時基本保持修飾抗體的構(gòu)型和免疫原性特4正。然而其4也實施方案包含添加一個或多個氨基酸到恒定區(qū)以增強需要的特征(諸如效應(yīng)物功能)或提供更多的細胞毒素或碳水化合物的連接。在此類實施方案中，可能需要插入或復(fù)制來自選^^的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的特定序列。本發(fā)明還4是供了包含本文所述的抗體分子(例如，VH區(qū)和/或VL區(qū))的變體(包括衍生物)、主要由本文所述的抗體分子(例如，VH區(qū)和/或VL區(qū))的變體(包括4汙生物)《且成或由本文所述的#元體分子(例如，VH區(qū)和/或VL區(qū))的變體(包括書于生物)組成的抗體，所述抗體或其片段免疫特異地結(jié)合疾病相關(guān)多肽或其片段或變體。本領(lǐng)域才支術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)，技術(shù)可用來在編碼抗體的核苷酸序列中引入突變，包括但不限于引起氨基酸置換的位點定向誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選地，變體(包括衍生物)編碼相對于參考VH區(qū)、VH-CDR1、VH-CDR2、VH國CDR3、VL區(qū)、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3的少于50個氨基酸置換、少于40個氨基酸置換、少于30個氨基酸置換、少于25個氨基酸置4灸、少于20個氨基酸置換、少于15個氨基酸置換、少于10個氨基酸置換、少于5個氨基酸置纟灸、少于4個氨基酸置換、少于3個氨基酸置4灸、或少于2個氨基酸置換。"保守氨基酸置換"是其中氨基酸殘基用具有相似電荷的側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的氨基酸置換。具有相似電荷的側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域已定義。這些家族包括具有^咸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非才及性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、具有(3-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)?？蛇x地，突變可沿編碼序列的所有或部分隨才幾地引入，諸如通過々包和-秀變，篩選得到的突變體的生物活性以鑒定^f呆持活性(例如，與疾病相關(guān)多肽結(jié)合的能力)的突變體。例如，可能^f義在抗體分子的構(gòu)架區(qū)或^又在CDR區(qū)引入突變。引入的突變可以是沉默或中性錯義突變，例如沒有或很少影響抗體結(jié)合抗原的能力，實際上一些此類突變不改變?nèi)?可氨基酸序列。這些類型的突變可用于優(yōu)化密碼子^f吏用、或改善雜交瘤的抗體產(chǎn)生。選地，非中性錯義突變可改變抗體結(jié)合抗原的能力。大部分沉默和中性的錯義突變的位置可能在構(gòu)架區(qū)，而大部分非中性錯義突變的位置可能在CDR,盡管這不是絕對的要求。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能設(shè)計和測試具有需要的特性的突變體分子，諸如沒有改變抗原結(jié)合活性或改變了結(jié)合活性(例如，抗原結(jié)合活性的改善或抗體特異性的改變)。誘變后，編碼蛋白可常規(guī)地被表達，編碼蛋白的功能和/或生物學(xué)活性(例如，免疫特異地與疾病相關(guān)多肽的至少一個表位結(jié)合的能力)可4吏用本文所述的才支術(shù)或通過本領(lǐng)域已知的常M/修飾才支術(shù)來確定。IV.編碼抗體的多核香酸根據(jù)上文，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的結(jié)合分子(例如，抗體)的多核苷酸。在抗體的情況中，該多核苷酸可編碼上文所述的抗體的免疫球蛋白鏈的至少可變區(qū)。編碼上述抗體的本發(fā)明的多核苷酸可以是例如，DNA、cDNA、RNA或合成產(chǎn)生的DNA或RNA或重組產(chǎn)生的包含單獨或組合的上述多核苷酸的^f壬一種的嵌合核酸分子。優(yōu)選地，所述多核苷酸是載體的一部分。此類載體可包含允許在適合的宿主細胞和適合的條件下選擇所述載體的諸如標(biāo)志基因的其他基因。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸可"f喿作地與允許在原核或真核細胞中表達的表達控制序列相連。所述多核苷酸的表達包括多核苦酸轉(zhuǎn)錄為可翁3i奪的mRNA。確保在真核細胞(優(yōu)選地哺乳動物細月包)中表達的調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些調(diào)節(jié)元件通常包4舌確{呆轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)序列和4壬選地確4呆轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定的poly-A信號。其他調(diào)節(jié)元件可包括轉(zhuǎn)錄以及翻i奪增強子和/或天然締合或異源的啟動子區(qū)。68編碼抗體、或其抗原結(jié)合片,殳、變體或書于生物的多核苦酸可主要由任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸組成，其可以是未修飾的RNA或DNA或》務(wù)飾的RNA或DNA。例如，編石馬抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物的多核苷酸可主要由單鏈和雙鏈DNA、單4連和雙《連區(qū)混合物的DNA、單4連和乂又《連RNA、和單《連和^又《連區(qū)混合物的RNA、包含可以是單4連或更通常是乂又《連的DNA和RNA或單鏈和雙《連區(qū)混合物的雜種分子組成。另外，編碼抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或4汙生物的多4亥普S吏可主要由包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)組成。編碼抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物的多核苷酸也可含有一個或多個修飾堿基或為了穩(wěn)定性或其他原因修飾的DNA或RNA主《連。1務(wù)飾"石威基包括例如，三苯甲基化堿基和不常見的石成基，諸如肌苦?？蓪NA和RNA進行多種修飾；因此，"多核苷酸"包括化學(xué)、酶促或代謝修飾的形式。編碼來自免疫5求蛋白(例如，免疫^求蛋白重《連部分或輕《連部分)的多肽的非天然變體的分離多核苷酸可通過將一種或多種核苷酸置換、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列以便一種或多種氨基酸置換、添加或缺失被引入編碼蛋白來產(chǎn)生?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入突變，諸如位點定向誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選地，在一個或多個非必需氨基酸殘基處進行保守氨基酸置換。如/>知，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)/人原始的雜交瘤細胞或從其他轉(zhuǎn)化細胞中分離RNA,所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如異石克氰酸胍提取和沉淀，然后離心或?qū)游?。需要時，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從總RNA中分離mRNA,所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如寡聚dT纖維素層析。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)為本領(lǐng)域所熟悉。在一個實施方案中，編碼抗體輕《連和重鏈的cDNA可才艮據(jù)爿厶知的方法使用反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶同時或分開制備。PCR可由共有恒定區(qū)引物或由基于公布的重鏈和輕鏈DNA和氨基酸序列的更特異的引物來起始。如上文討論，PCR也可用來分離編碼抗體輕4連和重《連的DNA克隆。在這種情況中，可用共有引物或更大的同源探針(諸如小鼠恒定區(qū)探針)來篩選文庫。DNA，一4殳為質(zhì)粒DNA,可使用本領(lǐng)域已知的4支術(shù)從細胞中分離，才艮據(jù)詳述于例如前文關(guān)于重組DNA4支術(shù)的參考文獻的標(biāo)準(zhǔn)/>知的才支術(shù)進4亍限制性酶切作圖并測序。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明，DNA可以是在分離過程或隨后分析期間的任一點合成的。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種包含編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)的核酸、主要由編碼免疫^求蛋白重鏈可變區(qū)(VH)的核酉臾《且成或由編石馬免疫J求蛋白重《連可變區(qū)(VH)的核fr復(fù)組成的分離多核苷酸，其中重《連可變區(qū)的CDR的至少一個或重《連可變區(qū)的VH-CDR的至少兩個與來自本文7>開的抗體的參考重《連VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3的氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%是相同的。可選地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3區(qū)與來自本文^>開的抗體的參考重《連VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3的氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%是相同的。因此，根據(jù)該實施方案，本發(fā)明的重鏈可變區(qū)具有與表4所示的多肽序列相關(guān)的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)的核酸、主要由編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)的核酸組成或由編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)的核酸組成的分離多核苷酸，其中輕《連可變區(qū)的VL-CDR的至少一個或輕鏈可變區(qū)的VL-CDR的至少兩個與來自本文公開的抗體的參考輕《連VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3的氨基酸序列至少80%、85%、90%或95%是相同的?？蛇x地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3區(qū)與來自本文開的抗體的參考輕《連VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3的氨基S吏序列至少80%、85%、90%或95%是相同的。因此，根據(jù)該實施方案，本發(fā)明的輕鏈可變區(qū)具有與表4所示的多肽序列相關(guān)的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)的核酸、主要由編碼免疫^求蛋白重鏈可變區(qū)(VH)的核酸組成或由編碼免疫^求蛋白重鏈可變區(qū)(VH)的核酸組成的分離多核香酸，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3區(qū)具有與表4所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3組相同的多肽序列。如本領(lǐng)域所已知，兩個多肽或兩個多核香酸之間的"序列同一性"通過比較一個多肽或多核苦酸的氨基酸或核酸序列與第二個多肽或多核芬酸的序列來確定。當(dāng)在本文討-論時，任4可特定的多肽與另一個多月太是否至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95。/。相同可^f吏用本領(lǐng)i或已知的方法和計算才幾程序/壽欠件來確定，-渚如^f旦不限于，BESTFIT程序(Wisconsin序列分一斤考呈序包，4十只于Unix的X反本8,GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,WI53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman,AdvancesinAppliedMathematics好的區(qū)段。當(dāng)使用BESTFIT或任何其他序列比對程序確定特定序列與根據(jù)本發(fā)明的參考序列是否例如95%相同時，當(dāng)然，參數(shù)設(shè)置為以便對參考多肽序列的全長計算同一性百分比，并允許參考序列中氨基酸總數(shù)最多5%的同源性缺口。表5:新表位特異抗體的VH區(qū)的多核苷酸序列。71抗體可變重鏈序列NI-101.10(SEQIDNO:3)AGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTTTGATGGAACTAAAAAATACTATACAGACTCCGTGGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGGGGTATAGGAGCTCGGCGGGGGCCGTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCANI-101.11(SEQIDNO:56)AGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTTTGATGGAACTAAAAAATACTATACAGACTCCGTGGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGGGGTATAGGAGCTCGGCGGGGGCCGTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCANI-101.11(SEQIDNO:5)(密碼子優(yōu)化)GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCGGGCCGGAGCCTGCGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGCCTTCAGCAGCTACGGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTTCGACGGCACGAAGAAGTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACACCCTGCGGGCCGAGGACACCGCGGTGTACTACTGCGCCCGGGACCGGGGCATCGGCGCCCGGCGGGGCCCCTACTACATGGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCNI-101.12(SEQIDNO:9)TGCACCGTGAGCGGCGGCAGCATCCGGAGCGGCAGCATCTGCTGGTACTGGATCCGGCAGCCCGCCTGCGGGGCCGGCTGACCATCAGCGTGGACGCCAGCAAGAACCAGCTGAGCCTGAGCCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGCGGGCCGGCGAGAACAGCGGCGGCATCGAGCCCTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>NO:15)CCGCGCCGAAACTGCTGATTTATCGCAACAACCAGCGCCCGAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCAAAAGCGGCACCAGCGCGAGCCTGGCGATTAGCGGCCTGCGCAGCGAAGATGAAGCGGATTATTATTGCGCGGCGTGGGATGATAGCCTGAGCGGCTATGTGTTTGGCACCGGCACCAAAGTGACCGTGCTGNM01.12F6A(SEQIDNO:40)TTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGAIIIIGCAACTTATTACTGTCAGCAGAGTTACAGTACCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTNI-101.13A(SEQIDNO:54》TTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGAIIIIGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCAGAACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGNI-101.13B(SEQIDNO:55)TTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGATTCCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCGTCTAGTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAA丌CACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGAIIIIGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAG丌ATTCTCGAACGTTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACG在這方面，本領(lǐng)域#支術(shù)人員將容易理解，編碼輕鏈和/或重《連的至少可變結(jié)構(gòu)域的多核普酸可編碼兩條免疫球蛋白鏈或僅一條的可變結(jié)構(gòu)域。同樣地，所述多核苷酸可處于相同啟動子的控制下，或者可被分開控制用于表達。允許在原核宿主細胞中表達的可能的調(diào)節(jié)元4牛包含例如，在大脈才干菌中的Pl、lac、trp或tac啟動子，允許在真核宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)元件的實例是在酵母中的AOX1或GAL1啟動子或在哺乳動物或其〗也動物細月包中的CMV-、SV40-、RSV-啟動子、CMV-增強子、SV40-增強子或J朱蛋白內(nèi)含子。除了負責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的元件外，此類調(diào)節(jié)元件還可包含多核苷酸下游的轉(zhuǎn)錄纟冬止4言號，i者^口SV40-poly-A4立,泉或tk畫poly-A4立,泉。ot匕夕卜，取,夬于使用的表達系統(tǒng)，能指引多肽到細胞區(qū)室或?qū)⑵浞置诘脚囵B(yǎng)基中的前導(dǎo)序列可加到本發(fā)明的多核苷酸的編碼序列中，并且是本領(lǐng)域公知的。前導(dǎo)序列在適當(dāng)?shù)臅r期與翻譯起始和終止序列一起裝配，并且優(yōu)選地前導(dǎo)序列能指引翻譯蛋白或其部分分泌到周質(zhì)間隙或胞外介質(zhì)。任選地，異源序列可編碼包括產(chǎn)生需要的特4正(例如，表74達的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性或簡化純化)的C-或N-末端鑒定肽的融合蛋白。在這方面，適合的表達載體是本領(lǐng)域已知的，諸如Okayama-BergcDNA表達載體pcDVl(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNAl、pcDNA3(Invitrogen)、或pSPORTl(GIBCOBRL)。優(yōu)選地，表達控制序列將是在能轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統(tǒng)，4旦也可4吏用原核宿主的4空制序列。一旦載體纟參入適當(dāng)?shù)乃拗?，該宿主保持在適合核苷酸序列高水平表達的條件下，如果需要，然后可收集和純化免疫球蛋白輕鏈、重鏈、輕鏈/重鏈二聚體或完整的抗體、結(jié)合片段或其他免疫球蛋白形式；參見，Beychok,CellsofImmunoglobulinSynthesis(免疫王求蛋白合成的細"包)，AcademicPress,N.Y"(1979)。本發(fā)明還包括本發(fā)明的多核苷酸的片段，如其他地方所述。另外本文所述的編碼融合多核苷酸、Fab片段和其他衍生物的多核苷酸也涵蓋于本發(fā)明。多核香酸可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來產(chǎn)生或制備。例如，如果抗體的核苦酸序列已知，編碼抗體的多核香酸可由化學(xué)合成的寡沖亥苦酉吏裝酉己(侈'B口，4笛述于Kutmeier等，5/orec/2m々wes77:242(1994))，筒單地說，這涉及含有編碼抗體的序列的部分的重疊寡核普酸的合成、上述寡核香酸的退火和連4妄，然后通過PCR擴增連4妄的寡核苷酸?？蛇x地，編碼抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或彩f生物的多核苦酸可乂人來自適合來源的核酸產(chǎn)生。如果含有編碼特定抗體的核酸的克隆不可用，但抗體分子的序列已知，則編碼抗體的核酸可化學(xué)地合成或乂人適合來源(例如，抗體cDNA文庫、或乂人表達新抗原特異抗體的任何組織或細胞產(chǎn)生的cDNA文庫、或從表達新抗原特異抗體的任何組織或細胞(諸如選4奪來表達抗體的雜交瘤細胞)分離的核酸，優(yōu)選地polyA+RNA)獲得，通過使用可與序列的3'和5'末端雜交的合成引物的PCR擴增，或通過4吏用特異于特定基因序列的寡核芬酸探針的克隆來例如從編碼抗體的cDNA文庫鑒定cDNA克隆。然后可使用本領(lǐng)域/>知的任何方法將通過PCR產(chǎn)生的擴增的核酸克隆到可復(fù)制的克隆載體中。一旦確定了抗體、或其抗原結(jié)合片,史、變體、或4汙生物的核苷酸序列和7于應(yīng)的氨基酸序列，其4亥苷酸序列可〗吏用本4貞3或/>知的用于核苦酸序列操:作的方法來才喿作，所述方法例如重組DNA技術(shù)、位點定向i秀變、PCR等(參見，例如，描述于Sambrook等，Mo/ecw/arC/謹(jǐn)'wg，^她畫/"、^^發(fā)泉發(fā)^絲j,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1990)和Ausubel等，編輯,Cwre"/Vofoco/s/"Mo/ecw/ar所o/ogy,處為、f^:發(fā)戎^J,JohnWiley&Sons,NY(1998)的才支術(shù)，兩者都通過引用整體并入本文)，以i"更產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體，例如產(chǎn)生氨基酸置換、缺失和/或插入。V.抗體多肽的表達本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生能表達本發(fā)明的抗體或其對應(yīng)的免疫J求蛋白鏈的細胞的方法，該方法包括用本發(fā)明的多核苦酸或載體遺傳改造細胞?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法獲得的細胞可用于例如測試本發(fā)明的抗體與其抗原的相互作用。提供本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物的分離遺傳材并+的才喿作后，編碼抗體的多核苷酸一般^皮插入表達載體，以便引入可用來產(chǎn)生需要量抗體的宿主細胞。與耙分子結(jié)合的抗體或其片段、衍生物或類似物(例如抗體的重《連或輕鏈)的重組表達描述于本文。一旦獲得了本發(fā)明的編碼抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈或其部分(優(yōu)選地含有重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域)的多核苦酸，用于產(chǎn)生抗體分子的載體可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。因此，通過表達含有編碼抗體的核苦酸序列的多核苷酸制備蛋白的方法描述于本文。本領(lǐng)域才支術(shù)人員公知的方法可用來構(gòu)建含有抗體編碼序列和適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括例如，體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。因此本發(fā)明提供了包含可操作地與啟動子相連的編碼本發(fā)明的抗體分子、或其重鏈或輕鏈、或重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)i或的核苷酸序列的可復(fù)制載體。此類載體可包括編碼抗體分子恒定區(qū)的核苷s吏序列(參jK，辨如，PCT^厶布WO86/05807;PCT/^布WO89/01036;和美國專利第5,122,464號)，并且抗體的可變結(jié)構(gòu)域可一皮克隆到此類載體中用于完整重《連或輕《連的表達。本發(fā)明涉及常規(guī)用于遺傳工程的載體，特別是質(zhì)粒、粘粒、病球蛋白鏈的可變結(jié)構(gòu)域的多核苷酸；任選地與編碼本發(fā)明的抗體的其他免疫球蛋白鏈的可變結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的多核苷酸組合。優(yōu)選地，所述載體是表達載體和/或基因轉(zhuǎn)移或靶向載體。來自諸如反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、腺伴隨病毒、皰滲病毒或牛乳頭狀瘤病毒的病毒的表達載體可用于將本發(fā)明的多核苷酸或載體遞送到纟皮耙向的細胞群體。本領(lǐng)域才支術(shù)人員〉知的方法可用來構(gòu)建重組病毒載體；參見，侈寸^口,4苗述于Sambrook,MolecularCloningALaboratoryManual(分子克隆實'驗指南)，ColdSpringHarborLaboratory(1989)N.Y,和Ausubel，CurrentProtocolsinMolecularBiology(最新分子生物學(xué)實驗技術(shù)),GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.(1994)的技術(shù)?？蛇x地，本發(fā)明的多核苷酸和載體可重構(gòu)到脂質(zhì)體中用于遞送至把細胞。含有本發(fā)明的多核苷酸(例如，免疫球蛋白鏈重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的編碼序列和表達控制序列)的載體可通過公知的方法轉(zhuǎn)移到宿主細胞，所述方法根據(jù)細胞宿主的類型而不同。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染通常用于原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用于其^f也細月包宿主；參見Sambrook,上文。術(shù)語"載體"或"表達載體"在本文用來指根據(jù)本發(fā)明用作引入宿主細胞并在宿主細胞中表達需要的基因的介質(zhì)的載體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，此類載體可容易地選自由質(zhì)粒、噬菌體、病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒組成的組。一般而言，與本發(fā)明相容的載體將包含選擇標(biāo)志、適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c以便有助于需要的基因的克隆和進入真核或原核細胞和/或在真核或原核細胞中復(fù)制的能力。為了本發(fā)明的目的，可采用許多表達載體系統(tǒng)。例如，一類載體利用來自諸如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、才干狀病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的動物病毒的DNA元件。其他載體涉及使用具有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點的多順反子系統(tǒng)。另外，DNA蜂皮整合進其染色體的細胞可通過f1入允許選擇轉(zhuǎn)染的宿主細胞的一種或多種標(biāo)志來選擇。標(biāo)志可為營養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)、殺蟲劑抗性(例如，抗生素)或?qū)χT如銅的重金屬的抗性。選4奪標(biāo)志基因可直接與待表達的DNA序列相連，或者可通過共轉(zhuǎn)化被引入同一細胞中。其他元件可能是mRNA的最佳合成所需要的。這些元件可包括信號、剪接信號、以及轉(zhuǎn)錄啟動子、增強子和終止信號。在特別優(yōu)選的實施方案中，克隆的可變區(qū)基因與如上文討i侖合成的重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因(優(yōu)選地人的)一起插入表達載體。在一個實施方案中，這是4吏用稱為NEOSPLA的BiogenIDEC,Inc.的專有表達載體實現(xiàn)的(7>開于美國專利6,159,730)。該載體含有巨細胞病毒啟動子/增強子、小鼠P珠蛋白主要啟動子、SV40復(fù)制起點、牛生長激素多聚&，苷化序列、新霉素》舞酸轉(zhuǎn)移酶外顯子1和外顯子2、二氫葉酸還原酶基因和前導(dǎo)序列。摻入可變區(qū)和恒定區(qū)基78因、轉(zhuǎn)染到CHO細胞中、然后在含有G418的培養(yǎng)基選擇和氨曱蝶呤擴增之后，發(fā)現(xiàn)該載體導(dǎo)致非常高水平的抗體表達。當(dāng)然，能引的實例包括j旦不卩艮于質(zhì)沖立pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR31、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5畫His、pVAXl和pZeoSV2(可/人Invitrogen,SanDiego，CA獲得)和質(zhì)粒pCI(可,人Promega,Madison，WI獲得)。一4殳而言，篩選大量轉(zhuǎn)化細胞中表達適合高水平的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的細胞是可例如通過機器人系統(tǒng)進行的常規(guī)實驗。載體系統(tǒng)還教導(dǎo)于美國專利第5,736，137和5,658,570號，其每個通過引用整體并入本文。該系統(tǒng)4是供了高表達水平，例如，>30pg/細胞/天。其他示例性載體系統(tǒng)/>開于例如美國專利6,413,777。在其他優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物可使用多順反子構(gòu)建體來表達，諸如公開于2002年11月18曰提交的美國專利申請公布第2003-0157641Al號的那些，其整體并入本文。在這些新的表達系統(tǒng)中，感興趣的多種基因產(chǎn)物(諸如抗體的重鏈和輕鏈)可從單個多順反子構(gòu)建體產(chǎn)生。這些系統(tǒng)有利地使用內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)來提供相對高水平的抗體。相容的IRES序列7>開于美國專利第6,193,980號，其也并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，此類表達系統(tǒng)可用來有效地產(chǎn)生本應(yīng)用/>開的全套抗體。更一H地，一旦制備了編碼抗體的單體亞基的載體或DNA序列，可將表達載體引入適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?。將質(zhì)粒引入宿主細胞可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員/>知的各種技術(shù)來實現(xiàn)。這些#支術(shù)包括^旦不限于，轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、細月包與包#皮DNA的融合、顯樣i注射和完整病毒的感染。參見，Ridgway，A.A.G.五xp廠es57'owPfe"o^f嗜#乙^'Vectors,Rodriguez和Denhardt，編輯，Butterworths，Boston,Mass.,第24.2章，第470-472頁(1988)。將質(zhì)粒引入宿主一4殳是通過電穿孔。含有表達構(gòu)建體的宿主細胞在適合輕鏈和重鏈產(chǎn)生的條件下生長，并測定重鏈和/或輕鏈蛋白的合成。示例性測定技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、；故射免疫測定(RIA)、或熒光激活細胞分選分析(FACS)、免疫組織化學(xué)和類似:技術(shù)。表達載體通過常規(guī)^支術(shù)轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，然后轉(zhuǎn)染的細"包通過常規(guī)4支術(shù)培養(yǎng)以產(chǎn)生用于本文所述的方法的抗體。因此，本發(fā)明鏈或輕鏈的多核普酸的宿主細胞。在表達雙《連抗體的優(yōu)選實施方案中，編碼重鏈和輕鏈的載體可在宿主細胞中共表達以便表達完整的免疫j求蛋白分子，如下文詳述。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。所述宿主細胞可以是原核或真核細胞。存在于宿主細胞的本發(fā)明的多核苦酸或載體可整合到宿主細胞的基因組中，或者其可保4寺在染色體外。宿主細月包可以是4壬4可原核或真核細月包，i者如纟田菌、昆蟲、真菌、植物、動物或人的細胞。優(yōu)選的真菌細胞是例如，釀酒酵母(5^cc/zaram_yc^)屬的那些，凈爭別是釀酒酵母種(XcewWWae)的那些。術(shù)語"原核的"意圖包括可用DNA或RNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以表達本發(fā)明的抗體或?qū)?yīng)免疫^求蛋白鏈的所有細菌。原核宿主可包:括革蘭氏陰性以及革蘭氏陽性細菌，i者4。，例如，大腸才干菌、鼠傷寒沙門氏菌(51.妙/n7wwr/w附)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serra"a)和枯草芽孢軒菌(^"c/〃m^^"to)。術(shù)語"真核的"意圖包括酵母、高等才直物、昆蟲和^尤選i也哺乳動物細月包，最^尤選:l也HEK293、NSO和CHO細胞。取決于在重組產(chǎn)生程序中采用的宿主，本發(fā)明的多核香酸編碼的抗體或免疫j求蛋白《連可以是#唐基化的或可以是非#唐基化的。本發(fā)明的抗體或?qū)?yīng)的免疫球蛋鏈還可包括起始曱硫氨酸氨基酸殘基。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的任何技術(shù)，本發(fā)明的多核苷酸可用來轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主。此外，用于制備融合、可才喿作連4妄的基因并在例如哺乳動物細胞和細菌中表達這些基因的方';去是本4貞i或公^口的(Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實驗指南)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY,1989)。本文所述的遺傳構(gòu)建體和方法可用于在真核或原核宿主中表達本發(fā)明的抗體或?qū)?yīng)的免疫球蛋白鏈。一般而言，含有有助于插入的多核香酸有效轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的表達載體可與宿主一起使用。表達載體一般含有復(fù)制起點、啟動子和終止子，以及能提供轉(zhuǎn)化細胞的表型選擇的特定基因。用于免疫球蛋白表達和分泌的DNA序列和宿主細月包的適合的來源細J包可乂人i午多來源獲4尋，T者如美國典型i備養(yǎng)物4呆藏中心(AmericanTypeCultureCollection)("CatalogueofcelllinesandHybridomas(纟田月包系禾口雜交瘤目錄)，"，第五版(1985)Rockville,Maryland,U.S.A.,其通過引用并入本文)。此外，包含本發(fā)明的細胞的轉(zhuǎn)基因動物(優(yōu)選地哺乳動物)可用于大規(guī)^t產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。因此，在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生疾病相關(guān)蛋白特異性結(jié)合分子(例如抗體或其結(jié)合片段或免疫球蛋白鏈)的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)上文所述細力包；和(b)從培養(yǎng)物中分離所述抗原、結(jié)合分子、抗體或其結(jié)合片段或免疫J求蛋白鏈。轉(zhuǎn)化的宿主可生長于發(fā)酵罐中，并根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)培養(yǎng)以獲得最佳的細胞生長。一旦表達，本發(fā)明的完整的抗體、其二聚體、單個輕鏈和重《連、或其他免疫球蛋白形式可才艮據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)程序純化，包括石克酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳和類似程序；參見Scopes,"ProteinPurification(蛋白纟屯4匕)"，SpringerVerlag,N.Y.(1982)。然后可從生長培養(yǎng)基、細胞裂解物或細胞膜級分中分離本發(fā)明的抗體或其對應(yīng)的免疫球蛋白鏈。例如本發(fā)明的重組表達的抗體或免疫球蛋白鏈的分離和純化可通過任何常規(guī)的手段，諸如，例如，制備型層析分離和諸如涉及使用針對本發(fā)明的抗體的恒定區(qū)的單克隆或多克隆抗體的免疫分離。對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的，本發(fā)明的抗體可進一步與用于例如藥物輩巴向和成^f象應(yīng)用的其4也部點，或者偶耳關(guān)產(chǎn)物可在DNA水平改造到本發(fā)明的抗體或抗原中。然后DNA在適合的宿主系統(tǒng)中表達，表達的蛋白被收集和復(fù)性(如果需要)。至少約90至95%同質(zhì)性的基本純的免疫球蛋白是優(yōu)選的，98%至99%或更高的同質(zhì)性是藥物用途最優(yōu)選的。一旦部分純化或純化到需要的同質(zhì)性，則抗體可治療地(包4舌體夕卜)^吏用或用于開發(fā)和，執(zhí)行測定程序。宿主細胞可與本發(fā)明的兩個表達載體共轉(zhuǎn)染，第一個載體編碼重鏈衍生的多肽，第二個載體編碼輕鏈衍生的多肽。兩個載體可含有允許重鏈和輕鏈多肽同等表達的相同的選^^標(biāo)志?？蛇x地，可使用編碼重鏈和輕鏈多肽兩者的單個載體。在此類情況中，輕《連有利;也置于重《連之前以避免毒'I"生;誇離重《連的過量(Proudfoot,7V"ft^e322:52(1986);Kohler，尸rac.7Vaf/.Sc/.t75L477:2197(1980))。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。如本文所用，"宿主細胞"指含有使用重組DNA4支術(shù)構(gòu)建并編碼至少一個異源基因的載體的細胞。在描述從重組宿主中分離抗體的方法中，術(shù)語"細胞"和"細胞培養(yǎng)物"可互換使用來表示抗體的來源，除非另外清楚指定。換句話說，從"細胞，，中回收多肽可意指從旋下的完整細胞中，或者從含有培養(yǎng)基和懸浮細胞的細胞培養(yǎng)物中回^欠多月太。多種宿主表達載體系統(tǒng)可用來表達用于本文所述的方法的抗體分子。此類宿主表達系統(tǒng)代表感興趣的編碼序列可通過其產(chǎn)生并隨后被純化的介質(zhì)，也代表當(dāng)用適當(dāng)?shù)暮塑账峋幋a序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時原位表達本發(fā)明的抗體分子的細胞。這些宿主表達系統(tǒng)包括但不限于用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的諸如細菌(例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)的孩i生物；用含有抗體編碼序列的重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，S良酒酵母，畢赤酵母(尸/c/^));用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達載體(例如，花浙卩菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)感染的、或用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或帶有含有來自哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如，金屬石克蛋白啟動子)或來自哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子；痘苗病毒7.5K啟動子)的重《且表達構(gòu)建體的哺乳動物細月包系統(tǒng)(例3口，COS、CHO、BLK、293、3T3細月包)。優(yōu)選i也，特別用于表達完整的重組抗體分子的細菌細胞(諸如大腸桿菌)和更優(yōu)選地真核細胞用于表達重組抗體分子。例如，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)的哺乳動物細胞連同諸如來自人巨細胞病毒的主要即時(intermediate)早期基因啟動子元件的載體是有歲文的抗體表達系統(tǒng)(Foecking等，^5:101(1986);Cockett等，5/o/7^c/2"o/ogy&2(1990))。用于蛋白表達的宿主細胞系通常是哺乳動物來源的；相信本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力優(yōu)先確定最適合需要的基因產(chǎn)物在其中表達的83特定宿主細胞系。示例性宿主細胞系包括^旦不限于，CHO(中國倉鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中國倉鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人頸癌)、CVI(賓吳腎系)、COS(具有SV40T^t原的CVI的書T生物)、VERY、BHK(幼倉鼠腎)、MDCK、293、WI38、R1610(中國倉鼠成纖維細月包)、BALBC/3T3(小鼠成纖維細月包)、HAK(倉鼠腎系)、SP2/OC小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA畫lclBPT(牛內(nèi)皮細胞)、RAJI(人淋巴纟田胞)和293(人腎)。CHO細胞是特別優(yōu)選的。宿主細胞系一般可乂人商業(yè)4幾構(gòu)美國組織培養(yǎng)物保藏中心或/人發(fā)表的文獻獲得。另夕卜，可選^奪調(diào)控插入序列表達、或以需要的特定方式^f'務(wù)飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細胞株。蛋白產(chǎn)物的此類修飾(例如，糖基化)和加工(例如，切割)對蛋白的功能可能是重要的。不同的宿主細胞具有特征的和特定的蛋白和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾機制?？蛇x擇適當(dāng)?shù)募毎祷蛩拗飨到y(tǒng)以確保表達的外源蛋白的正確修飾和加工。為達到這一目的，可4吏用具有用于初纟及津爭錄物的正確加工、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細胞機器的真核宿主細胞。為了重組蛋白長期、高產(chǎn)率的產(chǎn)生，穩(wěn)定表達是優(yōu)選的。例如，穩(wěn)定表達抗體分子的細胞系可被改造。不使用含有病毒復(fù)制起點的表達載體，宿主細胞可以用適當(dāng)表達控制元件(例如，啟動子、增強子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷化位點等)控制的DNA和可選擇標(biāo)志來轉(zhuǎn)化。引入外源DNA之后，允許改造的細胞在富集培養(yǎng)基中生長l-2天，然后轉(zhuǎn)換為選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的可選擇標(biāo)志賦予對選4奪的抗性，并允許細胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合進它們的染色體，并且生長以形成本身可^皮克隆和擴增成細月包系的轉(zhuǎn)化灶(foci)。該方法可有利i也用于改造穩(wěn)定表達抗體分子的細月包系?？墒褂迷S多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰滲病毒胸苷激酶(Wigler等，Ce〃77:223(1977))、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska&Szybalski,尸亂淑/.^cadSc/."&4(1992))、和腺。票呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，Ce〃22:8171980)基因可分別用于tk-、hgprt-或aprt-細胞?？勾x物抗性也可用作下述基因選才奪的基石出dhfr,貝武予對氨曱蟲菜p令的抗性(Wigler等，A^//.爿cad5W.t/SA77:357(1980);O'Hare等，7Vw/.^cad5W.7S:1527(1981));gpt，貝武予只十霉酚酉臾的4元寸生(Mulligan&Berg，尸rac.7Va"爿c^/.5W,7&2072(1981));neo,貝武予只于氨基并唐普G-418的4元性，C7/mW尸W層cj":488-505;Wu和Wu，腸f/z簡"3:87-95(1991);Tolstoshev，^肌Aev.P/2a環(huán),/.7bx/co/.32:573-596(1993);Mulligan,5W置e，:926-932(1993);和Morgan和Anderson,爿肌B,oc/2ew.62:191-217(1993);r￡C//〃r":155-215(1993年5月)；和hygro,貝武予對潮霉素的抗性(Santerre等，GWie30:147(1984)。在重組DNA4支術(shù)領(lǐng)i或通常已知的可用的方法描述于Ausubel等(編豐尋)，Cw^rewf/Votoco/sMo/eci//<3rf處Jf為、"^^:參夢^1^發(fā)戎^J，JohnWiley&Sons,NY(1993);Kriegler,Gewe7hm^r五x戸認.o"f差^掙移和^id;,,ALaboratoryManual(差^脊移和^這實'驗指南)，StocktonPress,NY(1990);和Dracopoli等(編輯)，Cwrre"/Prafoco/s/"T/w柳a"f處齊乂類遽傳夢J發(fā)戎^,，第12和13章，JohnWiley&Sons,NY(1994);Colberre畫Garapin等，乂Mo/."0:1(1981),其通過引用整體并入本文?？贵w分子的表達水平可通過載體的擴增而增加(綜述參ABebbington和Hentschel,7Tzewsevectors16aset/gewec/om77g("^7f^喊/乙動務(wù)勿/S^^這乂發(fā)W差^W差f羞^f乂f^戎謬^DA^乂謦^^A^J，AcademicPress,NewYork,第3巻(1987))。當(dāng)表達抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)志可擴增時，存在于宿主細胞培養(yǎng)物中的抑制物水平的提高將增加標(biāo)志基因的拷貝數(shù)。由于擴增區(qū)與抗體基因相關(guān)，因此抗體的產(chǎn)生也將增加(Crouse等，Mo/.Ce〃.3:257(1983))。體外產(chǎn)生允許按比例擴大以產(chǎn)生大量需要的多肽。用于在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)哺乳動物細胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如在氣升式反應(yīng)器或連續(xù)攪拌反應(yīng)器中的均質(zhì)懸浮培養(yǎng)，或例如在中空纖維、孩t嚢中、瓊脂津唐孩b朱或陶瓷管殼(ceramiccartridge)上的固定或陷入的細胞培養(yǎng)。如果必要和/或需要，多肽溶液可例如在合成的鉸鏈區(qū)多肽的優(yōu)先生物合成之后，或在本文所述的HIC層析步驟之前或之后，通過常規(guī)的層析方法來純化，所述方法例如凝膠過濾、離子交換層析、DEAE-纖維素層析或(免疫)親和層析。編碼本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物的基因也可在非哺乳動物細月包中表達，諸如細菌或昆蟲或酵母或才直物細月包。容易4妄納核酸的細菌包括下述成員腸4干菌牙牛(enterobacteriaceae),-渚如大腸才干菌或沙門氏菌的菌4朱；芽；包4干菌考牛(Bacillaceae)，諸^口才古草芽孑包才干菌；月申炎3求菌(P"ei/wococcws);鏈球菌(5Vre/^ococci/s)和流感嗜血桿菌(//aemop/z/to/"y/we"z"e)。應(yīng)進一步理解，當(dāng)在細菌中表達時，異源多肽一4殳成為包涵體的一部分。異源多肽必須#:分離、純化并且然后裝配成功能分子。當(dāng)需要四<介形式的抗體時，然后亞基爿夸自動裝配成四^介抗體(WO02/096948A2)。在細菌系統(tǒng)中，才艮據(jù)表達的抗體分子的預(yù)期用途，可有利地選擇許多表達載體。例如，當(dāng)要產(chǎn)生大量的此類蛋白用于生產(chǎn)抗體分子的藥物組合物時，可能需要指引容易純化的融合蛋白產(chǎn)物高水平表達的載體。此類載體包括^旦不限于大腸4干菌表達載體pUR278(Ruther等，五AiB(9乂2:1791(1983)),其中抗體編石馬序列可才安lacZ編碼區(qū)的閱讀框架單獨連接到載體中以便產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye&Inouye,他c/e/c^c油L73:3101-3109(1985);VanHeeke&Schuster,JS/o/.C/2ew.24:5503-5509(1989));和類似載體。pGEX載體也可用于將外源多肽表達為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，此類融合蛋白是可溶的，并且可容易地通過吸附并結(jié)合到基質(zhì)谷胱甘肽-瓊脂糖珠上、然后在游離谷胱甘肽存在時洗脫而從裂解細胞中純化。pGEX載體設(shè)計為包括凝血酶或Xa因子蛋白酶剪切位點，以^更克隆的靶基因產(chǎn)物可從GST部分釋》文。除了原核生物外，還可4吏用真核樣i生物。釀酒酵母或常見的面包酵母是最常用的真核微生物，盡管許多其他菌抹也常用，例如巴斯德畢赤酵母(尸/cfcpo^腦;？)。只于在酉良酒酵母中的表達，例3口質(zhì)斗立YRp7(Stinchcomb等，Nature，:39(1979);Kingsman等，G置7:141(1979);Tschemper等，70:157(1980))是常用的。該質(zhì)粒已經(jīng)含有為缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變抹提供選"^奪標(biāo)志的TRP1基因，例如ATCC第44076號或PEP4國1(Jones，G匿"cs55:12(1977))。然后作為酵母宿主細胞基因組特征的trpl缺陷的存在為通過在缺少色氨酸時生長來檢測轉(zhuǎn)化提供了有效的環(huán)境。在昆蟲系纟克中，苜蓿名艮纟丈夜蟲我(JWognap/zaca/i/br"/ca)沖亥型多角體病毒(AcNPV)—般用作載體來表達外源基因。病毒在草地貪夜蟲我(Spc^optera/rwg&enia)細月包中生長。4元體編石馬序列可單獨克隆到病毒的非必需區(qū)域(例如多角體蛋白基因)，并置于AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的控制下。一旦本發(fā)明的抗體分子纟皮重組表達，可通過本領(lǐng)域已知的用于純化免疫球蛋白分子的任何方法來純化抗體分子，例如，通過層析(例如，離子交換層析、親和層析、特別是針對蛋白A之后的特定抗原的親和層析和大小柱層析)、離心、差異溶解(differentialsolubility).或通過用于蛋白純化的任何其他的標(biāo)準(zhǔn)4支術(shù)?？蛇x地，用于增加本發(fā)明的抗體的親和力的優(yōu)選方法/>開于US20020123057Al。VI.融合蛋白和專厄合物本發(fā)明的抗體可包含其他結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域通過共i"介或非共價鍵相連。鍵合可基于根據(jù)本領(lǐng)域已知和上文所述的方法的遺傳融合，或者可通過描述于例如國際申請WO94/04686的例如化學(xué)交聯(lián)來進行。存在于包含本發(fā)明的抗體的融合蛋白的其他結(jié)構(gòu)域可優(yōu)選地通過柔性^接頭(有利地多肽4妄頭)連4妄，其中所述多肽4妄頭包含多個親水的肽鍵連接的氨基酸，氨基酸的長度足以^爭越所述其他結(jié)構(gòu)域的C-末端和本發(fā)明的抗體的N-末端之間的3巨離，或反之亦然。片段偶聯(lián)。這包括例如，包含本發(fā)明的抗體的可變區(qū)的單鏈融合蛋白通過共價方法(諸如肽鍵合)與治療或診斷活性劑偶聯(lián)。其他實例包括包含至少抗原結(jié)合片段的分子共價或非共價地與其他分子(包4舌在下述非限制性例i正列表中的那些)偶耳關(guān)。Tmunecker,Int.J.CancerSurp.SuDP7(1992),51-52描述了雙特異性試劑janusin,其中針對CD3的Fv區(qū)與可溶性CD4或與諸如OVCA和IL-7的其他配體偶聯(lián)。相似地，本發(fā)明的抗體的可變區(qū)可被構(gòu)建到Fv分子中，并與i者如在引用的文章中例i正的可選配體偶耳關(guān)。Higgins，J.InfectDisease166(1992)，198-202描述了主要由與針對GP120的V3區(qū)內(nèi)特定序列的抗體交耳關(guān)的OKT3組成的異型輒合抗體。此類異型4厄合定抗體的其^也實例包4舌描述于Fanger，CancerTreat.Res.68(1993),181-194和Fanger，Crit.Rev,Immunol.12(1992)，101-124的抗體。88在本發(fā)明的進一步的實施方案中，結(jié)合分子、抗體、免疫球蛋白鏈或其結(jié)合片段或抗原被可4企測地標(biāo)記。標(biāo)記劑可直接或間接與本發(fā)明的抗體或抗原偶聯(lián)。間接偶聯(lián)的一個實例是通過使用間隔部分。因此，結(jié)合分子(例如，本文鑒定的抗體)的生物活性暗示它們具有足夠的親和力以便使它們成為使藥物分別定位于表達疾患細月包和組織的適當(dāng)表面結(jié)構(gòu)的細"包的潛在^美選物。這種革巴向和與細胞的結(jié)合可用于遞送治療或診斷活性劑和基因治療/基因遞送。具有本發(fā)明的抗體的分子/顆粒將特異結(jié)合表達病理蛋白變體形式的細月包/組織，因此可能具有i貪斷和治療用途。因此，本發(fā)明的結(jié)合分子(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)可被標(biāo)記(例如，熒光、》丈射性、酶、核；茲、重金屬)，并用于在體內(nèi)或體外才企測特定的靶，包括體外"免疫化學(xué)，，類似測定。在體內(nèi)他們可以與核醫(yī)學(xué)成^f象4支術(shù)相似的方式^f吏用來4企測表達新表位的組織、細胞或其他材并+。因此，在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的結(jié)合分子或抗體或其結(jié)合片段在制備用于以下的組合物中的用途用于體內(nèi)檢測或靶向治療和/或i貪斷劑至腦中的疾病相關(guān)蛋白以便在對象中檢測、抑制其形成或減少病理蛋白聚集體或構(gòu)象，用于改善^人知或減緩或逆轉(zhuǎn)與疾患相關(guān)的認知衰退，或用于乂人體液體外才是取病理化合物或其前體。在某些實施方案中，抗體多肽包含正常與抗體無關(guān)的氨基酸序列或一個或多個部分。示例性^修飾更詳細i也描述于下文。例如，本發(fā)明的單鏈fv抗體片段可包含柔性接頭序列，或者可一皮修飾以加入功能性部分(例如，PEG、藥物、毒素、或標(biāo)記)。本發(fā)明的抗體多肽可包含融合蛋白、主要由融合蛋白組成、或由融合蛋白組成。融合蛋白是包含例如具有至少一個耙結(jié)合位點的免疫球蛋白抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和至少一個異源部分(即自然中不與其天然相連的部分)的嵌合分子。氨基酸序列正?？梢栽谌诤隙嚯闹斜贿B接到一起的分開的蛋白存在，或者它們正?？纱嬖谟谕坏鞍字?，但在融合多肽中被置于新的排列。融合蛋白可例如通過化學(xué)合成或通過產(chǎn)生并翁^奪其中肽區(qū)域以需要的關(guān)系被編碼的多核苦酸來產(chǎn)生。術(shù)語"異源"當(dāng)應(yīng)用于多核苷酸或多肽時意指來自與同其比壽交的其余實體不同的實體的多核普酸或多肽。例如，如本文所用，與抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或類似物融合的"異源多肽"來自同一物種的非免疫球蛋白多肽或不同物種的免疫球蛋白或非免疫J求蛋白多月太。如本文其他地方更詳細地討論，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片,殳、變體、或書f生物可進一步與位于N-或C-末端的異源多肽重組地融合或與多肽或其他組合物化學(xué)專厄合(包括共〗介和非共〗介專厄合)。例如，抗體可與在才企測測定中用作標(biāo)記的分子和諸如異源多肽、藥物、放射性核素或毒素的效應(yīng)物分子重組地融合或軛合。JS，辨如，PCT公布WO92/08495;WO91/14438;WO89/12624;美國專利第5,314,995號；和EP396,387。本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物可主要由通過肽鍵或修飾肽鍵(即肽等構(gòu)物)彼此相連的氨基酸組成，并且可含有除了20個基因編碼的氨基酸外的其他氨基酸?？贵w可通過天然方法(諸如翻i,后加工)或通過本領(lǐng)3或7>知的化學(xué){務(wù)飾:技術(shù)而被修飾。此類修飾清楚描述于基礎(chǔ)教本和更詳細的專著以及長篇研究文獻中。修飾可在抗體的任何位置發(fā)生，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端、或在諸如碳水化合物的部分。應(yīng)理解，同樣抗體還可含有許多類型的》務(wù)飾?？贵w例如由于泛素化可以是分支的，抗體可以是分支或不分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支和分支的環(huán)狀抗體可產(chǎn)生于翻譯后的天然過程，或者可通過合成方法產(chǎn)生。修飾包括乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共4介連接、血紅素部分的共^介連4妄、核苷酸或核苷酸4汙生物的共〗介連4妄、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價連接、磷脂酰肌醇的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫曱基化、共價交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、曱?；?？羧基化、糖基化、GPI錨的形成、羥基化、硪化、甲基化、豆蔻?；⒀趸?、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二晞化、外消旋化、硒化、硫酸化、諸如精氨酰化的轉(zhuǎn)移-RNA介導(dǎo)的添加氨基酸到蛋白質(zhì)和泛素^f匕。(#1,尸ra^/ra-5^m"w"爿wdMo/ecw/arf蛋^-/々^^為、子^￥"'/^義T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork第2版(1993);B.C.Johnson,編4專，AcademicPress,NewYork,第1-12頁(1983);Seifter等，她/Z2五"zy歸m2:626-646(1990);Rattan等，A朋A004c^/5W663:48-62(1992))。本發(fā)明還提供了包含抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物和異源多肽的融合蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含、主要由、或由具有本發(fā)明的抗體的VH區(qū)的任一個或多個的氨基酸序列、或本發(fā)明的抗體或其片,殳或變體的VL區(qū)的任一個或多個的氨基酸序列和異源多肽序列的多肽組成。在另一個實施方案中，用于本文公開的診斷和治療方法的融合蛋白包含、主要由、或由具有抗體或其片段、變體、或4汙生物的VH-CDR的任一個、兩個、三個的氨基酸序列、或抗體或其片段、變體、或書f生物的VL-CDR的任一個、兩個、三個的氨基酸序列和異源多肽序列的多肽組成。在一個實施方案中，融合蛋白包含具有本發(fā)明的抗體、或其片段、書亍生物、或變體的VH-CDR3的氨基酸序列和異源多肽序列的多肽，所述融合蛋白特異結(jié)合疾病相關(guān)蛋白的至少一個新表位。在另一個實施方案中，融合蛋白包含具有本發(fā)明的抗體的至少一個VH區(qū)的氨基酸序列和本發(fā)明的抗體或其片,殳、書f生物或變體的至少一個VL區(qū)的氨基酸序列和異源多月太序列的多月太。4尤選i也，融合蛋白的VH和VL區(qū)對應(yīng)于特異結(jié)合疾病相關(guān)蛋白的至少一個新表位的單一來源的抗體(或scFv或Fab片,殳)。在另一個實施方案中，用于本文^開的i貪斷和治療方法的融合蛋白包含具有抗體的VHCDR的任一個、兩個、三個或多個的氨基酸序列和抗體或其片段或變體的VLCDR的任一個、兩個、三個或多個的氨基酸序列和異源多肽序列的多肽。^f尤選i也，VH-CDR或VL-CDR的兩個、三個、四個、五個、六個或多個對應(yīng)于單一來源的本發(fā)明的抗體(或scFv或Fab片段)。編碼這些融合蛋白的核酸分子也包含于本發(fā)明中。才艮道于文獻中的示例性融合蛋白包括以下的融合體T細胞受體(Gascoigne等，尸亂淑/.爿c"d5W.t/5L4狄2936國2940(1987));CD4(Capon等，7Va/ww337:525-531(1989);Traunecker等，A^^/"339:68-70(1989);Zettmeissl等，DA^Ce〃5zo/.t/SJ9:347-353(1990);禾口Byrn等，A^^mm344:667-670(1990));L-選才奪蛋白(歸巢受體)(Watson等，《/Ce〃.5/。/."0:2221-2229(1990);和Watson等，Atowe349:164-167(1991));CD44(Aruffo等，Ce〃67:1303-1313(1990));CD28禾口B7(Linsley等，五x;Med773:721-730(1991));CTLA畫4(Lisley等，J五xp.A/et/.774:561-569(1991));CD22(Stamenkovic等，Ce〃66:1133-1144(1991));TNF受體(Ashkenazi等，iV""10535-10539(1991);Lesslauer等，五wk乂/mwwwo/.27:2883-2886(1991);禾口Peppel等，乂￡x/.Med774:1483-1489(1991));和IgE受體a(Ridgway和Gorman,JCe〃.說W.摘要第1448頁(1991))。如在本文其他地方討論，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物可與異源多肽融合以便增加多肽的體內(nèi)半衰期或用于使用本領(lǐng)域已知方法的免疫測定中。例如，在一個實施方案中，PEG可與本發(fā)明的抗體4厄合以Y更增加抗體在體內(nèi)的半衰期。Leong，S.R.等，C,h"eM:106(2001);y4"v.Z>wg"e/Zv.細.54:531(2002);或Weir等,>Sbc.rraw5YcWo"s30:512(2002)。此外，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物可與諸如肽的標(biāo)志序列融合以便有助于抗體的純化或檢測。在優(yōu)選的實施方案中，標(biāo)志氨基酸序列是六聯(lián)-組氨酸肽，諸如pQE載體(QIAGEN，Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth，Calif,91311)禾口其4也載體中提供的標(biāo)簽，這些載體的許多可商業(yè)獲得。如Gentz等，尸rac.A^/.Jem/.t/X456:821-824(1989)所述，例如，六聯(lián)-組氨酸4是供了融合蛋白的方便的純化。用于純化的其他肽標(biāo)簽包括但不限于對應(yīng)于來自流感血凝素蛋白的表位的"HA"標(biāo)簽(Wilson等，Ce〃37:767(1984))和"flag"標(biāo)簽。融合蛋白可使用本領(lǐng)域公知的方法來制備(參見例如美國專利第5,116,964和5,225,538號)。融合體產(chǎn)生的精確位點可通過經(jīng)-瞼選擇以便優(yōu)化融合蛋白的分泌或結(jié)合特征。然后編碼融合蛋白的DNA4爭染到宿主細l包中以<更表達。本發(fā)明的抗體可以非軛合形式使用，或者可與多種分子的至少一種軛合例如以便改善分子的治療特性、有助于把的4企測、或用于患者的成像或治療。本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或書亍生物可以在純化之前或之后、以及當(dāng)純化進4亍時一皮標(biāo)記或?qū)６蚝稀Ｌ貏e地，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物可與治療劑、前體藥物、肽、蛋白、酶、病毒、脂類、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物、藥劑或PEG專厄合。包括常規(guī)抗體的免疫毒素軛合物已在本領(lǐng)域廣泛描述。毒素可通過常^L偶if關(guān)4支術(shù)與抗體偶耳關(guān)，或者含有蛋白毒素部分的免疫毒素可作為融合蛋白產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體可以對應(yīng)的方式用來獲4尋此類免疫毒素。ot匕類免疫毒素的例i正是由Byers，SeminarsCell.Biol.2(1991),59-70禾口Fanger,Immunol.Today12(1991)，51-544^述的刃卩些。上述融合蛋白可進一步包含可切割的接頭或蛋白水解酶的切割位點。這些間隔部分本身可以是不可溶或可溶的(Diener等，Science231(1986),148),并且可^皮選4奪以允許藥物在草巴位點/人抗原釋放?？膳c本發(fā)明的抗體和抗原偶4關(guān)用于免疫治療的治療劑的實例為藥物、》丈射性同位素、凝集素和毒素?？膳c本發(fā)明的抗體和抗原軛合的藥物包括經(jīng)典地稱為諸如絲裂霉素C、柔紅霉素和長春花堿的藥物的化合物。在使用放射性同位素輒合的本發(fā)明的抗體或抗原用于例如免疫治療時，取決于諸如白細胞分布以及穩(wěn)定性和發(fā)射的因素，某些同位素可能比其他同位素更優(yōu)選。取決于自身免疫應(yīng)答，一些發(fā)射體可能比其他發(fā)射體更優(yōu)選。一4殳而言，發(fā)射》文射性同位素的a和p粒子在免疫治療中是優(yōu)選的。優(yōu)選的是短程、高能發(fā)射體，諸如^Bi。可與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合用于治療目的的放射性同位素的實例包括但不限于125I、131I、90Y、67Cu、64Cu、212Bi、212At、211Pb、47Sc、1Q9Pd和188Re?？膳c本發(fā)明的結(jié)合分子(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)偶聯(lián)的其他治療劑，以及離體和體內(nèi)治療方案是已知的，或者可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。在適當(dāng)?shù)那闆r中，本領(lǐng)i或:技術(shù)人員可4吏用編碼上述抗體、抗原或?qū)?yīng)載體的任一種的本發(fā)明的多核苷酸來代替蛋白材料本身。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，取決于選擇的待軛合的物質(zhì)，軛合物也可^f吏用多種^支術(shù)^皮裝配。例如，具有生物素的輒合物例如通過結(jié)合多肽與諸如生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯的生物素的活化酯反應(yīng)來制備。相似地，具有焚光標(biāo)志的軛合物可在例如本文所列的偶聯(lián)劑存在時制備，或者通過與異辟u氰酸鹽(優(yōu)選地?zé)晒馑?異-克氰酸鹽)反應(yīng)來制備。本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物的軛合物可用相似的方式來制備。本發(fā)明進一步包括與診斷或治療劑軛合的本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物。抗體可診斷地使用以便例如，監(jiān)測神經(jīng)疾患的發(fā)展或進展，作為例如確定特定治療和/或預(yù)防方法的療效的臨床測試程序的一部分。通過將抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物與可4企測物質(zhì)偶聯(lián)可有助于4企測?？沙馊珳y物質(zhì)的實例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、使用各種正電子成像術(shù)的正電子發(fā)射金屬和非放射性順磁金屬離子。可與抗體軛合用作根據(jù)本發(fā)明的診斷劑的金屬離子參^，辨如，美國專利第4,741,900號。適合的酶的實例包括f束才艮過氧化物酶、石咸性石粦酸酶、卩-半乳4唐香酶、或乙酰月旦石咸酯酶；適合的輔基復(fù)合體的實例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適合的熒光材料的實例包括傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸鹽、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹石黃酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；適合的放射性材料的實例包括125I、131I、mIn或"Tc?？贵w、或其抗原結(jié)合片,殳、變體、或衍生物也可通過將其與化學(xué)發(fā)光化合物偶聯(lián)而4皮可4企測地標(biāo)記。然后通過4全測在化學(xué)反應(yīng)期化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實例是魯米諾、異魯米諾、theromatic吖啶酉旨(theromaticacridiniumester)、口米峻、。丫口定鹽禾口草酉臾酉旨。抗體、或其抗原結(jié)合片^殳、變體、或衍生物可被可一企測標(biāo)記的方式之一是通過將其與酶相連，并在酶免疫測定(EIA)中使用連接產(chǎn)物(Voller,A.,"TheEnzymeLinkedImmunosorbentAssay(ELISA)(酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA))"樣i生物學(xué)會季刊，Walkersville,Md.,D/ag應(yīng)"c//腦'z畫2:1-7(1978));Voller等，C//".尸(^/zo/.37:507-520(1978);Butler，J.E.,MeA.五"zymo/.73:482-523(1981);Maggio,E,(纟扁l辱)，五"27/we/附wimoowqy產(chǎn)《y;C,，CRCPress,BocaRaton,FIa.,(1980);Ishikawa,E.等(編輯)，EVizywe7mmwwoos^a_y^/^^瘦^V定^,KgakuShoin，Tokyo(1981)。與抗體結(jié)合的酶將與適當(dāng)?shù)牡孜?優(yōu)選地生色底物)以產(chǎn)生可例如反應(yīng)。可用來可4企測地標(biāo)記抗體的酶包括^旦不限于蘋果酸脫氫酶、葡萄3求菌核酸酶、S-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氯酶、a-甘油石粦酉臾脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、p-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽石咸酯酶。另外，檢測可通過采用酶的生色底物的比色方法來實現(xiàn)。4企測也可通過一見覺比較底物與相似制備的標(biāo)準(zhǔn)物的酶反應(yīng)程度來實現(xiàn)。-險測也可使用多種其他免疫測定的任一種來實現(xiàn)。例如，通過》文射性標(biāo)記抗體、或其抗原結(jié)合片l殳、變體、或書亍生物，可能通過4吏用i文射免疫測定(RIA)來才企測抗體(^jS，例如，Weintraub，B.，定戎^的#七^乂#評謬癥，內(nèi)分泌學(xué)會，(1986年3月))，其通過引用并入本文)。放射性同位素可通過包括但不限于y計數(shù)、閃爍計數(shù)或》文射自顯影的手段來4企測。抗體、或其抗原結(jié)合片,殳、變體、或衍生物也可使用熒光發(fā)射金屬(諸如152Eu或鑭系其他金屬)而,皮可4企測地標(biāo)記。這些金屬可4吏用諸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金屬螯合基團與抗體相連。用于將各部分與抗體、或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物軛合的4支術(shù)是7>#口的，^^j^，Arnon等，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargettingOfDrugsInCancerTherapy(用于在癌癥治療中藥4勿的免疫輩巴向的單克隆#元體)"，MonaclonalAntibodiesAndCancerTherapy(單克隆抗體和癌癥治療)，Reisfeld等(編輯)，第243-56頁(AlanR.Liss,Inc.(1985);Hellstrom等，"AntibodiesForDrugDelivery(用于藥4勿遞送的^t體)"，ControlledDrugDelivery(對照藥物遞送)(第二X反)，Robinson等，(編輯)，MarcelDekker,Inc.,第623-53頁(1987);Thorpe,"AntibodiesCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview(癌癥治療中纟田月包毒寸生劑的4元體載體綜述)",A/owoc/o"a/JwZ/ZjoWes1爿w^/C7/w/c"/f單乂發(fā)拔謬'S4:^:教^^侈^t^^入Pinchera等(編輯)，第475-506頁(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy(在癌癥治療中放射標(biāo)記抗體的治療應(yīng)用的分析、結(jié)果和未來的展望)癥yivj^^浴^f^卓^i謦戎謬人Baldwin等(編輯)，AcademicPress第303-16頁(1985)和Thorpe等，"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates(4元體國毒素扼合凈勿的傳'J備禾口細胞毒性特性)"，/wmw"o/.iev.62:119-58(1982)。在某些實施方案中，增強例如結(jié)合多肽(例如抗體或其免疫特異性片段)的結(jié)合分子的穩(wěn)定性或療效的部分可被軛合。例如，在在體內(nèi)的半衰期。Leong,S.R.等，Q^>yb>7e76:106(2001);Jt/v./"Z)rwgZ)e//v.iev.54:531(2002);或Weir等，S/0c/7em.5bc.7hms^c"'om130:512(2002)。VII.〗吏用的《且合物禾口方法此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的例如抗體或其抗原結(jié)合片段的前述結(jié)合分子或其化學(xué)衍生物、或本發(fā)明的多核苦酸、載體或細胞的組合物。本發(fā)明的組合物可進一步包含藥學(xué)可接受的載體。術(shù)語"化學(xué)衍生物"描述含有正常不是基礎(chǔ)分子一部分的其他化學(xué)部分的分子。這些部分可改善基礎(chǔ)分子的可溶性、半衰期、吸收等。可選地，這些部分可減弱基礎(chǔ)分子的不希望的副作用或降低基礎(chǔ)分子的毒性。此外，取決于藥物組合物的預(yù)期用途，本發(fā)明的藥物組合物可包含諸如白介素或干擾素的其他物質(zhì)。例如，用于治療阿爾茨海默病的其他物質(zhì)可選自由小有機分子、抗-A卩抗體及其組合組成的組。因此，在特定的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的例如抗體或其抗原結(jié)合片,殳的結(jié)合分子、或與其4壬一個具有基本相同的結(jié)合特異性的結(jié)合分子、本發(fā)明的多核苷酸、載體或細力包制備用于以下的藥物組合物或診斷組合物的用途用于治療或預(yù)防阿爾茨海默病的進展；用于改善與阿爾茨海默病相關(guān)的癥狀；用于i貪斷或篩選對象中阿爾茨海默病的存在、或用于確定對象發(fā)展阿爾茨海默病的危險。所述藥物組合物可設(shè)計為靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸胃外或作為氣霧劑施用；也參見下文。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中蛋白的異常積累和/或沉積的神經(jīng)疾病的方法，該方法包括將治療有效量的前述本發(fā)明的結(jié)合分子、抗體、抗原、多核苷酸、載體或細胞的任一種施用于有相應(yīng)需要的對象。術(shù)語"神經(jīng)疾病"包括但不限于阿爾茨海默病、輕度認知損害、額顳葉癡呆、Lewy小體病、帕金森病、皮克病、賓斯萬格病；嗜剛果紅淀粉樣蛋白血管病、腦淀粉樣蛋白血管病、唐氏綜合征、多發(fā)性梗死性癡呆、亨廷頓病、克雅病、AIDS癡呆復(fù)合4正、抑郁、焦慮性障石f、恐懼癥、貝耳麻痹、癲癇、腦炎、多發(fā)性石更化；神經(jīng)月幾肉疾病、神經(jīng)腫瘤疾病、腦腫瘤、包括中風(fēng)的神經(jīng)血管疾病、神經(jīng)免疫疾病、神經(jīng)耳科病、包括脊髓損傷的神經(jīng)外傷、包括神經(jīng)病理性疼痛的疼痛、小兒神經(jīng)病和神經(jīng)精神病、睡眠障礙、圖雷特綜合征、輕度i人知損害、血管性癡呆、多發(fā)性才更死性癡呆、嚢性纖維4b、高雪病、其4也運動障石尋和一般的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)病。除非另外指明，術(shù)語神經(jīng)退行性、神經(jīng)、或神經(jīng)精神在本文可互換使用。在本發(fā)明中，公開的方法用于鑒定許多疾患的人抗體，并且也用來隨后產(chǎn)生所述抗體以1更在其免疫系統(tǒng)不與疾患病理發(fā)展的對應(yīng)免疫應(yīng)答反應(yīng)的患者中診斷地、治療地或預(yù)防地應(yīng)用這些抗體。特別地，這種情況將預(yù)期發(fā)生在高齡出現(xiàn)的疾病中，因為已知免疫系統(tǒng)的反應(yīng)性連續(xù)并顯著地隨年齡的增加而下降。在這些情況中，方面4卜償年齡相關(guān)的免疫系統(tǒng)的限制，并且因此可能有助于高齡時更好的健康狀態(tài)。因此，本發(fā)明的醫(yī)學(xué)應(yīng)用特別適用于例如年齡在60、65、70、75、80或更大的上述患者纟且，并且主要4十乂于本身以比如例如內(nèi)切蛋白酶解、構(gòu)象改變、翻i奪后》多飾的改變、體細月包突變或其組合的任一類錯亂(derailment)的形式表現(xiàn)、并且表型上通過發(fā)展內(nèi)源蛋白的病理生理變體而表現(xiàn)的所有疾患。在本發(fā)明中，病理生理變體^皮i人為是含有偏離生理的病理新表位的變體，參見上文。特別地，治療性應(yīng)用包括腫瘤病、炎性病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病，比如阿爾茨海默病、帕金森病、皮克病、具有Lewy小體的癡呆，包4舌克雅病的朊病毒病、進4亍性核上性麻痹、多系統(tǒng)萎縮、皮層基底節(jié)變性、具有與17號染色體亨廷頓病類似的帕金森癥的額顳葉變性、額顳葉癡呆、腦淀粉樣蛋白血管病、輕度認知損害、唐氏綜合征、具有荷蘭型和冰島型淀粉樣變性的遺傳性腦出血、脊髓小腦共濟失調(diào)和力幾萎縮性側(cè)索石更化癥，以及青光眼、包涵體"幾炎、家力矣性淀并分樣蛋白多神經(jīng)病和包括來自下述前體蛋白的至少一種的原纖維蛋白的淀粉樣蛋白病SAA(血清-淀粉樣-蛋白A)、AL(免疫球蛋白的k或1-輕鏈)、AH(glIg-重鏈)、ATTR(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白，血清-前清蛋白)、AApo-A-l(脫輔基脂蛋白Al)、AApoA2(脫輔基脂蛋白A2)、AGel(凝溶膠蛋白)、ACys(半胱氨酸蛋白酶抑制劑C)、ALys(溶菌酶)、AFib(纖維蛋白原)、P-淀粉樣蛋白(淀粉樣蛋白前體蛋白)、P-淀粉樣蛋白2M(卩24敬5求蛋白)、APrP(朊病毒蛋白)、ACal(降鈣素原)、AIAPP(胰島淀粉樣蛋白多肽)；APro(促乳素)、AIns(胰島素)；AMed(乳粘著蛋白)；Aker(角月莫上皮素)；ALac(乳纟失蛋白)、Abri(AbriPP)、ADan(ADanPP);或AANP(心房鈉尿肽)，(Skovronsky等，Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.2006;1:151-70;Buxbaum,CurrOpinRheumatol2003;16:67-75。本發(fā)明的治療方法的特定優(yōu)勢在于以下事實來自健康潛伏期的或臨床上異常穩(wěn)定生物的B細胞或B記憶細胞的抗體能以一定的概率預(yù)防臨床上表現(xiàn)的疾患、或者能以一定的概率降低臨床上表現(xiàn)的疾患發(fā)病的危險、或者能以一定的概率推遲臨床上表現(xiàn)的疾患的發(fā)病時間。此類抗體一般也已成功經(jīng)受了體細i包成熟，即通過抗體可變區(qū)的體細月包改變優(yōu)化以高親和力結(jié)合耙分子的選擇性和有效性。在自身免疫或變態(tài)反應(yīng)中，此類細胞在體內(nèi)(例如，在人中)沒有通過相關(guān)或其他生理蛋白或細胞結(jié)構(gòu)而#皮活化的知識在醫(yī)學(xué)上也是非常重要的，因為這意味著顯著增加了成功度過臨床測試階段的可能性?？梢哉f，在至少一個人類對象中預(yù)防性或治療性抗體的潛伏期發(fā)展之前，已證明了其效率、可接受性和耐受性。因此可以預(yù)期，使用根據(jù)本發(fā)明的程序，抗體作為治療劑的靶結(jié)構(gòu)特異性效率和其降低的副作用的概率顯著增加了抗體臨床成功的可能性。從前文明顯看出，本發(fā)明包括包含上述抗體的至少一個CDR的疾患特異性結(jié)合分子的任何應(yīng)用，特別用于診斷和/或治療分別與阿爾茨海默病和AP沉積相關(guān)的疾病。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子是本發(fā)明的抗體或其免疫球蛋白鏈。另夕卜，本發(fā)明涉及前文所述提到的抗體的任一種的抗獨特型抗體。這些抗體是與位于抗原結(jié)合位點附在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含上述本發(fā)明的結(jié)合分子、抗體、抗原結(jié)合片革殳、多核苷酸、載體或細胞的任一種的診斷組合物和任選地適當(dāng)?shù)臋z測手段，諸如常規(guī)用在基于免疫或核酸的診斷方法中的試劑。本發(fā)明的抗體例如適合用于其中抗體能以液相使用或與固相載體結(jié)合的免疫測定中。能使用本發(fā)明的抗體的免疫測定的實例是以直接或間接形式的竟?fàn)幮院头蔷範(fàn)幮悦庖邷y定。此類免疫測定的實例是》文射免疫測定(RIA)、三明治(免疫測定分才斤)、流式細胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡。本發(fā)明的抗原和抗體可與許多不同的載體結(jié)合，并且用來分離與其特異結(jié)合的細胞。公知的載體的實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚A友酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈淀粉、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁體。為了本發(fā)明的目的，載體的性質(zhì)可以是可溶的或不可溶的。有"i午多不同的標(biāo)記和標(biāo)記方法是本4頁域普通沖支術(shù)人員已知的?？捎糜诒景l(fā)明的標(biāo)記類型的實例包括酶、放射性同位素、膠體金屬、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物；也參見上文討^r的實施方案。101在進一步的實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子，特別是抗體也可用于通過乂人測試個體中獲得體液才羊品、并且在允i午抗體-抗原復(fù)合體形成的條件下^f吏體液樣品與本發(fā)明的抗體接觸來診斷個體疾病的方法，所述體液才羊品可以是血才羊、'淋巴才羊品、或4壬<可其4也體液才羊品。然后通過本領(lǐng)域已知的方法來確定此類復(fù)合體的水平，顯著高于在對照樣品中形成的復(fù)合體的水平表明測試個體中疾患的存在。以同樣的方式，也可使用本發(fā)明的抗體結(jié)合的特定抗原。因此，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的例如抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合分子的體外免疫測定。在此上下文中，本發(fā)明還涉及特別為此目的設(shè)計的手段。例如，可使用基于蛋白或抗體的陣列，該陣列例如負載有來自上述疾病相關(guān)蛋白并含有新表位的抗原，以便檢測可能存在于患有例如神經(jīng)疾病特別是阿爾茨海默病的患者中的自身抗體，或者該陣列負載有特異識別上述蛋白的任一種的本發(fā)明的抗體或等效的抗原結(jié)合分子。侈'B口，Hueber等，ArthritisRheum.52(2005)，2645-2655凈艮道了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中自身抗體的抗原微陣列特征。微陣列免疫測定的設(shè)計概述于Kusnezow等，Mol.CellProteomics5(2006),1681-1696。相陣列。本發(fā)明還分別提供了包含裝有上述成分(例如本發(fā)明的結(jié)合分子、抗體或其結(jié)合片段、抗原、多核苷酸、載體或細胞)的一種或多種的一個或多個容器的藥物和診斷包或試劑盒。此類容器附帶管理藥品或生物產(chǎn)品的制造、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定形式的通告，該通告反映了機構(gòu)批準(zhǔn)用于人類施用的制造、使用或銷售。另外或可選地，該試劑盒包含用在適當(dāng)診斷測定中的試劑和/或說明書。當(dāng)然本發(fā)明的組合物(例如試劑盒)特別適合用于診斷、預(yù)防和治療伴隨著如上文定義的疾病相關(guān)蛋白的存在的疾病，特別是淀粉樣變性，并且特別適用于治療阿爾茨海默病(AD)。術(shù)i吾"治療(treatment)"、"治療(treating)"禾口類4以術(shù)i吾在本文一般用來意指獲得需要的藥理和/或生理作用。該作用可以是就完全或部分預(yù)防疾患或其癥狀來說預(yù)防性的，和/或可以是就部分或完全治愈疾患和/或由疾患引起的副作用來說治療性的。術(shù)語"治療"(a)予貞防易患疾患Y旦仍未it斷患有該疾患的只于象中疾患的發(fā)??；(b)抑制疾患，例如阻止疾患的發(fā)展；或(c)纟爰解疾患，例如〗吏疾患減輕。此外，術(shù)語"對象"或"患者"指需要治療病況、疾病或疾患的哺乳動物，優(yōu)選地人。本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法來配制；參見例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明頓藥學(xué)-牛學(xué)與實踐)(2000),費J成-牛學(xué)大學(xué)(UniversityofSciencesinPhiladelphia)，ISBN0-683-306472。適合的藥物載體的實例是本領(lǐng)域公知的，包括磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、諸如油/水乳狀液的乳狀液、各種類型的潤濕劑、無菌溶液等。包含此類載體的組合物可通過公知的常規(guī)方法來配制。這些藥物組合物可以適合的劑量施用于對象。適合的組合物的施用可通過不同的方式來實現(xiàn)，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部或皮內(nèi)施用。諸如鼻噴霧制劑的氣霧劑制劑包括具有防腐劑和等滲劑的活性劑的純化水溶液或其他溶液。此類制劑優(yōu)選地調(diào)整至與鼻粘膜相容的pH和等滲狀態(tài)。用于直腸或陰道施用的制劑可作為具有適合載體的栓劑存在。此外，雖然本發(fā)明包4舌在頭骨鉆一個小孔來施用本發(fā)明藥物的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)(盡管幸運地不常見)程序，^f旦在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的結(jié)合分子，特別是抗體或基于抗體的藥物可穿越血腦屏障，這允許l爭月永內(nèi)或口月良施用。劑量方案將由主治醫(yī)生和臨床因素決定。如醫(yī)學(xué)4貞3或所/>知，任何一個患者的劑量耳又決于許多因素，包括患者的體積、體表面積、年齡、施用的特定化合物、性別、施用時間和途徑、一般健康和同時施用的其他藥物。一般的劑量可以是例如，在0.001pg至1000嗎的范圍內(nèi)(或在此范圍內(nèi)用于表達或用于抑制表達的核酸)；然而特別考慮到上文提到的因素，可考慮低于或高于此示例范圍的劑量。劑量的范圍一般例如乂人約0.0001mg/kg至100mg/kg和更通常地0.01mg/kg至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主體重。例如劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg的范圍內(nèi)，優(yōu)選i也至少1mg/kg。在上述范圍內(nèi)的中間劑量也預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。對象可每日、每兩日(alternativedays)、每周或才艮據(jù)經(jīng)-險分析確定的任何其他時間表來施用這些劑量。示例性治療需要以多劑量在例如至少六個月的延長時段內(nèi)施用。其他示例性治療方案需要每兩周施用一次或每個月施用一次或每3至6個月施用一次。示例性劑量時間表包4舌連續(xù)每天1-10mg/kg或15mg/kg、每兩天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同時施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體，其中每種抗體的施用劑量落入指示的范圍內(nèi)。通過定期評價監(jiān)測進展。用于腸胃外施用的制品包括無菌水溶液或非水溶液、懸浮液和乳狀液。非水溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油的才直物油和諸如油酸乙酯的可注射有機酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳狀液或懸浮液，包括鹽水和緩沖々某介。腸胃外介質(zhì)包括氯化鈉溶液、林才各葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化鈉溶液、乳酸林才各溶液或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)介質(zhì)包括流體和營養(yǎng)補充劑、電104解質(zhì)補充劑(諸如基于林格葡萄糖溶液的那些)和類似介質(zhì)。防腐劑和其他添加劑也可存在，i者如，例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體及類似添加劑。此外，取決于藥物組合物的預(yù)期用途，本發(fā)明的藥物組合物可包含諸如多巴胺或精神藥理藥物的其他物質(zhì)。此外，藥物組合物也可配制為疫苗，例如，如果本發(fā)明的藥物組合物包含用于一皮動免疫的抗Af3抗體。另夕卜，可能需要共同施用或順序施用其他物質(zhì)。治療有效劑量或量指足以改善癥狀或病況的活性成分的量。此類化合物的治療性療步丈和毒'性可在細月包i咅養(yǎng)物或?qū)崱€動物中通過標(biāo)準(zhǔn)藥理禾呈序確定，例如，ED5()(在群體的50%中治療有效的劑量)和LD5o(對群體的50%為致死的劑量)。治療性作用和毒性作用的劑量比率是治療指數(shù)，其可表示為LD5Q/ED5Q的比率。優(yōu)選地，組合物中的治療劑以足以在阿爾茨海默病情況中恢復(fù)正常行為和/或認知特性的量存在。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可優(yōu)選地用于治療神經(jīng)疾病，包括但不限于阿爾茨海默病、帕金森病、皮克病、具有Lewy小體的癡呆，朊病毒病(包4舌克3,病)、進4亍性核上性麻痹、多系統(tǒng)萎縮、皮層基底節(jié)變性、具有與17號染色體亨廷頓病類似的帕金森癥的額顳葉變性、額顳葉癡呆、腦淀沖分才羊蛋白血管病、輕度i人知損害、唐氏綜合征、具有荷蘭型和冰島型淀粉樣變性的遺傳性腦出血、脊髓小腦共濟失調(diào)、肌萎縮性側(cè)索石更化癥、貝耳麻痹、癲癇、腦炎、神經(jīng)月幾肉疾病、青光眼、包涵體肌炎、家族性淀粉樣蛋白多神經(jīng)病、包含來自下述前體蛋白的至少一種的原纖維蛋白的淀粉樣蛋白病SAA(血清-淀4分樣-蛋白A)、AL(免疫^求蛋白的k或1-輕鏈)、AH(glIg-重鏈)、ATTR(轉(zhuǎn)曱狀腺素蛋白，血清-前清蛋白)、AApo-A-l(脫輔基脂蛋白Al)、AApoA2(脫輔基脂蛋白A2)、AGel(凝溶膠蛋白)、ACys(半胱氨酸蛋白酶抑制劑C)、ALys(溶菌酶)、AFib(纖維蛋白原)、p-淀粉樣蛋白(淀粉樣蛋白前體蛋白)、P-淀粉樣蛋白2M((32-微球蛋白)、APrP(朊病毒蛋白)、ACal(降鈣素原)、AIAPP(胰島淀粉樣蛋白多肽)；APro(促乳素)、AIns(胰島素)；AMed(乳粘著蛋白)；Aker(角膜上皮素)；ALac(乳鐵蛋白)、Abri(AbriPP)、ADan(ADanPP);或AANP(心房鈉尿月太)(Skovronsky等，Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.2006;1:151-70;Buxbaum,CurrOpinRheumatol2003;16:67-75,神經(jīng)肺瘤、神經(jīng)免疫、神經(jīng)耳科疼痛、小兒神經(jīng)病、恐懼癥、情感障礙、睡眠障礙、圖雷特綜合征、其他運動障礙和一般的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)病。這些和其他實施方案公開并包含于本發(fā)明的說明書和實施例中。涉及根據(jù)本發(fā)明采用的材料、方法、用途和化合物的任一種的其他文獻資津?？?吏用例如電子設(shè)備/人7>共圖書館和凄t據(jù)庫才企索。例3口可4吏用由美國國立衛(wèi)生研究院的國家生物才支術(shù)4言息中心和/或國家醫(yī)學(xué)圖書館主持的公共數(shù)據(jù)庫"Medline"。諸如作為歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL)的一部分的歐洲生物信息研究所(EBI)的數(shù)據(jù)庫的其他數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)址是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且也可4吏用因特網(wǎng)搜索引擎獲得。生物技術(shù)的專利信息概述和用于追溯檢索和近期文獻通才艮的專利信息相關(guān)來源的縱覽在Berks,TIBTECH12(1994)，352-364中給出。上文公開內(nèi)容一般性地描述了本發(fā)明。除非另外指明，本文所用的術(shù)語被賦予OxfordDictionaryofBiochemistryandMolecularBiology(牛津生物4匕學(xué)與分子生物學(xué)字典)，OxfordUniversityPress,1997,2000年改版，2003年再版，ISBN0198506732中提供的定義。整個本說明書的正文引用了一些文獻。完整的引用目錄可發(fā)現(xiàn)于說明書的末尾，其后緊接權(quán)利要求。所有引用的參考文獻(包括整個本說明書引用的文獻參考、發(fā)布的專利、公布的專利申請和制造商的說明書、使用說明等)的內(nèi)容清楚地通過引用并入本文；然而沒有承認引用的任何文獻資料確實是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。通過參考下述具體實施例可獲得更完全的理解，所述實施例在本文僅為了例證的目的而提供，并且不預(yù)期限制本發(fā)明的范圍。實施例下面的實施例進一步例〗正了本發(fā)明，^旦不應(yīng)解釋為以4壬4可方式限制本發(fā)明的范圍。-清如在本文采用的常失見方法的詳述可發(fā)現(xiàn)于引用的文獻中；也參見"TheMerckManualofDiagnosisandTherapy(默克i貪療手冊)"第17片反，Beers和Berkow編輯(Merck&Co.,Inc.2003)。除非另外指示，本發(fā)明的實踐將采用在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的細胞生物學(xué)、細胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、孩i生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。有關(guān)用在本發(fā)明實踐中的一般技術(shù)的進一步詳述，專業(yè)人員可參考細胞生物學(xué)和組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)教本和綜述；也參見實施例中引用的參考文獻。分子和細胞生物化學(xué)的一4殳方法可發(fā)現(xiàn)于諸如以下的標(biāo)準(zhǔn)教本中MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實-驗指南)，第3X反(Sambrook等，HarborLaboratoryPress2001);ShortProtocolsinMolecularBiology(精編分子生物學(xué)實-險技術(shù))，第4版(Ausubel等編輯，JohnWiley&Sons1999);DNACloning(DNA克隆)，第I和II巻(Glover編4辱，1985);OligonucleotideSynthesis(寡4亥香酉吏合成)(Gait編輯，1984);NucleicAcidHybridization(核酸雜交)(Hames和Higgins纟扁l尋，1984);TranscriptionAndTranslation(4爭錄和翁3i奪)(Hames,口Higgins纟扁4專，1984);CultureOfAnimalCells(動4勿纟田月包的i咅養(yǎng))(Freshney和Alan,Liss,Inc.,1987);GeneTransferVectorsforMammalianCells(哺乳動物細月包的基因4爭移載體)(Miller和Calos,編輯)；CurrentProtocolsinMolecularBiologyandShortProtocolsinMolecularBiology(最新分子生物學(xué)實-3全才支術(shù)和4青編分子生物學(xué)實—瞼4支術(shù))，第3片反(Ausubel等，編輯)；和RecombinantDNAMethodology(重組DNA方法)(Wu,編輯，AcademicPress)。GeneTransferVectorsForMammalianCells(p甫享'L動4勿纟田月包的基因壽爭牙多載體)(Miller和Calos,編輯，1987,ColdSpringHarborLaboratory);MethodsInEnzymology(酶學(xué)方法)，第154和155巻(Wu等，編4專)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(固定4匕纟田月包禾口酶)(IRLPress,1986);Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(分子克隆實踐指南)(1984);專著，MethodsInEnzymology(酶學(xué)方法)(AcademicPress,Inc.,N.Y.);ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(細月包和分子生物學(xué)中的免疫4匕學(xué)方法)(Mayer和Walker,編輯，AcademicPress,London,1987);HandbookOfExperimentalImmunology(實馬全免疫學(xué)手冊)，I-IV巻(Weir和Blackwell編4尋，1986)。ProteinMethods(蛋白質(zhì)方法)(Bollag等，JohnWiley&Sons1996);Non-viralVectorsforGeneTherapy(用于基因治療的非病毒載體)(Wagner等編輯，AcademicPress1999);ViralVectors(病毒載體)(Kaplitt&Loewy編輯,AcademicPress1995);ImmunologyMethodsManual(免疫學(xué)方法手冊)(Lefkovits編輯，AcademicPress1997);和CellandTissueCulture:LaboratoryProceduresinBiotechnology(細月包,口纟且織i咅養(yǎng)生物才支術(shù)的實馬全禾呈序)(Doyle&Griffiths,JohnWiley&Sons1998)。本乂>開內(nèi)容中一是到的用于遺傳操作的試劑、克隆載體和試劑盒可^人諸如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich禾口ClonTech的商業(yè)供應(yīng)商獲;彈。細i包i咅養(yǎng)和i咅養(yǎng)基4欠集的一舶j支術(shù)和克述于LargeScaleMammalianCellCulture(大規(guī)^莫哺乳動物細i包;咅養(yǎng))(Hu等，Curr,Opin.Biotechnol.8(1997),148);Serum-freeMedia(不含血;青的i咅養(yǎng)基)(Kitano,Biotechnology17(1991),73);LargeScaleMammalianCellCulture(大規(guī)^莫哺乳動物細月包i告養(yǎng))(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991),375);和SuspensionCultureofMammalianCells108(p甫享L動物細月包的懸浮i咅養(yǎng))(Birch等，BioprocessTechnol.19(1990),251);ExtractinginformationfromcDNAarrays(從cDNA陣列捅:耳又信息)，Herzel等，CHAOS11(2001),98-107。以下實-驗是關(guān)于抗體NI-101.11的例i正和描述。然而，NI101系列的其他抗體、特別是NI101.10在結(jié)構(gòu)上相似，因此可預(yù)期4是供相似的結(jié)果。補充方法i己憶B細月包展示特征為異常陽性的臨床進程(例如，在危險因素存在時缺少疾患的臨床體征)、或無疾病發(fā)展的輕度或前驅(qū)體征的穩(wěn)定進程的臨床上小心選擇的人類對象或長期無進展者被征集來提供外周血淋巴細胞作為起始材料用于分離記憶B細胞。策略是基于傳染免疫學(xué)中確立的概念對象的記憶B細胞庫保持抗體的特異性，并且可能也4呆持在先前抗原遭遇期間產(chǎn)生抗體的頻率(McHeyzer-Williams禾口Ahm編壽辱，Curr.Opin.Immunol.11(1999),172-179;Bernasconi等，Science298(2002),2199-202;Traggiai等，Nat.Med.10(2004),871-875)。開發(fā)這一概念來解釋針對傳染劑的適應(yīng)性免疫，以及用于描述在首次感染之后抗體介導(dǎo)的免疫。根據(jù)這一理論，記憶B細胞庫應(yīng)完全代表了針對在對象病史中天然地或接種疫苗后已誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的所有抗原的抗體的完整補體。才艮才居本發(fā)明，該理i侖適用于由于其他生理相關(guān)蛋白的#f求桌減V々,而產(chǎn)生的力源抗原，該抗原因此不經(jīng)受生理免疫耐受，并且因此可獲得抗原特性并^^秀導(dǎo)針對構(gòu)象新-4在f萄i表位y)的免疫應(yīng)答。記憶B細胞用包括全B細胞標(biāo)志CD22的表面標(biāo)志、結(jié)合表達IgM、IgD、IgE和IgA的未經(jīng)歷抗原的B細胞的陰性選擇來分離。4吏用該4支術(shù)，乂人30ml人血中可獲得大約10.000至150.000個記憶B細胞。這些B細胞例如用埃巴病毒永生化，并在照射的人成纖維細月包飼養(yǎng)層上寡克隆i也i咅養(yǎng)(Zubler等，JImmunol.134(1985)，3662-3668;Traggiai等，Nat.Med.10(2004),871-875)。為改善分泌抗體的記憶B細胞的轉(zhuǎn)化和永生化功效，可^f吏用^t擬細菌未曱基4b的CpG畫二才亥香酉臾的CpG2006(Hartmann禾口KriegJImmunol164(2)(2000),944-953)。處發(fā)才襲.'/人PBL主體選才奪B細月包是4吏用MACS才支術(shù)和CD22孩吏玉朱(Miltenyi,BergischGladbach,Germany)進4亍的。PBL用MACS#元人CD22、藻紅蛋白隱專厄合的抗人IgD和APC-專厄合抗體抗人IgM、IgA、CD3、CD8、CD56(BectonDickinson,Basel,Switzerland)標(biāo)記。CD22-陽性細月包4吏用LS柱和MidiMACS"i殳備(Miltenyi)分離，然后4吏用MoFlo細月包分選器(Dako，F(xiàn)ortCollins,USA)選才奪藻紅蛋白國和APC-陰性細胞。然后將CD22-陽性、IgM畫、IgD-、IgA-和IgE畫陰性的B細胞與含有獲自B95-8細胞的上清液的埃巴病毒和濃度為2.5mg/l的CpG2006(Sigma,Buchs,Switzerland)—起在B細月包i咅養(yǎng)基(4卜充有10%月臺牛血清的RPMI1640(Hyclone,Perbio，Lausanne，Switzerland)中孵育。將每孔5-50個細月包4妻種到含有B細月包i咅養(yǎng)基的Costar圓底96孑14反(Corning,Vitaris，Baar，Switzerland)中乂人志愿供體制備的30.000個照射的人PBL上。記憶B細胞培養(yǎng)物保持在37。C和5%C02的加濕細胞培養(yǎng)箱中2-4周，然后培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基在ELISA和其他組織陣列上測定?？贵w篩選沖艮據(jù)在組織切片上與包4舌蛋白聚集體和異常病理相關(guān)結(jié)構(gòu)的病理表位的結(jié)合來篩選條件培養(yǎng)基中的抗體，所述組織切片獲自具有病理上確認的診斷為包括但不限于阿爾茨海默病的人類患者，或者獲自人類疾患的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的組織切片，或者來自從包括年老的非人靈長類的人類疾患的動物模型獲得的組織切片，或者通過聚集的合成肽制品的ELISA獲得。在本發(fā)明中，異常病理結(jié)構(gòu)包括但不限于p-淀粉樣蛋白斑塊、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、Lewy小體中的a-突觸核蛋白聚集體和在營養(yǎng)不良性軸突中沉積的蛋白聚集體。人類組織也用來排除抗體與正常細胞或超細胞組織結(jié)構(gòu)的交叉反應(yīng)性。進一步分一斤選^奪的抗體的類別，并確定輕鏈亞類。選才奪的來自記憶B細胞培養(yǎng)物的病理相關(guān)抗體的信^使使用RT-PCR^皮轉(zhuǎn)錄、克隆并組合到表達載體中用于重組產(chǎn)生。使用微量滴定相容的組織微陣列來篩選B細胞條件培養(yǎng)基。石蠟-包埋的人死后阿爾茨海默病腦組織被切成直徑為1-2mm、長度為1Omm的桿。將4個桿垂直包埋到石蠟中以形成適合9x9mm的微量滴定形式的方塊。用切片機乂人該裝配體上切下5pm的組織薄片，并且將2個薄片彼此鄰近地封固于載玻片上，得到適合96-孔孩史量滴定形式的2x4桿的裝配體。可選地，來自APP轉(zhuǎn)基因小鼠的纟且織用來制備該纟且織陣列。來自記憶B細月包培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基4吏用多道移液器轉(zhuǎn)移到組織陣列載^L片上，并在室溫孵育2小時。洗滌步艱《之后，4吏用Cy3國專厄合的人IgG二4元(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.,Suffolk,UK)分析人抗體與組織切片的結(jié)合。萸光分析在倒置熒光顯微鏡(Leica,Heerbrugg,Switzerland)上進行。96孑L半面積微量培養(yǎng)才反(Corning)用于包尋皮緩沖液(15mMNa2C03、35mMNaHC03,pH9.42)中標(biāo)準(zhǔn)濃度為1(ig/ml的合成A卩-肽于4。C包被過夜。洗滌平板，并且非特異結(jié)合位點用含有2%BSA(Sigma,Buchs,Switzerland)的PBS于RT封閉1小時。B細胞條件培養(yǎng)基從記憶B細胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至ELISA板，并于室溫孵育2小時。使用辣根過氧化物酶(HRP)-軛合的驢抗人IgG多克隆抗體(JacksonImmunoResearchEuropeLtd.,Cambridgeshire,UK)來確定人抗體的結(jié)合，然后在標(biāo)準(zhǔn)的比色測定中測量HRP的活性。顯示感興趣的特異性的抗體的分子克隆使用細胞分選器收集選4奪的記憶B細胞培養(yǎng)物的活體B細胞。制備mRNA,并〗吏用所有人可變重鏈和輕《連構(gòu)架1(FR1)家族的Ig-構(gòu)架特異引物作為5'引物和特異于所有人J-H區(qū)段的引物作為3'引物的組合來獲得免疫球蛋白的重鏈和輕鏈序歹ij(Marks等，Mol.Biol.222(1991).，581-597)?？蛇x地，來自記憶B細月包i咅養(yǎng)物的單個分選細胞的單細胞RT-PCR可用作Ig重鏈和輕《連序列的來源(Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(1996),7843-7848;Brezi腦hek等，J.Immunol.155(1995)，190-202;Coronella等，NucleicAcidsResearch28(2000);Owens等，J.Immunol.171(2003),2725-2733)。單細胞分選保持了最初在B細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的抗體克隆的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的正確配對。具有需要的特異性的抗體克隆的鑒定是通過完整抗體重組表達后重新篩選孩吏量滴定相容的組織;微陣列和ELISA來才丸行的。完整IgGl抗體的重組表達是將可變重鏈和輕鏈序列"以正確的閱讀框架"插入與可變區(qū)序列互補的表達載體之后獲得的，所述表達載體具有位于5-引發(fā)末端的編碼信號肽的序列和位于3'-引發(fā)末端的編碼適當(dāng)?shù)暮愣ńY(jié)構(gòu)域的序列。為達到這一目的，引物含有被設(shè)計為有助于將可變重4連和輕鏈序列克隆到抗體表達載體中的限制酶切位點。通過將免疫球蛋白重鏈的RT-PCR產(chǎn)物按閱讀框架插入帶有信號肽和人免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈表達載體來表達重鏈免疫球蛋白。通過將k輕鏈的RT-PCR-產(chǎn)物按閱讀框架插入提供信號肽和人k輕鏈免疫^求蛋白恒定結(jié)構(gòu)i或1的輕4連表達載體來表達k輕鏈免疫球蛋白。可選地，通過將X輕鏈RT-PCR-產(chǎn)物按閱讀框架插入提供信號肽和人X輕鏈免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域1的X輕鏈表達載體來表達入輕《連免疫J求蛋白。將Ig-重鏈表達載體和k或XIg-輕鏈表達載體共轉(zhuǎn)染進HEK293細胞(或任何其他適當(dāng)?shù)氖荏w細胞系)后獲得功能性重組單克隆抗體。隨后使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白A柱純化來乂人條件培養(yǎng)基中純化重組人單克隆抗體。使用瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞可無限量地產(chǎn)生重組人單克隆抗體。產(chǎn)生重組人單克隆抗體的細胞系可通過直接使用Ig-表達載體或通過將Ig-可變區(qū)重新克隆到不同的表達載體中來建立。諸如F(ab)、F(ab)2和scFv的書f生物也可乂人這些Ig-可變區(qū)產(chǎn)生。通過選纟奪的記憶B細胞培養(yǎng)物的正向和側(cè)向光散射特性鑒定的活細l包4吏用MoFlo細i包分選器以100-2000個細胞的小份直4妄分選到裝有20|alRNAlater(Ambion,Huntingdon,UK)的0.2mlPCR管中。4吏用mRNA畫DirectMicroi式劑盒(Dynal,Invitrogen,Basel,Switzerland)制備mRNA。4吏用"RTforPCR"試劑盒(ClontechBectonDickinson,Basel,Switzerland)制備cDNA，免疫J求蛋白(Ig)重《連和輕鏈可變序列的PCR是^吏用Advantage2PCR試劑盒(Clontech)進行，使用所有人可變重鏈和輕鏈構(gòu)架1(FR1)家族的特異引物作為5'引物和特異于人Ig重鏈或IgK或IgX輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)i或的引物作為3'引物的組合。引物購自Microsynth(Balgach，Switzerland)。用于所有表達載體的信號肽來自描述于V-Base的人免疫球蛋白k輕《連家族1L5序列(MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC;SEQIDNO:2),并且設(shè)計為纟是供Xba1的限制酶切位點，以便有助于PCR擴增的可變區(qū)的克隆GCTGTGGTTCCCCGGCTCTAGATGC;SEQIDNO:1)。Xbal通過沉默i秀變引入。作為用于克隆可變重鏈區(qū)的3'限制酶切4立點，Sail的限制酶切位點^皮引入載體l是供的IgGl的Cl。相似地，BsiWl的限制酶切位點被引入k輕鏈的Cl，而Xhol被引入X輕鏈的Cl。PCR產(chǎn)物的限制酶切消化和連接到受體載體根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進行。使用才示〉*i式劑盒(Quiagen,Hombrechtikon，Switzerland)制備質(zhì)4立DNA。受體載體含有CMV啟動子，以便抗體基因在哺乳動物細胞中表達。卓勿^ir畫尸ci對來自培養(yǎng)B細月包的Ig重鏈和輕鏈可變區(qū)的單細l包RT-PCR,-使用Owens等描述的方法(Owens等，2003)的修改。4吏用MoFlo細胞分選器，將單細胞直接置于0.2mlPCR管陣列的每個管中。預(yù)114備4吏每個管含有l(wèi)O(ilSuperscriptII反4爭錄物酶(Invitrogen)的RT緩沖液。將PCR管驟凍于干冰上，并且就在RT-PCR之前融化。佳L用隨機六聯(lián)體(Clontech)和SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄物酶(Invitrogen)制備cDNA。免疫J求蛋白重《連和輕《連可變區(qū)的第1輪PCR使用Ig-可變區(qū)家族之間保守的所有信號肽中引發(fā)的一組引物作為5'引物來進行。在3'位置，使用特異于IgCl重鏈或Igk-或IgX輕鏈恒定區(qū)的單個引物。第2輪PCR使用描述用于主體B細胞RT-PCR的引物對第1輪PCR期間獲得的PCR-產(chǎn)物來進行。克隆到受體載體相應(yīng)地進行。可選的細胞克隆4吏用標(biāo)準(zhǔn)的有限稀釋方法或通過4吏用細月包分選器(MoFlo，Dako,FortCollins,USA)將單個細月包沉積到96孔i咅養(yǎng)一反中進4亍克隆。只t有限,希浮奪，收集i己憶B細月包i備養(yǎng)物的細月包、通過30pm尼龍篩孑L(Falcon,BectonDickinson,Basel,Switzerland)、重懸于培養(yǎng)基中，并以每孔0.3個細胞的濃度4妻種到96孔板或384孔板中。對細胞分選器的接種，設(shè)備設(shè)置為將每孔一個單個細胞(單個才莫式1)沉積到補充有B細胞培養(yǎng)基的96孑L4反中。培養(yǎng)基^皮補充由活化T細胞調(diào)理的培養(yǎng)基。可選地，將30.000個照射的飼養(yǎng)細胞加到培養(yǎng)基中。免疫球蛋白可變區(qū)序列的序列分析^使用特異于存在于表達載體中插入的Ig可變區(qū)序列的5'的CMV啟動子的引物對克隆的免疫球蛋白可變區(qū)序列進行測序?？蛇x地，使用在Ig重鏈和輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域引發(fā)的引物。獲得的序列4吏用載體NTI專欠件(Informax-Invitrogen)進4亍分坤斤和比對。含有編碼按前導(dǎo)肽閱讀框架的完整免疫球蛋白可變區(qū)和恒定結(jié)構(gòu)域的序列的質(zhì)沖立用于表達。功能性重組單克隆抗體的表達4吏用本領(lǐng)域已知:f支術(shù)通過重組表達可產(chǎn)生足夠量的抗體(Trill等，Curr.Opin.Biotechnol.6(1995)，553-601)。瞬時轉(zhuǎn)染293HEK細胞后產(chǎn)生可達1mg的重組人單克隆抗體。使用重組慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)293HEK細胞或鼠NSO細胞后產(chǎn)生可達100mg的重組人單克隆抗體。遞i^摔^f脊染v、^e#,i乂f遂^#4吏用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣共沉淀方法將Ig-重4連載體和Ig-輕鏈載體共轉(zhuǎn)染到HEK293細月包中。^f吏用蛋白A柱純化(GE-Healthcare，Otelfingen,Switzerland)從轉(zhuǎn)染的HEK293細胞調(diào)理的培養(yǎng)基中純化重組抗體。本文采用基于慢病毒的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)來產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的產(chǎn)生人重組抗體的細月包系(Zufferey等，J.Virol.72(1998),9873-9880)。HEK293細胞與兩個不同的慢病毒載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)，一個慢病毒載體帶有Ig重鏈的表達盒，另一個帶有重組抗體的Ig輕鏈的表達盒。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)方法可用在廣范圍的哺乳動物細胞系中，諸如CHO和NSO細胞。在人類疾病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中驗證壽爭基因小鼠^口前文所述(Knobloch等，Neurobiol.Aging7月28曰(2006))在C57B1/6和DBA2的雜交背景上產(chǎn)生。測試組與116C57B1/6回交一次。小鼠保持在處于顛倒12小時:12小時光照/黑暗周期的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下，并且隨意獲耳又食物和水。平Hf治療組的年齡(第1次測試時24個月，第2次測試時26個月)和性別。通過每周一次腹膜內(nèi)注射抗體(3mg/kg體重)持續(xù)2個月的時間(達到每個動物8次注射)來治療小鼠。Y-迷宮中的4亍為測試使用40x20x10cm臂長的Y形塑料迷宮評4介自發(fā)交替率。在5分鐘期間，記錄進入臂的順序；交替定義為在重疊的三組中連續(xù)進入三個臂。交替百分比計算為實際交替與可能交替的比率?？贵w治療2個月后，這些小鼠在Y-迷宮中重新測試。整個實-瞼期間，實驗者對治療和基因型一直保持盲性。血腦屏障穿過和與腦中異常結(jié)構(gòu)的結(jié)合為評價選擇的抗體或其片段是否能穿過血腦屏障并與腦中異常聚集或構(gòu)象改變的蛋白靶結(jié)合，將有效劑量的抗體系統(tǒng)地、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)施用于特征為腦中聚集的或構(gòu)象改變的蛋白靶的非生理性積累的轉(zhuǎn)基因動物。然后通過標(biāo)記的抗人Ig二抗的免疫染色、然后標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)檢測來評估腦中抗體與病理特異結(jié)構(gòu)的結(jié)合。豸發(fā)才黃..PS-l/APPswe阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠才莫型在第1天和第3天接受兩次150pgNI-101.11的外周注射。第二次注射后24小時處死小鼠，并灌注PBS。冷凍腦，并使用恒冷切片機從冷凍的組織制備纟且織薄片。通過Cy3畫才示i己的4元人IgG4元體(JacksonImmunoResearchEurope,Suffolk,UK)的染色測定恒冷切片上人抗體的存在。淀凈分樣蛋白斑塊的定位通過用鼠Ap-特異的對照抗體6E10(可/人Covance獲得，目錄號SIG-39320)、然后用FITC-標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體共染色恒冷切片來進行?？蛇x地，單獨用Cy3-標(biāo)記的抗人IgG抗體染色。熒光分析在倒置熒光顯微鏡(Leica)上進行。月畝病-里的減少抗體治療對腦中聚集或構(gòu)象改變的蛋白輩巴水平的影響通過抗體和不相關(guān)的抗體對照的系統(tǒng)治療或靶向腦遞送(顱內(nèi)、鞘內(nèi)或心室內(nèi))至具有腦中聚集或構(gòu)象改變的蛋白靶的特征的非生理性積累的轉(zhuǎn)基因動物來評價。治療效果通過改變或聚集的蛋白靶的免疫染色或組織化學(xué)染色，并測量此類聚集體覆蓋的面積、聚集體的大小和聚集體的數(shù)目、和在不同腦區(qū)域蛋白靶濃度的生化定量來評估。缺少抗體-治療相關(guān)的副作用抗體治療潛在的輩巴相關(guān)的副作用將通過系統(tǒng)施用或耙向腦遞送(顱內(nèi)、鞘內(nèi)或心室內(nèi))抗體和不相關(guān)的抗體對照至具有腦中聚集或構(gòu)象改變的蛋白靶的特征的非生理性積累的轉(zhuǎn)基因動物來評1介。潛在的副作用將通過免疫染色或組織化學(xué)染色(例如普魯士藍4十對樣i出血(micorhemorrhages)、蘇木灃K尹紅4十對活4b的白細月包)和生化定量(例如通過ELISA定量細月包因子的水平)來評估。活細^^的免疫熒光染色用表達在胞內(nèi)C-末端融合到黃色熒光蛋白變體Citrine的人野生型APP的載體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞。轉(zhuǎn)染后24小時，細胞與人重組抗體或?qū)φ湛贵w一起于4。C孵育30分鐘。洗滌步驟之后，固定細胞，并使用針對人或小鼠IgG的Cy-3-標(biāo)記的二抗(JacksonImmunoResearch)才企測表面結(jié)合的抗體。焚光分神斤在共焦顯孩"竟(Leica)上進行。AB原纖維的制備AP月太購自Bachem(Bubendorf,Switzerland)。凍干的月太重才勾于TFA中，并且;f尤在其在測定中作為單體A(34吏用前重懸于PBS。A卩原纖維通過于PBS中100昭/ml濃度的單體A卩l(xiāng)-42肽于37。C孵育24小時來制備。單體A卩肽和原纖維制品也用作底物來包被ELISA板。蛋白質(zhì)印跡單體AP肽與上樣染料混合，力口熱變性，每個泳道上樣0.2昭，并在梯度SDS-PAGE上分離。印跡與一抗一起孵育2小時。-使用與辣才艮過氧化物酶(HRP)軛合的抗人或抗鼠二抗來顯示人單克隆一抗或小鼠只于照4元體6E10的結(jié)合。^吏用SuperSignalWestFemto最大靈敏度底物(Pierce,FisherScientific,Wohlen,Switzerland)來顯影印跡。組織淀粉樣蛋白斑塊結(jié)合的竟?fàn)幹亟M人NI-lOl.ll抗體與A(3肽制品一起孵育2小時。然后抗體/A(3制品用于獲自患有神經(jīng)病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織化學(xué)染色。制備5jam恒冷切片，用于PBS中的4%BSA、5。/。山羊血清和5。/。馬血清于室溫封閉1小時，用NI-101.il/Ap制品于室溫染色1小時。洗滌步驟之后，使用Cy3-軛合的人IgG二結(jié)合。焚光分沖斤在倒置熒光顯孩M竟(Leica,Heerbrugg,Switzerland)上進行。實施例1針對在人腦疾患中普遍存在的異常結(jié)構(gòu)的人抗體的才企測來自表型上健康的對象、或臨床上異常穩(wěn)定的阿爾茨海默病患者的抗體通過獲自患有病理上確i人的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織化學(xué)來測試。圖1A說明在臨床上異常穩(wěn)定的患者中存在與P-淀粉樣蛋白斑塊結(jié)合的抗體，這通過用針對人P-淀粉樣蛋白的已知抗體(抗體4G8;圖1B)的共染色得到證實。健康人類對象中針對獲自阿爾茨海默病患者的組織切片中神經(jīng)原纖維纏結(jié)的抗體的存在顯示于圖2A。這一結(jié)果通過用針對人tau(HT7)的已知抗體的共染色得到證實。圖3A揭示了健康人類對象中針對獲自阿爾茨海默病患者的組織切片中營養(yǎng)不良性軸突的抗體的存在。用針對人tau(HT7)的已知抗體的對照染色描述于圖3B。這些結(jié)果說明在表型上健康、或臨床上異常穩(wěn)定的患者中存在針對具有組織病理上確認的i貪斷的人組織樣品中可鑒定病理結(jié)構(gòu)的抗體。實施例2重組人抗體在體內(nèi)保持對異常結(jié)構(gòu)的特異性并識別腦淀壽分才羊蛋白斑塊中疾患相關(guān)P-淀賴4羊蛋白的構(gòu)象表4立而不識別其生理前體或非病理書于生物^t體NI-101.11、NI畫101.12、NI畫101.13A和NI國101.13B獲自具有顯著降低的認知衰退速率的臨床上異常穩(wěn)定的阿爾茨海默病患者?？贵w的分離和重組產(chǎn)生如補充方法中所述進行。NI-101.11120測試重組NI-101.11與腦(3-淀粉樣蛋白斑塊的結(jié)合(圖4)。獲自患有神經(jīng)病理上確^人的阿爾茨海默病的患者的腦切片以指示濃度被染色。50pM濃度的抗體與P-淀粉樣蛋白斑塊的結(jié)合暗示高親和力的結(jié)合。加入可達1jiM的過量的代表位置1至16的線性的合成N-末端Ap-衍生多肽不能竟?fàn)?.5nM濃度的抗體NI-101.11與卩-淀粉樣蛋白斑塊的結(jié)合(圖5)。此外，過量Api-42原纖維(4(xM)而不是4(iM濃度的線性的合成Api-42單體竟?fàn)?nM濃度的NI-101.11與腦切片上(3-淀粉樣蛋白斑塊的結(jié)合，這暗示NI-lOl.ll識別單體AP中不存在的構(gòu)象表位(圖6)。為進一步評4介人重組NI-101.11抗體與線性、單體、合成AP的結(jié)合，通過非變性PAGE分離單體AP制品。印跡蛋白用人重組NI-101.11抗體和針對N-末端線性A(3序列的對照抗體(6E10)來探測。盡管6E10產(chǎn)生顯著的單體Ap肽的染色，但沒有檢測到人NI-101.11的結(jié)合，這暗示NI-101.11不結(jié)合線性單體A卩肽，而是識別構(gòu)象AP表位。(圖7)重組NI-lOl.ll與/人合成的A卩l(xiāng)-42肽和單體AP制備的人工淀粉樣蛋白原纖維的結(jié)合通過ELISA來確定(圖8)。以同樣包被密濃度的NI-101.11—起孵育。與人工淀粉樣蛋白原纖維的結(jié)合(空心方塊)比單體AP(實心方塊)高100多倍。針對ApC-末端的對照抗體22C4優(yōu)先與單體Ap(實心圓圈)結(jié)合，與原纖維(空心圓圈)結(jié)合得不太好。這暗示NI-101-10識別也存在于從合成的A|3肽制備的人工淀粉樣蛋白原纖維的構(gòu)象表位。4十對細月包全長APP的重組人NI-101.11抗體與其4壬<可生理書亍生物的交叉反應(yīng)性通過細胞結(jié)合測定來確定(圖9)。穩(wěn)定表達與作為標(biāo)志的Citrin融合的人APP的活體HEK293細月包與重組人NI-101.11抗體或4十對N-末端線性A卩序列的對照抗體6E10—起于4。C孵育30分鐘，以防止內(nèi)在化。Citrin-陽性信號指示表達APP的纟田月包。與在表達融合構(gòu)建體的所有細月包中與細月包表面APP結(jié)合的對照抗體(6E10)相反，沒有一企測到重組人NI-101.11抗體與全長APP的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)說明NI-101.11與生理、細胞的APP沒有交叉反應(yīng)性。進一步通過大小排阻層析來證明NI-101.11不與單體AJ3結(jié)合沒有觀察到NI-101.11或不相關(guān)的對照抗體與單體FITC-標(biāo)記的A(31-42的結(jié)合(圖IOA、10B)。相反，針對存在于A(3C-末端的線性表位的抗體22C4與FITC-A(31-42單體共洗脫(圖10C)。在竟?fàn)幮訣LISA中，在與過量濃度的單體A卩l(xiāng)-16、A卩l(xiāng)-28和Api-40肽一起預(yù)孵育后，完全阻抑了針對APN-末端的線性表位的抗體6E10的結(jié)合。相反，與過量濃度的線性A(3肽一起預(yù)孵育沒有石皮壞NI-lOl.ll的結(jié)合，暗示NI-lOl.ll需要構(gòu)象表^f立(圖11)。NI-101.13A和13B測試重組人抗體NI-101.13A和13B與獲自阿爾茨海,默病的APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型(Tg2576)的腦切片的結(jié)合。10nM濃度的NI-101.13A和NI-101.13B產(chǎn)生顯著的卩-淀4分才羊蛋白斑塊的染色(圖12)。重組NI-101.13A和NI-101.13B與/人合成的Apl-42肽和單體A(3制備的人工淀4分樣蛋白原纖維的結(jié)合通過ELISA來確定。以同才羊包纟皮密度包一皮于ELISA一反上的合成的A卩原纖維或單體合成的Ap與指示濃度的NI-101.13A和NI-101.13B—起孵育。與單體Ap相比，測試的兩個抗體都觀察到對人工淀粉樣蛋白原纖維的優(yōu)先結(jié)合(圖13)。NI-101.12重組NI-101.12與合成的A|31-42肽的結(jié)合通過ELISA確i人(圖14A)。過量的A|31-42肽竟?fàn)?33nM濃度的NI-101.12的結(jié)合(圖14B)。實施例3在阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，針對腦|3-淀粉樣蛋白的重組人抗體穿越血腦屏障，并在體內(nèi)與腦P-淀粉樣蛋白斑塊結(jié)合.為確定重組人NI-101.11抗體是否穿越血腦屏障并在體內(nèi)與腦(3-淀粉樣蛋白斑塊結(jié)合，轉(zhuǎn)基因PS-l/APPswe阿爾茨海默病小鼠模型在第1天和第3天接受兩次150(igNI-101.11的外周注射。第二次注射后24小時處死小鼠，并灌注PBS。收集腦，并且腦切片用FITC-標(biāo)記的人IgG抗體、或用小鼠單克隆A卩抗體6E10染色，然后用FITC-標(biāo)i己的小鼠IgG抗體染色來i正實腦|3-淀4分才羊蛋白斑塊的存在。抗人IgG的淀粉樣蛋白斑塊的強染色表明重組人NI-101.11抗體可穿越轉(zhuǎn)基因小鼠的血腦屏障，并在活體動物中與腦P-淀粉樣蛋白斑塊結(jié)合(圖15)。實施例4在阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，針對P-淀粉樣蛋白的重組人抗體改善異常的認知行為，并賦予P-淀粉樣蛋白斑塊負載、星形膠質(zhì)細胞增生和小膠質(zhì)細胞增生的減少，而不增加農(nóng)i出血頻率24個月大的arcA卩小鼠和年齡匹配的野生型同窩小鼠用3mg/kg重組人NI-101.11抗體或同種型匹配的人對照抗體每周i.p.治療2個月。為評價轉(zhuǎn)基因小鼠中對異常行為的治療效果，在治療完成之前和之后進4亍Y-迷宮4亍為測試。-使用40x20x10cm臂長的Y形塑料迷宮來評價自發(fā)交替率。在5分鐘期間，記錄進入臂的順序；交替定義為在重疊的三組中連續(xù)進入三個臂。交替百分比計算為實際與可能交替的比率(定義為進入臂的總數(shù)-2)乘以100%。使用非配對t-檢驗比較未治療的arcAp小鼠和野生型同窩小鼠對照的Y-迷宮表現(xiàn)。<吏用非參凄t克魯斯凱-沃利斯^r-瞼比4交所有4組在治療之后的改善。選擇非參數(shù)曼-惠特尼U4企驗對不同組進行成對比較。零-表現(xiàn)者(即不離開它們被放置的臂的小鼠)不包括在分析中。如在前面的研究中觀察到，未治療的24個月大的arcA(3小鼠與其野生型同窩小鼠相比顯著受損(圖16A,治療前；非配對t-檢驗，p=0.0007)。2個月治療后，與NI-101.11治療的野生型對照小鼠相比，NI-101.11治療的arcAJ3小鼠顯示明顯增強的改變水平。改善的分沖斤(即治療后的表現(xiàn)減去治療前的表現(xiàn))顯示四組之間的顯著差異(圖16B,克魯斯凱-沃利斯4企驗；p=0.03)。所有組之間的成對事后分析顯示NI-101.11治療的arcA卩小鼠的認知表現(xiàn)的改善顯著高于野生型小鼠(曼-惠特尼U;p=0.05NI-101.11tg對比NI-101.11野生型；p=0.008NI-101.11tg對比對照野生型)。該組小鼠與對照抗體治療的轉(zhuǎn)基因同窩小鼠相比還顯示強烈傾向于改善的表現(xiàn)(曼-惠特尼-U;p=0.08NI-101.11tg對比對照tg)。所有小鼠在重新測試中顯示~10%的表現(xiàn)改善，這可能是由于對任務(wù)環(huán)境的熟悉。慢性、2個月NI-101.11治療對淀粉樣蛋白負荷、星形膠質(zhì)細胞增生和小力交質(zhì)細力包增生的影響通過定量組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)分一斤來分4斤。為達到此目的，在4亍為測試完成后麻醉小鼠，并心臟灌注PBS。一個腦半球在4%低聚曱醛中固定并包埋到石蠟中。用LeicaRM2135+刀片才幾(Bannockburn,Illinois)+刀成5的矢；夫+刀片。皮層和海馬中P-淀4分樣蛋白斑塊的負載才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案在石克代黃素S和剛果紅染色的腦切片上定量。對免疫組織化學(xué)，薄片蜂皮脫蠟、用于PBS中的4%BSA、5%山羊血清和5%馬血清于RT封閉1小時。-使用以下^希釋的4元體于4。C孵育過夜#元GFAP(AdvancedImmunochemicals)1:500,抗IBA1(WAKO)1:500。熒光團偶耳關(guān)的二抗于RT孵育2小時。每次染色使用間隔75(im的每個小鼠腦的2-3個切片。每個切片以10x放大拍攝2個圖像用于皮層分析(頂區(qū)和額區(qū))。拍才聶完整的海馬區(qū)(5x放大，修剪為ROI)用于海馬分析。使用軟件ImageJ進行自動圖像分析。對來自用6E10和抗人IgG免疫的arcAp小鼠的腦切片的乂又染色揭示了NI-101.11與Ap沉》積物的結(jié)合(圖17,左圖)，表明NI-101.11可穿越血腦屏障，并與腦(3-淀賴—羊蛋白斑塊結(jié)合。在對照抗體治療的arcA卩小鼠中沒有觀察到人抗體與A(3沉積物的這種結(jié)合(圖17右圖)。如碌l代黃素S和剛果紅染色所揭示，用3mg/kgNI-101.11的慢性治療可I起淀4分樣蛋白斑塊負載的顯著減少。與對照抗體治療的arcA(3小鼠相比，在皮層和海馬這種減少達到大于50%的水平(圖18A、B)。除了斑塊面積(圖18C),還觀察到斑塊數(shù)目(圖18D)和平均斑塊大小(圖18E)的顯著減少。為測試NI-lOl.ll的慢性治療是否影響arcA卩小鼠的神經(jīng)炎性應(yīng)答，在免疫組織染色之后定量反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞和d、膠質(zhì)細月包。與只于照纟元體治療的動物坤目比，NI-101.11治療的arcA(3小鼠皮層中觀察到反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞數(shù)目的減少(抗GFAP染色)(圖19A;曼-惠特尼-U;p=0.047)。在海馬中沒有4全測到改變。用針對小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞標(biāo)志的抗體(抗-Ibal)的染色還揭示了統(tǒng)計上傾向于減少的炎癥(圖19B;曼-惠特尼-U;皮層和海馬都是p=0.075)。星形月交質(zhì)細月包增生和小月交質(zhì)細月包增生的減少與NI-101.11治療之后觀察到的減少的P-淀4分樣蛋白負載一致。用針對AP的某些單克隆抗體的被動免疫治療與腦中微出血頻率的i曽力口才目關(guān)(Pfeifer等，Science298(2002)，1379;Wilcock等，JNeuroinflammation1(2004),24)。為了評{介NI-101.11'隻性治療的歲丈果，在慢性NI-101.11治療后，對arcAp和野生型小鼠的腦切片進行Perl氏普魯士藍染色。該染色揭示存在血紅蛋白分解產(chǎn)物血4失黃素和先前微出血的標(biāo)志(圖20)。與野生型同窩小鼠相比，在用對照抗體治療的年老arcAp小鼠中，普魯士藍陽性特征的頻率顯著4是高(曼-惠特尼-U;p=0.001)。當(dāng)與對照抗體治療的arcA(3小鼠相比時，NI-101.11治療沒有導(dǎo)致樣i出血凄t目的增加(曼-惠特尼-U;p=0.347),這表明NI-101.11治療的有益治療作用發(fā)生時沒有一皮動A(3免疫治療中經(jīng)常觀察到的這種副作用。實施例5針對腦P-淀粉樣蛋白的重組人抗體在體外抑制合成的AP原纖維的形成重組人NI-101.11抗體對A卩-原纖維形成的影響通過熒光分析測量與聚集AP結(jié)合的碌u代黃素S來測定。單體AP溶液在有或沒有增加濃度的NI-101.11時于37。C孵育24小時。在體外重組人NI-101.11以濃度依賴性的方式抑制合成的A|3原纖維的形成(圖21)。實施例6NI-101.11對BV-2小膠質(zhì)衍生細胞中AP原纖維的離體吞噬作用的影響NI-101.11對Fcy-受體介導(dǎo)的AP原纖維的吞嗟作用的影響在BV-2小膠質(zhì)衍生細胞系中研究。BV-2細胞保持在補充有5%FBS、Pen/Step和谷氨酰胺的DMEM中。細l包用月夷蛋白酶消化，將120'000個BV-2細胞/孔4妻種于平底24-孔^反。12小時后，用補充有20mMHEPES(pH7.3)、1%BSA、10(ig/mlPen/Step的權(quán)fJDMEM/F12/孔替換培養(yǎng)基。實-瞼前30分鐘加入100|ig/ml褐藻糖膠(清除受體抑制劑)。50pMFITC-標(biāo)記的AP原纖維與指示濃度的抗體一起于37。C預(yù)孵育30分鐘，洗滌兩次，然后14'000xg離心5分鐘。將該懸浮液加到組織培養(yǎng)板中。30分鐘后，BV-2細胞用HBSS洗滌兩次以去除未締合的原纖維AP。細月包用250pg/ml月夷蛋白酶/EDTA于4。C處理20分鐘，并通過4°C500xg離心5分4中;先f條兩;欠。纟田月包在FACS-Fix(PBS、2%FA、2%葡萄#唐、5mMNaN)中固定20分鐘，并用FACS洗液(PBS、5|iMEDTA、0.2%BSA)洗滌兩次。IO'OOO個纟田月包的熒光(FL畫1)通過FACS分析確定(基于WebsterSD等，JI2001)。FITC-標(biāo)i己的A(31-42原纖維的依賴于Fcy受體的吞噬作用在抑制清除受體系統(tǒng)后測量。人NI-lOl.ll和可商業(yè)獲得的針對位于A(3肽N-末端的線性表^f立的抗體(6E10)的比4交分析i兌明AP原纖維的吞噬作用的劑量依賴性誘導(dǎo)。NI-101.11介導(dǎo)的原纖維的攝取比6E10抗體中觀察到的高可達3倍(圖22)。這些數(shù)據(jù)表明，NI-101.11觸發(fā)小膠質(zhì)細胞對A卩原纖維強有力的劑量依賴性的Fey受體介導(dǎo)的吞噬作用。結(jié)論才艮據(jù)本發(fā)明進行的上述實驗證明，令人驚訝地在表型上健康、無癥狀的人類對象中、以及在盡管i貪斷為i人知損害或阿爾茨海默病但具有異常穩(wěn)定的臨床疾患進程的患者中，4企測保護性和治療上有活性的抗體和產(chǎn)生抗體的B細胞是可能的。更具體地，可能4全測和分離識別抗原的生理功能形式的一類新的人抗體，因此降低了迄今免疫治療中自身免疫原性副作用問題的危險。因此，提供了特異識別病理生理相關(guān)結(jié)構(gòu)的抗原變體的抗體和等歲丈結(jié)合分子，所述抗原變體預(yù)期被所述抗體結(jié)合以通過例如4吏病原體對表達FcR的巨噬細胞或小膠質(zhì)細胞可見并且因此使其無害而降低其毒性、或降低其濃度、或促進其降解。實施例中進一步證明，此類抗體治療上有效，并且能延緩以及防止異常病理蛋白及其聚集體的有害作用，而不增加腦孩i出血的頻率。權(quán)利要求1.一種分離疾病相關(guān)蛋白特異性結(jié)合分子的方法，所述方法包括(a)使獲自無癥狀但患有疾病或處于發(fā)展疾病的危險的患者、或具有異常穩(wěn)定的疾病進程的患者的樣品經(jīng)受具有預(yù)定臨床特征的病理上改變的細胞或組織試樣；和(b)鑒定并任選地分離與所述試樣結(jié)合、但不與健康對象的對應(yīng)細胞或組織結(jié)合的結(jié)合分子。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品包括體液或細胞樣口口o3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述體液是腦脊液、血漿或5尿。4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其中所述結(jié)合分子是抗體。5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其中所述樣品包括或來自B細月包或i己憶B細月包。6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的方法，其中所述患者和對象分別為人。7.如權(quán)利要求1至6^f壬一項所述的方法，其中所述患者已通過有或沒有替代標(biāo)志物而一皮確定患有尚未表現(xiàn)的疾病或處于發(fā)展疾病的危險。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述替代標(biāo)志物選自老年、腦淀粉樣蛋白負載、ApoE基因型、APP基因型、PS1基因型、體液中A卩肽的水平、異前列腺素、Tau和磷酸-Tau。9.如4又利要求1至8任一項所述的方法，其中所述疾病選自神經(jīng)疾病、自身免疫病和腫瘤。10.如權(quán)利要求1至9任一項所述的方法，其中所述疾病是阿爾茨海默病。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述樣品獲自滿足以下標(biāo)準(zhǔn)的患者(i)年齡為65歲或更大；(ii)具有完全的認知能力和良好的健康；和(iii)沒有癡呆的臨床體征；或(iv)具有異常緩慢的疾患進展速率，盡管存在可能為阿爾茨海默病的確定的臨床i貪斷。12.如4又利要求1至1K壬一項所述的方法，其進一步包4舌以下步驟(i)從已鑒定含有與所述試樣結(jié)合但不與健康對象的對應(yīng)纟田胞或組織結(jié)合的例如抗體的結(jié)合分子的樣品中純化B細胞或B記憶細月包；(ii)從所述B細胞或B記憶細胞獲得所述抗體的免疫球蛋白基因i普系；禾口(iii)4吏用所述i普系表達所述抗體。13.如權(quán)利要求.12所述的方法，其中步驟(ii)包括以下步驟(iv)乂人所述B細月包或i己憶B細月包獲4尋mRNA;(v)/人步艱《(iv)的mRNA獲得cDNA;和(vi)4吏用引物延伸反應(yīng)/人所述cDNA擴增對應(yīng)于所述抗體的重鏈(HC)和K輕鏈(LC)的片段。14.一種結(jié)合分子，其可通過片又利要求1至13^壬一項所述的方法獲得，所述結(jié)合分子能選擇性地識別疾病相關(guān)蛋白的新表位。15.如權(quán)利要求14所述的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子基本不識別以其非疾病相關(guān)形式存在的所述蛋白。16.如一又利要求14或15所述的結(jié)合分子，其為抗體或其抗原結(jié)合片段。17.如權(quán)利要求16所述的抗體，其為人抗體。18.如權(quán)利要求14至17任一項所述的結(jié)合分子，其中所述疾病是神經(jīng)疾病。19.如權(quán)利要求14至18任一項所述的結(jié)合分子，其中所述疾病是月畝疾病。20.如纟又利要求14至19任一項所述的結(jié)合分子，其能在病理事件位點穿越血腦屏障。21.如權(quán)利要求14至20任一項所述的結(jié)合分子，其能結(jié)合P-淀粉樣蛋白斑塊、腦血管淀粉樣蛋白、彌散性Ap沉積物、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、過度磷酸化的tau、a-突觸核蛋白陽性Lewy-小體或與營養(yǎng)不良性軸突結(jié)合的蛋白聚集體。22.如權(quán)利要求14至21任一項所述的結(jié)合分子，其能基本恢復(fù)正常4亍為。23.如權(quán)利要求14至22任一項所述的結(jié)合分子，其選自單鏈Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段。24.如權(quán)利要求14至23任一項所述的結(jié)合分子，其為在其可變區(qū)包含至少一個表4所示互補決定區(qū)(CDR)的抗體或其結(jié)合片段。25.如權(quán)利要求24所述的抗體或結(jié)合片段，其包含表2和3所示的VH和/或Vl區(qū)的氨基酸序列。26.—種抗原，所述抗原一皮4又利要求14至254壬一項所述的結(jié)合分子識別。27.如權(quán)利要求26所述的抗原，其為前面任一項權(quán)利要求中限定的疾病相關(guān)蛋白的至少一部分。28.—種多核苷酸，其編碼沖又利要求14至254壬一項所述的結(jié)合分子或4又利要求26或27所述的4元原。29.如權(quán)利要求28所述的多核苦酸，其編碼權(quán)利要求24或25所述的抗體或結(jié)合片段的免疫球蛋白鏈的至少可變區(qū)。30.—種載體，其包含權(quán)利要求28所述的多核苷酸或權(quán)利要求29所述的多核苦酸，任選地與編碼所述抗體的其他免疫J求蛋白《連的可變區(qū)的4又利要求29所述的多核苷酸組合。31.—種宿主細胞，其包含權(quán)利要求28或29所述的多核香酸或權(quán)利要求30所述的載體。32.—種用于制備疾病相關(guān)蛋白特異性結(jié)合分子、抗體或其結(jié)合片段或免疫球蛋白鏈的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)一又利要求31所述的細胞；和(b)從所述培養(yǎng)物中分離所述結(jié)合分子、抗體或其結(jié)合片段或免疫球蛋白鏈。33.—種結(jié)合分子、抗體、或其免疫球蛋白鏈或結(jié)合片段，其由權(quán)利要求28或29所述的多核苦酸編碼，或者可通過片又利要求32所述的方法獲得。34.如權(quán)利要求14至25或33任一項所述的結(jié)合分子、抗體或結(jié)合片|史，其^皮可4企測地標(biāo)i己。35.如權(quán)利要求34所述的結(jié)合分子、抗體或結(jié)合片段，其中所述可檢測標(biāo)記選自酶、放射性同位素、熒光團和重金屬。36.如權(quán)利要求14至25或33至35任一項所述的結(jié)合分子、抗體或結(jié)合片段，其與藥物相連。37.—種組合物，其包含4又利要求14至25或33至36任一項所述的結(jié)合分子、抗體或結(jié)合片,殳，^又利要求26或27所述的抗原，權(quán)利要求28或29所述的多核苷酸，權(quán)利要求30所述的載體，或權(quán)利要求31所述的細胞。38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其為藥物組合物，并且進一步包含藥學(xué)可接受的載體。39.如權(quán)利要求38所述的藥物組合物，其進一步包含用于治療阿爾茨海默病的其4也物質(zhì)，所述其〗也物質(zhì)選自小有才幾分子、抗國AP抗體及其組合。40.如權(quán)利要求37所述的組合物，其為診斷組合物，并且進一步包含常失見用在基于免疫或核酸的i貪斷方法中的試劑。41.一又利要求14至25或33至36任一項所述的結(jié)合分子、抗體或結(jié)合片段、或具有與上述任一個基本相同的結(jié)合特異性的抗體、4又利要求26或27所述的抗原、一又利要求28或29所述的多核苷酸、權(quán)利要求30所述的載體或權(quán)利要求31所述的細胞制備藥物組合物或診斷組合物的用途，所述藥物組合物或診斷組合物用于治療或預(yù)防阿爾茨海默病的進展；用于改善與阿爾茨海默病相關(guān)的癥狀；用于診斷或篩選對象中阿爾茨海默病的存在或用于確定對象發(fā)展阿爾茨海默病的危險。42.如權(quán)利要求41所述的用途，其中所述藥物組合物通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸胃外、或作為氣霧劑施用。43.—種治療特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中蛋白異常積累和/或沉積的神經(jīng)疾病的方法，所述方法包括將治療有效量的權(quán)利要求14至25或33至36任一項所述的結(jié)合分子、斥又利要求26或27所述的抗原、4又利要求28或29所述的多核苷酸、4又利要求30所述的載體或權(quán)利要求31所述的細胞施用于有相應(yīng)需要的對象。44.如—又利要求43所述的方法，其中所述疾病選自阿爾茨海默病、唐氏綜合征、輕度認知損害、腦淀粉樣蛋白血管病、血管性癡呆、多發(fā)性梗死性癡呆、帕金森病、亨廷頓病、克雅病、嚢性纖維化或高雪病。45.如權(quán)利要求43或44所述的方法，其中施用是通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸胃外或作為氣霧劑進行的。46.—種診斷和/或治療分別與阿爾茨海默病和Ap沉積相關(guān)的疾病的方法，所述方法包4舌4務(wù)治療有歲支量的配體Ap結(jié)合分子施用于對象，所述配體A(3結(jié)合分子包含權(quán)利要求24或25所述47.—種用于i貪斷疾病的試劑盒，所述疾病伴隨著要求^呆護的肽的任一個中限定的疾病相關(guān)蛋白的存在，所述試劑盒包含權(quán)利要求14至25或33至36任一項所述的結(jié)合分子、抗體或結(jié)合片段、權(quán)利要求26或27所述的抗原、權(quán)利要求28或29所述的多核苷酸、4又利要求30所述的載體或4又利要求31所述的細月包，任選地具有試劑和/或使用說明書。48.如權(quán)利要求14至25或33至36任一項所述的結(jié)合分子、抗體或其結(jié)合片段的用途，所述用途是用于腦中疾病相關(guān)蛋白的體內(nèi)檢測或?qū)⒅委焺┖?或診斷劑靶向腦中的疾病相關(guān)蛋白，在對象中檢測病理蛋白聚集體或構(gòu)象、抑制病理蛋白聚集體或構(gòu)象的形成或減少病理蛋白聚集體或構(gòu)象，用于改善i人知或減緩或逆轉(zhuǎn)與疾患相關(guān)的認知衰退，或用于從體液體外提取病理化合物或它們的前體。49.一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與參考抗體特異性結(jié)合相同的疾病相關(guān)蛋白的新表位，所述參考抗體選自NI-IOLIO、NI-101.11、NI國101.12、NI-101.13、NI-101.12F6A、NI-101.13A和NI-101.13B。50.—種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體竟?fàn)幮砸种茀⒖伎贵w與疾病相關(guān)的新表位的結(jié)合，所述參考抗體選自NI畫101.10、NI-101.11、NI-101.12、NI-101.13、NI-101.12F6A、NI-101,13A和NI國101.13B。51.—種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含與選自NI-lOl.lO、NI-101.11、NI國101.12、NI-101.13、NI國101.12F6A、NI-101.13A和NI-101.13B的抗體相同的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。全文摘要提供了識別疾患相關(guān)蛋白新表位的新的特異性結(jié)合分子、特別是人抗體及其片段、衍生物和變體，所述疾患相關(guān)蛋白來自天然的內(nèi)源蛋白，但在患者體內(nèi)以變體形式和/或脫離其正常生理環(huán)境普遍存在。另外，描述了包含此類結(jié)合分子、抗體及其模擬物的藥物組合物和篩選治療諸如阿爾茨海默病的神經(jīng)疾病的新的結(jié)合分子(可以是或可以不是抗體)和靶的方法。文檔編號C07K16/18GK101622275SQ200880006294公開日2010年1月6日申請日期2008年1月7日優(yōu)先權(quán)日2007年1月5日發(fā)明者克里斯托夫·愛瑟蘭格,克里斯托夫·霍克,凱瑟琳·蒂索,簡·格林,羅格·尼奇,馬倫·科諾布洛赫申請人:蘇黎世大學(xué)