專利名稱：：重組膠原樣蛋白質的生產的制作方法重組膠原樣蛋白質的生產本發(fā)明涉及用于生產重組膠原樣蛋白質的酵母細胞。本發(fā)明還涉及用于產生該蛋白質的試劑盒(kitofpart)或共表達系統(tǒng)，以及生產該重組蛋白及由該重組蛋白所制備的線的方法。此外，本發(fā)明涉及通過這些方法得到的蛋白質或線以及它們在技術和醫(yī)學的各個領域中的用途。海生貝類存在于潮間帶的端流場所中并且在這里，海生貝類已經(jīng)十分成功地定居在暴露于風和浪的巖石上。這種成功部分歸因于獨特的錨定作用，其中海生貝類通過這種錨定作用將自身固定在巖石的固體表面上。這種錨定作用的一部分是稱作"足絲"或又稱作"貝絲"的纖維結構。足絲為貝類提供必需的韌度以通過與巖石或硬質表面連接而在波浪不斷沖擊下存活。貝類足絲完全由形成與細微腱類似的短線束的胞外基質構成[2]。足絲線顯示不尋常的機械特性，因為它們在一端類似于軟橡膠而在另一端類似于硬尼龍并且這些特性以無縫及漸進過渡的方式存在[4]。足絲線還是彈性的它們能夠承受劇烈變形而不破裂，并且在應力撤除時可以恢復至原始狀態(tài)[5]。在遠端，足絲線通過教性斑固定在巖石上。在近端，足絲線合并成錨定在貝足基部的所謂足絲莖(見圖3)。海生貝類的足絲線是具有巨大的吸收和散逸能量能力的彈性纖維。多達70%的總吸收能量可以在足絲中散逸。在貽貝(M少"/船)物種(貝臺貝(Me^fc)和紫貽貝(Mga/qpraw'"c/afo))中，每條新線具有長度為數(shù)厘米以及直徑小于O.lcm的尺度，并且通過與反應注射成型相似的過程在足的腹面溝中在大約5分鐘內形成[3]。在形態(tài)學上，足絲分成4個部分(由近及遠)根、莖、線和斑或腕趾。此外，根據(jù)外觀將線進一步分成近端部分和遠端部分，即遠端部分光滑堅硬并且近端部分柔軟纖弱，足絲線是彈性材料。楊氏模量低(在10-500MPa的范圍內)，延伸率可以高達200。/。并且存在復原性恢復(restorativerecall)。與其它蛋白質彈性體如彈性蛋白、節(jié)肢彈性蛋白和展肌蛋白(abductine)相同，足絲線相當堅韌。韌度和能量散逸對于吸附器官均是重要性質。將進行循環(huán)應力-應變分析的纖維中的能量散逸相對于總吸收能量進行歸一化并報告為滯后或滯后百分數(shù)。已經(jīng)將一條線的應力-應變循環(huán)分割成用于線的遠端部分和近端部分的單獨的機械作用。如上所述的，在這些部分中，遠端部分更粗壯、更堅硬并且在緩沖作用方面性能優(yōu)越，而近端部分更柔軟及纖弱，具有較低但仍明顯的滯后。足絲線的機械特性因時間及應變依賴行為而進一步復雜化。已經(jīng)證實，當受拉伸超出其屈服點時，遠端部分表現(xiàn)示意性應力軟化(schematicstresssoftening),即第二循環(huán)的初始模量減少至第一循環(huán)中模量(500-80MPa)的約20%。第一循環(huán)模量的完全恢復是緩慢的，例如超過24小時，但是明顯恢復可以在1小時內出現(xiàn)(初始值的30%)。近端部分也顯示隨循環(huán)載荷而改變勁度的傾向。在此情況下，存在從35MPa的初始模量至在50MPa的漸近水平的應變-變硬作用，增長約40%。MASCOLO和WAITE(1986)首先鑒定了Mytilus足絲中的化學梯度。在用胃蛋白酶處理足絲線后，鑒定了被稱為ColP和ColD的兩種抗胃蛋白酶的膠原片段，其分別具有50kDa和60kDa的分子量。ColP可以主要在近端區(qū)域中找到并且?guī)缀醪粫谶h端區(qū)域中找到。相反，ColD的量在遠端部分增加至大約100%(LUCAS等，2002;QIN和WAITE,1995)。在足絲線中以及在貝足中，存在參與構建足絲線結構的另一種膠原樣蛋白質。這種另外的蛋白質被稱為ColNG(NG=無梯度)，與ColD和ColP相反，它均勻分布在整條足絲線中。它的生理學功能大概是作為其它兩種線膠原的連接物(QIN和WAITE，1998).胃蛋白酶切割的片段ColD和ColP源自所謂的前月交原P和D。來自貽貝的前膠原(即D和P)都以共同的基礎結構為特征兩側有不同側翼區(qū)的中央膠原螺旋，其中所述的側翼區(qū)分別由富含組氨酸和DOPA的末端端接(見圖1)。充分認識到膠原經(jīng)交聯(lián)發(fā)生穩(wěn)定化；然而這種化學過程仍然未充分理解。存在兩種明顯不同的交聯(lián)可能性膠原單元間的金屬絡合及共價鍵形成[8,9]。金屬絡合作用由足絲中存在高水平的鐵、銅、鎳和鋅以及在足絲蛋白質兩個末端中存在結合金屬的組氨酸豐富序列所提示。另外，DOPA出現(xiàn)在所有前膠原的兩個末端。肽基-DOPA提供優(yōu)異的金屬結合位點并且肽基-DOPA-Fe(III)螯合物已經(jīng)在海洋生物l占斑(marineadhesiveplaque)mefp-l中報道[IO]。此外，已經(jīng)證實通過EDTA從足絲纖維中除去金屬離子降低了纖維的屈服強度。也已經(jīng)觀察到了共價交聯(lián)。它們通常由酪氨酸、DOPA與半胱氨酸間的氧化偶聯(lián)而形成。在研究受高流量和高通氣條件應激的足絲中，發(fā)現(xiàn)氧化的初級產物是5,5'-二DOPA[ll]。沒有發(fā)現(xiàn)其它可能的偶聯(lián)產物如將賴氨酸Michael型加成至氧化的DOPA[7]。如同"正常"膠原，每種貝類膠原具有確保將a-鏈運輸至內質網(wǎng)中的20個氨基酸的信號序列。在內質網(wǎng)中，三條相同的ct-鏈裝配成同三聚體。ColDa-鏈(指胃蛋白酶切割的前膠原D)具有由SDS-PAGE確定的60kDa分子量和由MALDI-TOF質i普確定的47kD分子量(QIN等，1997)。ColPa-鏈(指胃蛋白酶切割的前膠原P)分別具有55kDa分子量(SDS-PAGE)和40kD分子量(MALDI-TOF)(COYNE等，1997)。a-鏈的前體叫做前膠原D和前膠原P,分別具有由SDS-PAGE分析所確定的95和97kDa的分子量和通過用MALDI-TOF質譜分析所確定的75和80kD分子量(COYNE等，1997;QIN等，1997)。兩種膠原均具有對I-III型膠原典型的特征。兩者均具有含量大于34%的甘氨酸并在膠原結構域中顯示出合計20%的脯氨酸及羥脯氨酸含量。側翼區(qū)完全對應于其它結構蛋白，即彈性蛋白(前膠原P)和絲纖蛋白(前膠原D)。這種結構性構造解釋了貝類足絲的機械行為。由于此原因，為了利用這些異乎尋常的天然材料作為新技術學應用中的結構單元，重組地生產基礎性貝類足絲膠原將是極有意義的。開發(fā)具有所定義特征的材料、尤其是在應力或過載后能夠自行恢復的材料在材料科學中長時間以來具有高度的重要性。復合結構在技術學中引起了興趣，尤其對于電子元件和器件、換能器和其它材料。通過組合具有不同機械性質的材料，將會形成引起新的技術問題的結構界面。因此，對于眾多應用而言，極其需要提供漸變性結構，從而降低材料的整體負荷。此外，貝類膠原在醫(yī)學中的用途和應用引起極大的興趣，原因在于高度的潛在生物相容性?；谶@一點，可以產生具有高度免疫相容性的醫(yī)用移植物和組織。重組貝類膠原的生產是在可以構想貝類膠原的技術應用之前必須解決的一個有趣而重要的技術問題。因此，本發(fā)明首要目的是提供這樣的重組貝類足絲蛋白，其具有提高的特性，如尤其是提高的以高產量表達的能力和優(yōu)異強度及撓性。本發(fā)明的另一目足絲蛋白，其中它們基于所述的特定排列以提供漸變性結構。此外，本發(fā)明的目的是提供編碼重組貝類足絲蛋白的表達載體，其可以方便地在已知真核表達系統(tǒng)中表達。另外，本發(fā)明的目的是提供改良的紙張、織物和皮革產品。其它目的是提供于重組貝類足絲蛋白的新蛋白質和其它材料如球、納米纖維、水凝膠、線、泡沫、薄膜用于生物技術、醫(yī)學、藥物和食物應用、化妝品中、在電子器件中及用于其它商業(yè)目。本發(fā)明的另一個目的是提供能夠以高產量及高品質表達膠原樣蛋白質、特別是貝類足絲蛋白的宿主細胞。這些目的由獨立權利要求的主題解決。優(yōu)選的實施方式在從屬權利要求中描述。迄今為止，重組貝類足絲蛋白的表達從未得到證實。這可能至少部分地歸因于表達這些蛋白質和從這些蛋白質制備線的復雜過程。生物合成膠原的復雜性造成對任何嘗試表達重組膠原的結果的降低的可預測性，因此，這些嘗試大概可能導致錯誤折疊的蛋白質、低產量或在最壞情況下根本沒有表達膠原。在本發(fā)明中，提供產生高產量的正確折疊的膠原樣蛋白質、尤其貝類足絲蛋白的宿主細胞系統(tǒng)。本發(fā)明特別是涉及以下方面和實施方式根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供用于生產重組膠原樣蛋白質、特別是貝類足絲蛋白的酵母細胞，該酵母細胞已經(jīng)用以下元件轉化a)編碼所述重組膠原樣蛋白質的第一表達載體；和b)包含編碼脯氨酰-4-羥化酶(P4H)的核酸的第二表達載體.由于膠原生物合成的復雜性，對于重組合成膠原樣蛋白質而言，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)必需考慮某些因素，其中最重要的一個因素是在內質網(wǎng)(ER)中通過脯氨酰-4羥化酶將脯氨酸翻譯后修飾為羥脯氨酸，其中脯氨酰-4羥化酶是一種由兩個亞基即a-PH(=P4HA)和PDI(=P4HB)構成的四聚體酶(BULLEID等，2000)。因為這個原因，原核表達系統(tǒng)例如細菌表達系統(tǒng)將不能用于本發(fā)明。酵母在一方面提供對于合成膠原所需要的細胞區(qū)室化，然而在另一方面酵母缺少膠元合成所需要的酶即脯氨酰-羥化酶(P4H)。除此之外，酵母將是用于重組膠原的理想的表達系統(tǒng)，因為它們的培養(yǎng)尤其在大規(guī)模表達系統(tǒng)中相對容易實現(xiàn)并且來自酵母培養(yǎng)的重組蛋白的產量超過其它表達系統(tǒng)。因此，在酵母中的表達可能導致高效(且成本可行)地生產重組膠原樣蛋白質，尤其貝類足絲蛋白。然而由于酵母細胞的上述缺點，這些蛋白質在酵母中的表達迄今并未實現(xiàn)。本發(fā)明人可以證實對于不擁有P4H的酵母細胞而言，人P4H亞基可以重組地產生并且可以正確地折疊。除此之外，對這些酵母抹而言，可以證實通過共表達兩個人P4H亞單位，合成貝類足絲膠原是可能的，并且形成了折疊的穩(wěn)定膠原。有趣的是，共表達兩個P4H亞基的基因足以在酵母中形成穩(wěn)定的三股螺旋而無需其它的酶或折疊促進劑或對膠原專用的伴侶蛋白例如Hsp47,或換而言之，酵母天生的伴侶蛋白是足夠"活性的"。與天然膠原相比，酵母中重組產生的人膠原具有相同含量的羥脯氨酸，并且此外在眾多其它特征上相同。通過在酵母ER中的高效運輸，共表達的P4H亞基的信號序列發(fā)揮重要作用?？梢酝ㄟ^以下方法來實現(xiàn)最大充分的定位在優(yōu)選實施方案用酵母信號序列，例如來自釀酒酵母CS.cwev&"e)的信息素交配因子al(MFa)，替換人信號序列而實現(xiàn)。被MFa信號序列修飾的P4H亞基被有效地運輸至ER的網(wǎng)眼中。更優(yōu)選地，信號序列是#>據(jù)8￡()101^0:10的釀酒酵母交配因子al(MFa)。作為酵母細胞，可以優(yōu)選地使用釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(ScWzoracc/^rawycaspo/w&)、巴斯德畢赤酵母(尸/c/z/aposton's)、白假絲酵母(Caw&/aa/6/cam)，或多形漢遜酵母(/f(3m^咖/apo/ymo/77/2a)。第一表達載體優(yōu)選地還包含一種或多種調節(jié)元件。該表達載體必須適宜用于在酵母細胞中表達。優(yōu)選地，調節(jié)元件含有選自組成型或誘導型啟動子、更具體地選自GPD、GAL4、CUP1、MET25、GAL1或GAL1-10的啟動子。在另一個實施方式中，表達載體是質粒。優(yōu)選地，重組膠原樣蛋白質是重組貝類足絲蛋白，其包含兩側有彈性蛋白或絲纖蛋白的膠原結構域的一個或多個片段，或者由兩側有彈性蛋白或絲纖蛋白的膠原結構域的一個或多個片段構成。這種重組貝類足絲蛋白由向形成的蛋白質提供不同特征的一種或多種類型的結構單元構成如上所述，彈性蛋白和絲纖蛋白具有某些機械特征，這可以解釋貝類足絲的機械特性并因此也用于設計重組產生的貝類足絲蛋白。因此，這些片段可以僅作為一種單一類型的片段加以使用，或作為備選，重組蛋白可以包含兩種或多種不同的片段。例如若需要大的彈性，蛋白質可以僅包含或主要包含兩側有彈性蛋白的膠原的片段。若需要大的硬度和強度，蛋白質可以包含兩側有絲纖蛋白的膠原的片段。作為另一個且優(yōu)選的替代方案，蛋白質可以包含兩種類型片段的混合物，例如形成從一個區(qū)域至另一個區(qū)域的梯度。因此，可以形成這樣的蛋白質/線，其具有特別適應的構象，即部分具有較高的彈性而部分具有較高的硬度等。術語"兩側有，，意指彈性蛋白(或絲纖蛋白)存在于膠原結構域的兩側。上述片段可以是天然衍生的，例如片段可以來源于貽貝屬的種(M聲z7w取)，優(yōu)選地來自貽貝、紫貽貝、加利福尼亞貽貝或半皺殼菜蛤(G^fenVde附/M")。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的重組貝類足絲蛋白包含前膠原P和/或前膠原D或它們的變體的一個或多個片段，或由前膠原P和/或前膠原D或它們的變體的一個或多個片段構成。這些片段描述如上。兩種前膠原(即D和P)均來源于貽貝并且以共同的基礎結構為特征兩側有不同側翼區(qū)的中央膠原螺旋，其中所述的側翼區(qū)分別由富含組氨酸和DOPA的末端端接。側翼區(qū)完全對應于已知的結構蛋白，即彈性蛋白(前膠原P)和絲纖蛋白(前膠原D)。將前膠原P和前膠原D的序列從各自的核酸中翻譯。因此，每當氨基酸在本文以下中提及時，它們指的是前膠原P和前膠原D,并且這些序列將在本文以上所提及各種技術應用中使用。本文所提及的核酸序列首先涉及編碼前膠原P和前膠原D的序列。根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的重組蛋白包含由SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4或它們的變體的一個或多個片段，或由SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4或它們的變體的一個或多個片段構成。SeqIDNo對應于前膠原P和前膠原D的序列。如上提及，本發(fā)明也包含這些氨基酸序列的變體。例如，當與上文提及的氨基酸序列比較時，所述的變體可以含有一個或多個置換、插入和/或缺失。特別地，將引起所謂"沉默"變化的蛋白質的變體，例如序列的缺失、插入和/或替代，視為本發(fā)明的一部分。優(yōu)選這樣的氨基酸替代，替代的結果是用具有相似結構特征和/或化學特征的相似氨基酸替代氨基酸，即保守氨基酸替代。氨基酸替代可以基于所涉及殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩性(兩親)性質方面的相似性進行。疏水性氨基酸的實例是丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。極性且中性的氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。"插入"或"缺失"通常是在1-5個氨基酸范圍內?？梢酝ㄟ^在多肽分子中有序使用的氨基酸插入、缺失或替代，利用重組DNA方法實驗確定允許變異的程度?？梢詫λ玫淖凅w測試其性質、尤其機械性質。應當指出，本文中所用的術語"變體，，也包含前膠原P和前膠原D的上述氨基酸序列，其中構成原貝類信號序列的頭19個氨基酸被其它信號序列替代。優(yōu)選的實例是貝類信號序列被信號序列aMF(SEQIDNO:IO:"MRFPSIFTAVLFAASSALA")替換。該信號序列特別適合于核酸在酵母中的表達。本發(fā)明也提供編碼如上文所定義的重組蛋白的分離核酸。本文所用的關于核酸的術語"分離的，，是指不與兩個序列緊密連接的天然存在的核酸，在該核酸所來源的生物的天然存在基因組中該核酸與這兩個序列緊密連接(一個序列在5，端而另一個序列在3，端)。例如，分離的核酸可以是但不限于任意長度的重組DNA分子，只要在天然存在基因組中通常所發(fā)現(xiàn)的緊密位于該重組DNA分子兩側的核酸序列中的一個被去除或不存在。因此，分離的核酸包括但不限于獨立于其它序列、作為獨立分子存在的重組DNA(例如通過PCR或限制性核酸內切酶處理所產生的cDNA或基因組DNA片段)，以及被并入到載體、自主復制性質粒、病毒(例如逆轉錄病毒、腺病毒或皰滲病毒)中或被并入到原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA。另夕卜，分離的核酸可以包括是雜交體核酸序列或融合核酸序列的一部分的重組DNA分子。術語"分離的"也包括任何非天然存在的核酸，因為在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)非天然存在的核酸序列，并且不具有在天然存在的基因組中的緊密連接的序列。例如，將非天然存在的核酸(如設計的核酸)視為分離的核酸。可以使用常見的分子克隆技術或化學核酸合成技術來制備設計的核酸。分離的非天然存在的核酸可以獨立于其它序列存在，或者將其并入到載體、自主復制性質粒、病毒(例如逆轉錄病毒、腺病毒或皰滲病毒)或原核生物或真核生物的基因組DNA中。另夕卜，非天然存在的核酸可以包括是雜交體核^列或融合核酸序列的一部分的重組DNA分子。對本領域技術員顯而易見的是，在例如cDNA或基因組文庫或含有基因組>見為分離的核酸。編碼以上氨基酸的核酸可以是編碼重組貝類足絲蛋白的成熟或不成熟氨基酸序列的核酸序列。在優(yōu)選實施方案中，分離的核酸包含SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2或它們的變體的核酸，或由SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2或它們的變體的核酸構成。當與SEQIDNO:1或2的序列比較時，這些變體每一個都定義為具有一個或多個替代、插入和/或缺失，只要所述的變體在中等嚴格或嚴格條件下與包含SEQIDNO:l或2的序列的核酸雜交，或者只要所述的變體包含歸因于遺傳密碼簡并性的核酸變化，其中所述的核酸變化編碼如SEQIDNO:1或2的核酸序列那樣的相同或功能等同的氨基酸。如上提及，本發(fā)明還包含所述核酸的變體，其中編碼前19個氨基酸(信號序列)的核酸被替換，優(yōu)選地被酵母信號序列MFa(SEQIDNO:IO)替換。本文中所用的嚴格雜交是指這樣的條件，其中多核苷酸雙鏈體在所述條件下是穩(wěn)定的。如本領域技術員已知的，雙鏈體的穩(wěn)定性是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)(見,例如Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual第二版(ColdSpringHarborLaboratory，(1989))。用于雜交的嚴才各性水平可以便利地由本領域技術員改變。嚴格洗涂條件指在65°C下的0.2xSSC(0.03MNaCl，0.003M檸檬酸鈉，pH7)/0.1%SDS。對于較短的片段，例如最多30個核苷酸的寡核苷酸，雜交溫度低于65。C，例如在50。C,優(yōu)選高于50。C，但低于65°C。嚴格雜交溫度取決于相應核酸的大小或長度和它們的核酸組成，并且將由熟練技術員經(jīng)驗地確定。中等嚴格雜交溫度例如是42°C,并且具有在42。C的0.2xSSC/0.1%SDS洗滌條件。本發(fā)明中所用的P4H優(yōu)選地是人或貝類的P4H。在第二方面，提供了一種包含以下組分的試劑盒或共表達系統(tǒng)a)如本文中所定義的第一表達載體；和b)如上文定義的第二表達載體。該試劑盒或共表達系統(tǒng)可以高效地用于在酵母細胞中表達重組貝類足絲蛋白。在另一個方面，公開了一種生產重組膠原樣蛋白質、尤其是生產貝類足絲蛋白的方法，該方法包括步驟a)提供如上文中所定義的酵母細胞；b)用上文描述的表達載體或共表達系統(tǒng)轉化該酵母細胞；c)在合適條件下從所述宿主細胞中表達重組蛋白；以及d)回收該蛋白質。此外，提供了一種用于從重組貝類足絲蛋白中生產線的方法，該方法包括以下步驟a)提供根據(jù)以上方法生產的重組蛋白，和b)通過合適的方法使所述的蛋白質紡絲或模塑為線。紡絲可以優(yōu)選地通過電紡絲法進行。電紡絲法是使用靜電力來生產連續(xù)的納米直徑纖維的纖維成型技術。已經(jīng)將類型廣泛的天然高分子和人工高分子從溶液中和熔融相中電紡絲成型，并且對于需要高表面積材料(濾膜和生物醫(yī)學器件)的各種應用領域有意義。本發(fā)明的另外方面是通過以上方法之一可得到的蛋白質或線。本發(fā)明的蛋白質/線優(yōu)選在生物技術和/或醫(yī)藥領域中具有用途。例如，它們可以用于制造傷口閉合或覆蓋系統(tǒng)或縫合材料。此外，該蛋白質/線可以優(yōu)選地用于制造替代材料，優(yōu)選是人工軟骨或肌腱材料。另外，本發(fā)明的線/蛋白質可以用于制造醫(yī)療器械如醫(yī)用粘合帶、皮膚移植物、替代韌帶和外科用網(wǎng)片；以及用于范圍廣泛的工業(yè)產品和商品如服裝面料、防彈背心內襯、容器面料、手提袋或女用包皮帶、纜、繩子、黏性結合材料、非黏性結合材料、捆扎材料、汽車覆蓋件和零件、飛機結構材料、耐候性材料、柔性分隔材料、體育器材；以及實際上，用于高抗拉強度和彈性是所需特征的纖維或面料的幾乎任何用途。本發(fā)明也構思了處于其它形式下的穩(wěn)定纖維產物(如干噴涂料、珠樣粒)的適應性和用途以及在混合物中與其它組合物的用途。應當明確指出的是，本發(fā)明的貝類足絲膠原的優(yōu)選應用是制造和加工服裝面料(織物)及皮革、汽車覆蓋件及零件、飛機結構材料，以及制造和加工紙張?？梢詫⒈景l(fā)明的重組貝類足絲蛋白添加至纖維素產品和角蛋白及膠原產品中，因此，本發(fā)明也涉及紙張或護膚產品和護發(fā)產品，其包含纖維素和/或角蛋白和/或膠原和本發(fā)明蛋白質。其中加入本發(fā)明蛋白質的紙張和護膚產品和護發(fā)產品顯示改良的特性，特別是改良的抗拉或撕裂強度。此外，可以將本發(fā)明的重組貝類足絲蛋白用作織物和皮革產品的涂料，從而賦予涂層產物穩(wěn)定性和耐久性。特別地，所述蛋白質顯示對涂層皮革產品的可用性，因為在這種情況下，可以避免或至少降低鞣革及其對環(huán)境的不利作用。本發(fā)明也涉及含有所述貝類足絲蛋白的產物，例如傷口閉合或覆蓋系統(tǒng)、縫合材料、替代材料優(yōu)選是人工軟骨或肌腱材料、化妝品、藥物送遞載體、面料、織物、紙產品、皮革產品、汽車零件或飛_機零件。通常，本發(fā)明也涉及基于重組貝類足絲蛋白的材料，如球、納米纖維、水凝膠、泡沫、薄膜。除非另外定義，本文中所用的全部技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員慣常所理解的相同含義。本文所提及的全部出版物、專利申請、專利和其它參考文獻完整地引用作為參考。在發(fā)生沖突的情況下，本說明書，包括定義，將優(yōu)先。另外，實施例僅是說明性的并且不應理解為是限制性的。14現(xiàn)在，通過實施例和顯示如下的附圖進一步說明本發(fā)明圖l顯示了貝類足絲膠原的一般結構；圖2描繪了足絲線從遠端至近端方向上的一系列SEM圖像-標出的部分分別在以下放大。a)遠端；b)中部；c)近端；圖3顯示了貝類足絲的結構；圖4顯示了通過足絲線與固體結合的貝類；圖5:(A)前膠原在線中的分布。(B)具有側翼結構域的膠原亞基的示意圖。由菱形所示的末端區(qū)域富含His。DOPA由Y指示。(C)軸向前膠原與水平前膠原之間交聯(lián)相互作用的模型；圖6:P4H構建體的設計；圖7:對產生a-MF信號序列的寡核苷酸的設計，其中a-MF信號序列可隨時克隆至相應的表達質粒中；圖8:a-PH的克隆策略；圖9:載體圖。實施例貝類足絲的膠原蛋白質在母酵中的表達膠原合成通常反映復雜的生物化學過程。該過程例如需要通過脯氨酰-4羥化酶在內質網(wǎng)中將相應膠原的某些脯氨酸翻譯后修飾為4-羥脯氨酸。脯氨酰-4羥化酶在脊推動物中是012/32四聚體，在膠原合成中發(fā)揮重要作用。由P4H產生的4-羥脯氨酸殘基對于將新合成的膠原多肽鏈折疊成三螺旋膠原分子是必需的[13]。乂l減應-4-,^錄《迷種建傳P4H的構建體需要將信號序列克隆至酵母載體中鄰近于P4H的兩個亞基a-PH和PDI的基因處。這兩個基因均處于在半乳糖(Gall/10)存在時受誘導的雙向啟動子控制下(見圖6)。該信號序列是將P4H亞基轉運至ER所需要的，在ER中P4H亞基可以裝配成天然四聚體。在人信號序列被酵母自身的交配因子a-MF信號序列替代時已經(jīng)實現(xiàn)了定位的最大效率[12]。見本文中的圖6。從來自HepG2肝細胞的c-DNA文庫(由德國慕尼黑研究中心(GSFMunich)Adamski教授提供)中通過PCR擴增a-PH的基因(無信號序列)，從大腸桿菌(五.//.)克隆載體(由英國曼徹斯特大學(1)11^^5^ofManchester,UK)NeilBulleid教授提供)中擴增(3-亞基(PDI)的c-DNA(無信號序列)。對于每個基因，相應的aMF信號序列將基于兩個單鏈寡核苦酸進行設計。寡核苷酸A和B以這樣的方式(見圖7)進行設計在退火之后可以將雙鏈DNA直接克隆至相應的載體中。用于a-PH的克隆策略顯示如實施例(圖8)。對PDIcDNA的克隆將以相同方式進行。將使用兩種不同酵母載體pRS315(CEN，代表單拷貝數(shù)質粒)和pRS425(2|n，代表多拷貝質粒)，兩者均含有雙向Gall/10啟動子，允許從一個質粒中同時表達兩個亞基。#魔,"^微j,^魏賴貝類足絲的兩種主要的蛋白質組分即前膠原D和前膠原P的重組合成是本發(fā)明的實施例。已經(jīng)從Waite教授(UCSB,USA)處得到了大腸桿菌克隆載體中的前膠原P和前膠原D的c-DNA。通過PCR擴增該cDNA，然后將其克隆至不同酵母表達載體。載體區(qū)別于單位細胞的拷貝數(shù)上以及激活物(組成型啟動子GPD或誘導型啟動子GAL4)的選擇上。為了最大的定位效率，原初信號序列將被酵母a-MF的信號序列所替代。^^^#逾#乂湊/《^Co/P斧Cb/D用于高效重組合成貝類膠原的試驗需要獲得抗貝類膠原的多克隆抗體。用抗人I-III型膠原多克隆抗體的預備試驗顯示針對化學變性的來自貝類足絲的膠原的極微弱交叉反應性。這種交叉反應性不足以檢測在重組合成過程中存在的膠原水平。因此，需要產生抗貝類膠原的抗體。為了能夠產生抗體，需要純化的天然貝類膠原。將足絲從新鮮貝類中提取出來，并且使用幾種色譜方法進行純化(其中有反相色譜)。使用含有前膠原D和前膠原P的純化蛋白質樣品來免疫家兔并產生抗體。對重組膠原的生物物理學研究各種物理學方法可以被被用來表征每種蛋白質即前膠原P/前膠原D并評估在自裝配方面纖維形成的效率。這些方法包括遠紫外和近紫外圓二色譜(CD)法、近態(tài)和動態(tài)光散射法、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)法、電子顯微鏡法(EM)、原子力顯微鏡法(AFM)和場流分級法(FFF)。j^^個^^^p;^^^^Z)好4在將使用CD和FTIR來確定前膠原P和前膠原D的二級結構和三級結構。也將在各種條件下測試它們的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。關于膠原形成中涉及的蛋白質形狀方面的數(shù)據(jù)由光散射法、AFM和TEM提供。舉多4'^遽卓;^放,^^^"通過CD和FTIR分析貝類足絲膠原的二級結構和三級結構。AFM和EM將提供關于已裝配的聚集物和纖維的四級結構及形態(tài)學方面的信息。FFF(—種由于FFF是無基質的色譜技術，它可以分離不能被其它經(jīng)典色譜技術所分離的不同的溶解大分子，尤其是纖維。裝配過程的動力學也將用CD和FTIR研究，這可以作為時間的函數(shù)通過監(jiān)測在纖維形成過程中二級及三級結構的變化而進行。此外，靜態(tài)光散射法、動態(tài)光散射法和時滯AFM(time-lapseAFM)允許實時監(jiān)測蛋白質裝配。熒光染料也可以用來研究與蛋白質裝配相關的結構變化。某些染料(如3-氯-6-曱氧基-9氨基吖啶和氨基萘磺酸的N-千基衍生物)的熒光特性隨蛋白質環(huán)境的極性而改變。因此，用這些染料對膠原的標記用來研究膠原的裝配過程。對金屬在膠原裝配和交聯(lián)中作用的研究GG//4DO/M一夥肩邀Jt農拃在前膠原P和前膠原D的羧基端上均已經(jīng)觀察到氨基酸序列GGH。在乙酸鎳[Ni(OAc)2]和氧化劑單過氧鄰苯二甲酸鎂(MMPP)[18,19]存在的條件下，三肽NH2-Gly-Gly-His-COOH(GGH)介導溶液中結合蛋白的交聯(lián)。此外，該肽為鎳中心提供有利的配位環(huán)境，并且認為推測性Ni(III)中間體從鄰近的酪氨酸的芳環(huán)中吸取一個電子，產生失去質子后的酪氨酰自由基(見圖5)。高度活化的自由基中間體與鄰近酪氨酸偶聯(lián)，產生交聯(lián)的加合物。酪氨酸交聯(lián)的機理在貝類膠原羧基端上的GGH的可能作用可能是結合Ni(II)以便形成活性催化劑Ni-GGH。該復合物可以緩慢地催化空氣氧化酪氨酸和DOPA以形成交聯(lián)。該催化劑對酪氨酸和/或DOPA的接近將顯著增加氧化速率。為檢驗這個假設，可以使GGH序列遺傳性地缺失或修飾，使得它將不會結合鎳。交聯(lián)和裝配的速率可以通過上述方法進4亍監(jiān)測。^夢處必潛減^"^魔^一承4x^在釕(II)三(聯(lián)吡啶)二離子[Ru(bpy)^+]和電子受體如過硫酸銨(APS)[18,20，21]存在的條件下，可見光輻射誘導接觸的蛋白質之間非常高效的交聯(lián)。這個過程效率極高并且推測其機理與Ni/GGH/MMPP的機理相似。在APS存在的情況下，用[Ru(bpy)^+]對從前膠原P和/或前膠原D的自裝配中所形成的纖維進行輻射。這應當導致足絲膠原中酪氨酸/DOPA的交聯(lián)增加并且產生具有改變的機械性質的纖維，這將基于如上所述的物理化學表征進行評估。其它實施例和序列貝類膠原即前膠原P和前膠原D的DNA序列提供如下。將兩種前膠原蛋白(P和D)的cDNA整合到pGEM-T克隆載體中。為了驗證起始材料，對兩個cDNA完全測序，分別使用T7和SP6作為標準引物，以及使用前膠原(P或D)-T7/1和SP6/1作為內部引物。得到的DNA序列顯示與兩種前膠原的已經(jīng)公開版本的差異并且因此進行比較。preColP(SEQIDNO:l)atggttcggttctccctagcatcggtactattactggcagtcaccagcacagctttcgctggaccagttagtgattatggtggtggtggaatcaaagtagtaccctaccacggaggcggsggtggaagcggcggcggtggcggtggaggaggaggatcatcac3tgcacatgcccactgaccaggtggatcttcacatgcatcagctgacggtttaggaggtggcagtgctcatgcacgtggattcggtggattcggcggtattggtgtcggaggcggtsttggcccaggaggaagtgttggcggcggtggtggsccaggcggtaatggaggattcggaccaggttcatctgctsgtgcaggaggttcaagcgcaagcgcaaacgcaggattcggtggaccaggtaccccaggaaactgsgcaccaggccaaccsggscgtccsggssgaccaccaggtcaaccaggtaacccaggacccggccasccagg3ggtcc3ggacgtccagasccaggscagccsggcggcccaggscsscgacgaaacggaaatccaggaaaccccggtacaggatcacgaggaatgccaggaaccccagccgtcggaggacgaggaccaagaggaccaggaaatccagg3gagccaggaaatccsggtgaaggaccacaagg3cc3gccggaggsccagcaccaggtacaccaggaggaactggaccaagagcaccaggggacca3ggaccacaaggagcaggacctaaaggactacaaggatcasatgccgcaggaccac33ggcccacaaggaaagsgagctaggggaccaga3gg3saagccggacaaggaccasc3gg3gcac3aggsccagccgcaggaggggasagsggaggccagggaccacgaccaagaggaccagcaggatcacaaggaccaggtaaaaaaggaccsaatggagaccgagaaaacggagcacgaggaaatagaggatcasgccatggcggaagcggtattggtggtatcgcttcagcatctgcccatgtgcaccattttggttcatcatcccatgcatccgcatcccataatagcagttccagcgccaacgctcattccggtattggcggtattggcccaggaggaagtgtcggaggcggcattggcggtsttggcggtagcggtatcggattcggaccaggattcggaggatccggaagtggcagcgcattcggtggtcctgcacgtgcaaatgcaaatggtggtggagcsggaccaccsggccaacccggactaccaggtaccccaccsggtcgsccaggssaccccggtccaggctcttcaggaagaccaggaggatgaacccccggcaaaccaggaaaccgaggaccaggtcacccaggagcaggaggacaaccagaaccaggaacaccaggtcacccaggaacaggaaccccaggacaaccaggaattccaggcactggaatcatcggattaattggaccasaagcaccaggaggcccaggatctscaggaccacgagcatcaggcggaccaggagacaaaggcggaggaccaatcgga_ccaitcaggscceitcsggtagaggaacaccaggactcgcaggcssacgagaagttggsccccaaggsccatctggacacggtgtcaaaggagcagcaggagatcaagcagctggaccacsaggagaaacaggsccaagtccagccggaccatcaggagsacaaggacaaggagctga3ggaccaagtggaccsgcagcaagtggtgaacgcggagaaccaggagcacgaaaccaaggatcaccaggagcaccaggcagaggaagcaacggatcacccggcagstcaggaggatcaccttgttatcgatcggaggagcgttccgctgggaggaggaccc3gg3ggcccgagtsgg3ggcaggaggattctggagcatcatgtaggaccC3C3tgcacscstctagctccatcacatgtaagccgaggatgaccagsgattcagctaacagcaggttcaattcggaggaaggaggagtatggaccaggatggaccaggaatcatcaggacggaggtsgacgcttttggt3C3CtC3tttttcaagcggaggaccscgtg3caggsccaggcsgcaagtttcatcaggaggcaggaggtgggsggsggagggagtaggagggsgcsggsgtcsgc3tctgatcggtggtgggtctcggagggcggacscgggtcacggaggagsccsagg3sgttgc3g3catgc333tgcctaacgcaaagtcccggagcttggaggtgggtggaccagggatttggtggC3tcta3cgggaagcgcatcggggaagtgct3ttCC3C3ggtcatggagg3c3tgg3ccsagcaccaggtattcccaggaatttgctggtcgcaggtggaagcaggaggc3CC3ggagg3aggagcaggaatttggaggatggaccattcagcatctgcactcagctggttgtgacccataggtccatacgttattcgtatttggtggatggscccggtgttcccattcgccsggaggaggtaggaggtgccsggsggsgggatctagcgggagtactcagcstctsgagagtcattcctC3tggsggtcaaacctggatattaa由于遺傳密碼的簡并性，并非每個石咸基交換都導致氨基酸交換。因此，將DNA序列翻譯成氨基酸序列并進行比較。這里，顯示了公開的序列(COYNE等，1997)[gi:2386675](變體P38,(COYNE和WAITE，2000))與通過測序得到的前膠原P序列的比對。數(shù)據(jù)庫序列對應于SEQIDNO:9,測序的前膠原P序列是SEQIDNO:3。數(shù)據(jù)庫1MVRFSIASVLI^AVTSTAFAGPVSDYGGGGIKVVPYHGGGGGGGGGGGGG50測序1MVRFSIASVLLLAVTSTAFAGPVSDYGGGGIKVVPYHGGGGGSGGGGGGG50數(shù)據(jù)庫51HGGSFRNGRHGGIGGIGGGSSHAHAHSSASAHVHHF"GPGGSSHASAGSSS100測序51HGGS-------GIGGIGGGSSHAHAHSSASMVHHFGPGGSSHASAGSSS93數(shù)據(jù)庫101HASASHNGLGGGSAHAHSSSSANAHSGGFGGFGGIGGIGGIGPGGSVGGG150測序94HASASHNGLGGGSAHAHSSSSANAHSGGreGFGGIGG工GGIGPGGSVGGG143數(shù)據(jù)庫151IGPGGSVGGGIGGIGGIGGGGGPGGNGGIGFGPGFGGGFGPGSSASGSGS200測序144IGPGGSVGGGIGGIGGIGGGGGPGGNGGIGFGPGFGGGFGPGSSASGSGS193數(shù)據(jù)庫2。1GSAF"GGPGGSSASANAAARANANGGGGFGGPGTPGNSGPPGQPGLPGAPG250測序194GSAFGGPGGSSASANAAARANANGGGGFGGPGTPGNSGPPGQPGLPGAPG243數(shù)據(jù)庫251QPGRPGSTPPGR]LGNPGPPGQPGNPGRPGSSGRPGGSGQPGGPGRPGTPG300測序244QPGRPGSTPPGRPGNPGPPGQPGNPGRPGSSGRPGGSGQPGGPGRPGTPG293數(shù)據(jù)庫301KPGNRGQPGQPGGPGQPGHPGAGGQPGRNGNPGNPGKPGTPGHPGTAGSR350湖[l序294KPGNRGQPGQPGGPGQPGHPGAGGQPGRNGNPGNPGKPGTPGHPGTAGSR343數(shù)據(jù)庫351GMPGTPGTPGQPGIPGTVGGRGPRGPAGIIGLIGPKGNPGEPGNPGAPGG400測序344GMPGTPGTPGQPGIPGTVGGRGPRGPAGIIGLIGPKGNPGEPGNPGAPGG393數(shù)據(jù)庫401PGSTGPQGPQGPAGGPGASGGPGDKGAPGTPGGTGPRGPIGPSGPSGAPG450測序394PGSTGPQGPQGPAGGPGASGGPGDKGAPGTPGGTGPRGPIGPSGPSGAPG443數(shù)據(jù)庫451DQGPQGGRGTPGLAGKPGPKGLQGSNGEVGPQGPSGPAGPQGPQGKNGVK500數(shù)據(jù)庫501GAAGDQGARGPEGKAGPAGPQGETGPKGPTGAQGPAGPAGPSGEQGPGGE550領!l序494GAAGDQGARGPEGKAGPAGPQGETGPKGPTGAQGPAGPAGPSGEQGPGGE543數(shù)據(jù)庫551RGGQGPQGAEGPSGPAGPRGPAGSQGPSGERGEPGAPGKKGPNGDRGNQG600湖!l序544RGGQGPQGAEGPSGPAGPRGPAGSQGPSGERGEPGAPGKKGPNGDRGNQG593數(shù)據(jù)庫601SPGAPGKNGARGNRGSRGSNGSPGRSGSPGSRGKPGPQGPHGPRGLRGSP650測序594SPGAPGKNGARGNRGSRGSNGSPGRSGSPGSRGKPGPQGPHGPRGARGSP643數(shù)據(jù)庫651GQKGPRGDQGAPGV工RIV工DDQRTGPEVAEFPGFGGFGGASM1AASSANA700頂!l序644GQKGPRGDQGAPGVIRIVIDDQRTGPEVAEFPGFGGFGGASANAASSANA693數(shù)據(jù)庫701FAGGPGGSAGAGSSSGANANAGGF-----PFGGAGGGPGAAGGPGGAGGP745測序694FAGGPGGSAGAGSSSGANANAGGFPFGGGPFGGAGGGPGAAGGPGGAGGP743數(shù)據(jù)庫746GGVGGGVGGGPGGVGGGVGGGPGGVGGGPGGAGPGGAGGFGPGGAGGFGG795測序744GGVGGGVGGGPGGVGGGVGGGPGGVGGGPGGAGPGGAGGFGPGGAGGFGG793數(shù)據(jù)庫796FGGGSSAGASSSGSASASNGGPFGVLNVGPGGRIGGGSASASAASRAHM845湖lj序794FGGGSSAGASSSGSASASNGGPFGVLNVGPGGRIGGGSASASAASRAHAH843數(shù)據(jù)庫846AFGGLGGGSASAGSHSSSSSHSFGGHVFHSVTHHGGPSHVSSGGHGGHGG895測序844AFGGLGGGSASAGSHSSSSSHSFGGHVFHSVTHHGGPSHVSSGGHGGHGG893數(shù)據(jù)庫896GPYKPGY902湖lj序894GPYKPGY900COYNE和WAITE已經(jīng)i正實不同前月交原P變體(P22、P33和P38)存在于其cDNA序列的某些部分區(qū)域中(COYNE和WAITE,2000)。如果將變體P22的這些短的已知序列區(qū)域與本發(fā)明的前膠原P的DNA序列進行比較，獲得100%匹配。前膠原D(SEQIDNO:2)atggtctacaaactcctgaccgtgtgtcttgtagcatctcttctagagatttgcttagtaggaggcgggtgccggagcgtggtggcgcc3cgagc3gcatgcsgcsgctcggsggsctccgcsggsgcgagtaccagggaggagatgsaaccaggagagacaagtaggg3ggtg33gccagtaggagggtgaacgaggagggatcagtgaccaagaggtgggtagscgcagacggtaattgasgscctgaaccggtggcaggaccagggaccaggagggcggtgg3ctgaggaggtttc3gg3gc3ggC3gccgcagccagcaagagcccgccgcsgcg3tcscacgcgtgactatcataatggtggttgcscatggaagcacgagca3gcsgc33gscggaggagttcaaacaaggaaggaccagttcaaaggacctagaccaaggc3gg333ggccacaaggaccaaccacaaggacggagsccas3cc3gg3gagagatagaggaaggaasccgtcc33gg3caacagaacagcc3CC3gC3CC3aictcggsggscggaigg3ttssggtggtgga3gg3sacggt3cg3gcsgca3gc3gcstcaagcsgccaacacscgctgcccgg333cgstcagtatggcggcaggagccggcaagagcaccacccaggattcagcaggaggcaggsgcagggcggtccaggcaggacgtcccsgtaggagggsccsaagggatggagaaaaaaccaggagggcgaacaaggcaggaccagccaacagg3tggagcacaagagaggacaacgcaaagggaaggatcccaagcgtggagsacggagtaggaggcaggaggaactaggaggacggaggagcagctcggaggttggagcaggaggcsgc3tc3ggcagccgctagcagccgcacgccgcagctcgccggctatcgcagatacggtagcccatgcatgcacgdgctcccagttggg3tt3ggtgggatttggtgggtcaaccaggcaggaccatggacaaggaccgcg33cc3ggccggaccacacaaagggagagacc3gg3ggccggscc3ctcagsaggaccgagaccaaggaaggagcagcttca-aggaagg3gc3gt3ggaaggsgcaccgccccgtagacagcagcaacacgcagccgcttggtgcaggg3ggttt3ggtaggaggtggcaiggsggeigccagcagcagcgagcaaccgtscgcsgccgccaacagataccc3tgcccstcttggcccsttggtsgcgcaattcggatcaattcggtggaacatgccggttgg3g3tsgssggaccagctaaccggagatcstcc33ggscggaccacaaagttggagcaagcaactggc3gg3ccsgtcccgaggacgaacc3cg3gg33ggsgtt3tcaacctttgac3gc3gg3gc3aggagcaggatggactcggatggtggactcagcaggaggattcsggscttagcaggacat33gtsgcgt3atattaaggaaacggttgcccatgccagcacatgccg3gcgc3gccggcagcagccatt3ggsggstggggcaccagcgaggaccacgctgatggtaggsccaaaggcaaggagcacccasagggacggaccaatggccaggaccaagctgatggcaggccg3ccsgccaggtggtagaaactggccacccttgtcagcaggagcagtttgc3gg3gccaggagtagggtgg3ctcgggaggattaggcsggaggcgggtggaggatggtggsgcagggagcatggagggaagtggaaggacasggagatccatggtg在下文中，顯示了發(fā)表的序列(QIN等，1997)[gi:2772914]與通過對前膠原D測序所得到的完整序列的比對。將DNA序列翻譯成蛋白質序列。應當指出數(shù)據(jù)庫序列是SEQIDNO:8而通過測序所得到的序列是SEQIDNO:4。數(shù)據(jù)庫1MVYKLLTVCLVASI^EICLADYNGNKQYGGRYGNRYGNGLGGGNGGAGAV50測序1MVYKLiljTVCIjVASIjLEICIiADYISIGNKQYGGRYGNRYGNIGLGGGNGGAGAV50數(shù)據(jù)庫51AHAHAHAHASAGANGRARAHARALAHAHAGGGAAHGHPGETVGGSASAAA100湖!l序51AHAHAHAHASAGANGRARAHARALAHAHAGGGAAHGHPGFPVGGSASAAA100數(shù)據(jù)庫101RAAARASAGGLGGFGSAAANAAAAARAGAGFGGFGGLGGFGGLGGVGGPG150測序101RAAARASAGGLGGFGSAAANAAAAARAGAGFGGFGGLGGFGGLGGVGGPG150數(shù)據(jù)庫151QPGGPGGPGGPGGPGGPGMPGGPGGPSGPGTGGPGQPGGPGGPGGPGGPG200測序151G-------------------------------------------------151數(shù)據(jù)庫201GPSMPGGPGGPGGPGMPGGPGGPGGPGGAGGIPGMTGPAGPPGPAGPQGP250測序151--------------------------------------------------151數(shù)據(jù)庫251EGEQGPRGRTPAGTPGPPGNPGEPGQGGAPGAPGAPGHAGKHGTAGAAGK300測序152-----------------------------------PGHAGKHGTAGAAGK166數(shù)據(jù)庫301AGRPGPXGQAGASGSSGQHGASGAPGRPGNPGSTGRPGATGDPGRPGATG350測序167AGRP----------------------------------------------170數(shù)據(jù)庫351TTGRPGPSGAPGNPGAPGMiGAPGPRGSPGFVGLPGPRGSPGEPGNQGPI400測序1"70--------------------------------------------------170數(shù)據(jù)庫401GGPGYPGPRGPQGPDGAMGPQGPCGDRGAPGVPGKQGPVGGQGPAGPRGP450測序171---------------------GPCGDRGAPGVPGKQGPVGGQGPAGPRGP199數(shù)據(jù)庫451RGDEGPVGPKGEPGARGADGKPGDKGPDGETGPQGPAGPKGQVGDQGKPG500須!)序200RGDEGPVGPKGEPGARGADGKPGDKGPDGETGPQGPAGPKGQVGDQGKPG249數(shù)據(jù)庫501AKGETGDQGARGEAGKAGEQGPGG工QGPKGPVGGQGPAGPAGPLGPQGPM550狽ll序250AKGETGDQGARGEAGKAGEQGPGGIQGPKGPVGGQGPAGPAGPLGPQGPM299數(shù)據(jù)庫551GERGPQGPTGSEGPVGAPGPKGSVGDQGAQGDQGATGADGKKGEPGERGQ600須!l序300GERGPQGPTGSEGPVGAPGPKGSVGDQGAQGDQGATGADGKKGEPGERGQ349數(shù)據(jù)庫601QGAAGPVGRPGPRGDRGAKGIQGSRGRPGGMGRRGNRGSQGAVGPRGETG650湖!]序350QGAAGPVGRPGPRGDRGAKGIQGSRGRPGGMGRRGNRGSQGAVGPRGETG399數(shù)據(jù)庫651PDGNQGQRGEQGAPGVITLVIEDLRTAGVESPVETFDAGAGTGGPAPGVG700測序400PDGNQGQRGEQGAPGVITLVIEDLRTAGVESPVETFDAGAGTGGPAPGVG449數(shù)據(jù)庫701AAATAGAFAGAGPGGANAGGNAAAGAGPGVGPGGLGGLGGLGAGGLGGGL750測序450AAATAGAFAGAGPGGANAGGNAAAGAGPGVGPGG!LGGliGGIjGAGGIjGGGlj499數(shù)據(jù)庫751GGGIiGGLiGGAGGLGGGLGGLGGGLGGGLGGIjG——GGAGGAGAGGNGGAG797測序500GGG:LGGLGGAGGLGGGLGGD3GGLGGGIjGGLGGGAGGAGGAGAGGNGGAG549數(shù)據(jù)庫798AGGAGGNGGGSAAARAAAQAAAAAGGNGGAAQAAAQAAASAAANSGLGAG847觀J序550AGGAGGNGGGSAAARAAAQAAAAAGGNGGAAQAAAQAAASAAANSGLGAG599數(shù)據(jù)庫848AARAAASAAARATVTGHGSGTAAAAANAAAQAHAATRGQGGSHAHAAAAA897測序600AARAAASAAARATVAGHGSGTAAAAANAAAQAHAATRGQGGSHAHAAAAA649數(shù)據(jù)庫898HAAASSVIHGGDYHGNDAGYHKPGY922測序650HAAASSVIHGGDYHGNDAGYHKPGY674在兩個序列中存在顯著差異所用的前膠原D序列比已發(fā)表的序列短250個氨基酸。膠原結構域中的大部分氨基酸丟失。因此，這里公開的前膠原D基因是前膠原D基因迄今未發(fā)表及未知的形式。應當指出截短膠原結構域增加了絲纖蛋白結構域在整個蛋白質中的量，因此，整個蛋白質分子的行為將是不同的。P4H表達構建體在下文中，將在P4H表達質粒后在5Wc//至Xpa/區(qū)域中的DNA序列顯示為雙鏈。MFa/P4H融合構建體的開頭和結尾均印刷出來。所用的限制性位點以下劃線標出。SEQIDNO:71ccgcggtcattacagttcatctttcacagctttctgatcatcgtcttcctccatgtctgg1ggcgccagtaatgtcaagtagaaagtgtcgaaagactagtagcagaaggaggtacagacc61ctcctctgcttcttccsggtcctcgagatcgtc3tcstcccctgccccstcctggccacc61agaaggtccagg3gctct3gcsgt3gt3ggggacggggtaggaccggtgg121cgagaggtccttaaagaattttggtaggtcgcacgcaaggggcaacattagttactggca121gctctcc3gg33tttCtt33a3CC3tccsgcgtgcgttccccgttgt33tcaatgaccgt181cctgtcggcactggcaggaaag33cttg3gtgtggggssgctgtgcsctttgacggcctc181ggscagccgtgsccgtcctttcttgaactc3C3CCCCttCgacacgtgaaactgccggag241cscctcgttggcagtcgagtccatcttggcgatgacgatgttctcstggtccttgtacgt241gtggagcaaccgtcsgctcaggtagaaccgctactgctacaagagtaccaggaacatgca301ctctcccsgttt3tCCC333tgggagccaactgtttgc3gtg3CC3C3CCatggggcata301gagagggtcaaatagggtttaccctcggttactggtgtggtaccccgtat361g33CtCC3C3sagacgttttttttCtC3tCaasagccacg七CttC333gttCttCCC33C361cttgaggtgtttctgcasasaaaagagtagttttcggtgcagaagtttcaagaagggttg421asgcaccttgacsggctgcttgtcccagtcctccggcagctcctggctcatcaggtgggg421ttcgtggaactgtccgacgaacagggtcaggaggccgtcgagtccacccc481cttgattttgccctccaggaagcggtggcagasctctgtg3tcctctctgccgtcagctc481gggsggtccttcgccsccgtcttgsgac3ctaggagagacggcagtcgag541ctccgattcgggcttgtacttggtcatctcctcctccagggtgatgaggcgcacggccgg541gaggctaagcccgaacatgaaccagtagaggaggaggtcccactactccgcgtgccggcc601gcactcttccttcttcaggccaaagaactcgaggatgcgctggttgtcggtgtggtcgct601cgtgagaaggaagaagtccggtttcttgagctcctacgcgaccaacagccacsccagcga661gtcgatgaagatgaacaggatcttgcccttgaagctctcggctgctgttttgaagttgct661cagctacttctacttgtcctagaacgggaacttcgagagccgacgacaaaacttcaacga721cagtttgccgtcatagtcagacacactcttgggcaagaacagcaggatgtgagtcttgat721gtcaaacggcagtatcagtctgtgtgagaacccgttcttgtcgtcctacactcagaacta781ttcacctccaaaaatcttcggggctgtctgctcggtgaac781aagtggaggtttttagaagccccgacagacgagccacttg841gttgtgtttgataaagtccagcaggttctccttggtgacc841caacacaaactatttcaggtcgtccaagaggaaccactggtcgatgacaaggggcagctgagctactgttccccgtcgactccccttcaaagttgttccgaggggsagtttcaacaaggc901gccttcatcaaacttcttaaagaggacaaccccatctttgtcgagctggtatttggagaa901cggaagtagtttgaagsatttctcctgttggggtagaaacagctcgaccataaacctctt961cacgtcactgttggaagtgatcccaaatggtatgtcatcgatggcctctgctgcctgcaa961gtgcagtgacaaccttcactagggtttaccatacagtagctaccggagacgacggacgtt1021aaactgcttggcagagtccgactccacgtccttgaagaagccgatgacagccacctcgct1021tttgacgaaccgtctcaggctgaggtgcaggaacttcttcggctactgtcggtggagcga1081ggactccscc1081cctgaggtgg1141gcgcttcttc1141cgcgaagaagaaggactctgttcctgagacagccagttcatcggtcaagtcagctgcgccgtcgacgcggApalcgatgtcatcgctacagtaggtcaggcagggtggtggcsgccgggcccgtcagtccgtcccaecaccgtcggcccgggca3gcctctctgccsgctgtst3ttccttgggteggagagaeggtcgacatataaggaaccc1201ggaagccgtgtctccattcctgaagaacttgatggtgggatagccgcgcacgccgtactg1201ccttcggcacagaggtaaggacttcttgaactaccaccctateggegegtgeggcatgae1261ctgggccaggtcagactcctccgtggcgtccaccttggccaacctgatctcggaaccttc1261gacccggtccagtctgaggaggcaccgcaggtggaaccggttggactagagccttggaag1321tgccttcagcttcccagcggctttggcatactcaggggccagagecttgeagtggccaca1321aeggaagtegaagggtcgeegaaacegtatgagtccccggteteggaacgtcaccggtgt1381ggttccccgtatcttgaggtggtegtccatgaacacccggeggtcgeggaggcgcttcaa1381ccaaggggcatagaactccaccagcaggtacttgtgggccgccagcgcctccgcgaagtt1441gcttttccgcagcaccaggacgtggtcctcctcctccggagegtcagctaatgcggagga1441egaaaaggegtcgtggtcctgcaccaggaggaggaggectcgcagtcgattacgcctcctBspEI1501tgctgcgaataaaactgcagtaaaaattgaaggaaatctcatggatccggggttttttct1501acgacgcttattttgacgtcatttttaacttcctttagagtacctaggccccaaaaaagaStartBamHI1561ecttgaegttaaagtatagaggtatattaacaattttttgttgatacttttattacattt1561ggaactgcaatttcatatctccatataattgttaaaaaacaactatgaaaataatgtaaa1621gastaagaagtaatacaaaccgaaaatgttgaaagtattsgttaaagtggttstgcagtt1621cttattcttcattatgtttggcttttacaactttcataatcaatttcaccaatacgtcaa1681tttgcatttatatatctgttaatagatcaa1681sascgtaaatatatagacsattatctagtt1741gaaataaggctaaaaaactaatcgcattat1741ctttattccgattttttgattagcgtaata1801tttgaaggtttgtggggccaggttactgcc1801aaacttccaaacaccccggtccaatgacgg1861gtattgtagaatctttattgttcggagcag1861c3七33C3tctt3g333t33C3sgcctcgtc19213cgcgaccggtgaagacgaggacgcacgga1921tgcgctggccacttctgctcctgcgtgcct1981gctcggcggcttctaatccgtacttcaata1981cgagccgccgaagattaggcatgaagttat2041agttccaaagagaaggtttttttaggctaa2041tcaaggtttctcttccaaaaasatccgatt2101tataagtsagattagatatggatatgtata2101StattC3ttct33tctat3CCt3t3C3t3t2161atatgattattaaacttctttgcgtccatc2161tatactaataatttgaagaaacgcaggtag2221saggaattcgatatcaagcttatcgatacc2221ttccttaagctatagttcgaatagctatggEcoR工SailStartasatcstcgcttcgctgstt3attscccc3tttagtagcgaagcgactaattaatggggtcatcctatggttgttaatttgattcgttcagtaggataccaacaattaaactaagcaagt33tttttCCtCttC3t￡l3CC3t3333gct3ttaaaaaggagaagtattggtattttcgattgcggcgcgsggcscstctgcgtttc3gg3acgccgcgctccgtgtagacgcaaagtcctggagagtcttccttcggagggctgtcaccccctctcsgsaggaagcctcccgacagtgggtagcaatgagcagttaagcgtattactgaaatcgttactcgtcaattcgcataatgacttgataatggggctctttacatttccacaacactattaccccgagaaatgtaaaggtgttgttggatatgtatatggtggtaatgccatgtaacctatacatataccaccattacggtacatgt33gwtttttgsswttcgtttttttttcsttctt33aascttttasggtcgacatgagatttccttcaatttttactcagctgtactctaaaggaagttaaaaatga2281gcagttttattcgcagcatcctccgcgctagctcatccaggcttttttacttcaattggt2281cgtcaaaataagcgtcgtsggaggcgcgstcgagtaggtccgaaaasatgaagttaaccaNhel2341cagatgactgatttgatccatactgagaaa2341gtctactgactaaactaggtatgactcttt2401aaggcagaagaggscaagttagascaaats2401ttccgtcttctcctgttcaatcttgtttat2461actagtacagcgacaaaagatccagaagga2461tgatcatgtcgctgttttctaggtcttcct2521ttaatgaaacgtctgaatactgagtggagt2521aattactttgcagacttatgactcacctca2581tC3g3tggCttt3tCtct33CCt33CC3tt2581agtctaccgaaatagagattggattggtaagatctggtgacttctctgaaagattatattctagaccactgaagagsctttctaatataaaaaaaatgggcagaga3gttagatcggctattttttacccgtctcttcaatctagccgattttgttgggcatccagtaaatgcattcaaaaaacaacccgtaggtcatttacgtaagtttgagttggagaatctggtccttaaggatatgCtC33CCtCt七3g3CC3gg33ttCCt3t3Ccagsgaccagtactttctaatgatgaagatgtctctggtcatg33ag3ttactacttct32641caggttggggcagccaaagctctgttacgt2641gtccasccccgtcggtttcgagacaatgca2701accatctcaaagggtaatcttccaggagtg2701tggtagagtttcccattagaaggtcctcac2761tgctttgagttgggcaaagtggcctataca27613cgaaactcascccgtttcaccggatatgtctcc3gg3t3cct3C33tttggst3C3g3tgaggtcctatggatgttaaacctatgtctasaacacaaatcttttctaacggctgaggactttgtgtttagaaaagattgccgactcctggaagcagattattaccatacggaactgtggcttcgtctaataatggtatgccttgacacc<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>MRFPSIFTAVLFAASSALAHPGFFTSIGQMWAEKLDRLTSTATKDPEGFVGHPVNAFKLMPVLSNDEDGVGAAKAL^RL^DTYNLDTDTIDYYHTELWMEQ虹RQLDEGEIST工DKVSVLQRANGNLKYFEYIMAKEKDVNKSASDDQSDKMTPRRGKKLFCRYHDGNRNPKFILAPAKGRLSRATVHDPETGKLTTAQYRVSKSAWLSGNYGVGGQYEPHFDFARKDEPDAFKELGTGNKGTAVFWYNLFASGEGDYSTRHAACPVLVGMFa-P4HB(SEQIDNO:6)MRFPSIFTAVLFAASSALADAPEEEDHVLVLAPEYAKAAGKLKAEGSEIRLAKVDATEESGREADDIV麗LKKRTGPAATTLPDGAAAESIDDIPFGITSNSDVFSKYQLDKDGVVLFKKEFTEQTAPKIFGGEIKTHILLFLPKSVSDYQRILEFFGLKKEECPAVRLITLEEEMTKYKELPEDWDK(2PVKVLVGKNFEDVAFDEKKNVNIVIAKMDSTANEVEAVKVHSFPTLKFFPAGDDDDLEDLEEAEEPDMEEDDDQKAVKDELMFa的序列(SEQIDNO:10)MRFPSIFTAVLFAASSALATDLIHTEKDLVTSLKDYIKAEEDKLEG工KKKRLNTEWSELE肌VLKDMSDGFISNIjTIQRSKGNLPGVKHKSFLTAEDCFELGKVAYTEADYLSYAVYQQGDLDKALLLTKKLLELDPEHQKTTPKKKGVAVDYLPERQKYEMLCRGEGIEDEWDKPRIIRFHDIISDAEIEIVKDLAKPYENPVVSRINMRIQDLTGLDVSTAEELQVARIATWLFYMSDVSAGGATVFPEVGASVWPKNKWVSNKWMERGQEFRRPCTLSELELRKSNFAEALAAHKYLLVEFYAPWCGHCKADLAQQYGVRGYPTIKETRNGDTASPKEYTALVESSEVAVTGETKDVESDSA叨FLGAAEAFDEGR,FEGEVTKENliDFIKH即LPLVIDGKLSNFKTAAESFKGKILFIFIDSDHTDNPESEELTAERITEFCHRFLEGKIKPHLMSQFVEFYAPWCGHCKGLAPIWDKLGETYKDHESADRTV工DYNGERTLDGFKKFLESGGQDGA1.Yonge，M.(1962).Onthesignificanceofthebyssusinthebivalviaanditseffectsinevolution(關于足絲在雙殼綱(bivalvia)的意義及其在演化中的作用).J.Mar.Biol.Ass.U.K.化113-125.2.Qin,X,X.,Coyne,K丄和Waite,J,H.(1997).Toughtendons.MusselbyssusJournalofBiologicalChe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