專利名稱：采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生命工程技術(shù)領(lǐng)域的分離方法，特別是一種采用超聲強(qiáng)化荷電 超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方法。
背景技術(shù)：
超濾是以壓力為驅(qū)動力的膜過濾技術(shù)，能在較低的操作費(fèi)用下實(shí)現(xiàn)高處理能力 的一種分離過程，已廣泛用于蛋白質(zhì)、酶、干擾素、類毒素、抗毒素、血液制劑等 的分離、濃縮、精制及洗濾等。但膜的低選擇性和污染問題嚴(yán)重制約了超濾技術(shù)在 蛋白質(zhì)分離過程中的應(yīng)用，是目前仍不能替代其它高附加值蛋白質(zhì)分離的最主要原 因。傳統(tǒng)的超濾是基于物理篩分原理實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)分離的過程。超濾膜的高選擇性必然 是以犧牲膜的通量為代價的，若要獲得較高的產(chǎn)物收率，則必須選擇較小孔徑的 膜，但較小的膜孔徑必然造成膜的透過系數(shù)減小，從而影響了產(chǎn)物的分離速度。因 此在實(shí)際分離過程中必須權(quán)衡膜的選擇性和透過通量之間的取舍關(guān)系，這最終限制 了產(chǎn)物的分離速度和收率。由膜污染引起的透過系數(shù)的減少是制約超濾在蛋白質(zhì)分離中更廣泛應(yīng)用的另一 關(guān)鍵問題。預(yù)處理料液、選用改性膜、優(yōu)化操作條件和清洗膜是目前控制、減少膜 污染的主要措施。不少研究顯示湍流促進(jìn)器、渦流混合、不穩(wěn)態(tài)流、氣噴流等技術(shù) 也能有效減少膜污染并得到了一定的發(fā)展。近年來，利用外力場來強(qiáng)化超濾、減少 膜污染的研究已引起越來越多的關(guān)注。外加電場強(qiáng)化超濾的相關(guān)研究報(bào)道較多，但 由于處理的對象(需帶荷電)有限，電極表面易電解，料液中離子的復(fù)雜性和高過 程能耗等使之工業(yè)化應(yīng)用推廣受到限制。利用超聲在流體傳遞過程中產(chǎn)生的空化作 用、聲沖流，輻射壓力以及溶質(zhì)的分散、凝集和變化等特性，超聲技術(shù)已在懸浮分 離、細(xì)胞破碎提取、萃取、結(jié)晶、乳化和破乳、超聲清洗等各工業(yè)過程得到了廣泛 應(yīng)用。己有研究表明利用外加超聲場作用的強(qiáng)化超濾可減緩污染層的形成速度，同時對已形成的污染層進(jìn)行自動、及時、在線地清洗，有效地提高超濾速度。針對蛋 白質(zhì)超濾分離中膜的低選擇性和污染兩大問題，目前的措施基本上只側(cè)重于利用超 聲強(qiáng)化作用來提高單一蛋白質(zhì)的通量，而未對選擇性和通量進(jìn)行協(xié)同考慮。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，S. Muthukumaran等人在Mechanisms for the ultrasonic enhancement of dairy沐hey ultrafiltration (超聲強(qiáng)化乳清超 濾的機(jī)理) 一文中(發(fā)表在Journal of Membrane Science《膜科學(xué)雜志》， 2005， 258: 106—114)采用聚砜超濾膜，在室溫(22 — 25。C)條件下超濾分子量 約為24000 g/mol的濃度為6%的乳清，加載超聲波(超聲頻率50 kHz,超聲強(qiáng)度 0.02W/cm2) 4小時后發(fā)現(xiàn)，膜通量比未加載超聲波的同樣條件下的超濾過程提高了 50%左右。但文章中并未涉及兩種蛋白質(zhì)分離的過程及分離選擇性問題，只對超聲 可提高單一蛋白質(zhì)超濾通量進(jìn)行了考察。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善 蛋白質(zhì)分離行為的方法，使其能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離速度和收率同時提高的方法，可 有效地提高蛋白質(zhì)的分離選擇性，減少膜污染，自動、及時、在線地清除膜污染并 有效提高膜通量。從而實(shí)現(xiàn)分子量相近、高附加值蛋白質(zhì)的分離，膜的使用壽命的 延長和整個分離過程費(fèi)用的減少。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟-第一步，在傳統(tǒng)的利用篩分原理實(shí)現(xiàn)分離的超濾膜上，采用荷電改性技術(shù)使膜 成為荷電超濾膜，由待分離蛋白質(zhì)的分子量大小、等電點(diǎn)和荷電超濾膜的電量確定 待分離蛋白質(zhì)溶液的環(huán)境條件，這樣可充分利用荷電超濾膜和蛋白質(zhì)之間的靜電相 互作用，有效地提高蛋白質(zhì)的分離選擇性和產(chǎn)品蛋白質(zhì)的收率，亦可能實(shí)現(xiàn)分子量 相近的蛋白質(zhì)之間的有效分離。所述采用荷電改性技術(shù)使膜成為荷電超濾膜，可以采用現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)，如表面 化學(xué)反應(yīng)、表面涂覆、表面吸附、化學(xué)接枝、表面光接枝聚合改性法、等離子體技 術(shù)和電子束輻射接枝法等，使膜成為荷電超濾膜。在改性過程中，還可根據(jù)不同改 性條件，獲得具有不同荷電量的膜。所述荷電超濾膜可以是正電膜也可以是負(fù)電膜，其形狀可以是平板式，巻式， 中空纖維式或管式。所述待分離蛋白質(zhì)溶液的環(huán)境條件，具體為pH值2 — 11，離子強(qiáng)度lmM-滿0mM。第二步，將制備的荷電超濾膜置于超濾裝置上，并對超濾裝置加載超聲波。在 超聲環(huán)境下的超濾過程中，超聲在荷電超濾膜表面附近產(chǎn)生的空化現(xiàn)象以及超聲波 在傳播過程中使液體產(chǎn)生更高流速形成聲流共同作用的結(jié)果，可減少濃差極化和膜 污染，達(dá)到強(qiáng)化超濾的作用；利用超聲在流體傳遞過程中產(chǎn)生的空化作用和聲沖流 等特性，能夠有效地減少污染物在膜表面的沉積和膜孔內(nèi)的吸附，有效提高膜通量 和延長膜的壽命；另外，即使污染物在膜表面沉積和膜孔內(nèi)吸附，利用超聲在流體 傳遞過程中產(chǎn)生的空化作用和聲沖流等特性，可實(shí)現(xiàn)自動、及時、在線地除去膜表 面污染物，甚至進(jìn)入膜孔內(nèi)去除污染物，從而有效提高膜通量和延長膜的壽命。上述步驟中，可以根據(jù)需要選擇合適的超聲加載方式、超聲參數(shù)以及超濾過程 操作參數(shù)，確保超聲在強(qiáng)化超濾，提高蛋白質(zhì)分離速度和選擇性的同時，不造成對 蛋白質(zhì)和膜材料不可逆的破壞。這里超聲加載方式包括將整個超濾裝置置于超聲波 發(fā)生器水浴中，超聲波發(fā)生器直接貼于膜組件表面，或超聲發(fā)生器棒作為攪拌棒。 超聲參數(shù)具體為超聲強(qiáng)度為0. 01W/cm2 -30W/cm2，頻率為10kHz-2000kHz，超聲 發(fā)聲位置為膜分離表面的上側(cè)、下側(cè)、左側(cè)或右側(cè)，超聲加載時間為10min到 24hr。超聲加載可以是連續(xù)、間歇或脈沖式的。超濾跨膜壓差為0.05 MPa-O. 5 MPa，超濾溫度為20°C到85°C。超濾方式可以死端或錯流操作方式。本發(fā)明有效地將荷電超濾膜提高膜的選擇性和外加超聲場提高膜的通量各自的 優(yōu)勢結(jié)合起來，形成了超聲強(qiáng)化荷電超濾膜超濾新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了膜的選擇性和通量 的協(xié)同提高。本發(fā)明公開了一種方便、可行、經(jīng)濟(jì)的，在一定程度上同時解決了超 濾在蛋白質(zhì)分離過程應(yīng)用中的兩大瓶頸問題膜的低選擇性和污染問題的分離方 法。對于荷電超濾膜的獲取，本發(fā)明采用化學(xué)反應(yīng)的方法，即在商業(yè)用再生纖維素 超濾膜上，通過與適合的化學(xué)試劑進(jìn)行不同時間的反應(yīng)，使膜帶上不同電量的正電 或負(fù)電。這種獲得荷電改性超濾膜的方法簡單、易行。對于超聲技術(shù)的實(shí)現(xiàn)，只需 將整個超濾裝置置于超聲波發(fā)生器水浴中，或超聲波發(fā)生器直接貼于膜組件表面，或超聲發(fā)生器棒作為攪拌棒，無需額外添加復(fù)雜設(shè)備，操作相當(dāng)方便?？傊?，本發(fā) 明提供了一種有效改善蛋白質(zhì)分離行為的方法，能同時提高膜的選擇性和通量，同 時提高產(chǎn)品蛋白質(zhì)的收率和分離速度，在較低的操作費(fèi)用下實(shí)現(xiàn)高處理能力。本發(fā) 明能非常有效地減緩膜表面或膜孔內(nèi)污染層的形成速度，同時可對已形成的污染層 進(jìn)行自動、及時、在線地清洗，有效地提高超濾速度，延長膜的使用壽命，降低操 作費(fèi)用。針對待分離的蛋白質(zhì)體系，通過合理選擇荷電超濾膜、溶液環(huán)境、超聲參 數(shù)和超濾過程的操作條件，還可實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)超濾無法實(shí)現(xiàn)的相近分子量蛋白質(zhì)的有效 分離。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn) 行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下 述的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例以牛血清蛋白和D—色氨酸為分離對象。 實(shí)施例1(1) 選取截留分子量為100kDa的平板式再生纖維素膜，其表面zeta電位為 一0.8V。采用表面化學(xué)反應(yīng)的改性方法，使該膜與磺酸類物質(zhì)反應(yīng)12小時后獲得 zeta電位為一10.4V的改性荷負(fù)電超濾膜。根據(jù)步驟(1)中選取pH值和離子強(qiáng)度 的依據(jù)，最終選取待分離的蛋白質(zhì)溶解在pH=7.0和離子強(qiáng)度為10mM的溶液中， 這樣可充分利用荷電超濾膜和蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用，有效地提高牛血清蛋白 和D—色氨酸的分離選擇性，提高牛血清蛋白的收率。(2) 將步驟(1)獲得的荷電超濾膜置于死端超濾裝置上，并將整個超濾系 統(tǒng)置于超聲波水浴20°C中。超濾過程中的跨膜壓差為0.07 MPa，超聲強(qiáng)度為 2W/cm2，頻率為28kHz，超聲發(fā)聲位置在膜分離表面的下側(cè)10cm，超聲發(fā)聲時間為 60min且連續(xù)加載。在此超濾系統(tǒng)和操作參數(shù)下進(jìn)行的超聲強(qiáng)化荷電超濾，膜通量 為1.2x10—4m/s，較使用未改性再生纖維素超濾膜和未加載超聲超濾過程的通量提 高了 44%; D—色氨酸和牛血清蛋白的分離因子(即D —色氨酸和牛血清蛋白的透 過率之比)為135，較使用未改性再生纖維素超濾膜和未加載超聲超濾過程的分離 因子提高了 4. 1倍。實(shí)施例2(1) 選取截留分子量為100kDa的平板式再生纖維素膜，其表面zeta電位為 一0.8V。采用表面化學(xué)反應(yīng)的改性方法，使該膜與磺酸類物質(zhì)反應(yīng)48小時后獲得 zeta電位為—16.8V的改性荷負(fù)電超濾膜。根據(jù)步驟(1)中選取pH值和離子強(qiáng)度 的依據(jù)，最終選取待分離的蛋白質(zhì)溶解在pH=7.0和離子強(qiáng)度為10mM的溶液中， 這樣可充分利用荷電超濾膜和蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用，有效地提高牛血清蛋白 和D —色氨酸的分離選擇性，提高牛血清蛋白的收率。(2) 將步驟(1)獲得的荷電超濾膜置于死端超濾裝置上，并將整個超濾系 統(tǒng)置于超聲波水浴20°C中。超濾過程中的跨膜壓差為0.07 MPa，超聲強(qiáng)度為 2W/cm2，頻率為28kHz，超聲發(fā)聲位置在膜分離表面的下側(cè)10cm，超聲發(fā)聲時間為 60min且連續(xù)加載。在此超濾系統(tǒng)和操作參數(shù)下進(jìn)行的超聲強(qiáng)化荷電超濾，膜通量 為1.16xl(T4m/S，較使用未改性再生纖維素超濾膜和未加載超聲超濾過程的通量提 高了 40%; D —色氨酸和牛血清蛋白的分離因子為146，較使用未改性再生纖維素 超濾膜和未加載超聲超濾過程的分離因子提高了 4. 6倍。實(shí)施例3(1) 選取截留分子量為100kDa的平板式再生纖維素膜,其表面zeta電位為 一0.8V。采用表面化學(xué)反應(yīng)的改性方法，使該膜與磺酸類物質(zhì)反應(yīng)12小時后獲得 zeta電位為一10.4V的改性荷負(fù)電超濾膜。根據(jù)步驟(1)中選取pH值和離子強(qiáng)度 的依據(jù)，最終選取待分離的蛋白質(zhì)溶解在pH=7.0和離子強(qiáng)度為10mM的溶液中， 這樣可充分利用荷電超濾膜和蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用，有效地提高牛血清蛋白 和D —色氨酸的分離選擇性，提高牛血清蛋白的收率。(2) 將步驟(1)獲得的荷電超濾膜置于死端超濾裝置上，并將整個超濾系 統(tǒng)置于超聲波水浴20°C中。超濾過程中的跨膜壓差為0.07 MPa，超聲強(qiáng)度為 2W/cm2，頻率為45kHz，超聲發(fā)聲位置在膜分離表面的下側(cè)lOcm，超聲發(fā)聲時間為 60min且連續(xù)加載。在此超濾系統(tǒng)和操作參數(shù)下進(jìn)行的超聲強(qiáng)化荷電超濾，膜通量 為1. 1x10—4m/s，較使用未改性再生纖維素超濾膜和未加載超聲超濾過程的通量提高了 33%; D —色氨酸和牛血清蛋白的分離因子為130，較使用未改性再生纖維素 超濾膜和未加載超聲超濾過程的分離因子提高了 4. 0倍。實(shí)施例4(1) 選取截留分子量為100kDa的平板式再生纖維素膜,其表面zeta電位為 —0.8V。采用表面化學(xué)反應(yīng)的改性方法，使該膜與磺酸類物質(zhì)反應(yīng)12小時后獲得 zeta電位為—10.4V的改性荷負(fù)電超濾膜。根據(jù)步驟(1)中選取pH值和離子強(qiáng)度 的依據(jù)，最終選取待分離的蛋白質(zhì)溶解在pH=7.0和離子強(qiáng)度為lOraM的溶液中， 這樣可充分利用荷電超濾膜和蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用，有效地提高牛血清蛋白 和D —色氨酸的分離選擇性，提高牛血清蛋白的收率。(2) 將步驟(1)獲得的荷電超濾膜置于死端超濾裝置上，并將整個超濾系 統(tǒng)置于超聲波水浴20°C中。超濾過程中的跨膜壓差為0.07 MPa，超聲強(qiáng)度為 2W/cm2，頻率為28kHz，超聲發(fā)聲位置在膜分離表面的下側(cè)10cm，超聲加載時間為 間歇式地(每隔5分鐘加載一次且一次加載時間為5分鐘)。在此超濾系統(tǒng)和操作 參數(shù)下進(jìn)行的超聲強(qiáng)化荷電超濾，膜通量為1. 15x10—4m/s，較使用未改性再生纖維 素超濾膜和未加載超聲超濾過程的通量提高了 35%; D —色氨酸和牛血清蛋白的分 離因子(即D —色氨酸和牛血清蛋白的透過率之比)為130，較使用未改性再生纖 維素超濾膜和未加載超聲超濾過程的分離因子提高了 3. 9倍。
權(quán)利要求
1、一種采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方法，其特征在于包括如下步驟第一步，采用荷電改性技術(shù)使超濾膜成為荷電超濾膜，由待分離蛋白質(zhì)的分子量大小、等電點(diǎn)和荷電超濾膜的電量確定待分離蛋白質(zhì)溶液的環(huán)境條件，利用荷電超濾膜和蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用提高蛋白質(zhì)的分離選擇性和產(chǎn)品蛋白質(zhì)的收率；第二步，將制備的荷電超濾膜置于超濾裝置上，并對超濾裝置加載超聲波，在超聲環(huán)境下的超濾過程中，超聲在荷電超濾膜表面附近產(chǎn)生空化現(xiàn)象且超聲波在傳播過程中使液體產(chǎn)生更高流速形成聲流，利用它們的共同作用除去膜表面污染物，從而進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的分離質(zhì)量和分離速度。
2、 如權(quán)利要求1所述的采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方法， 其特征是，所述荷電超濾膜是正電膜，或是負(fù)電膜，其形狀是平板式、巻式、中空 纖維式或管式。
3、 如權(quán)利要求1所述的采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方法， 其特征是，所述待分離蛋白質(zhì)溶液的環(huán)境條件，具體為PH值2—11，離子強(qiáng)度 lmM-lOOOraM。
4、 如權(quán)利要求1所述的采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方法， 其特征是，所述加載超聲波，將整個超濾裝置置于超聲波發(fā)生器水浴中，或超聲波 發(fā)生器直接貼于膜組件表面，或超聲發(fā)生器棒作為攪拌棒。
5、 如權(quán)利要求1或4所述的采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方 法，其特征是，所述加載超聲波，其時間為10rain - 24hr。
6、 如權(quán)利要求1或4所述的采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方 法，其特征是，所述加載超聲波，其加載是連續(xù)、間歇或脈沖式的。
7、 如權(quán)利要求1所述的采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方法， 其特征是，所述超聲，其參數(shù)為超聲強(qiáng)度為0. 01W/cm2 _30W/cm2,頻率為10kHz-2000kHz。
8、 如權(quán)利要求1或7所述的采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方 法，其特征是，所述超聲，其發(fā)聲位置為膜分離表面的上側(cè)、下側(cè)、左側(cè)或右側(cè)。
9、 如權(quán)利要求1所述的采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方法， 其特征是，所述超濾，其跨膜壓差為0. 05 MPa-O. 5 MPa，溫度為20°C到85°C。
10、 如權(quán)利要求1或9所述的采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方 法，其特征是，所述超濾，其方式為死端或錯流操作方式。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用超聲強(qiáng)化荷電超濾改善蛋白質(zhì)分離行為的方法，采用荷電改性技術(shù)使膜成為荷電超濾膜，由待分離蛋白質(zhì)的分子量大小、等電點(diǎn)和荷電超濾膜的電量確定待分離蛋白質(zhì)溶液的環(huán)境條件，利用荷電超濾膜和蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用提高蛋白質(zhì)的分離選擇性和產(chǎn)品蛋白質(zhì)的收率；將制備的荷電超濾膜置于超濾裝置上，并對超濾裝置加載超聲波。本發(fā)明能有效地將超聲強(qiáng)化提高膜通量和荷電超濾膜超濾提高膜的選擇性各自的優(yōu)勢有機(jī)結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離速度和收率的同時提高，有效地同時解決了制約超濾技術(shù)在蛋白質(zhì)分離過程應(yīng)用中的兩大瓶頸問題膜的低選擇性和污染問題。
文檔編號C07K1/00GK101215320SQ200710173278
公開日2008年7月9日 申請日期2007年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日
發(fā)明者何義亮, 王來歡, 邵嘉慧, 強(qiáng) 靳 申請人:上海交通大學(xué)