專利名稱：：惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性檢測芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及瘧原蟲抗性相關(guān)基因多態(tài)性檢測芯片，尤其涉及一種惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性檢測芯片及其應(yīng)用。技術(shù)背景惡性瘧在世界范圍內(nèi)流行形勢嚴(yán)峻，每年約100萬人死于惡性瘧，尚不包括間接引起的死亡。我國瘧疾防治取得顯著成就，但瘧疾仍然是我國最重要的寄生蟲病之一，且云南和海南仍然存在惡性瘧流行，歷年均有死亡病例報告。惡性瘧對流行地區(qū)造成嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，藥物抗性的產(chǎn)生進(jìn)一步加重其危害。20世紀(jì)50年代后期在泰緬邊境和哥倫比亞出現(xiàn)氯喹抗性病例。隨后，氯喹抗性幾乎遍布惡性瘧流行區(qū)，哌喹、甲氟喹、乙胺嘧啶和磺胺類藥物抗性株相繼出現(xiàn)，甚至青蒿素類藥物的敏感性也開始下降。研究結(jié)果表明我國也存在較為嚴(yán)重的惡性瘧原蟲抗性問題，呈現(xiàn)以下趨勢抗一種藥物一抗多種藥物，低度抗性一高度抗性，單一抗性一多重抗性，產(chǎn)生抗性慢一產(chǎn)生抗性快。深入理解惡性瘧抗性的產(chǎn)生機(jī)制，準(zhǔn)確快速監(jiān)測抗性株的分布和流行已成為當(dāng)前惡性瘧防治工作面臨的重要問題。近期研究表明抗瘧藥抗性的產(chǎn)生與惡性瘧原蟲某些關(guān)鍵基因的單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)有關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)多個基因的SNP可反映惡性瘧原蟲對相應(yīng)藥物的抗性情況，并在不同地區(qū)的多項研究中得到驗證。已明確的惡性瘧原蟲抗性相關(guān)SNP包括:惡性瘧原蟲氯喹抗性轉(zhuǎn)運蛋白基因(Pfcrt)的391T/A、392G/C、399G/T、400A/G、402T/A和404A/C多態(tài)性(對應(yīng)7276位氨基酸編碼序列)與氯喹抗性相關(guān)聯(lián)(AndersonTJ，NairS,QinH，etal.AntimicrobAgentsChemother,2005，49(6):2180-2188;TagelsirN，IbrahimZ,MedaniA，etal.ActaTrop，2006，97(1):19-25;DittrichS,AlifrangisM,StohrerJM，etal.TropMedIntHealth,2005,10(12):1267-1270);惡性癥原蟲多藥抗性基因(Pfmdrl)的256A/T和257A/T多態(tài)性(對應(yīng)86位氨基酸編碼序列)與甲氟喹、氯喹等多種藥物的抗性有關(guān)(AndersonT丄NairS，QinH,etal.AntimicrobAgentsChemother,2005,49(6):2180—2188;TagelsirN，IbrahimZ，MedaniA,etal.ActaTrop，2006,97(1):19-25;DuraisinghMT，RefourP.MolMicrobiol,2005，57(4):874-877);惡性瘧原蟲二氫喋酸合成酶基因(Pfdhps)的1482T/G、1483C/T/G、1486G/C、1794A/G、1918C/G和2013G/T/A多態(tài)性(對應(yīng)436、437、540、581和613位氨基酸編碼序列)與磺胺類藥物抗性有關(guān)；惡性瘧原蟲二氫葉酸還原酶基因(Pfdhfr)的148T/C、152A/T、153T/C、175T/C、323G/A/C和490A/T多態(tài)性(對應(yīng)50、51、59、108和164位氨基酸編碼序列)與乙胺嘧啶抗性有關(guān)(官亞宜，湯林華.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2005,23(2):117-120;Ha卯iCT，GbotoshoGO,FolarinOA,etal.ActaTrop，2005,95(3):183-193;NdiayeD,DailyJP，Sarr0，etal.TropMedIntHealth,2005，10(11):1176-1179);惡性疙原蟲三磷酸腺苷酶第6亞基基因(PfATPase6)的2306G/A多態(tài)性(對應(yīng)769位氨基酸編碼序列)與青蒿素類藥物IC50升高有關(guān)(JambouR，LegrandE，NiangM，etal.Lancet,2005,366(9501):1960-1963;Eckstein-LudwigU，WebbRJ，VanGoethemID，etal.Nature,2003，424(6951):957-961)。在非洲和東南亞等惡性癥嚴(yán)重流行地區(qū)，上述SNP已被作為分子標(biāo)志用于現(xiàn)場惡性瘧原蟲的藥物抗性評價(官亞宜，湯林華.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2005,23(2):117-120;CongpuongK，NaBangchangK，MungthinM,etal.TropMedIntHealth,2005，10(8):717-722;SyafruddinD,AsihPB，CaseyGJ，etal.AmJTropMedHyg，2005，72(2):174-181;NsimbaB,Jafari-GuemouriS,MalongaDA，etal.TropMedIntHealth.2005，10(10):1030-1037)。為找到一種高效、便捷的檢測這些抗性分子標(biāo)志的手段，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量研究，運用各種分子生物學(xué)技術(shù)，已建立起以下幾種方法。(1)突變特異性PCR(mutation-specificPCR)，該方法利用PCR引物的3，端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計突變特異性PCR擴(kuò)增引物，在嚴(yán)格的條件下，只有在引物3'堿基與模板配對時才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，從而檢測出突變。Djimde等運用該技術(shù)檢測了pfcrt氨基酸76位點的突變情況(Djimde,A.，0.K.Doumbo，J.F.Cortese，etal.NEnglJMed.2001，344:257—263)。(2)巢式PCR-RFLP，巢式PCR是指利用兩對PCR引物對模板DNA進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外側(cè)引物擴(kuò)增出第一輪產(chǎn)物，再以此產(chǎn)物作為內(nèi)側(cè)引物模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。接下來，對第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，根據(jù)酶切產(chǎn)物的電泳圖譜，確定標(biāo)本基因型。Djimde等設(shè)計了pfcrt和pfmdrl基因多態(tài)性的巢式PCR-RFLP檢測方法，用于檢測pfcrt氨基酸76位點和pfmdrl氨基酸86位點的SNP(Djimde,A.,0.K.Doumbo，J.F.Cortese，etal.NEnglJMed.2001，344:257-263)。(3)巢式PCR-DNA測序，首先對模板DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，再對第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與參考序列比對，確定待測標(biāo)本的基因型。該方法被認(rèn)為是目前最為可靠的檢測方法，常用于評價其他檢測方法的準(zhǔn)確性。(4)多重PCR-RFLP，多重PCR是指在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時擴(kuò)增出多個核苷酸片段，然后進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，根據(jù)酶切產(chǎn)物的電泳圖譜，確定標(biāo)本多個位點的基因型。如Veiga等通過進(jìn)行兩次多重PCR反應(yīng)，完成pfcrt、pfmdrl和pfdhfr三個基因目的片段擴(kuò)增，再結(jié)合限制性酶切反應(yīng)，建立了檢測pfcrt氨基酸76位點、pfmdrl氦基酸86位點和pfdhfr氨基酸51、59、108位點的多態(tài)性檢測方法(Veiga，M.I.,P.E.Ferreira，A.Bjorkman，etal.MolCellProbes.2006,20:100-104)。(5)斑點雜交(dotblothybridization),是將核酸樣品點樣并固定在硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再與標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，洗脫非特異性雜交探針后，應(yīng)用放射性探針自顯影或非放射性探針顯色檢測雜交反應(yīng)結(jié)果，從而進(jìn)行DNA多態(tài)性分析。Abdel-Muhsin等通過紫外交聯(lián)技術(shù)將惡性瘧原蟲基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物固定到尼龍膜上，利用7條32p標(biāo)記的序列特異性探針與之雜交，成功檢測了pfdhfr氨基酸51、59和108位點的多態(tài)性(Abdel-Muhsin'A.M.，L.C.Ranford-Cartwright，etal.AmJTr叩MedHyg.2002,67:24-27)。Pearce等應(yīng)用序列特異性寡核苷酸探針斑點雜交方法，建立了Pfdhfr氨基酸50、51、59、108、164位點和pfdhps氨基酸436、437、540、581、613位點的SNP檢測方法(Pearce，R.J.，C.Drakeley，D.Chandramohan，etal.AntimicrobAgentsChemother.2003,47:1347-1354)。(6)分子信標(biāo)(molecularbeacons),該技術(shù)是通過構(gòu)建熒光物質(zhì)標(biāo)記的發(fā)卡型分子探針，這些探針在未結(jié)合時不產(chǎn)生熒光，即便只存在一個堿基的錯配也不會發(fā)出熒光。當(dāng)探針與模板鏈完全互補配對時，構(gòu)象發(fā)生改變，由U型變?yōu)橹本€型，將自動發(fā)出熒光?？梢酝ㄟ^觀察熒光信號的有無或顏色不同，識別出對應(yīng)位點的堿基類型。Durand等運用兩個分子信標(biāo)，其中之一被綠色熒光標(biāo)記，另一被紅色熒光標(biāo)記，分別針對pfdhfr氨基酸108位點的野生型和突變型序列，實現(xiàn)了對該位點多態(tài)性的快速、靈敏檢測(Durand，R.，J.Eslahpazire,S.Jafari，etaLAntimicrobAgentsChemother.2000，44:3461-3464)。(7)實時PCR(rea卜timePCR)，是在PCR及應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量或定性分析的方法。Alker等利用5'端核酸酶實時定量PCR方法(又稱TaqMar/分析方法)，對pfdhfr氨基酸51、59、108位點和pfdhps氨基酸436、437、540、581、613位點的多態(tài)性進(jìn)行了分析(Alker，A.P.，V.Mwapasa，andS.R.Meshnick.AntimicrobAgentsChemother.2004，48:2924-9)。(8)PCR-ELISA，是一種在微孔板上對PCR產(chǎn)物進(jìn)行快速、非放射性的檢測。首先，提取樣本基因組DNA，根據(jù)特異基因序列(模板DNA)設(shè)計的引物進(jìn)行特異擴(kuò)增。在擴(kuò)增的同時，給PCR產(chǎn)物加上某種特殊標(biāo)記，然后令該PCR產(chǎn)物與事先標(biāo)記的捕獲性探針(該探針能與模板DNA內(nèi)部某段序列互補結(jié)合)進(jìn)行雜交，再加入酶標(biāo)抗體反應(yīng)，最后加入底物顯色，測定0D值，以此方法檢測某種特定基因的存在或進(jìn)行基因分型。Alifrangis等利用該技術(shù)建立了pfdhfr、pfdhps和pfcrt三個抗性基因9個位點的多態(tài)性檢測方法(Alifrangis,M.,S.Enosse，R.Pearce,etal.AmJTropMedHyg.2005,72:155-162)。(9)焦磷酸測序(pyrosequencing)，該技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogranT轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反應(yīng)中慘入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，在完成DNA鏈合成同時完成DNA的序列分析。Zhou等嘗試?yán)迷摷夹g(shù)分析pfdhfr和pfdhps基因多個位點的SNP，獲得成功(Zhou,Z.,A.C.Poe，J.Limor,etal.JClinMicrobiol.2006'44:3900-3910)。以上檢測方法各具優(yōu)勢，在惡性瘧原蟲抗性相關(guān)基因多態(tài)性檢測中分別得到了不同程度的應(yīng)用，但這些方法共有的特點是檢測通量有限，每次反應(yīng)都只能平行檢測一個或數(shù)個位點的抗性相關(guān)SNP，且在檢測之前普遍需要先采用巢式PCR方法對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，每檢測一個SNP需進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，消耗較多人力，操作步驟復(fù)雜，所需費用高，時效性欠佳，制約了惡性瘧原蟲抗性相關(guān)分子標(biāo)志在瘧疾防治中的廣泛應(yīng)用，急于尋找一種高效、便捷的手段來檢測這些基因中的抗性相關(guān)分子標(biāo)志。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性檢測芯片，能及時、快速檢測出惡性瘧原蟲是否存在對多種抗瘧藥的抗性，進(jìn)一步指導(dǎo)惡性瘧治療方案的選擇。為此，本發(fā)明還提供一種應(yīng)用上述芯片檢測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性檢測芯片，包括固相載體和探針，所述探針與待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補序列進(jìn)行雜交。所述待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因至少包括一種或兩種以上的下述基因Pfdhfr(惡性瘧原蟲二氫葉酸還原酶基因)、Pfmdrl(惡性瘧原蟲多藥抗性基因)、PfATPase6(惡性瘧原蟲三磷酸腺苷酶第6亞基基因)、Pfdhps(惡性瘧原蟲二氫喋酸合成酶基因)和Pfcrt(惡性瘧原蟲氯喹抗性轉(zhuǎn)運蛋白基因)。所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要能完成與目的核苷酸序列特異性結(jié)合。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過40個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以20-30個堿基對之間的為最佳。所述探針的自身互補序列最好少于6個堿基對，以免影響雜交效率。本發(fā)明檢測芯片的探針為DNA，至少包括下述一種或兩種以上的探針(1)與待測Pfdhfr基因雜交的探針，其包含選自(a)SEQIDN0:1SEQIDN0:16所示序列，(b)SEQIDN0:1SEQIDNO:16所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQIDN0:1SEQIDNO:16所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(2)與待測Pfmdrl基因雜交的探針，其包含選自(a)SEQIDN0:17SEQIDN0:20所示序列，(b)SEQIDN0:17SEQIDN0:20所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQIDN0:17SEQIDN0:20所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(3)與待測PfATPase6基因雜交的探針，其包含選自(a)SEQIDN0:21SEQIDN0:23所示序列，(b)SEQIDN0:21SEQIDN0:23所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQIDN0:21SEQIDN0:23所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(4)與待測Pfdhps基因雜交的探針，其包含選自(a)SEQIDN0:24SEQIDN0:40所示序列，(b)SEQIDN0:24SEQIDN0:40所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQIDN0:24SEQIDN0:40所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(5)與待測Pfcrt基因雜交的探針，其包含選自(a)SEQIDN0:41SEQIDN0:45所示序列，(b)SEQIDN0:41SEQIDN0:45所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQIDN0:41SEQIDN0:45所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列。優(yōu)選的，本發(fā)明檢測芯片的探針包括選自SEQIDN0:1SEQIDN0:45所示的序列。所述探針序列可包含1-10個錯配堿基，較佳地，可包含1-5個錯配堿基，更佳地，可包含l-2個錯配堿基。本發(fā)明檢測芯片還包括至少一種對照探針，所述對照探針選自陰性對照探針、陽性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針。所述探針可通過連接臂固定于固相載體上。連接臂可以為探針形成雙鏈的部分提供一個自由的空間以減少空間位阻，有助于雜交反應(yīng)的進(jìn)行[AfanassievV，HanemannV,WolflS.NucleicAcidsRes.2000,28:e66;USAPatentNo.5556752]。連接臂越長，雜交效率越高。典型的連接臂包括1530個功能基團(tuán)長度。連接臂可以選用適當(dāng)形式的功能基團(tuán)，如PolyT(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇與PolyT(A、C或G)的嵌合體、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其組合物。所述探針或連接臂通過連接分子固定于固相載體上。探針固定到載體上可以通過C-C鍵實現(xiàn)，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧垸鍵(玻璃或二氧化硅作支持物時使用)。硅氧垸鍵鍵合可以通過支持物和連接分子的三氯甲硅垸基或三烷氧基甲硅烷基等基團(tuán)反應(yīng)完成。氨基垸基硅垸、輕基垸基硅烷、2—輕乙基一氨丙基三乙氧基硅垸、輕乙基一氨丙基三乙氧基硅垸或輕丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基團(tuán)。所述探針可以被修飾，修飾方法可以是5'-^^修飾、5'-SH修飾、5'-PolyT(A、C或G)修飾、5，-生物素修飾、3，-NH2修飾、3，-SH修飾、3，-PolyT(A、C或G)修飾和3'-生物素修飾等。所述探針可以有一條或幾條，甚至全部都是經(jīng)過標(biāo)記的，所述標(biāo)記包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記、酶標(biāo)記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記。本發(fā)明中所述固相載體可選用領(lǐng)域周知的載體，只要所述載體與所述反應(yīng)物相容，不會影響檢測結(jié)果即可。優(yōu)選的，本發(fā)明所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應(yīng)用上述芯片檢測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟(1)在固相載體表面點載與待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補序列進(jìn)行雜交的探針；(2)抽提待測樣品核酸；(3)制備待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因目的核苷酸序列；(4)標(biāo)記步驟(3)的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(1)所述的點載在固相載體上的探針進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的目的核苷酸序列，并使其反應(yīng)足夠時間；(6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種應(yīng)用上述芯片檢測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟(1)標(biāo)記與待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補序列進(jìn)行雜交的探針；(2)抽提待測樣品核酸；(3)制備待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因目的核苷酸序列；(4)在固相載體表面點載步驟(3)所述的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(4)所述的點載在固相載體上的目的核苷酸序列進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的探針，并使其反應(yīng)足夠時間；(6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。所述目的核苷酸序列的制備可包括擴(kuò)增的步驟，用分離的靶樣本中含核酸的細(xì)胞直接擴(kuò)增，也可用抽提的靶核酸直接擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的單鏈或雙鏈的DNA或RNA可含有熒光或生物素標(biāo)記，標(biāo)記的DNA或RNA可不經(jīng)純化直接用于雜交。與本發(fā)明中所述芯片雜交的優(yōu)選靶核苷酸分子是單鏈核酸分子，雙鏈核酸分子經(jīng)過變性等處理后也與本發(fā)明所述芯片雜交。目的核苷酸序列可使用任何適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法進(jìn)行富集，如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)，多重PCR，連接酶鏈反應(yīng)(ligasechainreaction,LCR)，滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcycleamplification,RCA)，基于核酸序列的擴(kuò)增(nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA)，鏈置換擴(kuò)增(stranddisplacementamplification,SDA)禾口轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(transcriptionmedicatedamplification,TMA)等。在本發(fā)明的一個實施例中，目的核苷酸序列的制備采用多重PCR擴(kuò)增方法。所述探針或目的核苷酸序列都適合用于標(biāo)記。探針在合成引入標(biāo)記，目的核苷酸序列可以在擴(kuò)增中引入標(biāo)記，或者擴(kuò)增后用合適的方法引入標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、發(fā)色團(tuán)、發(fā)光體、FRET、酶、生物素或有特殊結(jié)合配體的配基。本發(fā)明方法的雜交可在任何適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行，如25'C65'C，所述雜交時間為2分鐘18小時?？梢愿淖冸s交條件以提高或降低雜交的嚴(yán)謹(jǐn)程度、雜交特異性。本發(fā)明的惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性檢測芯片及其應(yīng)用，能同時進(jìn)行多個惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性的檢測，一次芯片反應(yīng)完成5個基因21個主要抗性相關(guān)單核苷酸多態(tài)性的檢測，結(jié)果準(zhǔn)確、通量高。采用本發(fā)明的芯片方法檢測87份現(xiàn)場標(biāo)本，其結(jié)果與采用傳統(tǒng)巢式PCR結(jié)合測序方法檢測該87份現(xiàn)場標(biāo)本的結(jié)果相比較，一致率為98.7%。本發(fā)明芯片內(nèi)部三次平行檢測結(jié)果一致率為98.2%，30份標(biāo)本不同批次芯片兩次獨立檢測，外部一致率為95.7%。模板DNA量達(dá)0.06ng即滿足擴(kuò)增和芯片檢測要求。5份近緣蟲種對照(間日瘧原蟲、伯氏瘧原蟲、食蟹猴癥原蟲、杜氏利什曼原蟲和牛源隱孢子蟲)經(jīng)芯片檢測，特異性探針均無陽性信號。此外，本發(fā)明芯片顯著提高了惡性瘧原蟲抗性分子標(biāo)志的檢測效率。以巢式PCR結(jié)合測序方法為例，每檢測一個抗性基因的多態(tài)性需進(jìn)行2次PCR反應(yīng)，檢測5個抗性相關(guān)基因的多態(tài)性，則需10次PCR反應(yīng)，約需5個工作日，加上測序所用時間，至少6個工作日方能完成。運用本發(fā)明的方法，從基因擴(kuò)增到完成基因型判定，整個過程只需約8小時(多重PCR需4小時，DNA片段化和標(biāo)記2小時、雜交1.5小時，洗片0.25小時，掃描和結(jié)果分析0.25小時)。兩名實驗室技術(shù)人員在一個工作日內(nèi)可完成50份標(biāo)本的21抗性相關(guān)SNP的檢測。本發(fā)明一張芯片可檢測10份標(biāo)本的21個SNP，每張芯片片基市場價約20元，加上PCR反應(yīng)、熒光標(biāo)記、雜交反應(yīng)等試劑和耗材費用，每檢測一個SNP約需4.5元，成本顯著低于傳統(tǒng)方法。本發(fā)明的芯片可滿足大規(guī)模多位點SNP同時檢測的要求，特別適用于抗性分子標(biāo)志的現(xiàn)場監(jiān)測，且本發(fā)明芯片能快速掌握惡性瘧流行區(qū)的多類藥物抗性產(chǎn)生情況，指導(dǎo)治療方案的調(diào)整，從而提高惡性瘧的防治效果，減輕該病造成的社會、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。圖1是本發(fā)明芯片的探針排布示意圖；圖2是本發(fā)明多重PCR擴(kuò)增后的電泳檢測結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實施例1芯片檢測的雜交結(jié)果圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實施例l反向雜交1.基因芯片的制備(1)探針溶解每條探針用TE溶液稀釋，終濃度為50MM。將濃度為50幽的探針與濃度為200mM的PBS溶液(含0.05%SDS)于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心，-2(TC保存，以備點樣使用。(2)點樣將預(yù)先設(shè)計并合成好的探針(見表l)通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、硅片等材質(zhì)的固相載體片基上。表l所列的探針序列中，名稱為A1、Bl、Cl、Dl、El、Fl、G3、Hl、II、Jl、Kl的探針序列對應(yīng)的基因型為野生型，其余探針對應(yīng)的基因型為突變型。所述片基采用北京博奧生物有限公司的晶芯②醛基片基。GeneMachine公司的0mniGrid111IOO型號的點樣儀，在濕度55%-65%，溫度為25'C的條件下點樣，點樣的格式為1X3，每個矩陣為5X10，點樣完畢后，放置半小時后，將芯片取出，室溫干燥保存。芯片探針排布如圖l所示。表l.芯片所用探針序列SEQIDNO名稱對應(yīng)基因型序列(5'-3')1Alpfdhfr-50CNNH2-(T)15-CCATGGAAATGTAATTCCCTAGATAT2A2-50CINH2-(T)15-CCATGGAAATGTATTTCCCTAGATAT3A3-50CN2NH2-(T)15-CATGGAAATGTAACTCCCTAGATATG4A4-50RNNHr(T)15-CCATGGAAACGTAATTCCCTAGATAT5A5-50RN2NHr(T)15-CATGGAAACGTAACTCCCTAGATAT6A6-50RINH2-(T)15-CCATGGAAACGTATTTCCCTAGATAT7Bl-59CNH2-(T)15-ATATGAAATATTTTTGTGCAGTTACAACAT<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2多重PCR反應(yīng)所用引物及擴(kuò)增產(chǎn)物長度<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>多重PCR反應(yīng)體系為IOXPCR緩沖液(含20mmol/LMg2+)5.0ul，10面ol/L脫氧核苷三磷酸(dNTPs)1.2yl，引物混合物液(組成3.2u112.5umol/LP1F、3.2ii112.5umol/LP1R、2.0u112.5umol/LP2F、2.0y112.5umol/LP2R、2.0u112.5ymol/LP3F、2.0ix112.5ymol/LP3R、2.0y112.5ymol/LP4F、2.0u112.5ixmol/LP4R、2.0u112.5Pmol/LP5F、2.0y112.5umol/LP5R)l.Oixl,模板DNA2.5ul，5U/ulHotStartTaqDNA聚合酶0.4yl，加滅菌雙蒸水至50.0u1。擴(kuò)增參數(shù)94°C預(yù)變性15min;94°C變性40s、50°C退火2min、由50。C按0.1°C/s遞增至72°C，共40循環(huán)；72°C延伸3min。PCR結(jié)束后用2.0%瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增結(jié)果，如圖2所示，5條特異性目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物長度由下往上依次分別為315bp、437bp、514bp、594bp和770bp。3.PCR產(chǎn)物純化和片段化PCR產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen，Hilden，德國)純化。純化的PCR經(jīng)測定濃度后，用DNaseI(Takara，大連，中國)進(jìn)行片段化。30W片段化的反應(yīng)體系包括lXDNasel緩沖液，200ng/W純化PCR產(chǎn)物，DNaseI(0.001U/ug)。反應(yīng)條件為37。C溫浴5min，然后95°C15min。4.熒光素標(biāo)記用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(DeoxynucleotidylTransferase,TDT)進(jìn)行熒光素標(biāo)記，25W反應(yīng)體系含200mMpotassiumcacodylate，25mMTris-HCl(pH7.2)，lmMCoCl"0.01%TritonX-100，20,Cy3-dCTP(GEHealthcare,USA)，20UTDT(Fermentas，Lithuania)，37。C標(biāo)記l小時，隨后于95。C變性10min。5.雜交、洗滌和結(jié)果檢測熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物95。C變性5min，立即置于冰上，用于雜交，雜交反應(yīng)體系包括15u1熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，1.2P120XSSPE,0.2u11%Triton,0.9u1lOXDenhardts，0.5u1甲酰胺，2.2u1ddH20。反應(yīng)條件為52'C溫浴2小時，雜交后，芯片分別用2XSSC和1%SDS、IXSSC和0.2%SDS的洗液42'C洗滌6min。最后用0.6XSSC洗液于室溫洗滌3min，并甩干。甩干的芯片用GenePix4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。以惡性瘧原蟲國際標(biāo)準(zhǔn)株3D7株為例，掃描雜交后的芯片得到的雜交結(jié)果如圖3所示，再用GenePixPro軟件處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析即可確定待測標(biāo)本各多態(tài)性位點的基因型。圖3所示的分型結(jié)果是pfdhfr50/51CN,59C，108S，1641;pfmdrl86N;pfATPase6769S;pfdhps436/437SG，540K,581A，613A;pfcrt72-76CVMNK。其中，pfdhfr50/51CN說明pfdhfr蛋白第50位氨基酸是C(Cys，半胱氨酸)、第51位氨基酸是N(Asn，天冬酰胺)。其它的分型結(jié)果按類似方式解釋。采用本發(fā)明的芯片方法檢測87份現(xiàn)場標(biāo)本，其結(jié)果與采用傳統(tǒng)巢式PCR結(jié)合測序方法檢測該87份現(xiàn)場標(biāo)本的結(jié)果相比較，一致率為98.7%。本發(fā)明芯片內(nèi)部三次平行檢測結(jié)果一致率為98.2%，30份標(biāo)本不同批次芯片兩次獨立檢測，外部一致率為95.7%。模板DNA量達(dá)0.06ng即滿足擴(kuò)增和芯片檢測要求。5份近緣蟲種對照(間日瘧原蟲、伯氏瘧原蟲、食蟹猴瘧原蟲、杜氏利什曼原蟲和牛源隱孢子蟲)經(jīng)芯片檢測，特異性探針均無陽性信號。這些結(jié)果和數(shù)據(jù)表明，應(yīng)用本發(fā)明芯片檢測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因的多態(tài)性，準(zhǔn)確率高，且速度快，適于惡性瘧原蟲抗性分子標(biāo)志的現(xiàn)場監(jiān)測，為迅速掌握惡性瘧流行區(qū)的多類藥物抗性產(chǎn)生情況并及時調(diào)整治療方案提供了有效的檢測手段。實施例2正向雜交1.惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因的擴(kuò)增和芯片制備利用上述表2的5對引物，以惡性瘧原蟲基因組DNA為模板，擴(kuò)增產(chǎn)生包含21個SNP位點的5個抗性相關(guān)基因目的片段。多重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例1。PCR產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen，Hilden，德國)純化。將純化的PCR產(chǎn)物濃度調(diào)整至400ng>l。將濃度為400ng/W的PCR產(chǎn)物與100%的DMSO于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心。將200ng/W的PCR產(chǎn)物通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、硅片等材質(zhì)的固相載體片基上。采用GeneMachine公司的0minigrid100型號的點樣儀，在濕度55%_65%,溫度為25'C的條件下點樣，點樣完畢放置半小時后，將芯片放于飽和食鹽水盒中，37T:水化過夜，次日取出，600mj交聯(lián)，交聯(lián)完畢之芯片即可使用。2.芯片雜交雜交反應(yīng)體系包括2nM熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針(見表l)，1.2W20XSSPE，0.2W1%Triton，0.9W10XDenhardts，0.5W甲酰胺，2.2WddH20。反應(yīng)條件為52t溫浴2小時，雜交后，芯片分別用2XSSC和1%SDS、IXSSC和0.2%SDS的洗液42。C洗滌6min。最后用0.6XSSC洗液于室溫洗滌3min，并甩干。用GenePix4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。序歹U表〈110〉中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所〈120〉惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性檢測芯片及其應(yīng)用〈130〉NP-08-12168〈160〉45〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉26〈212〉腿〈213〉人工序列〈■>1ccatggaaatgtaattccctagatat26〈210〉2<211>26〈212〉腿〈213〉人工序列〈210〉3<211〉26〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉3catggaaatgtaactccctagatatg26〈210〉4〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉2ccatggaaatgtatttccctagatat〈400〉ccatggaaacgtaattccctagatat〈210>〈211〉〈212〉〈213〉525DNA人工序列〈400〉5catggaaacgtaactccctagatat25〈210〉6〈211〉26<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉6ccatggaaacgtatttccctagatat26〈210〉7〈211〉30<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉7atatgaaatatttttgtgcagttacaacat30〈210〉8〈211〉26〈212〉腿<213>人工序列<400>8atgaaatattttcgtgcagttacaac26〈210〉9<211>26〈212〉■〈213〉人工序列<400〉93tgaaatattttggtgcagttacaac26〈210>10〈211〉20〈212〉DNA<213>人工序列<400>10gaagaacaagctgggaaagc20<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>〈400〉16atgttttattctaggaggttccg23<210>17〈211>28〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉17attaaagaacatgaatttaggtgatgat.28〈210〉18〈211>28〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉18attaaagaacatgtatttaggtgatgat28〈210〉19〈211〉28<212〉DNA〈213〉人工序列<400>19ttaaagaacatgtttttaggtgatgata28〈210〉20<211>26〈212>腿〈213〉人工序列〈400>20ttaaagaacatgcatttaggtgatga26<210〉21〈211〉38〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>21tttgcttataaaaaattaagtagtaaagatttaaatait38<210〉22〈211〉39〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉22ctttgcttataaaaaattaaatagtaaagatttaaatat39〈210>23〈211〉38〈212〉DNA<213〉人工序列〈400>23tttgcttataaaa3attaactagtaaagatttaaatat38〈210〉24<211>21〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉24agaatccgctgctccttttgt21〈210〉25〈211>21〈212〉腿〈213>人工序列〈400〉25agaatccgctggtccttttgt21<210>26〈211〉21<212>DNA<213>人工序列<400>26gagaatcctctgctccttttg21〈210〉27<211>21〈212〉DNA<213〉人工序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>〈210〉33<211〉27<212〉■<213>人工序列〈400〉33cacatacaatggatcaactaacaaatt27〈210〉34〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>34gattaggatttgcgaagaaaceitg24〈210〉35〈211〉25〈212〉腿<213〉人工序列〈400〉35gattaggatttgggaagaaacatga25<210〉36〈211〉24'<212>腿<213>人工序列〈400〉36gattaggatttgagaagaaacatg24〈210〉37〈211>25〈212>腿.〈213〉人工序列〈400〉37aaaagatttattgcccattgcatga25〈210〉38<211>28〈212>腿<213>人工序列〈400〉38aaaaagatttatttcccattgcatgaat28〈210〉39〈211〉28〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉39aaaaagatttattacccattgcatgaat28<210〉40〈211〉25〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉40aaaagatttattccccattgcatga25〈210〉41<211〉30〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉41gtgtatgtgtaatgaataaaatttttgcta30〈210〉42〈211〉30〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉42tgtatgtgtaattgaaacaatttttgctaa30<210>43<211>34〈212〉腿<213>人工序列<400〉43tatttatttaagtgtaagtgtaatgaatacaatt34〈210〉44〈211〉30〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉44gtgtatgtgtaattgaaaaaatttttgcta30<210〉45<211〉38<212>腿<213〉人工序列〈400〉45tatttatttaagtgtatctgtaatgaatacaatttttg38權(quán)利要求1.一種惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性檢測芯片，包括固相載體和探針，其特征在于，所述探針與待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補序列進(jìn)行雜交。2.如權(quán)利要求1所述的檢測芯片，其特征在于，所述待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因至少包括一種或兩種以上的下述基因Pfdhfr、Pfmdrl、PfATPase6、Pfdhps和Pfcrt。3.如權(quán)利要求1或2所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針為DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。4.如權(quán)利要求3所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針為DNA，至少包括下述一種或兩種以上的探針(1)與待測Pfdhfr基因雜交的探針，其包含選自(a)SEQIDN0:1SEQIDN0:16所示序列，(b)SEQIDN0:1SEQIDNO:16所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQIDN0:1SEQIDNO:16所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(2)與待測Pfmdrl基因雜交的探針，其包含選自(a)SEQIDN0:17SEQIDN0:20所示序列，(b)SEQIDN0:17SEQIDN0:20所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQIDN0:17SEQIDN0:20所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(3)與待測PfATPase6基因雜交的探針，其包含選自(a)SEQIDN0:21SEQIDN0:23所示序列，(b)SEQIDN0:21SEQIDN0:23所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQIDN0:21SEQIDNO:23所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列;(4)與待測Pfdhps基因雜交的探針，其包含選自(a)SEQIDN0:24SEQIDN0:40所示序列，(b)SEQIDN0:24SEQIDN0:40所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQIDN0:24SEQIDN0:40所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(5)與待測Pfcrt基因雜交的探針，其包含選自(a)SEQIDN0:41SEQIDN0:45所示序列，(b)SEQIDN0:41SEQIDN0:45所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQIDN0:41SEQIDN0:45所示序列中每條序列有至少70%同源性的序列。5.如權(quán)利要求4所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針包括選自SEQIDN(hlSEQIDN0:45所示的序列。6.—種應(yīng)用權(quán)利要求1所述芯片檢測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在固相載體表面點載權(quán)利要求l所述的探針；(2)抽提待測樣品核酸；(3)制備待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因的目的核苷酸序列；(4)標(biāo)記步驟(3)的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(1)所述的點載在固相載體上的探針進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的目的核苷酸序列，并使其反應(yīng)足夠時間；(6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述目的核苷酸序列的標(biāo)記采用包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記或酶標(biāo)記。8.—種應(yīng)用權(quán)利要求1所述芯片檢測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)標(biāo)記權(quán)利要求l所述的探針；(2)抽提待測樣品核酸；(3)制備待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因的目的核苷酸序列；(4)在固相載體表面點載步驟(3)所述的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(4)所述的點載在固相載體上的目的核苷酸序列進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的探針，并使其反應(yīng)足夠時間；(6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(l)所述的探針標(biāo)記采用包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記或酶標(biāo)記。全文摘要本發(fā)明涉及基因多態(tài)性檢測芯片，公開了一種惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性檢測芯片，該芯片包括固相載體和探針，所述探針與待測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補序列進(jìn)行雜交。本發(fā)明還公開了所述芯片用于檢測惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性的方法。本發(fā)明的檢測芯片能同時進(jìn)行多種惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)基因多態(tài)性的檢測，可用于惡性瘧原蟲藥物抗性相關(guān)分子標(biāo)志的現(xiàn)場監(jiān)測，以快速掌握惡性瘧流行區(qū)的多種藥物抗性產(chǎn)生情況，指導(dǎo)治療方案的調(diào)整，從而提高惡性瘧防治效果，減輕該病造成的社會、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。文檔編號C07H21/00GK101240344SQ200810043028公開日2008年8月13日申請日期2008年1月16日優(yōu)先權(quán)日2008年1月16日發(fā)明者官亞宜,張國慶,松武,湯林華申請人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所