專利名稱:用于口腔衛(wèi)生保健的天然多肽的制作方法
用于口腔衛(wèi)生保健的天然多肽 優(yōu)選權(quán)的要求
本申請(qǐng)要求2007年1月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/880, 753 的優(yōu)先權(quán),該申請(qǐng)的^^開內(nèi)容以其全文通過引用合并入本文。
背景技術(shù):
多年來,研究者一直試圖開發(fā)可用于抵抗口腔中的感染的化學(xué)治 療劑。早在20世紀(jì)40年代中期,隨著抗生素的引入,人們開始明白, 雖然這些有力的試劑可能是有效的,但口腔的獨(dú)特性問題干擾了它們 的用途。隨著時(shí)間的推移,對(duì)口腔中菌斑的產(chǎn)生理解更深。隨著理解 的加深,人們開始明白,遞送至口腔的試劑需要附著至口腔組織以抵 抗唾液流動(dòng)和口部咀嚼的力量引起的去除。被廣為接受的是,為了使 抗微生物劑在口腔中有效,需要將該試劑在該環(huán)境中保持一段時(shí)間。 說明該原理的一個(gè)實(shí)驗(yàn)比較了兩個(gè)著名的抗微生物劑四環(huán)素和青霉素 的功效。經(jīng)顯示當(dāng)在體外進(jìn)行檢測(cè)時(shí),與四環(huán)素相比,青霉素是更有 效的試劑。同樣,顯示當(dāng)在肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行抗細(xì)菌生長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí), 與四環(huán)素相比,青霉素在顯著更低的濃度上有效地抗口腔細(xì)菌(1 ug/ml (對(duì)于青霉素)對(duì)10-20 ug/ml (對(duì)于四環(huán)素))。此外,青霉 素是殺菌劑,從而促進(jìn)殺死細(xì)菌,然而四環(huán)素是抑菌劑,從而減緩細(xì) 菌的生長(zhǎng)和發(fā)育。然而,盡管功效上存在這些顯著的差異,但經(jīng)證明 當(dāng)局部應(yīng)用于口腔時(shí)四環(huán)素是更有效的抗微生物劑。因此,當(dāng)向涂覆 有唾液的羥基磷灰石盤(SHA)(牙/釉質(zhì)表面的替代品)加入四環(huán)素, 然后清洗該四環(huán)素處理的SHA牙齒類似物,并將其置于細(xì)菌的培養(yǎng)物 中時(shí),看到此類生物極少能夠粘附至SHA。另一方面,當(dāng)以相似的方 式用青霉素處理SHA時(shí),沒有效果。因此,盡管當(dāng)與青霉素相比時(shí)四 環(huán)素的功效較低,但四環(huán)素在解釋藥物粘附和從涂覆有唾液的牙齒類似物釋》文的測(cè)定中更優(yōu)。因?yàn)閮煞N最常見的牙病,齲病(caries)和牙 周病由粘附至牙齒表面的口腔細(xì)菌引起,所以口腔中抗微生物功效的 檢測(cè)需要集中在預(yù)防或減少細(xì)菌粘附至牙齒表面的方法上。
基于該理解,20世紀(jì)60年代后期和70年代早期的研究檢查了具 有直接性(substantivity )的特征(試劑結(jié)合牙齒樣表面并從其釋i文 的能力)的試劑。已研究的具有該特征的首批試劑中的一個(gè)是氯己定 (雙縮二胍(bisbiguanide)抗樣l生物劑),其在體外和體內(nèi)都顯示減少 菌斑至牙齒的附著。研究稱為Peridex⑧和Perioguard⑧的試劑,其為 目前可商購獲得的已進(jìn)行過檢測(cè)并且顯示結(jié)合口腔組織的口腔清洗 劑。當(dāng)用于臨床研究時(shí),與抗微生物活性組合的該直接性的特性導(dǎo)致 齦炎和齲病水平的降低。自那時(shí)以來,已進(jìn)行許多努力以開發(fā)在口腔 中有效作用的試劑。迄今臨床試驗(yàn)已顯示極少成功例子。 一個(gè)這樣的 成功例子利用了試劑三氯生(triclosan) , Colgate Total⑧牙膏中 的活性成分。該潔牙劑經(jīng)試驗(yàn)證明足以獲得聯(lián)邦機(jī)構(gòu)例如ADA和FDA 的認(rèn)可。商購可獲得的含有三氯生的潔牙劑由Colgate Palmolive公 司提供。通過采用已知的抗微生物劑三氯生(酚類化合物)(其已用 于洗發(fā)劑和除臭劑中),并且將其連接至允許其結(jié)合至口腔組織的試 劑開發(fā)了全效牙膏(Total toothpaste )。三個(gè)主要的工業(yè)公司Procter and Gamble/Unilever以及Colgate Palmolive/>司幾乎同時(shí)將三氯 生作為在口腔中可能有效的試劑進(jìn)行開發(fā)。各公司具有其自己的策略,
所述策略設(shè)計(jì)用于使活性劑三氯生結(jié)合至口腔組織以使其可有效地抗 結(jié)合牙齒的口腔微生物。要重申的是,三氯生本身不能結(jié)合口腔組織, 從而盡管其具有有效的抗微生物特性但其在口腔中是無效的。Colgate Palmolive 7>司將igicare或gantrex與三氯生混合,從而形成聚合 化合物,該化合物,當(dāng)遞送至口腔時(shí),以使三氯生有效的方式結(jié)合。 該組合產(chǎn)品,除了包含氯己定的產(chǎn)品外,和其他包含酚類化合物的試 劑是過去40年中開發(fā)的最好的有效試劑之一。
齲病是最常見的慢性兒童期疾病,其頻繁程度比哮喘高5倍。17 歲以上的兒童中超過70%具有蛀洞。超過1億8百萬美國(guó)人缺少牙齒健康保險(xiǎn),從而缺少該感染的治療。變異鏈球菌(又邁W"/7S)被認(rèn)為是 與蛀牙相關(guān)程度最高的微生物之一。在患有局限型青少年牙周炎(現(xiàn)
稱為局限型侵襲性牙周炎(Localized Aggressive Periodontitis )) 的兒童的研究中, 一個(gè)申請(qǐng)者發(fā)現(xiàn)這些兒童中有許多具有最小程度的 牙蛀蝕。此外,這些研究發(fā)現(xiàn),患有該形式的牙周病的兒童具有唾液 蛋白乳鐵蛋白(lactoferrin) (Lf)的變體。當(dāng)該Lf變體(賴氨酸變 體)在昆蟲載體中表達(dá)并且對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)時(shí),發(fā)現(xiàn)其殺死變異鏈球菌。 相反,存在于健康的非牙周病兒童中的另一種更常見的Lf變體(精氨 酸變體)對(duì)變異鏈球菌的存活影響極小或無影響。
近來,我們已顯示具有該乳鐵蛋白的賴氨酸形式的合成肽殺死變 異鏈球菌。其他研究人員已顯示乳鐵蛋白肽具有抗微生物活性,但迄 今為止沒有人顯示來源于該肽的抗菌活性可用于抗口腔中的生物。我 們也已證明該肽在口腔中具有有限的有效性,除非將其連接至將允許 該肽結(jié)合至牙齒表面的某些物質(zhì)。因此,我們已開發(fā)了融合肽,其中 將活性肽連接至小唾液肽富酪蛋白(statherin),這樣其可保持其抗微 生物活性,同時(shí)也可保留在牙齒表面以減少變異鏈球菌對(duì)該表面的結(jié) 合。
乳鐵蛋白(Lf)是在乳房分泌物、淚液和唾液以及在胃腸道中發(fā)現(xiàn) 的多功能蛋白質(zhì)。其主要功能是將鐵與其周圍環(huán)境隔離以阻止口腔微 生物獲得得鐵(微生物存活所必需的礦物質(zhì))。此外,在其N端中, Lf擁有具有抗^L生物特性的區(qū)域。該區(qū)域稱為防衛(wèi)素(defensin)區(qū) 域,并且自20世紀(jì)80年代以來已顯示Lf可殺死許多類型的細(xì)菌,包 括口腔細(xì)菌。還顯示,在該N端區(qū)域,從氨基酸位置11至31存在至 少2個(gè)多態(tài)性形式。對(duì)于該防衛(wèi)素區(qū)域中的大部分變異,在氨基酸位 置29可包含精氨酸或賴氨酸。近至1998年,已顯示氨基酸位置29 中的這2種變體具有不同的抗微生物活性,并且經(jīng)設(shè)計(jì)具有此類形式 的肽可具有抗微生物活性。事實(shí)上,我們的小組在2003年產(chǎn)生了由昆 蟲細(xì)胞分泌的全長(zhǎng)乳鐵蛋白。產(chǎn)生具有2種多態(tài)性形式(賴氨酸和精氨 酸)的該昆蟲細(xì)胞分泌的乳鐵蛋白并且其通過桿狀病毒載體導(dǎo)入。分泌的蛋白質(zhì)具有人乳鐵蛋白的所有特征性質(zhì),并且我們就抗革蘭氏陽性 和革蘭氏陰性生物的活性檢測(cè)了這兩種形式。我們發(fā)現(xiàn)賴氨酸形式更 有效地抗一 系列革蘭氏陽性和革蘭氏陰性生物,特別地更有效地抗變 異鏈球菌(公認(rèn)的齲齒的原因)。因?yàn)楦l繁地在患有局限型侵襲性
牙周炎(LAP)(其中兒童具有比他們的匹配對(duì)照更少的齲病的疾病)的 患者中發(fā)現(xiàn)Lf的賴氨酸形式,我們推測(cè)乳鐵蛋白的該賴氨酸形式可對(duì) 這些兒童提供生態(tài)學(xué)有利方面,所述生態(tài)學(xué)有利方面可解釋在這些兒 童中看到的齲病的減少。然后我們進(jìn)一步確定,除非純?nèi)殍F蛋白連接 至允許其結(jié)合牙齒表面的某種物質(zhì)上,否則其將在口腔中具有有限的 有用性。富酪蛋白是在唾液中發(fā)現(xiàn)的小唾液磷蛋白,其在受刺激的唾 液中的濃度為200 ug/mi,但在未受刺激的唾液中濃度低大約10倍。 唾液蛋白至釉質(zhì)的吸附形成了釉質(zhì)的薄膜涂層,口中的細(xì)菌粘附至該 薄膜涂層,形成了斑的最初細(xì)菌組分。吸附的最初唾液蛋白是粘蛋白 (mucin)、淀粉酶、唾液IgA、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑 (cystatin)、富含酸性脯氨酸的蛋白質(zhì)(PRP)和凝集素。至釉質(zhì)或羥 基磷灰石(HA)表面上的薄膜吸附促進(jìn)變異鏈球菌的粘著。相反地,唾 液蛋白如富酪蛋白和富組蛋白(histatin)表現(xiàn)出具有相反的作用, 從而抑制變異鏈球菌的附著(Gibbons和Hay 1989)。富酪蛋白是富含 酪氨酸的包含43個(gè)氨基酸的磷蛋白(Hay和Moreno 1989)。富酪蛋白 主要因其通過結(jié)合鈣而減少牙垢形成的能力而著名(Hay和Moreno 1987)。最近,Shimotoyodeme等人(2006)已提出富酪蛋白與高分子量 唾液蛋白竟?fàn)帍亩鴾p少變異鏈球菌與牙齒表面結(jié)合。他們進(jìn)一步顯示 由前6個(gè)氨基酸組成的小肽也具有該能力。到現(xiàn)在為止,仍然不存在 可確定這些氨基酸殘基是否可結(jié)合另一種唾液蛋白或由富酪蛋白和乳
上的空間的能力的證據(jù)。此外,還不清楚包含富酪蛋白的融合肽是否 可保留在釉質(zhì)上以及該融合肽是否可保持其抗微生物活性。
.,此處描述了融合蛋白,在該融合蛋白中,抗菌肽(以乳鐵蛋白的 形戒存在)被連接至小唾液肽(富酪蛋白),所述小唾液肽允許抗菌肽結(jié)合牙齒表面從而干擾變異鏈球菌結(jié)合牙齒表面的能力。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及使用乳鐵蛋白和富酪蛋白融合蛋白和包含所述蛋白 的組合物進(jìn)行的由口腔細(xì)菌引起的牙疾病的治療。
在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及用于抑制口腔中細(xì)菌生長(zhǎng)的包含 融合蛋白的組合物,所述融合蛋白包含乳鐵蛋白多肽的賴氨酸形式或 其功能等同的肽分子和富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
在其他實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO. 10、 SEQIDNO. ll或SEQ ID NO. 13的融合蛋白或其功能等同的肽分子。在其他實(shí)施 方案中,本發(fā)明涉及包含具有SEQ ID NO. 10、 SEQ ID NO. 11或SEQ ID NO. 13的融合蛋白或其功能等同的肽分子的組合物。
在另外的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及用于通過對(duì)需要其的患者施用 有效量的組合物來抑制口腔中的細(xì)菌、治療或預(yù)防齲齒、治療或預(yù)防 牙周病、治療或預(yù)防牙斑或治療與牙斑的存在相關(guān)的口腔炎癥的方法, 所述組合物包含含有乳鐵蛋白多肽的賴氨酸形式或其功能等同的肽分 子和富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子的融合蛋白。
附圖概述
圖1:乳鐵蛋白、富酪蛋白和STAT-LF融合蛋白的肽序列。 圖2:說明肽結(jié)合羥基磷灰石(HA)(牙齒類似物)的能力的直接性 測(cè)定法。
圖3:顯示只有一種形式的乳鐵蛋白具有活性的擴(kuò)散測(cè)定法 (Diffusionassay)。在所有圖框中,圓圏是用不同試劑(PBS-作為 對(duì)照的磷酸鹽緩沖鹽水)浸漬的濾紙盤;LF "R"=在氨基酸位置29 上具有精氨酸(R)的乳鐵蛋白的11 mer; LF "K"是在氨基酸位置29 上具有賴氨酸(K)的乳鐵蛋白的11 mer。將包含標(biāo)準(zhǔn)濃度的一種試 劑的盤置于變異鏈球菌的匯合培養(yǎng)物上方。圍繞盤的空區(qū)(clear zone)顯示試劑擴(kuò)散入瓊脂培養(yǎng)基并且已抑制變異鏈球菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng),從而表明存在抗菌活性以及變異鏈球菌不能在該區(qū)域生長(zhǎng)。
左圖框用PBS-對(duì)照浸漬的盤顯示無抑制作用。
中間的圖框用乳鐵蛋白的精氨酸變體浸漬的盤沒有顯示空區(qū), 從而不抑制變異鏈球菌。
右圖框用乳鐵蛋白的賴氨酸變體浸漬的盤顯示空區(qū),這表明試 劑已擴(kuò)散入瓊脂并且抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)。
圖4:顯示最具活性的融合肽是LF和富酪蛋白6mer的擴(kuò)散測(cè)定 法。顯示5個(gè)圖框,各自估計(jì)受試試劑的活性。在所有圖框中,圓圏 是用不同試劑浸漬的盤。將盤置于變異鏈球菌的匯合培養(yǎng)物上方。圍 繞盤的空區(qū)顯示存在抗菌活性以及變異鏈球菌不能在該區(qū)域生長(zhǎng)。
左上方圖框其中存在賴氨酸的乳鐵蛋白(11 raer)。如在圍繞盤 的空區(qū)中所見,該制劑抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)。
中間和右上方的圖框是兩種富酪蛋白肽(6 mer和15 mer )。如 通過未見與盤相鄰的抑制區(qū)的事實(shí)所看到的,這兩種制劑都不具有任 何抗菌活性。
左下方圖框注釋為L(zhǎng)F的乳鐵蛋白11 raer融合至富酪蛋白6 mer。該融合蛋白保持乳鐵蛋白11 mer的活性。
右下方圖框注釋為L(zhǎng)F的乳鐵蛋白11 mer融合至富酪蛋白15 mer。該融合蛋白具有比當(dāng)LF融合至Stat 6 mer時(shí)更低的活性。
下方的兩個(gè)圖框顯示當(dāng)向兩種富酪蛋白加入LF時(shí)干擾的水平。 與當(dāng)更大的肽融合至LF時(shí)相比,當(dāng)更小的富酪蛋白肽融合至LF時(shí)LF 的活性更大。
圖5:在2小時(shí)的肽處理后,從SHA方塊回收變異鏈球菌。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及用于抑制細(xì)菌定殖的組合物。為了本發(fā)明的目的,術(shù) 語"抑制,,是指減少或引起存在的細(xì)菌死亡,或阻止新的細(xì)菌生長(zhǎng)。 本發(fā)明還涉及抑制細(xì)菌在口腔中定殖從而減少牙斑和齲病的量的口腔 治療性處理。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是由乳鐵蛋白和富酪蛋白組成的大體上純化的融合蛋白(STAT-LF)。圖1中提供了 STAT-LF的核酸和氨 基酸序列。通常,"純化的"將是指已經(jīng)歷分離從而除去各種其他組 分的蛋白質(zhì)或肽組合物,并且該組合物基本上保持其表達(dá)的生物學(xué)活 性。當(dāng)使用術(shù)語"大體上純化的"時(shí),該術(shù)語將表示這樣的組合物, 在該組合物中,蛋白質(zhì)或肽形成了組合物的主要組分,例如構(gòu)成組合 物中大約50%、大約60%、大約70%、大約80%、大約90%、大約95% 或更多的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可與第 二多肽序列有效連接。
^游爭(zhēng)/^W凝^^子
本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括其為STAT-LF序列的全部或一部分的 功能等同物的核酸分子。(在本申請(qǐng)中核酸分子還可以稱為DNA序列或 核苷酸序列。所有這些術(shù)語具有與核酸分子相同的意義)。功能等同的 核酸分子是編碼具有與圖1中所示的STAT-LF肽相同或相似的 STAT-LF活性的肽的DNA和RM (例如基因組DNA、互補(bǔ)DNA、合成的 DM和信使RNA分子)。功能等同的核酸分子可編碼包含與STAT-LF 肽的區(qū)域或更優(yōu)選與整個(gè)STAT-LF肽具有序列同一性的區(qū)域的肽。本 申請(qǐng)中描述的突變優(yōu)選不破壞編碼序列的閱讀框。功能上等同于 STAT-LF序列的核酸分子可以以下面描述的多種形式發(fā)生。
核酸分子可編碼STAT-LF肽中的保守氨基酸變化。本發(fā)明的某些 實(shí)施方案包括功能等同的核酸分子,其編碼STAT-LF氨基酸序列內(nèi)的 保守氨基酸變化和在STAT-LF中產(chǎn)生沉默氨基酸變化。
核酸分子可編碼STAT-LF肽中的非保守氨基酸置換、添加或缺失。 本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括在STAT-LF氨基酸序列(圖1)內(nèi)產(chǎn)生非 保守氨基酸變化的功能等同的核酸分子。功能等同的核酸分子包括 DM和RNA,所述DM和RM編碼具有非保守氨基酸置換(優(yōu)選化學(xué)上 相似的氨基酸的置換)、添加或缺失但還保留與STAT-LF肽相同或相 似的STAT-LF活性的肽、肽和蛋白質(zhì)。DM或RNA可編碼STAT-LF的 片段或變體。此類片段和變體的STAT-LF或STAT-LF樣活性通過下面描述的測(cè)定法來測(cè)定。本發(fā)明包括的STAT-LF的片段和變體應(yīng)當(dāng)優(yōu)選 具有與STAT-LF核酸至少大約40%、 60°/。、 80%或95%的序列同一性,其 編碼分子或序列的區(qū)域,例如核酸分子的編碼序列或保守結(jié)構(gòu)域之一。
根據(jù)下列描述,功能上等同于圖1中的STAT-LF分子的核酸分子 將變得明了。例如,[圖l(d)]中顯示的序列可通過天然或人工突變例 如部分核苷酸插入或缺失使其長(zhǎng)度改變,從而當(dāng)將[圖l(d)]中的編碼 序列的完整長(zhǎng)度當(dāng)作100%時(shí),功能等同的核酸分子優(yōu)選具有其大約 60-120%,更優(yōu)選其大約80-110%的長(zhǎng)度。片段可以小于60%。
核酸分子包含部分(通常80%或更少,優(yōu)選60%或更少,更優(yōu)選40% 或更少的完整長(zhǎng)度)天然或人工突變以使這些序列中的一些密碼子編 碼不同的氨基酸,但其中所得的肽保持相同的或相似的STAT-LF活性。 以該方式產(chǎn)生的突變的DNA應(yīng)當(dāng)優(yōu)選編碼這樣的肽,所述肽具有與[圖 1U)]中的STAT-LF肽的氨基酸序列至少大約40%,優(yōu)選至少大約60%, 至少大約80%和更優(yōu)選至少大約90%或95°/。的序列同一性。
由于遺傳密碼是簡(jiǎn)并性的,所以[圖1 (d)]中的核酸序列不是可編 碼具有STAT-LF活性的肽的唯一序列。本發(fā)明包括具有與[圖l(d)]中 描述的核酸分子相同的基本遺傳信息的核酸分子。與本申請(qǐng)中描述的 序列相比具有一個(gè)或多個(gè)核酸變化并且導(dǎo)致[圖l(d)]中所示的肽產(chǎn) 生的核酸分子(包括RM)在本發(fā)明的各種實(shí)施方案的范圍內(nèi)。
可使用常規(guī)的DNA-DNA或DNA-RNA雜交技術(shù)分離編碼STAT-LF的 核酸的其他功能等同的形式。因此,本發(fā)明的某些實(shí)施方案還包括核 酸分子,所述核酸分子與[圖l(d)]中的一個(gè)或多個(gè)序列或其互補(bǔ)序列 雜交,并且編碼展示與由[圖l(d)]中的DNA或其變體產(chǎn)生的STAT-LF 肽的活性相同或相似的活性的肽、肽和蛋白質(zhì)的表達(dá)。此類核酸分子 優(yōu)選在中度至高度嚴(yán)格條件(參見Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 最新版.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)下與[圖1 (d)]中的序列雜交。高 嚴(yán)格清洗具有低鹽(優(yōu)選大約0.2% SSC),低嚴(yán)格清洗具有高鹽(優(yōu)選 大約2。/。SSC)。大約37。C或大約42。C的溫度被認(rèn)為是低嚴(yán)格的,大約50-65 。C的溫度是高嚴(yán)格的。本發(fā)明的一些實(shí)施方案還包括鑒定編碼 STAT-LF激活物肽(優(yōu)選哺乳動(dòng)物的肽)的核酸分子的方法,其包括在 中度或高度嚴(yán)格雜交條件下接觸包含核酸分子的樣品,所述核酸分子 包含[圖l(d)]的全部或一部分(優(yōu)選[圖l(d)]的至少大約15或20個(gè) 核苷酸),然后鑒定與包含[圖l(d)]的全部或一部分的核酸分子雜交 的核酸分子。相似的方法描述于美國(guó)專利5,851,788。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案還包括將與[圖l(d)]的全部或一部分雜 交的核酸分子的全部或一部分例如用作探針或用于測(cè)定中以鑒定由核 酸分子(下面描述的)產(chǎn)生的肽的拮抗劑或抑制劑的方法。本發(fā)明的 一些實(shí)施方案包括以相似的方法使用與STAT-LF核酸分子(如下面所 描述的)具有序列同一性的核酸分子的方法。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案還包括核酸分子檢測(cè)試劑盒,其包含(優(yōu) 選在適當(dāng)?shù)娜萜鞴ぞ咧谢蚋街帘砻?本文中公開的編碼STAT-LF[圖 1 (d)]或具有STAT-LF活性的肽的核酸分子和檢測(cè)試劑(例如可檢測(cè)的 標(biāo)記)。
秀浙遂合參一浴^^"法
當(dāng)在藥物組合物中與栽體組合時(shí),STAT-LF也是有用的。當(dāng)在由 變異鏈球菌引起的疾病、病癥或異常身體狀況的醫(yī)學(xué)治療或預(yù)防的方 法中施用時(shí),組合物是有用的。本發(fā)明的某些實(shí)施方案還包括例如通 過施用包含載體和STAT-LF的藥物組合物醫(yī)學(xué)治療由過度的變異鏈球 菌表征的疾病、病癥或異常身體狀況的方法。齲病是可通過施用 STAT-LF[圖l(d)]治療或預(yù)防的疾病的一個(gè)實(shí)例。當(dāng)在由其他引起牙 斑的革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌(包括但不限于放線菌屬物種 (Jc〃"咖7ces )和其他鏈球菌屬物種(57re/7&cocc/ )) 引起的疾病、病癥或異常身體狀況的醫(yī)學(xué)治療或預(yù)防的方法中施用時(shí), 組合物也是有用的。
在醫(yī)學(xué)治療的方法中,可通過方法例如食物、食品添加劑、潔牙 劑、凝膠、牙膏、漱口劑、牙線、假牙清洗劑(denture wash)、義齒粘附劑(denture adhesive) 、 口香糖、糖果、餅干、軟々欠料(soft drink )或體育飲料(sports drink )對(duì)人或動(dòng)物施用藥物組合物???將STAT-LF偶聯(lián)至脂質(zhì)或碳水化合物。這通過延長(zhǎng)粘附的持續(xù)時(shí)間或 通過增加其親和力或兩者來增加它們粘附牙齒的能力。還可將它們偶 聯(lián)至聚合物,例如在牙科工作中(例如,齒冠、牙套、填料)或牙線。 可對(duì)人或動(dòng)物施用藥物組合物。施用的劑量取決于個(gè)體患者的狀況、 藥物的指示(indication of the drug)、藥物的物理和化學(xué)穩(wěn)定性、 期望的效應(yīng)的毒性和選擇的施用途徑(Robert Rakel.等人.Conn's Current Therapy (1995. W B. Saunders Company, USA)。藥物組合 物用于治療由形成牙斑的細(xì)菌感染引起的疾病例如齲齒、牙周病和心 內(nèi)膜炎。在優(yōu)選實(shí)施方案中,藥物組合物用于治療由放線菌屬物種和 鏈球菌屬物種引起的疾病。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中,藥物組合物用 于治療疾病,用于治療由(但不限于)變異鏈球菌、表兄鏈球菌 (51 5^6r/77M) 、 口腔鏈球菌(S. oralis)、血鏈球菌"譜^//力、 緩癥鏈球菌(、格氏鏈J求菌(5.《0/7/0/7//)、肺炎鏈J求菌 (iS7re/^ococcwi1 /7/7ew370/7/ae)、酉良膿鏈J求菌(^ / 7C^e/ ei1)和無 乳鏈球菌(圼aw/"〃ae)引起的鏈球菌感染。
可使用體內(nèi)遞送媒介物例如脂質(zhì)體將核酸分子和STAT-LF[圖 1 (d)]導(dǎo)入細(xì)胞。還可使用物理技術(shù)例如顯微注射和電穿孔或化學(xué)方法 例如共沉淀或使用脂質(zhì)體將它們導(dǎo)入此類細(xì)胞。在一些情況下,期望 使用被靶向目的細(xì)菌的脂質(zhì)體。
在優(yōu)選實(shí)施方案中,使用一種或多種能夠在與牙斑相關(guān)的細(xì)菌中 抑制生物膜形成的STAT-LF肽制備根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。
包含STAT-LF肽的藥物組合物特別適合用于治療或防治(預(yù)防) 由鏈球菌感染引起的疾病、病癥或異常身體狀況的方法。此類藥物組 合物特別地用于治療由 一種或多種的口腔鏈球菌例如變異鏈球菌、表 兄鏈球菌、口腔鏈球菌、血鏈球菌、緩癥鏈球菌或格氏鏈球菌引起的 感染。藥物組合物還用于治療和預(yù)防其他類型的鏈球菌感染例如肺炎 鏈球菌、釀膿鏈球菌和無乳鏈球菌感染。藥物組合物可通過已知的用于制備可對(duì)患者施用的藥學(xué)上可接 受的組合物的方法來制備,以使有效量的核酸分子或肽與藥學(xué)上可接
受的媒介物組合在混合物中。適當(dāng)?shù)妮d體描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company. Easton. Pa. , USA)。載體包括鹽水和謂
(5%葡萄糖和水)。賦形劑包括添加劑例如緩沖劑、增溶劑、表面活性 劑、懸浮劑、乳化劑、粘度控制劑(viscosity controlling agent)、 香料(flavor)、乳糖填充劑、抗氧化劑、防腐劑或染料。存在用于 穩(wěn)定肽以進(jìn)行胃腸外和其他施用的優(yōu)選賦形劑。賦形劑包括血清白蛋 白、谷氨酸或天冬氨酸、磷脂和脂肪酸。
在其他優(yōu)選實(shí)施方案中,將表面活性劑包含在組合物中以幫助滲 透生物膜。可用于本發(fā)明的表面活性劑通常包括藥學(xué)上可接受的陰離 子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性(兼性/兩親性)表面活性劑和 非離子型表面活性劑。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的陰離子表面活性劑包括 例如單價(jià)烷基羧酸鹽、酰基乳酸鹽、烷基醚羧酸鹽、N-?;“彼猁}、 多價(jià)烷基碳酸鹽、N-酰基谷氨酸鹽、脂肪酸-多肽濃縮物
(condensates )、石危酸酯、烷基辟u酸鹽(包括十二烷基石危酸鈉(SLS))、 乙氧基化烷基硫酸鹽、酯連接的磺酸鹽(包括多庫酯鈉或二辛基琥珀酸 鈉(dioctyl sodium succinate) (DSS))、 a-烯烴磺酸鹽和石粦酸化 乙氧基化醇(phosphated ethoxylated alcohol)。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可 接受的陽離子表面活性劑包括例如單烷基季銨鹽、二烷基季胺化合物、 酰胺胺(amidoamine )和胺化酰亞胺。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的兩性(兼 性/兩親性)表面活性劑包括例如N-取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜堿、 磺基甜菜堿和N-烷基P -氨基丙酸鹽。
在優(yōu)選實(shí)施方案中,使用十二烷基硫酸鈉。在優(yōu)選實(shí)施方案中, 組合物包含按體積計(jì)算大約0. 1至大約10%,大約0. 3至大約5%或大 約0. 5%至大約2%的十二烷基硫酸鈉??蛇x地,可在體現(xiàn)活性、傳導(dǎo)活 性的賴氨酸殘基之一上將取代的序列如十二烷基硫酸鈉插入融合肽。 例如,可用十一酸修飾Lys的側(cè)鏈這將導(dǎo)入與SLS中的十二烷基部分相似的長(zhǎng)烷基鏈。
還可用氨基十一酸修飾Lys的側(cè)鏈這將導(dǎo)入與SLS中的十二烷 基部分相似的長(zhǎng)烷基鏈且在末端導(dǎo)入正電荷(NH2)。<formula>formula see original document page 16</formula>
還可用例如氨基十一酸修飾Lys的側(cè)鏈并且在末端偶聯(lián)天冬氨酸 以在末端導(dǎo)入兩性離子。
在此基礎(chǔ)上,藥物組合物可包含活性化合物或物質(zhì)例如STAT-LF 肽和一種或多種藥學(xué)上可接受的媒介物或稀釋劑,并且其包含在具有 適當(dāng)?shù)膒H和與生理體液(physiological fluid)等滲的緩沖溶液中。 藥物載體將取決于期望的施用途徑。將活性分子與媒介物組合或?qū)⑺?們與稀釋劑組合的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。組合物還 可包含添加劑例如抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、殺菌性抗生素和使制 劑在期望的接受者中等滲的溶質(zhì);和可包含懸浮劑和增稠劑的水性和 非水性無菌懸浮液。組合物可包含用于將活性化合物運(yùn)輸至特定位置 的靶向性試劑。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何適當(dāng)?shù)耐緩絹硎┯?。在其中感染是局部性的情況下,可將藥物組合物局部施用 至被感染的區(qū)域。在其中感染是全身性的情況下,可口服、靜脈內(nèi)或 胃腸外施用藥物組合物。
在一些情況下,可能期望將根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物和已知的抗 菌劑例如抗生素一起施用。在一些情況下,抑制生物膜形成的藥物組 合物也用于使細(xì)菌細(xì)胞對(duì)抗生素更易感。
本文中使用的術(shù)語"抗生素"是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的抑制細(xì) 菌的生長(zhǎng)或殺死其的任何化合物。術(shù)語"抗生素"包括但不限于P-
內(nèi)酰胺(青霉素類和頭孢菌素類)、萬古霉素、桿菌肽(bacitracin)、 大環(huán)內(nèi)酯(紅霉素)、林可酰胺(lincosamide)(克林達(dá)霉素)、氯霉素、 四環(huán)素、氨基糖苷類(慶大霉素)、兩性霉素、頭孢唑啉、克林霉素、 莫匹羅星、磺胺類和曱氧芐啶、利福平、曱硝唑、喹諾酮、新生霉素、 多粘菌素(polymixin)、短桿菌肽或其任何鹽或變體。使用的抗生素 將取決于細(xì)菌感染的類型。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的治療有效劑量將取決于感染的類型 和嚴(yán)重度以及藥物組合物是否包含另外的活性成分例如抗生素。通常, 治療有效劑量是足以控制生物膜形成或齲齒并且對(duì)被治療的人或動(dòng)物 無毒的最小量。用于測(cè)定有效劑量和毒性的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面,提供了產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾從而產(chǎn)生抑制 生物膜形成或齲齒的STAT-LF肽的細(xì)胞的方法。另一個(gè)方面包括對(duì)患 者施用經(jīng)遺傳修飾從而產(chǎn)生抑制生物膜形成或齲齒的STAT-LF肽的細(xì) 胞。
本發(fā)明的另外方面提供了有活力的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(其經(jīng)遺傳修飾 從而產(chǎn)生抑制生物膜形成的STAT-LF肽)在制備藥劑中的用途,所述 藥劑用于對(duì)哺乳動(dòng)物患者施用以改善口腔衛(wèi)生或減輕齲齒。
在凝j參逾合參
用于制備藥物組合物的上述STAT-LF肽還可用于制備抗微生物組 合物例如液體消毒溶液。此類溶液還可包含抗孩i生物劑或抗真菌劑例如酒沖*、聚維酮石典溶液和抗生素以及防腐劑。這些溶液可例如在插入 或植入裝置例如導(dǎo)管之前用作皮膚或周圍環(huán)境區(qū)域的消毒劑,用作封
管液(catheter lock)和/或沖洗液(flush solution),和用作任 何醫(yī)療器械(包括但不限于導(dǎo)管組件例如針、Leur-Lok接頭 (connector)、無針接頭和針座(hub)以及其他可植入裝置)的殺 菌漂洗液。此類溶液還可用于涂覆或消毒手術(shù)器械,包括但不限于鉗 子、攝子、剪刀、皮膚鉤、管、針、牽開器(retractor )、刮器(scaler )、 鉆子、鑿子、銼刀(rasp)和鋸子。
用于抑制生物膜形成的抗微生物組合物可包含任何上述肽、反義 分子和抗體STAT-LF肽。
抗微生物組合物還可包含另外的組分,包括但不限于表面活性 劑、殺菌劑(antiseptic)和抗生素(參見上面列出的實(shí)例)。
5X4r-Z,^^凝和,裙勿^
本文中公開的核酸分子可從cDNA文庫獲得。核苷酸分子還可從 本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他來源例如表達(dá)序列標(biāo)簽分析或體外合成獲得???將本申請(qǐng)中描述的DNA (包括為功能等同物的變體)導(dǎo)入多種真核和 原核宿主細(xì)胞并且在其中表達(dá)。STAT-LF的重組核酸分子包含合適的 有效連接的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件。適當(dāng)?shù)恼{(diào)控元件來源于多種來源, 并且它們可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇(Sambrook, J. Fritsch, E. E. & Maniatis, T.(最新版本).Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York; Ausubel 等人(最新版本).Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons. Inc.)。例如,如果要上調(diào)核酸分子的表達(dá),可將有義 序列或沉默RM以及適當(dāng)?shù)膯?dòng)子插入載體。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的 或組成型的、受環(huán)境或發(fā)育調(diào)控的或細(xì)胞或組織特異性的。用本領(lǐng)域 已知的用于表達(dá)的啟動(dòng)子增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。CMV和SV40啟動(dòng)子通常用于在細(xì) 胞中表達(dá)期望的肽。還可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他啟動(dòng)子(許多適當(dāng)?shù)?啟動(dòng)子和載體描述于本申請(qǐng)中引用的申請(qǐng)和專利中)。如果要下調(diào)核酸分子的表達(dá),可將反義序列和適當(dāng)?shù)膯?dòng)子插入 栽體。核酸分子可從天然來源(以有義或反義方向)分離、合成或其 可以是突變的天然或合成的序列或這些序列的組合。
調(diào)控元件的實(shí)例包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和增強(qiáng)子或RNA聚合酶結(jié)合序 列、核糖體結(jié)合序列,包括翻譯起始信號(hào)。此外,取決于使用的栽體, 可將其他基因元件例如選擇標(biāo)記整合入重組分子??墒褂玫钠渌{(diào)控 區(qū)包括增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域和終止區(qū)域。調(diào)控元件可以是細(xì)菌、真菌、病毒 或鳥類來源的。同樣,調(diào)控元件可來源于動(dòng)物、植物、酵母、昆蟲或 其他來源,包括合成產(chǎn)生的元件和突變的元件。
除了使用上述表達(dá)栽體外,還可通過將重組核酸分子插入已知的 來源于細(xì)菌、病毒、酵母、哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌或鳥類的表達(dá)系統(tǒng) 來表達(dá)肽。取決于細(xì)胞類型,可通過技術(shù)例如根癌農(nóng)桿菌 (^To6ac&r/"/z7 /^/Z7e尸a"'e/7)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、;微粒轟擊介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 (particle-bombardment-mediated transformation)、 直接吸收、 顯微注射、共沉淀、轉(zhuǎn)染和電穿孔將重組分子導(dǎo)入細(xì)胞。可使用逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、DM病毒栽體和脂 質(zhì)體。將適當(dāng)?shù)臉?gòu)建體插入表達(dá)栽體,該表達(dá)載體還可包含用于選擇 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記。可將構(gòu)建體插入在由限制性酶產(chǎn)生的位點(diǎn)上。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,用插入在表達(dá)載體中的本發(fā)明的核 酸分子轉(zhuǎn)染細(xì)胞來產(chǎn)生表達(dá)由該核酸分子編碼的肽的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用本文中公開的插入在表達(dá)載體 中的核酸分子轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)STAT-LF肽[圖l]或本發(fā)明的其他 肽的細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案,提供了用于在細(xì)胞中 表達(dá)公開的肽的方法。優(yōu)選方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(所述細(xì)胞 包含含有編碼STAT-LF[圖l]的核酸分子(或本發(fā)明的另一種核酸分子) 的重組DM栽體)以使肽表達(dá)。方法優(yōu)選還包括從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回 收肽。
絲本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括從本申請(qǐng)中描述的克隆的STAT-LF肽 分子或本文中公開的其他核酸分子(參見材料和方法部分)制備的寡 核苷酸探針。探針在長(zhǎng)度上可以是15至20個(gè)核苷酸。優(yōu)選探針是[圖 1]中的STAT-LF的至少15個(gè)核苦酸。本發(fā)明的某些實(shí)施方案還包括[圖 l]的至少15個(gè)連續(xù)核普酸。探針用于鑒定編碼STAT-LF肽以及與 STAT-LF功能等同的肽的核酸。寡核苷酸探針能夠在嚴(yán)格雜交條件下 與[圖l]中顯示的序列雜交。編碼本文中公開的肽的核酸分子可通過 在中度至高度嚴(yán)格雜交條件下用已標(biāo)記的探針篩選文庫來從其他生物 分離。由核酸分子編碼的肽的活性通過DNA的克隆和表達(dá)來評(píng)估。在 分離表達(dá)產(chǎn)物后,如本申請(qǐng)中所描述的,就STAT-LF活性測(cè)定肽。
來自其他細(xì)胞的功能等同的STAT-LF肽分子或編碼等同的 STAT-LF的cDNA或合成的DNA還可使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法通過
擴(kuò)增來分離??芍苽浠赱圖l]的寡核苷酸引物例如簡(jiǎn)并引物并且將 其與PCR和逆轉(zhuǎn)錄酶一起使用(E. S. Kawasaki (1990). In Innis等 人,Eds" PCR Protocols, Academic Press, San Diego, Chapter 3, p. 21)從而從其他生物的基因組或cDNA文庫擴(kuò)增功能等同的DNA。寡 核苷酸還可用作篩選cDM文庫的探針。
^潔爭(zhēng)/^W應(yīng)、農(nóng)和蛋^^
本發(fā)明不僅包括由本文中公開的序列編碼的肽,而且還包括展示 相同的或相似的STAT-LF肽活性的功能等同的肽、肽和蛋白以及模擬 物(圖1)。
實(shí)施例
進(jìn)行兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)以證明我們檢測(cè)的物質(zhì)的抗微生物活性。第
一個(gè)實(shí)驗(yàn)是我們?cè)谖覀兊膶?shí)驗(yàn)室開發(fā)的盤擴(kuò)散篩選測(cè)定法。在該測(cè)定 中,我們?cè)谟梢壤译舜蠖谷鉁?trypticase soy)和20%的添加的蔗糖
組成的肉湯中培養(yǎng)變異鏈球菌的過夜培養(yǎng)物。將細(xì)胞培養(yǎng)過夜,然后在Mitis Salivarius Bacitracin (MSB)瓊脂上劃線至匯合。此外,我們采用25 cm無菌濾紙盤并且加入200 ul完全唾液、包含乳鐵蛋白的賴氨酸或精氨酸變體的唾液,讓唾液在濾紙上干燥1小時(shí),然后將含有添加的蛋白質(zhì)的濾紙置于MSB瓊脂上的變異鏈球菌的匯合培養(yǎng)物的中央上。然后讓該培養(yǎng)物在37。C下溫育24小時(shí),之后我們就圍繞濾紙盤邊緣的變異鏈球菌生長(zhǎng)的抑制區(qū)來檢查平板。該測(cè)定法用于篩選潛在的抗微生物活性。
第二組實(shí)驗(yàn)由在含有20%蔗糖的胰酪胨大豆肉湯(TSBS)中培養(yǎng)變異鏈球菌的貯備培養(yǎng)物過夜組成,其應(yīng)當(dāng)在24小時(shí)的時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生大約1 x 1()8個(gè)細(xì)胞/ml。然后我們徹底渦旋該致密的培養(yǎng)物以使其均勻,然后取出100 ul等分的該培養(yǎng)物,并且將其置于裝有9. 8 mi無菌TSBS的新管(我們向其中加入了 100ul/ml的2ug/ml劑量的a)Lf的賴氨酸變體、b)Lf的精氨酸變體、c)氯己定[陽性對(duì)照]、d)PBS[陰性對(duì)照])。讓該混合物生長(zhǎng)過夜。第二天早上,取出100ul等分置于MSB瓊脂上,在該瓊脂上涂板,然后將其培養(yǎng)過夜,次日就菌落形成單位/ml對(duì)其進(jìn)行檢查。該組實(shí)驗(yàn)用于通過標(biāo)準(zhǔn)MIC培養(yǎng)模式(standardMIC patterns of growth)比t支和定量Lf變體的抗孩i生物活性。還通過將細(xì)菌培養(yǎng)物和受試試劑混合1至2小時(shí),然后涂板過夜來進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)以測(cè)定在短暫的接觸時(shí)間后試劑的活性。
第三組實(shí)驗(yàn)使用直接性測(cè)定法,該測(cè)定法證明肽結(jié)合羥基磷灰石(HA)的能力(圖4)。圖5中提供測(cè)定的結(jié)果。
^f農(nóng)合^W才法
用于合成肽的方法包括逐步加入通過共價(jià)鍵被加至固體樹脂顆粒的被保護(hù)的氨基酸。該方法使用Fmoc合成化學(xué)法。 一個(gè)氨基酸加入的平均循環(huán)時(shí)間花費(fèi)大約60分鐘。加入的氨基酸受到保護(hù)。用于保護(hù)側(cè)鏈官能團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)是對(duì)酸敏感的,然而氨基酸的N末端氨基官能團(tuán)受到對(duì)堿敏感的Fmoc基團(tuán)保護(hù)。樹脂以200-400目的多孔珠粒的形式存在,其允許試劑滲入凝膠篩。在受保護(hù)的環(huán)境中進(jìn)行氨基酸的添說明書第18/18頁
加,然后通過過濾和重結(jié)晶除去試劑和副產(chǎn)物。正在生長(zhǎng)的肽鏈在不溶性固相中受到完全保護(hù)。形成的肽與通過標(biāo)準(zhǔn)對(duì)-硝基苯基酯法
(p—nitophenyl ester procedure)制備的樣品相同。
盤擴(kuò)散測(cè)定允許將特定蛋白質(zhì)加入至濾紙盤,由此蛋白質(zhì)可擴(kuò)散入瓊脂以測(cè)定抗微生物活性。將下列肽添加至盤;R=Lf的精氨酸形式(圖l(a))。 K=Lf的賴氨酸形式(圖l(a))。 PBS-磷酸鹽緩沖鹽水,其用作對(duì)照溶液,或其中加入了 Lf的R形式或K形式。在下面的圖1中,我們以1 ug/ml的濃度向200 ul PBS中加入R形式或K形式,然后將其加至25 cm濾紙條的表面,讓紙條干燥l小時(shí)。然后我們將變異鏈球菌的培養(yǎng)物在含有20%蔗糖的胰酪胨大豆瓊脂平板上劃線至匯合,然后將干燥的盤置于平板中央上。將培養(yǎng)物在培養(yǎng)箱中于37。C下培養(yǎng),然后在接種后第24或48小時(shí)時(shí)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估??稍诒PK周圍(其中賴氨酸變體懸浮在PBS中)和在盤K中(其中賴氨酸變體懸浮在正常的唾液(所述唾液在加入K之前不具有抗菌活性)中)看到抑制區(qū)。在盤R/PBS或R/唾液(其中用精氨酸變體替代了賴氨酸變體)上未看到抑制區(qū)(圖3)。以大約15 ug/ml的濃度加入LF肽的R和K形式。
圖4顯示ST6和ST15不具有任何抗微生物活性。在圖4的最下行,從左至右可看見LFll (圖1)制劑抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng),如通過圍繞盤的空區(qū)所看到的。對(duì)于融合至富酪蛋白6的LF,該融合蛋白保持乳鐵蛋白11 mer的活性(圖4)。與ST 15組合的LF具有比STAT-LF6更低的活性。
權(quán)利要求
1.用于抑制口腔中細(xì)菌生長(zhǎng)的包含融合蛋白的組合物,所述融合蛋白包含i.乳鐵蛋白多肽的賴氨酸形式或其功能等同的肽分子;和ii.富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
2. 權(quán)利要求l的組合物,其中融合蛋白是大體上純化的。
3. 權(quán)利要求1的組合物,其中組合物還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
4. 權(quán)利要求1的組合物,其中組合物還包含表面活性劑或表面 活性劑樣分子。
5. 權(quán)利要求4的組合物,其中表面活性劑是十二烷基硫酸鈉。
6. 權(quán)利要求5的組合物,其中十二烷基硫酸鈉以允許組合物滲 透生物膜的有效量存在。
7. 權(quán)利要求l的組合物,其中融合蛋白還包含另外的多肽序列。
8. 權(quán)利要求3的組合物,其中組合物是選自食物、食品添加劑、 潔牙劑、凝膠、牙膏、漱口劑、牙線、假牙清洗劑、義齒粘附劑、口 香糖、糖果、咀嚼片劑和溶液的劑型。
9. 權(quán)利要求1的組合物,其還包含抗菌劑、抗微生物劑、抗真 菌劑或其組合。
10. 用于抑制口腔中的細(xì)菌的方法,其包括對(duì)需要其的患者施用 有效量的包含融合蛋白的組合物,所述融合蛋白包含i. 乳鐵蛋白多肽的賴氨酸形式或其功能等同的肽分子;和ii. 富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
11. 用于治療或預(yù)防齲齒的方法,其包括對(duì)需要其的患者施用有 效量的包含融合蛋白的組合物,所述融合蛋白包含i. 乳鐵蛋白多肽的賴氨酸形式或其功能等同的肽分子;和ii. 富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
12. 用于治療或預(yù)防牙周病的方法,其包括對(duì)需要其的患者施用有效量的包含融合蛋白的組合物,所述融合蛋白包含i. 乳鐵蛋白多肽的賴氨酸形式或其功能等同的肽分子;和ii. 富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
13. 用于治療或預(yù)防牙斑的方法,其包括對(duì)需要其的患者施用有 效量的包含融合蛋白的組合物,所述融合蛋白包含i. 乳鐵蛋白多肽的賴氨酸形式或其功能等同的肽分子;和ii. 富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
14. 用于治療與牙斑的存在相關(guān)的口腔炎癥的方法,其包括對(duì)需 要其的患者施用有效量的包含融合蛋白的組合物,所述融合蛋白包含i. 乳鐵蛋白多肽的賴氨酸形式或其功能等同的肽分子;和ii. 富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
15. 權(quán)利要求10至14的任一項(xiàng)的方法,其中融合蛋白是大體上 純化的。
16. 權(quán)利要求10至14的任一項(xiàng)的方法,其中組合物還包含藥學(xué) 上可接受的賦形劑。
17. 權(quán)利要求10至14的任一項(xiàng)的方法,其中組合物還包含表面 活性劑或表面活性劑樣分子。
18. 權(quán)利要求17的方法,其中表面活性劑是十二烷基硫酸鈉。
19. 權(quán)利要求18的方法,其中十二烷基硫酸鈉以允許組合物滲透生物膜的有效量存在。
20. 權(quán)利要求10至14的任一項(xiàng)的方法,其中通過選自食物、食 品添加劑、潔牙劑、凝膠、牙膏、漱口劑、牙線、假牙清洗劑、義齒 粘附劑、口香糖、糖果、咀嚼片劑和溶液的劑型施用組合物。
21. 權(quán)利要求10至14的任一項(xiàng)的方法,其中組合物還包含抗菌 劑、抗微生物劑、抗真菌劑或其組合。
22. 權(quán)利要求10至14的任一項(xiàng)的方法,其中將融合蛋白與另外 的多肽序列連接。
23. 用于抑制口腔中細(xì)菌生長(zhǎng)的組合物,其包含具有SEQ IDNO. 10、 SEQ ID NO. 11或SEQ ID NO. 13的融合蛋白或其功能等同的肽分子。
24.具有SEQ ID NO. 10、 SEQ ID NO. 11或SEQ ID NO. 13的 融合蛋白或其功能等同的肽分子。
全文摘要
本發(fā)明總地說來涉及牙疾病、齲病(caries)和牙周病。更具體地,本發(fā)明涉及乳鐵蛋白(lactoferrin)和富酪蛋白(statherin)融合蛋白(STAT-LF)以及此類多肽的治療性、診斷性和研究性用途。本發(fā)明還提供了治療牙疾病、齲病和牙周病的方法。
文檔編號(hào)C07K14/00GK101657466SQ200880006251
公開日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2008年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月16日
發(fā)明者D·菲勒, N·拉馬蘇布 申請(qǐng)人:新澤西內(nèi)科與牙科大學(xué)