專利名稱：一種具有抗菌及促傷口愈合功能的融合多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，尤其涉及具有抗菌及促傷口 愈合功能的融合多肽。
背景技術：
兩棲類動物皮膚濕潤、裸露，無疑給外界微生物的侵入 提供了便利條件，為了自身生存和適應棲息地的多樣化生態(tài)環(huán)境的需 要，它們依靠皮膚腺體分泌出一系列抗菌肽，防御外界病原菌的侵襲。 抗菌肽具有高效廣譜的抗細菌、真菌、病毒、寄生蟲、腫瘤、內(nèi)毒素以 及免疫趨化、促進創(chuàng)面修復等多種生物學功能，成為兩棲類動物先天免 疫的第一道防線。兩棲動物種類繁多、作用各異的抗菌肽構成了抗菌肽 的天然資源庫。因此，兩棲類動物抗菌肽開發(fā)利用有望成為繼傳統(tǒng)抗生 素之后的又一類重要的新型抗菌藥物，為解決病原菌對傳統(tǒng)抗生素曰益 增強的耐藥性這一棘手難題提供新途徑。但是現(xiàn)有抗菌肽直接應用存在的問題是(1) 抗菌肽分子量過小導致表達過程中降解。(2) 由于抗菌肽是一類小分子肽，分離純化難度較大。(3) 在基因工程表達過程中，抗菌肽對宿主細胞具有殺傷作用。(4) 天然提取抗菌肽的產(chǎn)量低、成本高。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種含有從東北林蛙 皮膚中提取的東北林蛙抗菌肽、并且可有效保護宿主細胞不被殺傷，易 于分離純化的具有抗菌及促傷口愈合功能的融合多肽。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是包括序列表SEQID NO. 1所述的人表皮生長因子氨基酸序列、序列表SEQ ID NO. 2所述的凝 血酶酶切位點氨基酸序列和序列表SEQ ID NO. 3所述的東北林蛙抗菌肽 氨基酸序列；凝血酶酶切位點將人表皮生長因子和東北林蛙抗菌肽融合 在一起，構建的融合多肽具有序列表SEQ ID N0.4所述氨基酸序列。本發(fā)明所涉及的東北林蛙抗菌肽為東北林蛙皮膚中新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽家族成員，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所述，我們命名為 dybowskin-2CDYa。其具有正電荷數(shù)量高，親水性強，具有廣譜的抗革 蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌的活性。不具有溶血性，因此使用安 全性高。從東北林蛙皮膚中新發(fā)現(xiàn)的東北林蛙抗菌肽dybowskin-2CDYa的制 備方法是將活體東北林蛙用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，8V 直流電刺激，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從東北林蛙皮膚分泌出來，收集分 泌物，立即加入乙酸使其終濃度為4%，酸化處理，冷凍干燥，經(jīng) S印hadexG-50層析，收取II峰，濃縮凍干，凍干物經(jīng)S印hadexA-25層 析，收取IV峰，濃縮，凍干，再經(jīng)反相高效液相色譜(HPLC ) C18柱 分離純化，取PT-HPLC的峰VH，即為從東北林蛙皮膚中分離出的抗菌肽 dybowskin-2CDYa。利用PT-HPLC方法鑒定其純度。分子量測定采用快 原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment . 55 spectrometry ， 以B 一 Ms )，測得分子量為2184.2;等電聚焦電泳測定等電點，測得等 電點為12.60;用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。氨基酸序列 如序列表中SEQ ID NO. 3所述的氨基酸序列。人表皮生長因子(Human Epidermal Growth Factor, hEGF)是重 要的生長因子之一，也是最早發(fā)現(xiàn)并試用于臨床的生長因子之一，其氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。臨床表明，hEGF能促進皮膚創(chuàng)面組織修 復過程中DNA、 RNA和羥脯氨酸的合成，誘導分化成熟的表皮細胞逆轉(zhuǎn) 化為表皮干細胞，加速創(chuàng)面肉芽組織的生成和上皮細胞的增殖，促使外 胚層細胞和毛細血管生長，促進燒傷、創(chuàng)傷及外科傷口的愈合，加速移 植表皮和移值角膜的生長，從而縮短創(chuàng)面的愈合時間，提高創(chuàng)面修復質(zhì) 量。因此，hEGF對創(chuàng)燒傷救治、皮膚和角膜移植、外傷性皮膚潰瘍等治 療已有廣泛使用。人表皮生長因子可用于(i)燒傷、燙傷、灼傷創(chuàng)面(包括淺n度、深II度創(chuàng)面)，殘余小創(chuàng)面，供皮區(qū)創(chuàng)面等的治療；(2)各類慢性潰瘍 創(chuàng)面(包括糖尿病性、血管性、放射性潰瘍)等；(3)各類新鮮及難 愈性皮膚創(chuàng)面的治療；(4)如普通創(chuàng)面、足壞疽、角膜炎、鼓膜穿孔、褥瘡、口腔潰瘍、黃雀斑、激光手術防護等。本發(fā)明中，利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術，構建含有人表皮生 長因子、凝血酶酶切位點和東北林蛙抗菌肽dybowskin-2CDYa的融合蛋 白基因，克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K或pPICZ a系列中，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris)。篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，通過高密度 發(fā)酵表達及分離純化獲得重組融合多肽。該融合多肽穩(wěn)定性好，酶解后 具有廣譜抗菌、促細胞分裂功能。以凝膠劑、噴劑等劑型給藥可以應用 到人及哺乳動物的燒傷、燙傷、創(chuàng)傷等外傷治療。具有防止傷口感染、 加快傷口愈合的作用。利用凝血酶酶切位點(Leu-Val-Pro-Arg-Ala-Ser)將具有皮膚修復功能的人表皮生長因子和具有抗菌功能的東北林蛙抗菌肽基因融合 在一起，構建新型融合多肽，將編碼上述融合蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入 酵母分泌型表達載體中并在畢赤酵母(Pichiapastoris)中進行表達。 哺乳動物體內(nèi)的各種凝血酶能特異性識別該融合多肽中的凝血酶酶切 位點并切割融合多肽，使融合多肽在人體傷口應用時能自動裂解成同時 具有皮膚修復功能的人表皮生長因子和抗菌功能的東北林蛙抗菌肽。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明將兩種蛋白采用融合的方式表達解決 了以下問題(1) 增大了抗菌肽dybowskin-2CDYa的分子量，防止由于抗菌肽 分子量過小引起的表達過程中的降解。(2) 可降低分離純化的難度。由于抗菌肽是一類小分子肽，分離 純化及其困難。利用融合表達，增大抗菌肽分子量，大大降低融合多肽的分離純化難度。(3) 融合表達降低抗菌肽的抑菌活性。防止分泌表達過程中，抗 菌肽對宿主細胞的殺傷作用。(4) 在體表應用時融合多肽被凝血酶從凝血酶切割位點切斷從而 獲得具抗菌功能的抗菌肽和具有修復功能的表皮生長因子。本發(fā)明采用酵母細胞融合表達具有以下優(yōu)點(1) 天然提取抗菌肽具有產(chǎn)量低、成本高的問題。本發(fā)明為抗菌 肽的來源提供新的途徑。(2) 抗菌肽對宿主細胞具有殺傷作用。本發(fā)明利用融合表達使抗 菌肽的抗菌活性大大降低，可有效保護宿主細胞不被殺傷。(3) 降低分離純化難度。酵母表達系統(tǒng)自分泌的蛋白極少，因此可通過常規(guī)的層析、透析等方法進行分離純化。(4) 不需另外使用蛋白酶進行酶切。通過人或哺乳動物血液中含 有的凝血酶即可將融合蛋白酶切，使抗菌肽及人表皮生長因子的活性恢復。
具體實施方式
舉例實施例l具有抗菌及促傷口愈合功能的融合多肽(一)hEGF-抗菌肽融合多肽真核表達根據(jù)hEGF的DNA序列設計引物Pl(序列見序列表中SEQ ID NO. 5)、 P2 (序列見序列表中SEQ ID NO. 6) 、 P3 (序列見序列表中SEQ ID NO. 7)、 P4 (序列見序列表中SEQ ID NO. 8)用于組建人表皮生長因子基因 (力況70;特異引物E1 (序列見序列表中SEQ ID NO. 9)和E2 (序列見 序列表中SEQ ID NO. 10)，用于擴增力漢^并在其5，、 3，端分別加掛 EcoR I酶切位點及凝血酶酶切位點。P1: AATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTG; P2: CATACTTGTCCAATGCTTCAATATACATGCACACACCATCATGGAGGCAGTACC;P3: TGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGG;P4: CCACCACTTCAGGTCTCGGTACTGACATCGCTCCCCGATGTAGCCAACMCACAG;E1: CCGGAATTCMTAGTGACTCTGAATGTC ;E2: AGAACCTCTTGGAACCAAGCGCAGTTCCCACCACTTCAGGTCTC 。從東北林蛙皮膚中新發(fā)現(xiàn)的東北林蛙抗菌肽dybowskin-2CDYa的制 備方法是將活體東北林蛙用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，8V 直流電刺激，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從東北林蛙皮膚分泌出來，收集分 泌物，立即加入乙酸使其終濃度為4%，酸化處理，冷凍干燥，經(jīng) S印hadexG-50層析，收取II峰，濃縮凍干，凍干物經(jīng)S印hadexA -25層 析，收取IV峰，濃縮，凍干，再經(jīng)反相高效液相色譜(HPLC ) C18柱 分離純化，取PT-HPLC的峰VH，即為從東北林蛙皮膚中分離出的抗菌肽 dybowskin-2CDYa。利用PT-HPLC方法鑒定其純度。分子量測定采用快 原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment 55 spectrometry ， 以B 一 Ms )，測得分子量為2184.2;等電聚焦電泳測定等電點，測得等 電點為12.60;用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。氨基酸序列 如序列表中SEQ ID NO. 3所述的氨基酸序列。設計特異引物Z73-1 (序列見序列表中SEQ ID NO. 11)和Z73-2 (序 列見序列表中SEQ ID NO. 12)，用于擴增東北林蛙抗菌肽基因序列并 在其5，、 3'端分別加掛凝血酶酶切位點及Not I酶切位點。 Z73-1: TTGGTTCCAAGAGGTTCTTCTGCAGTAGGAAGACATAG Z73-2: ATAGTTTAGCGGCCGCTTAATGTTTTCTGTGTTTTC將擴增得到的A^^和東北林蛙抗菌肽基因序列共同作為模板，利 用兩端引物E1和Z73-2進行擴增，得到從5'端到3'端依次為人表皮生長因子、凝血酶酶切位點、東北林蛙抗菌肽融合基因。融合基因與酵 母分泌型表達載體pPIC9K (或pPICZ a )分別經(jīng)EcoRI、 Notl雙酶切后 進行連接，經(jīng)測序證實堿基序列及讀碼框無誤后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。以宿主基因組DNA為模板，利用a-factor、 3' AOX載體通用引物進行 擴增，得到430bp片段，證實目的融合多肽基因以插入宿主基因組內(nèi)； 以宿主總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，以E1、 Z73-2特異引物進行 擴增，得到260bp片段，證實外源融合多肽基因能夠轉(zhuǎn)錄；利用G418 篩選多拷貝的陽性克隆子，并進行甲醇誘導表達。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE 分析證實上清液中含有目的蛋白，其顯示為約9KD蛋白產(chǎn)物。 (二)融合多肽的純化將發(fā)酵的上清液進行超濾濃縮，超濾板截留量為3.5kD，超濾產(chǎn)物 進行S印hadex G-50層析。收集目的蛋白峰，冷凍干燥即為融合多肽。實施例2:融合多肽凝血酶酶切產(chǎn)物的抗菌實驗利用瓊脂擴散法檢測體外抑菌活性。受試菌株為蠟狀芽孢桿菌標準 株72《)；出血性大腸桿菌0157、鮑曼溶血不動桿菌、產(chǎn)氣腸 桿菌、耳葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門 桿菌、綠膿桿菌分離株。取未經(jīng)酶切的融合多肽及生理鹽水作為對照。 結果顯示酶切后的多肽對上述所有受試菌株均有強大的殺傷作用，抑 菌圈直徑均大于20mm (0〈8ram視為無抑菌活性)。不同菌株的抑菌圈直 徑大小差異不顯著。未經(jīng)酶切的融合多肽及及生理鹽水不具抗菌活性。實施例3:融合多肽凝血酶切產(chǎn)物的促細胞分裂活性實驗以原代培養(yǎng)的大鼠肺成纖維細胞、人胚腎HEK293細胞系為受試細 胞。利用MTT法進行融合多肽酶切產(chǎn)物的促細胞生長活性分析，并以人 表皮生長因子(hEGF)標準品為陽性對照，以Hanks緩沖液為陰性對照。 試驗結果顯示融合多肽凝血酶切產(chǎn)物及hEGF均能明顯促細胞分裂， 二者之間無顯著差異，但與陰性對照差異極其顯著。實施例4:融合多肽酶切產(chǎn)物的溶血活性實驗用血色素的泄露來評估溶血性，從而考察融合多肽的使用安全性。 用生理鹽水配成2%健康人血紅細胞懸液，并加入一定濃度的融合多肽酶切產(chǎn)物。37。C孵育lh后離心取上清，測540nm吸光值，并計算溶血率。 以生理鹽水作為陰性對照。結果顯示在融合多肽酶切產(chǎn)物的濃度在 lmg/ml時，溶血率不足1%，與生理鹽水無顯著差別。 實施例5:融合多肽卡波姆凝膠劑的制備取實施例1中，純化后融合多肽lmg及蒸餾水90ml、丙二醇10ml 置于燒杯內(nèi)，加入卡波姆940干粉lg，攪勻后用0. Olmol/L NaOH調(diào)節(jié) pH至7. 5即成透明凝膠狀。經(jīng)真空脫氣后即為融合多肽濃度為10ug/ml 的凝膠劑。實施例6:融合多肽卡波姆凝膠劑對大鼠燒傷模型促愈合及抗菌實驗取健康Wister大鼠，建立深II度燒傷模型。創(chuàng)面滴加綠膿桿菌、 金黃色葡萄球菌混合液。藥物組創(chuàng)面涂抹融合多肽卡波姆凝膠劑，對照 組創(chuàng)面涂抹無融合多肽成分的卡波姆凝膠。觀察試驗結果涂抹融合多 肽卡波姆凝膠劑的大鼠，第二天創(chuàng)面變干燥，開始結痂，13天痂殼脫落， 無感染現(xiàn)象。對照組大鼠第二天傷口潮濕泛白，表面覆蓋膿性體液，出 現(xiàn)感染現(xiàn)象。6天后結痂，21天結痂脫落。實施例7:融合多肽卡波姆凝膠劑的穩(wěn)定性將實施例5制備的融合多肽卡波姆凝膠劑分別置于37。C、8(TC環(huán)境 l個月、5h，涂抹大鼠燒傷模型傷口表面。其抗菌促愈合效果明顯，與 新鮮制備的融合多肽卡波姆凝膠劑效果無差別。序列表<110〉 遼寧大學〈120〉一種具有抗菌及促傷口愈合的融合多肽 〈160〉 12〈170>Patentln version 3. 1〈210〉 1 〈211〉 51 <212> PRT <213〉 人 <400> 1Asn Ser Asp Ser Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gyl 15 10 15Val Cys Met Tyr lie Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys20 25 30Val Val Gly Tyr lie Gly Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp Leu Lys35 40 45Trp Trp Glu Leu Arg50〈210> 2〈211〉 6〈212〉 PRT<213> 人〈400〉 2Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5<210> 3 〈211〉 18 〈212> PRT <213〉 東北林蛙 〈400〉 3Ser Ala Val Gly Arg His Ser Arg Arg Phe Gly Leu Arg Lys His Arg 15 10 15Lys His〈210> 4 <211〉 75 〈212〉 PRT 〈400〉 4Asn Ser Asp Ser Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gyl 15 10 15Val Cys Met Tyr lie Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys20 25 30Val Val Gly Tyr lie Gly Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp Leu Lys35 40 45Trp Trp Glu Leu Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Ala Val Gly Arg50 55 60His Ser Arg Arg Phe Gly Leu Arg Lys His Arg Lys His 65 70 75〈210〉 5 〈211〉 55 〈212〉 DNA <400> 5aatagtgact ctgaatgtcc cctgtcccac gatgggtact gcctccatga tggtg 55〈210〉 6 〈211> 54 <212〉 DNA <400> 6catacttgtc caatgcttca atatacatgc acacaccatc atggaggcag tacc 54<210〉 7 <211〉 49 〈212> 腿 <400> 7tgaagcattg gacaagtatg catgcaactg tgttgttggc t織tcggg 49<210〉 8 〈211> 55 <212> 薩 <400> 8ccaccacttc aggtctcggt actgacatcg ctccccgatg tagccaacaa cacag 55〈210〉 9 <211〉 28 〈212〉 DNA 〈400〉 9ccggaattca atagtgactc tgaatgtc28〈210〉 10 <211〉 44 <212〉 DNA 〈400〉 10agaacctctt ggaaccaagc gcagttccca ccacttcagg tctc〈210〉 11 〈211〉 38 <212〉 DNA <400〉 11ttggttccaa gaggttcttc tgcagtagga agacatag〈210> 12 <211〉 36 〈212〉 DNA <400〉 12atagtttagc ggccgcttaa tgttttctgt gttttc
權利要求
1、一種具有抗菌及促傷口愈合功能的融合多肽，其特征在于包括序列表SEQ ID NO.1所述的人表皮生長因子氨基酸序列、序列表SEQ IDNO.2所述的凝血酶酶切位點氨基酸序列和序列表SEQ ID NO.3所述的東北林蛙抗菌肽氨基酸序列；凝血酶酶切位點將人表皮生長因子和東北林蛙抗菌肽融合在一起，構建的融合多肽具有序列表SEQ ID NO.4所述氨基酸序列。
2、 權利要求1所述的具有抗菌及促傷口愈合功能的融合多肽在治 療創(chuàng)傷、燙傷及燒傷中的應用。
3、 一種重組載體，含有權利要求1所述的融合多肽。
4、 按照權利要求3所述的重組載體，為畢赤酵母表達載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗菌及促傷口愈合功能的融合多肽。采用的技術方案是一種具有抗菌及促傷口愈合功能的融合多肽包括序列表SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的人表皮生長因子、序列表SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的凝血酶蛋白切割位點和序列表SEQ ID NO.3所述氨基酸序列的東北林蛙抗菌肽；凝血酶酶切位點將人表皮生長因子和東北林蛙抗菌肽融合在一起，構建的融合多肽具有序列表SEQ ID NO.4所述氨基酸序列。本發(fā)明融合多肽穩(wěn)定性好，酶解后具有廣譜抗菌、促細胞分裂功能，以凝膠劑、噴劑等劑型給藥可以應用到人及哺乳動物的燒傷、燙傷、創(chuàng)傷等外傷治療。具有防止傷口感染、加快傷口愈合的作用。
文檔編號C07K19/00GK101333258SQ20081001253
公開日2008年12月31日 申請日期2008年7月29日 優(yōu)先權日2008年7月29日
發(fā)明者愷 馮, 強 李, 王秋雨, 金莉莉 申請人:遼寧大學