專利名稱：：用于在植物中遺傳控制昆蟲(chóng)侵襲的方法和組合物的制作方法用于在植物中遺傳控制昆蟲(chóng)侵襲的方法和組合物在光盤上提交的序列表通過(guò)引用結(jié)合到本文中在一張光盤(拷貝l)以及其復(fù)制文件(拷貝2)上提交了序列表，每個(gè)文件都是在2006年9月15日建立的，均含有命名為"MNDE002.APP.TXT."的一個(gè)669kb文件。在此將光盤上含有的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。優(yōu)先權(quán)本申請(qǐng)要求2005年9月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列No.60/718,034的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)通過(guò)整體引用結(jié)合到本文中。發(fā)明背景1.發(fā)明領(lǐng)域一般而言，本發(fā)明涉及害蟲(chóng)侵襲的遺傳控制。更具體地，本發(fā)明本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)錄后阻抑或抑制耙編碼序列在害蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)以提供害蟲(chóng)防護(hù)作用的重組DNA技術(shù)。2.相關(guān)領(lǐng)域的描述人類生存的環(huán)境充滿了害蟲(chóng)侵襲。害蟲(chóng)包括昆蟲(chóng)、蜘蛛、甲殼類動(dòng)物、真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲(chóng)、扁形蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)、鄉(xiāng)條蟲(chóng)、錐形蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、馬蠅、跳蚤、扁虱、螨、虱等，它們是人類環(huán)境中普遍存在的，已應(yīng)用了多種手段企圖控制這些害蟲(chóng)的侵襲。用于控制微小害蟲(chóng)(例如細(xì)菌、真菌和病毒)侵襲的組合物已被提供為抗生素組合物、抗病毒組合物以及抗真菌組合物形式。用于控制較大害蟲(chóng)(例如，線蟲(chóng)、扁形蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)、犬心蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、錐形蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)等)侵襲的組合物典型地已作為化學(xué)組合物的形式存在，它們可被應(yīng)用到已知會(huì)出現(xiàn)害蟲(chóng)侵襲的物質(zhì)表面，或者以藥丸、粉末、藥片、軟膏或膠嚢等形式4皮受侵襲的動(dòng)物攝取。本發(fā)明涉及提供較之本領(lǐng)域已知的組合物，用于控制害蟲(chóng)侵襲的改進(jìn)方法。商業(yè)農(nóng)農(nóng)作物通常是昆蟲(chóng)攻擊的輩巴。在過(guò)去數(shù)十年中，關(guān)于開(kāi)發(fā)用于控制植物中昆蟲(chóng)侵襲的更為有效的方法和組合物，已有了一些實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展?；瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑對(duì)于根除害蟲(chóng)侵襲非常有效。但是，使用化學(xué)殺蟲(chóng)6劑有多種缺點(diǎn)?；瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑是非選擇性的。人們意欲應(yīng)用化學(xué)殺蟲(chóng)劑來(lái)控制對(duì)多種農(nóng)作物和其它植物來(lái)說(shuō)有害的無(wú)脊推害蟲(chóng)。但是，因?yàn)槿狈x擇性，化學(xué)殺蟲(chóng)劑對(duì)于非耙動(dòng)物也會(huì)施加其作用，并且，在化學(xué)殺蟲(chóng)劑應(yīng)用過(guò)的一段時(shí)間，通常會(huì)使田野貧瘠?；瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑持續(xù)存在于環(huán)境中，通常很慢被代謝，如果完全不被代謝的話。它們會(huì)積累于食物鏈中，特別是高等食肉動(dòng)物的食物鏈中。這些化學(xué)殺蟲(chóng)劑的積累導(dǎo)致對(duì)這些試劑抗性的發(fā)展以及導(dǎo)致進(jìn)化梯高端的物種，所述殺蟲(chóng)劑作為誘變劑和/或致癌劑發(fā)生作用，通常導(dǎo)致不可逆的有害遺傳修飾。因此人們強(qiáng)烈需要對(duì)環(huán)境友善的方法用于控制或根除植物中或植物上的昆蟲(chóng)侵襲，即，選擇性的、環(huán)境惰性的、非持續(xù)保留的以及生物可降解的，并且能很好地是用于害蟲(chóng)抗性管理體系的方法。包括蘇云金芽孢桿菌(B.t.)的組合物是可通過(guò)商業(yè)途徑獲得的，其作為對(duì)環(huán)境安全并且可接受的殺昆蟲(chóng)劑已使用了在超過(guò)三十年。Bt細(xì)菌的殺昆蟲(chóng)作用是這些細(xì)菌專有產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的結(jié)果，所述蛋白質(zhì)不會(huì)持續(xù)存在于環(huán)境中，并且，對(duì)于受影響的靶物種具有高度的選擇性，僅通過(guò)被靶害蟲(chóng)攝取來(lái)施加其作用，它們已顯示出了對(duì)環(huán)境和其它非靶生物(包括人類)的無(wú)害性。含有編碼殺昆蟲(chóng)B丄蛋白的一種或多種基因的轉(zhuǎn)基因植物還可在本領(lǐng)域內(nèi)獲得，它們明顯有效于控制有害昆蟲(chóng)的侵襲。使用表達(dá)Bt殺昆蟲(chóng)蛋白的重組植物的實(shí)質(zhì)性結(jié)果是，在使用此類轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的地區(qū)，應(yīng)用到環(huán)境以控制農(nóng)作物田間害蟲(chóng)侵襲的化學(xué)殺蟲(chóng)劑的量明顯減少。化學(xué)殺蟲(chóng)劑應(yīng)用的減少使得土壤更為清潔，并且使得從土壤流向周圍溪流、江河、池塘和湖泊的水也更為清潔。除這些環(huán)境好處之外，轉(zhuǎn)基因抗昆蟲(chóng)農(nóng)作物生長(zhǎng)的農(nóng)作物田間，有利昆蟲(chóng)的數(shù)量有顯著增加，這是因?yàn)榛瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑的使用減少的緣故。本領(lǐng)域中已報(bào)道了反義方法和組合物，它們被相信能通過(guò)單鏈RNA分子(理論上，能在體內(nèi)與高度互補(bǔ)的有義鏈RNA分子雜交)的合成施加其作用。反義技術(shù)難于在很多系統(tǒng)中使用，這有三個(gè)主要原因。首先，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的反義序列不穩(wěn)定。第二，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的反義序列的不穩(wěn)定性隨之對(duì)將該序列送遞到遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的宿主、細(xì)胞類型或生物系統(tǒng)造成困難。第三，隨著不穩(wěn)定性和反義序列的送遞遇到的困難對(duì)于如下企圖來(lái)說(shuō)也制造了困難，所述企圖是在編碼該反義序列的重組細(xì)胞內(nèi)部提供能有效調(diào)節(jié)靶有義核苷酸序列表達(dá)水平的劑量。用于在細(xì)胞、組織或生物內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的技術(shù)鮮有改進(jìn)，特別地，缺少用于通過(guò)使用重組DNA技術(shù)來(lái)延遲、抑制或減少特定基因表達(dá)的發(fā)展的技術(shù)。此外，作為這些手段的不可預(yù)見(jiàn)性的結(jié)果，沒(méi)有用于在真核或原核生物中調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)水平的、商業(yè)途徑可獲得的手段。以前已展示了在多種害蟲(chóng)中對(duì)特定基因進(jìn)行雙鏈RNA介導(dǎo)的抑制。已在一種果蠅，即黑腹果蠅(Dmy，/2^2附e/awoga^er)中對(duì)dsRNA介導(dǎo)的用于遺傳控制的手段加以了檢測(cè)(Kennerdell和Carthew,1998;Kennerdell和Carthew,2000)。Kennerdell和Carthew(1998)描述了一種方法，用于送遞涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)(其表達(dá)雙鏈RNA分子)的dsRNA或?qū)sRNA溶液注射到昆蟲(chóng)體內(nèi)或在胚胎發(fā)育之前注射到卵嚢內(nèi)。研究人員之前已經(jīng)展示，通過(guò)將含有雙鏈或小干擾RNA分子的溶液喂飼給線蟲(chóng)或?qū)⒕€蟲(chóng)浸于該溶液中，以及通過(guò)注射dsRNA分子，可在線蟲(chóng)中獲得雙鏈RNA介導(dǎo)的基因抑制。Rajagopal等人(2002)描述了如下失敗的嘗試通過(guò)喂祠含特異于革巴基因的dsRNA的溶液，或通過(guò)將幼蟲(chóng)浸于該溶液中，來(lái)抑制有害昆蟲(chóng)斜紋-良蛾(5^ocfo/7&ra/"wraj幼蟲(chóng)的內(nèi)源基因，但是，在用微施用器(microapplicator)將dsRNA注射到第五齡幼蟲(chóng)的血淋巴之后，Rajagopal等人卻成功地獲得了抑制。最近，Yadav等人(2006)報(bào)道了在植物中產(chǎn)生的宿主制備的dsRNA可以防止植物感染線蟲(chóng)。類似地，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)No.2003/0150017預(yù)見(jiàn)性地描述了用于使用送遞到幼蟲(chóng)的dsRNA抑制鱗翅目幼蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)(//e/zcovw/^w脂gera)的優(yōu)選基因座，所述送遞通過(guò)才聶取了^皮轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生dsRNA的對(duì)關(guān)鍵CRW基因的CRW特異性dsRNA。在體外和植物中在CRW食物中提供dsRNA，結(jié)果是在攝入該食物后CRW幼蟲(chóng)的成長(zhǎng)受阻礙或被殺死，并且對(duì)一些不同的基因證明了該作用。因此，需要鑒定有效核苷酸序列，所述序列用于通過(guò)阻抑、延遲或其它方式減少特定鞘翅目害蟲(chóng)中的基因表達(dá)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的改進(jìn)方法中，該方法的目的是控制害蟲(chóng)侵襲或誘導(dǎo)新的表型性狀。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供抑制鞘翅目害蟲(chóng)中靶基因表達(dá)的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括調(diào)節(jié)或抑制鞘翅目害蟲(chóng)中一種或多種靶基因的表達(dá)，所述方法能導(dǎo)致攝食、生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和/或感染力停止，最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡。所述方法包括將穩(wěn)定化的雙鏈RNA(dsRNA),包括其修飾形式(例如，小干擾RNA(siRNA)序列)的部分或全部引入到鞘翅目昆蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞外環(huán)境(例如，中腸)中，其中dsRNA進(jìn)入到細(xì)胞中，并且抑制至少一種或多種靶基因的表達(dá)，并且，其中該抑制在鞘翅目害蟲(chóng)上施加了有害的作用。本發(fā)明的方法和相關(guān)組合物可以用于通過(guò)在害蟲(chóng)的食物中提供本文描述的一種或多種包含dsRNA分子的組合物，在任何害蟲(chóng)宿主、害蟲(chóng)共生體或害蟲(chóng)存在的環(huán)境內(nèi)部或表面上限制或消除鞘翅目害蟲(chóng)的侵襲。該方法對(duì)于防止昆蟲(chóng)攻擊植物特別有益。在一種實(shí)施方案中，害蟲(chóng)限定為消化系統(tǒng)的pH為大約4.5至大約9.5，大約5至大約9，大約6至大約7以及大約pH7.0。另一方面，本發(fā)明提供了示例性核酸組合物，其與輩巴害蟲(chóng)中一種或多種天然核酸序列的至少一部分同源。在某些實(shí)施方案中，害蟲(chóng)選自葉曱物種(Dza6TO"cflsp.),包4舌西部玉米才艮蟲(chóng)(WCR,D/"6n"cawgz/era或Z)z'"6ra〃C(3w>gz/era"wrg7^ra)、南部玉米才艮蟲(chóng)(SCR,Z)z'a/)ra"caww(iec/w/7wwctoto/zowaniz)、墨西哥玉米才艮蟲(chóng)(MCR,Z)z.(2方/"o"caWrg〖Zera、巴西玉米才艮蟲(chóng)(BZR,Z)^5;-c)/7'cafco/feato,Dza&ohcaW"c/w/a，Z)w/)ra/zc"s/ecz'os'")、北部玉米才艮蟲(chóng)(NCR,Z)z"/),o//caZ"rZe")、Z)z"Z)尸o"c"麗Je"m;朋"ata;以及科羅^立多馬鈴薯曱蟲(chóng)(CPB,丄e/^zwotor^(iece7w/z"eflf")、赤4以谷盜(RFB,7Vz'Zo/z.wm)禾口'畺、西哥豆甲(E/H7ac/wavanVeWw)。在其它實(shí)施方案中，害蟲(chóng)選自鱗翅目昆蟲(chóng)，包括歐洲玉米螟(ECB，O^nma"w&7a/w)、??；也老虎(BCW,^gro"《z;w7ow)、玉米豐占蟲(chóng)(CEW,//e/zcover/jazea)、-大4艾蟲(chóng)我(FAW,5^ot/o/^eroyhyg&enia)、才帛鈴象鼻蟲(chóng)(BWV,y4/2/7zo"ow2^gn2/7(3fe)、蠶(Bo/w6jkx)和煙草天蛾(A/"wy>,以及雙翅目昆蟲(chóng)，包括黑腹果蠅(Z)ms'o/M(2膨/朋ogoy,er)、癡蟲(chóng)丈(A"(9//ze/wgaw6zae)和埃及伊蟲(chóng)丈。本發(fā)明提供的所述核酸的具體實(shí)例示于所附序列表中的SEQIDN0:1—SEQIDNO:906。另一方面，本發(fā)明提供了用于抑制鞘翅目害蟲(chóng)如玉米根蟲(chóng)或相關(guān)物種的基因表達(dá)的方法，該方法包括在害蟲(chóng)的食物中提供基因抑制量的至少一種從上文描述的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的dsRNA分子，其至少一個(gè)片段與害蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的mRNA序列互補(bǔ)。該方法可以進(jìn)一步包括觀察害蟲(chóng)的死亡、攝食抑制、受阻或停止。根據(jù)本發(fā)明使害蟲(chóng)攝食的dsRNA分子，包括其修飾形式，如siRNA分子，可以與從選自SEQIDNO:l-SEQIDNO:906的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA分子具有約80，81,82,83,84,85,86，87,8889,90，91，92,93，94,95,96,97，98,99或約100%同一性。在特定實(shí)施方案中，核苷酸序列可以選自SEQIDN〇:697、SEQIDNOs:813-819、SEQIDNO:841和SEQIDNO:874。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了一組分離和純化的核苷酸序列，如SEQIDNO:l-SEQIDNO:906所示。本發(fā)明提供了穩(wěn)定化的dsRNA分子或一種或多種miRNA的表達(dá)，用于抑制鞘翅目害蟲(chóng)中從這些序列和片段表達(dá)耙基因。穩(wěn)定化的dsRNA,包括miRNA或siRNA分子可以包含至少兩個(gè)編碼序列，它們相對(duì)于至少一個(gè)啟動(dòng)子是有義和反義方向排列的，其中包含有義鏈和反義鏈的核苷酸序列通過(guò)至少約5-約1000個(gè)核苷酸的間隔序列連接或相連，其中有義鏈和反義鏈可以是不同的長(zhǎng)度，并且其中所述兩個(gè)編碼序列中的每一個(gè)序列與SEQIDNO:l-SEQIDNO:906所示的4壬4可一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列具有至少80%的序列同一性，至少90%,至少95%,至少98%，或100%的序列同一性。本發(fā)明進(jìn)一步提供了選自SEQIDNO:l_SEQIDNO:906的核酸序列的片段或串聯(lián)體。在特定實(shí)施方案中，核苷酸序列可以包含選自SEQIDNO:697、SEQIDNOs:813-819、SEQIDNO:841和SEQIDNO:874的序列的片段或串聯(lián)體。當(dāng)表達(dá)為dsRNA并且提供給害蟲(chóng)時(shí)，該片段可以定義為導(dǎo)致害蟲(chóng)死亡、攝食抑制、受阻或停止。該片段可以例如包含SEQIDNO:1-SEQIDNO:906中任何一個(gè)或多個(gè)序列或其互補(bǔ)序列的至少約19,21,23,25,40,60,80,100,125或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。用于本發(fā)明中的一種有益的DNA片段的長(zhǎng)度是約19-約23個(gè)核香酸，或約23-約100個(gè)核苷酸，最多至約2000個(gè)核苷酸或更多。特別有用的將是包括約23-約300個(gè)與害蟲(chóng)靼序列同源的核苷酸的dsRNA序列。本發(fā)明也提供了從任何所述序列表達(dá)的核糖核酸，包括dsRNA?？梢詠V人來(lái)自一種或多種輩巴害蟲(chóng)的單個(gè)序列構(gòu)建選擇用于表達(dá)基因抑制劑的序列，并且用于表達(dá)抑制一種或多種靶害蟲(chóng)中的單個(gè)基因或基因家族的RNA,或該DNA序列可從多種DNA序列構(gòu)建為嵌合體。另一方面，本發(fā)明提供了重組DNA構(gòu)建體，其包含編碼本文描述的dsRNA分子的核酸分子?？梢酝ㄟ^(guò)從與選自SEQIDNO:l-SEQIDNO:906的核苷酸序列具有至少約80%-約100%同一性的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄dsRNA分子的一條鏈，形成dsRNA。所述重組DNA構(gòu)建體可以定位為能夠在攝入后在害蟲(chóng)中抑制內(nèi)源靶基因表達(dá)的dsRNA分子。該構(gòu)建體可以包含任選與在宿主細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子序列連接的本發(fā)明的核苷酸序列。所述啟動(dòng)子可以是組織特異性的，并且可以例如特異于受害蟲(chóng)攻擊的組織類型。例如，在根蟲(chóng)的情況下，可能需要使用提供優(yōu)選根表達(dá)的啟動(dòng)子。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以包含至少一個(gè)非天然存在的核苷酸序列，其可以轉(zhuǎn)錄為能夠在體內(nèi)通過(guò)雜交形成dsRNA分子的單鏈RNA。所述dsRNA序列自身組裝，并且可以提供在鞘翅目害蟲(chóng)的食物中，以達(dá)到需要的抑制。重組DNA構(gòu)建體可以包含兩種不同的非天然序列，所述序列在體內(nèi)表達(dá)為dsRNA序列并且提供在鞘翅目害蟲(chóng)的食物中時(shí)，抑制至少兩種不同的靶基因在鞘翅目害蟲(chóng)細(xì)^^中的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，在包括具有害蟲(chóng)抑制作用的細(xì)胞的細(xì)胞或植物中產(chǎn)生至少3,4,5,6,8或10或更多種不同的dsRNAs。所述dsRNA可以從不同轉(zhuǎn)化事件中引入的多個(gè)構(gòu)建體表達(dá)，或可以引入單個(gè)核酸分子上。可以用單個(gè)啟動(dòng)子或多個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)dsRNA。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，產(chǎn)生單個(gè)dsRNA,其包含與害蟲(chóng)內(nèi)的多個(gè)基因座同源的核酸。另一方面，本發(fā)明提供重組宿主細(xì)胞，其基因組中具有至少一個(gè)重組DNA序列，該序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生至少一個(gè)dsRNA分子，該分子在鞘翅目害蟲(chóng)攝入時(shí)起作用，抑制害蟲(chóng)中靶基因的表達(dá)。dsRNA分子可以由本文描述和序列表所示的任何核酸編碼。本發(fā)明也提供了基因組中具有至少一個(gè)本文描述的重組DNA序列的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。也提供了包含所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物，包括任何代的后代植物、種子和植物產(chǎn)品，它們均包含重組DNA。本發(fā)明的方法和組合物可應(yīng)用于任何單子葉和雙子葉植物，這取決于想要的鞘翅目害蟲(chóng)控制。特別地，植物包括但不限于苜蓿、蒔蘿(aneth)、Apple、杏、朝鮮薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、菜豆、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、巻心菜、卡羅拉(canola)、香瓜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芹菜、櫻桃、芫荽、柑橘、克萊門氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、花旗松、茄子、苦苣、寬葉萵苣、桉樹(shù)、茴香、無(wú)花果、葫蘆、葡萄、柚子、哈密瓜、豆薯、奇異果、萵苣、韭菜、檸檬、酸橙、火炬松、芒果、瓜、蘑菇、堅(jiān)果、燕麥、黃秋葵、洋蔥、桔、裝飾用植物、木瓜、歐芽、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿、松樹(shù)、菠蘿、大蕉、李、石榴、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、菊苣、蘿卜、覆盆子、水稻、棵麥、高粱、南方松、大豆、菠菜、倭瓜、草莓、糖甜菜、甘蔗、向日葵、紅薯、蘇合香、蜜柑、茶、煙草、番茄、草皮、蔓生植物、西瓜、小麥、薯蕷以及小胡瓜植物。因此，本發(fā)明也提供了SEQIDNO:l-SEQIDNO:906所示的重組DNA序列或其串聯(lián)體、片段或互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)化的植物，所述序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生至少一種當(dāng)鞘翅目害蟲(chóng)攝取時(shí)抑制害蟲(chóng)中靶基因表達(dá)的dsRNA分子。在特定實(shí)施方案中，-重組DNA序列可以選自SEQIDNO:697、SEQIDNOs:813-819、SEQIDNO:841和SEQIDNO:874或其片段、互補(bǔ)序列或串聯(lián)體。本發(fā)明還提供了用于控制鞘翅目害蟲(chóng)侵襲的方法和組合物的組合。一種手段提供了用于保護(hù)植物防止昆蟲(chóng)侵襲的、本文所述的dsRNA方法，以及一種或多種殺昆蟲(chóng)劑，所述殺昆蟲(chóng)劑展示出與dsRNA方法和組合物所展示出的特征不同的特征。例如，可以在昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的食物中提供一種或多種Bt蛋白，其與本文描述一種或多種dsRNA組合。配制為局部應(yīng)用的組合物，或使用轉(zhuǎn)基因方法獲得的將dsRNA方法和組合物與Bt方法和組合物組合起來(lái)的組合物，能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，這是控制昆蟲(chóng)侵襲的領(lǐng)域中以前未知的。一種協(xié)同效應(yīng)是dsRNA或Bt蛋白所需的表達(dá)水平降低。當(dāng)組合到一起時(shí)，每種害蟲(chóng)控制劑都僅需要更低的有效劑量。認(rèn)為Bt殺昆蟲(chóng)蛋白建立了進(jìn)入孔，dsRNA分子通過(guò)所述的進(jìn)入孔能更為有效地穿透進(jìn)入遠(yuǎn)離昆蟲(chóng)腸道的空間，或者更為有效地進(jìn)入Bt蛋白所建立的損傷附近的細(xì)胞，由此僅需要更少量的Bt或dsRNA就能獲得想要的殺昆蟲(chóng)結(jié)果，或者想要的對(duì)靶害蟲(chóng)靶生物功能的抑制或遏制。因此，本發(fā)明提供了一種組合物，其中含有兩種或多種不同的殺蟲(chóng)劑，其中每種都對(duì)同樣的害蟲(chóng)或昆蟲(chóng)物種有毒，其中的至少一種包含本文描述dsRNA。在某些實(shí)施方案中，第二種殺蟲(chóng)劑可以選自下組馬鈴薯塊莖儲(chǔ)藏蛋白(patatm)、蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白、致病桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白、光桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白、側(cè)孢芽孢桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白、球形芽孢桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白以及木質(zhì)素。蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白可以是大量殺昆蟲(chóng)蛋白中的任何種類，所述殺昆蟲(chóng)蛋白包括但不限于Cryl、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、二元?dú)⒗ハx(chóng)蛋白CryET33和CryET34、二元?dú)⒗ハx(chóng)蛋白CryET80和CryET76、二元?dú)⒗ハx(chóng)蛋白TIC100和TICIOI、二元?dú)⒗ハx(chóng)蛋白PS149B1、VIP殺昆蟲(chóng)蛋白、TIC卯O或相關(guān)蛋白、或殺昆蟲(chóng)蛋白ET29或ET37與殺昆蟲(chóng)蛋白TIC810或TIC812的組合，以及任何前述殺昆蟲(chóng)蛋白的殺昆蟲(chóng)嵌合體。在食物中提供的核糖核酸可以提供在人工食物中，該食物配制用于滿足害蟲(chóng)保持所述食物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求。該食物中可以補(bǔ)充害蟲(chóng)控制量的RNA，該RNA從分開(kāi)的表達(dá)系統(tǒng)中純化，以確定害蟲(chóng)控制量的RNA組合物或確定害蟲(chóng)攝取經(jīng)過(guò)補(bǔ)充的食物后的抑制活性程度。該食物也可以是用DNA序列轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞，所述DNA序列構(gòu)建用于表達(dá)試劑、RNA或基因抑制劑。害蟲(chóng)攝取一種或多種所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，觀察到需要的表型結(jié)果，表明該試劑抑制害蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的耙核苷酸序列的表達(dá)。被靶向進(jìn)行抑制的基因可編碼必須的蛋白，所述蛋白的預(yù)期功能選自-.肌肉形成，保幼激素的形成，保幼激素的調(diào)節(jié)，離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)，蛋白合成和轉(zhuǎn)運(yùn)、消化酶合成，細(xì)胞膜電位保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素傳感，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲(chóng)成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴的保持，神經(jīng)傳遞，細(xì)胞分裂，能量代謝，呼吸，未知功能，以及凋亡。本發(fā)明的另一方面也提供了用于改進(jìn)受到昆蟲(chóng)害蟲(chóng)侵襲的農(nóng)作物產(chǎn)生的農(nóng)作物產(chǎn)量的方法，所述方法包括以下步驟a)將包含選自SEQIDNO:l-SEQIDNO:906的序列的多核苷酸或其互補(bǔ)序列或串耳關(guān)體或片段引入所述農(nóng)作物植物；和b)培養(yǎng)所述農(nóng)作物植物以使所述多核苷酸表達(dá)，其中所述多核苷酸的表達(dá)抑制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的攝食和由于害蟲(chóng)侵襲導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生RNA分子，其抑制攝取了所述農(nóng)作物植物的一部分的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中的至少第一靶基因，其中該靶基因行使選自下組的至少一種必須功能害蟲(chóng)攝食，害蟲(chóng)存活力，害蟲(chóng)細(xì)胞凋亡，害蟲(chóng)或任何害蟲(chóng)細(xì)胞的分化和發(fā)育，害蟲(chóng)的有性繁殖，肌肉形成，肌肉顫搐，肌肉收縮、保幼激素的形成和/或減少，保幼激素的調(diào)節(jié)，離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞膜電位的保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素傳感，觸角形成，翅膀形成，腿形成，卯形成，幼蟲(chóng)成熟、消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神經(jīng)傳遞，幼蟲(chóng)階段轉(zhuǎn)變，化蛹，破蛹，細(xì)胞分裂，能量代謝，呼吸，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)合成和保持，核苷酸代謝，氮代謝，水利用，水保持，以及感覺(jué)感知。在其它實(shí)施方案中，昆蟲(chóng)害蟲(chóng)是玉米才艮蟲(chóng)害蟲(chóng)，選自Dw6TO"caww(iec/m/7wctoto/2。w"niz'(南部玉米才艮蟲(chóng)(SCR)),Z^'a^radc"w>gz/erav&gz/era(西部玉米才艮蟲(chóng)(WCR)),Z)w/)ra"caZaAen(北部玉米才艮蟲(chóng)(NCR)),Z)z"Z^c^c"Wrgz/er"(墨西哥玉米才艮蟲(chóng)(MCR)),Z)z"Zra"c"6a/teato(巴西玉米才艮蟲(chóng)(BZR)),Z)wZ)ra"c"wr^w/a(巴西玉米才艮蟲(chóng)(BZR)):和D&6to"c"平eczo紹(巴西玉米才艮蟲(chóng)(BZR))。也提供了改進(jìn)由受到昆蟲(chóng)害蟲(chóng)侵襲的農(nóng)作物植物產(chǎn)生的農(nóng)作物的干旱耐受力的方法，所述方法包括以下步驟a)將選自SEQIDNO:l-SEQIDNO:906的多核苦酸序列或其片段引入所述農(nóng)作物植物；和b)培養(yǎng)所述農(nóng)作物植物以使所述多核苷酸表達(dá)，其中所述多核普酸的表達(dá)抑制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的攝食和由于害蟲(chóng)侵襲導(dǎo)致的干旱耐受力受損。本發(fā)明的另一方面進(jìn)一步提供了農(nóng)業(yè)上和商業(yè)上重要的產(chǎn)品和/或組合物，包括但不限于，動(dòng)物飼料、農(nóng)產(chǎn)品和意欲用作人類消耗的食物或用于人類消耗的組合物和農(nóng)產(chǎn)品中的產(chǎn)品和副產(chǎn)品，包括但不限于玉米面、玉米4且并分、玉米漿、玉米油、玉米;定4分、纟暴米花、玉米々并、谷物等。這些組合物可以含有可斗全測(cè)量的本文示出的核苷酸序列，因此也可以診斷含有此類核苷酸序列的任何轉(zhuǎn)基因事件。這些產(chǎn)品是有用的，至少因?yàn)樗鼈兛赡軄?lái)源于在更少殺蟲(chóng)劑和有機(jī)磷酸酯的條件下繁殖的農(nóng)作物，這是由于它們摻入了本發(fā)明的核苷酸用于控制鞘翅目害蟲(chóng)在植物中的侵襲的結(jié)果。此類農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品制品是從由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子來(lái)生產(chǎn)的，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)RNA,所述RNA來(lái)自本發(fā)明的一種或多種連續(xù)核苷酸，或一種或多種鞘翅目害蟲(chóng)的核苷酸及其互補(bǔ)序列。此類農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品制品還可用于控制此類農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品制品的鞘翅目害蟲(chóng)，例如，控制面粉象鼻蟲(chóng)，因?yàn)樵谵r(nóng)產(chǎn)品或農(nóng)產(chǎn)品制品中存在有能抑制害蟲(chóng)基因的RNA,所述RNA是本發(fā)明所示的基因序列所表達(dá)的。也提供了生產(chǎn)所述農(nóng)產(chǎn)品制品的方法，包括獲得用包含選自SEQIDN0:1-SEQIDN0:卯6的序列或其串聯(lián)體或片l爻或互補(bǔ)序列的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物，并且從所述植物或其部分制備農(nóng)產(chǎn)品制品。此外，本發(fā)明的另一方面是生產(chǎn)食品或祠料的方法，包括獲得用選自SEQIDNO:l-SEQIDNO:906的多核普酸或其片段或互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)化的植物，并且從所述植物或其部分制備食品或飼料。本發(fā)明也提供了計(jì)算機(jī)可讀的介質(zhì)，在其上記錄有SEQIDNO:1-SEQIDNO:卯6示出的核苷酸序列中的一種或多種或其互補(bǔ)序列，用于大量基于計(jì)算機(jī)的應(yīng)用，包括但不限于，DNA同一性和相似性檢索、蛋白質(zhì)同一性和相似性檢索、轉(zhuǎn)錄譜表征、基因組之間的比較以及人工雜交分析。附圖簡(jiǎn)述圖1:用pMON98503(SEQIDNO:820)轉(zhuǎn)化并且用西部玉米根蟲(chóng)(WCR)侵襲的Fl玉米植物事件的生物測(cè)定。圖2:用包含串聯(lián)體CI(SEQIDNO:821)的pMON98504轉(zhuǎn)化并且用西部玉米根蟲(chóng)(WCR)侵襲的Fl玉米植物事件的生物測(cè)定。圖3:Dv49和Dv248片段的選擇和Dv49-Dv248串聯(lián)體C38的示意性設(shè)計(jì)。圖4:基于串聯(lián)體C38合成的dsRNAsFl-F13。圖5:DV49-DV248串耳關(guān)體38劑量反應(yīng)(片I史F1-F6)。圖6:DV49-DV248串耳關(guān)體38劑量反應(yīng)(片I殳F7—F10)。圖7:DV49-DV248串聯(lián)體38劑量反應(yīng)(片革史F11-F13)。發(fā)明詳述下文是對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述，其被提供來(lái)協(xié)助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可不離開(kāi)本發(fā)明宗旨或范圍的情況下在本文所述的實(shí)施方式中做出改良和變化。本發(fā)明提供了用于遺傳控制害蟲(chóng)侵襲的方法和組合物。例如，本發(fā)明提供了重組DNA技術(shù)，用于轉(zhuǎn)錄后阻抑或抑制害蟲(chóng)細(xì)胞中靶編碼序列的表達(dá)，從而提供害蟲(chóng)防護(hù)作用，該方法是通過(guò)使害蟲(chóng)攝食一種或多種從耙編碼序列的全部或部分轉(zhuǎn)錄的雙鏈或小干擾核糖核酸(RNA)分子，從而控制4曼襲。因此，本發(fā)明涉及用雙鏈RNA(dsRNA),包括小干擾RNA(siRNA)對(duì)編碼序列的表達(dá)進(jìn)行序列特異性抑制，以達(dá)到預(yù)期的害蟲(chóng)控制水平。提供了分離和基本純化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的核苷酸序列和重組DNA構(gòu)建體，用于轉(zhuǎn)錄物發(fā)明的dsRNA分子，所述序列和構(gòu)建體在引入時(shí)阻抑或抑制害蟲(chóng)中的內(nèi)源編碼序列或靶編碼序列的表達(dá)。也提供了轉(zhuǎn)基因植物，它們(a)包含編碼用于轉(zhuǎn)錄dsRNA分子從而控制植物害蟲(chóng)侵襲的分離和基本純化的核酸分子以及非天然存在的重組DNA構(gòu)建體的核苷酸序列，并且(b)展示對(duì)昆蟲(chóng)侵襲的抗性和/或增強(qiáng)的耐受性。也描述了含有本發(fā)明的dsRNA核苷酸序列的組合物，用于表面施用到植物上或動(dòng)物上或施用到動(dòng)物的環(huán)境中，以實(shí)現(xiàn)害蟲(chóng)侵襲的消除或減少。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)相反，使鞘翅目物種(由所述物種得到核苷酸序列)攝食含有由鞘翅目物種的一種或多種表達(dá)的核苷酸序或多種生物功能的抑制。特別地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使農(nóng)作物害蟲(chóng)物種如玉米根蟲(chóng)攝食本文描述的雙鏈RNA分子，導(dǎo)致攝入這些組合物的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的死亡或發(fā)育和分化抑制。發(fā)明人鑒定了本文描述的核苷酸序列提供抗鞘翅目害蟲(chóng)物種的保護(hù)作用。推導(dǎo)了cDNA序列編碼的氨基酸序列，并且與已知氨基酸序列進(jìn)行比較。預(yù)測(cè)這些序列中的許多序列都編碼具有與其相關(guān)的一些注釋信息的蛋白。與特定核苷酸序列和由其編碼的蛋白序列相關(guān)的注釋信息是基于通過(guò)本文描述的編碼序列的翻譯推導(dǎo)的氨基酸序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的本領(lǐng)域已知氨基酸序列之間的同源性或相似性。選擇編碼存活所必須的蛋白或蛋白部分的cDNA序列，用于制備在鞘翅目害蟲(chóng)的食物中提供的雙鏈RNA分子，所述蛋白例如參與多種代謝或分解代謝生化途徑、細(xì)胞分裂、繁殖、能量代謝、消化、神經(jīng)系統(tǒng)功能等的氨基酸。如本文的描述，靶害蟲(chóng)攝入含有一種或多種dsRNA(其至少一個(gè)片段相應(yīng)于革巴害蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生的至少一個(gè)基本相同的RNA片段)的組合物，導(dǎo)致粑害蟲(chóng)的死亡、發(fā)育遲緩或其它抑制。這些結(jié)果表明，由鞘翅目害蟲(chóng)得到的核苷酸序列，即DNA或RNA,可以用于構(gòu)建抗害蟲(chóng)侵襲的植物細(xì)胞。例如，可以轉(zhuǎn)化害蟲(chóng)宿主，使其含有一種或多種來(lái)源于鞘翅目害蟲(chóng)的核苷酸序列。轉(zhuǎn)化到害蟲(chóng)宿主或共生體中的核苷酸序列可以編碼在轉(zhuǎn)化的宿主或共生體中的細(xì)J包或生物流體中形成dsRNA的一種或多種RNA,從而如果/當(dāng)害蟲(chóng)在轉(zhuǎn)基因宿主或共生體上攝食時(shí)，害蟲(chóng)的食物中可以存在dsRNA,導(dǎo)致害蟲(chóng)細(xì)胞中的一種或多種基因的表達(dá)阻抑，并且最終導(dǎo)致害蟲(chóng)死亡、生長(zhǎng)遲緩或其它抑制。本發(fā)明一般涉及宿主生物中鞘翅目害蟲(chóng)侵襲的遺傳控制。更具體地，本發(fā)明包括用于將害蟲(chóng)控制劑送遞給鞘翅目害蟲(chóng)的方法。所述害蟲(chóng)控制劑直接或間接導(dǎo)致害蟲(chóng)保持自身生長(zhǎng)或以其它方式侵襲靶宿主或共生體的能力受損。本發(fā)明提供了用于在害蟲(chóng)食物中采用穩(wěn)定化的dsRNA分子作為阻抑害蟲(chóng)中粑基因的手段的方法，從而實(shí)現(xiàn)了害蟲(chóng)靶定在實(shí)現(xiàn)前述目的的過(guò)程中，本發(fā)明提供了抑制鞘翅目害蟲(chóng)，包括例如玉米根蟲(chóng)或其它鞘翅目昆蟲(chóng)物種中靶基因表達(dá)的方法，導(dǎo)致害蟲(chóng)的攝食、生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、感染力的停止，最終可以導(dǎo)致害蟲(chóng)死亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將部分或完全穩(wěn)定化的雙鏈RNA(dsRNA)核苷酸分子引入作為害蟲(chóng)食物來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)組合物，并且使害蟲(chóng)能夠得到所述營(yíng)養(yǎng)組合物用于攝食。攝入含有雙鏈或siRNA分子的營(yíng)養(yǎng)組合物導(dǎo)致害蟲(chóng)細(xì)胞攝取分子，導(dǎo)致害蟲(chóng)細(xì)胞中至少一種靶基因表達(dá)的抑制。靶基因的抑制對(duì)害蟲(chóng)施加有害作用D在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的dsRNA分子包含與SEQIDNO:l-SEQIDNO:906中^壬意一個(gè)所示序列互補(bǔ)的核苷酸序列，害蟲(chóng)生物中SEQIDN0:1-SEQIDNO:卯6中任意一個(gè)所示序列的抑制導(dǎo)致害蟲(chóng)生長(zhǎng)和發(fā)育或其它生物功能所必須的蛋白或核苷酸試劑的減少或去除。選擇的核苷酸序列可以與序列表中SEQIDN0:1-SEQIDNO:906所示的核苷酸序列之一，包括其互補(bǔ)序列具有約80%-至少約100%的序列同一性。所述抑制可以描述為特異性的，因?yàn)榘谢虻囊徊糠值暮丝嗨嵝蛄羞x自抑制性dsRNA或siRNA轉(zhuǎn)錄的序列。該方法可以有效抑制至少一種輩巴基因的表達(dá)，并且可以用于抑制害蟲(chóng)中的很多不同類型的靶基因。在特定實(shí)施方案中，核苷酸序列可以選自SEQIDNO:697,SEQIDNOs:813畫(huà)819,SEQIDNO:841和SEQIDNO:874。通過(guò)建立合適的表達(dá)構(gòu)建體，鑒定為具有害蟲(chóng)防護(hù)作用的序列可以容易地表達(dá)為dsRNA分子。例如，通過(guò)以下步驟，所述序列可以表達(dá)為發(fā)夾以及莖和環(huán)結(jié)構(gòu)取出相應(yīng)于選自SEQIDNO:l-SEQIDNO:卯6的序列或其片段的第一片段，將該序列連接于不與笫一片段同源或互補(bǔ)的第二片段間隔區(qū)，并且將其與轉(zhuǎn)錄RNA的第三片段連接，其中第三片段的至少一部分與第一片段基本互補(bǔ)。所述構(gòu)建體通過(guò)第一片段與第三片段的雜交形成莖和環(huán)結(jié)構(gòu)，形成包含第二片段的環(huán)結(jié)構(gòu)(W094/01550，WO98/05770,US2002/0048814A1,和US2003/0018993Al)。A.核酸組合物和構(gòu)建體本發(fā)明提供了用于實(shí)現(xiàn)特定宿主或共生體害蟲(chóng)靶的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的重組DNA構(gòu)建體。轉(zhuǎn)化的宿主或共生體害蟲(chóng)靶可以表達(dá)殺蟲(chóng)有效水平的來(lái)自所述重組DNA構(gòu)建體的優(yōu)選dsRNA或siRNA分子，并且在害蟲(chóng)的食物中提供所述分子。可以從cDNA文庫(kù)和/或基因組文庫(kù)信息提供成對(duì)的分離和純化的核普酸序列。核苷酸序列對(duì)可以來(lái)源于任何優(yōu)選的鞘翅目害蟲(chóng)，用作熱擴(kuò)增對(duì)，以產(chǎn)生用于制備本發(fā)明的dsRNA和siRNA分子的DNA模板。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"核酸"指從5，至3，末端讀碼的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單或雙鏈聚合物。任選地，"核酸"還可含有非天然存在的或被改變的核苷酸堿基，其允許通過(guò)聚合酶的正確讀碼，不會(huì)減少該核酸編碼的多肽的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"核苷酸序列"或"核酸序列"指作為單獨(dú)的單鏈存在或存在于雙鏈體中的核酸的有義和反義鏈。術(shù)語(yǔ)"核糖核酸"(RNA)包括RNAi(抑制性RNA)、dsRNA(雙鏈RNA)、siRNA(小干擾RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微RNA)、tRNA(轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、被或未被相應(yīng)的?；被峒由想姾傻?以及cRNA(互補(bǔ)RNA),術(shù)語(yǔ)"脫氧核糖核酸，，(DNA)包括cDNA和基因組DNA以及DNA-RNA雜交體。詞匯"核酸片段"、"核酸序列片段"或更常見(jiàn)的"片段"將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為其包括基因組序列、核糖體RNA序列、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA序列、信4吏RNA序列、燥縱子序列和更小的工程化的核苷酸序列，所述序列表達(dá)或可適于表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽。根據(jù)本發(fā)明，提供了核苷酸序列，其表達(dá)得到與昆蟲(chóng)中的靶基因的RNA分子顯著同源的RNA序列，所述昆蟲(chóng)包含由昆蟲(chóng)基因組中的核苷酸序列編碼的RNA序列。因此，在攝入穩(wěn)定化的RNA序列后，可以獲得對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞中靶基因的核苷酸序列的下調(diào)，導(dǎo)致對(duì)昆蟲(chóng)的維持、存活力、增殖、繁殖和侵襲的有害作用。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"顯著同源"或者"顯著同源性"，在提到核酸序列時(shí)，包括在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQIDNO:1-SEQIDNO:906中任意一個(gè)所示的編碼序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQIDNO:1-SEQIDNO:906的任意序列或其兩條序列能在嚴(yán)格條件下與相反鏈上的對(duì)應(yīng)堿基形成氫鍵，以形成雙鏈體分子，其在嚴(yán)格條件下是足夠穩(wěn)定的，使用本領(lǐng)域公知方法能檢測(cè)到。優(yōu)選地，顯著同源的序列與序列表中的SEQIDNO:1-SEQIDNO:906中任意一個(gè)所示的參照核苷酸序列或其互補(bǔ)序列具有大約70%-大約80%的序列同一性，或者更優(yōu)選地，大約80%-大約85%的序列同一性，或者最優(yōu)選地，大約90%-大約95%的序列同一性，至大約99%的序列同一性。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"序列同一性"、"序列相似性"或"同源性"-故用于描述兩條或多條核苷酸序列之間的關(guān)系。兩條序列之間"序列同一性，，的百分比是通過(guò)下述方法來(lái)測(cè)定的在比較窗上比較兩條最優(yōu)比對(duì)的序列，其中，較之參照序列(不包含添加或缺失)，比較窗中序列的一部分可以包含添加或缺失(即，空位)，用于最優(yōu)比對(duì)兩條序列。通過(guò)下述方法來(lái)計(jì)算百分比測(cè)定兩條序列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)量，以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量，用匹配位置的數(shù)量除以比較窗中的位置總數(shù)，將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。與參照序列比較時(shí)每個(gè)位置都相同的序列被認(rèn)為與對(duì)照序列相同，反之亦然。如果第一條核苷酸序列展示出與第二條或參照序列的完全互補(bǔ)性，以5，至3，方向來(lái)觀察時(shí)，第一條核苷酸序列被認(rèn)為是以3，至5，方向來(lái)觀察的第二條或參照核苷酸序列的互補(bǔ)序列或與其互補(bǔ)。在本文中，以5，至3，方向讀碼的序列之一中的每個(gè)核苷酸與以3，至5，方向讀碼的其它序列的每個(gè)核苷酸都互補(bǔ)的時(shí)候，我們說(shuō)核酸序列分子展示出"完全互補(bǔ)性"。與參照核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列將展示出與參照核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列相同的序列。這些術(shù)語(yǔ)和描述在本領(lǐng)域中有明確的定義，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于理解的。本文中使用的"比較窗"指，至少6個(gè)連續(xù)位置的概念上的片段，通常大約50至大約100,更常見(jiàn)地，大約IOO至大約150個(gè)連續(xù)位置，其中，兩條序列被最優(yōu)比對(duì)之后，將一條序列與具有同樣數(shù)量連續(xù)位置的參照序列相比。較之參照序列(不包含添加或缺失)，比較窗可以包含大約20%或更少的添加或缺失(即，空位)，用于兩條序列的最優(yōu)比對(duì)。本領(lǐng)域沖支術(shù)人員將參考WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0,GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,Wis.,USA)中用于序列比對(duì)的詳細(xì)方法或參考Ausubel等人(1998)中關(guān)于序列分析的詳纟田討論。本發(fā)明還提供了DNA序列，其能在細(xì)胞或微生物中表達(dá)為RNA，以便抑制昆蟲(chóng)細(xì)胞、組織或器官中靶基因的表達(dá)，該序列包含編碼一種或多種不同核苷酸序列的DNA分子，其中，不同核苷酸序列中的每一種都包含間隔序列所連接的有義核苷酸序列和反義核苷酸序列，所述序列編碼本發(fā)明的dsRNA分子。間隔序列構(gòu)成了有義核苷酸序列或反義核苷酸序列的部分，并且形成于有義和反義序列之間的dsRNA分子內(nèi)。有義核苦酸序列和反義核普酸序列與靶基因的核苷酸序列或其衍生物或其互補(bǔ)序列基本相同。dsDNA分子被可操作地置于啟動(dòng)子序列的控制下，所述啟動(dòng)子序列在宿主的細(xì)胞、組織或器官中發(fā)揮作用，表達(dá)dsDNA,產(chǎn)生dsRNA分子。在一種實(shí)施方案中，DNA序列可以來(lái)源于序列表中SEQIDNO:l-SEQIDNO:906所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了DNA序列，用于在植物細(xì)胞中表達(dá)，并且，隨著DNA表達(dá)為RNA以及被靶害蟲(chóng)攝取，能獲得對(duì)有害昆蟲(chóng)細(xì)胞、組織或器官中耙基因的表達(dá)的阻抑。dsRNA至少包含一種或多種結(jié)構(gòu)基因序列，其中，每種結(jié)構(gòu)基因序列都包含間隔序列所連接的有義核苷酸序列和反義核苷酸序列，所述序列在互補(bǔ)和反義序列中形成環(huán)。有義核苷酸序列和反義核苷酸序列與靶基因的核苷酸序列或其衍生物或其互補(bǔ)序列基本相同。一種或多種結(jié)構(gòu)基因序列被可操作地置于一種或多種啟動(dòng)子序列的控制下，其中至少一種在原核或真核生物，特別是植物的細(xì)胞、組織或器官中是可操作的。本發(fā)明的用于控制害蟲(chóng)的基因序列或片段可被克隆到在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中可操作的兩種組織特異性啟動(dòng)子，例如兩種根特異性啟動(dòng)子之間，所述基因序列或其片段可在此處表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中產(chǎn)生mRNA,其形成dsRNA分子。植物組織中含有的dsRNA分子被昆蟲(chóng)攝取，從而獲得對(duì)靶基因表達(dá)的預(yù)期阻抑。本發(fā)明提供的核苷酸序列可以包含被"間隔序列，，分離開(kāi)的反向重復(fù)序列。間隔序列可以是包含下述任何核苷酸序列的區(qū)域，如果需要，所述核普酸序列能促進(jìn)每個(gè)重復(fù)序列之間二級(jí)結(jié)構(gòu)形成。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，間隔序列是mRNA的有義或反義編碼序列的一部分。或者，間隔序列可以包含能與核酸分子共價(jià)連接的核苷酸或其同源物的任何組合。間隔序列可包含長(zhǎng)度為至少大約10-100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，或者長(zhǎng)度為至少大約100-200個(gè)核苷酸，長(zhǎng)度為至少大約200-400個(gè)核香酸，或者長(zhǎng)度為至少大約400-500個(gè)核苷酸。序列表中的核酸分子或核酸分子的片段或其它核酸分子能在某些條件下特異性地與其它核酸分子雜交。本文中，如果兩個(gè)分子能形成反向平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就說(shuō)兩個(gè)核酸分子能互相特異性雜交。如果兩個(gè)核酸分子展示出完全互補(bǔ)性，我們就說(shuō)一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的互補(bǔ)序列。如果在至少傳統(tǒng)的"低嚴(yán)格性"條件下，兩個(gè)分子能以足夠的穩(wěn)定性互相雜交，允許它們保持為互相退火的狀態(tài)，我們就說(shuō)這兩個(gè)分子是"最小互補(bǔ)的"。類似地，如果在傳統(tǒng)的"高嚴(yán)格性"條件下，兩個(gè)分子能以足夠的穩(wěn)定性互相雜交，允許它們保持為互相退火的狀態(tài)，我們就說(shuō)這兩個(gè)分子是互補(bǔ)的。傳統(tǒng)的嚴(yán)才各條件在Sambrook等人和Haymes等人的文獻(xiàn)中有所描述。因此，與完全互補(bǔ)有背離是允許的，只要這種背離不會(huì)使分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力完全消失即可。因此，為使核酸分子或核酸分子的片段被用作為引物或探針，僅需要序列足夠互補(bǔ)，能在所用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)即可。能促進(jìn)DNA雜交的合適的嚴(yán)格條件是，例如，大約45。C下，6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC),接著在5CTC用2.0xSSC洗滌，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可在CurrentProtocolsinMolecularBiology(1989)中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可選自5CTC下大約2.0xSSC的低嚴(yán)格性，至5(TC下大約0.2xSSc的高嚴(yán)格性。此外，洗滌步驟的溫度可以從室溫，即約22。C下的低嚴(yán)格性條件至約65。C下的高嚴(yán)格性條件。溫度和鹽可都改變，或者，溫度或者鹽濃度可以保持恒定，其它變量改變。用于本發(fā)明的核酸可以在所述條件下可以與來(lái)自WCR的一種或多種核酸分子或其互補(bǔ)序列特異性雜交。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的核酸將與序列表中SEQIDNO:1-SEQIDNO:906所示的一種或多種核酸分子具有至少大約80%,或者至少大約90%,或者至少大約95%,或者至少大約98%,或者甚至大約100%的序列同一性。本發(fā)明的核酸還可以是通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法完全或部分合成的。因此本發(fā)明核酸的全部或部分可以是使用選則的宿主偏好的密碼子來(lái)合成的。物種偏好的密碼子可以通過(guò)，例如，從在特定宿主物種中表達(dá)的蛋白中使用最頻繁的密碼子來(lái)確定。對(duì)核苷酸序列的其它修飾可以得到具有輕微改變的活性的突變體。dsRNA或siRNA核普酸序列包含聚合的核糖核苷酸的雙鏈，并且可以包含對(duì)磷酸-糖主鏈或核苦的修飾。RNA結(jié)構(gòu)的修飾可以進(jìn)行調(diào)整，以允許特異性遺傳抑制。在一種實(shí)施方式中，可通過(guò)酶方法對(duì)dsRNA分子進(jìn)行修飾，從而可以產(chǎn)生siRNA分子。siRNA可有效介導(dǎo)針對(duì)一些昆蟲(chóng)中的一些粑基因的下調(diào)作用。這種酶方法可通過(guò)在真核RNAi途徑中利用昆蟲(chóng)、脊推動(dòng)物、真菌或植物細(xì)胞中存在的RNAseIII酶或DICER酶來(lái)完成(Elbashir等人，2002;Hamilton和Baulcombe,1999)。該方法還可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解的通過(guò)重組DNA技術(shù)引入到靶昆蟲(chóng)細(xì)胞中的重組DICER或RNAseIII來(lái)進(jìn)行。天然存在于昆蟲(chóng)中的或通過(guò)重組DNA技術(shù)制造的DICER酶和RNAseIII能將較大的dsRNA鏈切割為較小的寡核苷酸。DICER酶能特異性地將dsRNA分子切割為siRNA片段，其中，每個(gè)siRNA片段的長(zhǎng)度為大約19-25個(gè)核苷酸，而RNAseIII酶通常將dsRNA分子切割為12-15個(gè)堿基對(duì)的siRNA。通過(guò)上述任何酶產(chǎn)生的siRNA分子具有2至3個(gè)核苷酸的3，突出端和5'磷酸和3，羥基末端。通過(guò)RNAseIII酶產(chǎn)生的siRNA與在真核RNAi途徑中通過(guò)Dicer酶產(chǎn)生的那些相同，因此，然后可被靶定，并在隨后松散之后被內(nèi)在的細(xì)胞RNA降解機(jī)制降解，分離為單鏈RNA,并且與靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA序列雜交。這種方法導(dǎo)致對(duì)昆蟲(chóng)中靶基因的核苷酸序列編碼的RNA序列進(jìn)行有效降解或除去。結(jié)果就是昆蟲(chóng)中被特別靶定的核苷酸序列的沉默。對(duì)酶方法的細(xì)節(jié)描述可在Hannon(2002)中找到。本發(fā)明的核苷酸序列可被記錄到計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上。本文中使用的"計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)"指可通過(guò)計(jì)算機(jī)直接閱讀和存取的有形表達(dá)介質(zhì)。此類介質(zhì)包括但不限于磁性存儲(chǔ)介質(zhì)，例如軟盤，硬盤，存儲(chǔ)介質(zhì)和磁帶；光學(xué)存儲(chǔ)介質(zhì)，例如CD-ROM;電子存儲(chǔ)介質(zhì)，例如RAM和ROM;光學(xué)字符識(shí)別格式的計(jì)算機(jī)文檔，以及上述種類的雜合體，例如，^磁性/光學(xué)存儲(chǔ)介質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地i人識(shí)到，目前任何已知的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可^t用于制造下述產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含記錄本發(fā)明的核苷酸序列的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。本文中使用的"記錄"指，用于在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上存貯信息的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地采用任何目前已知的方法來(lái)在計(jì)算才幾可讀介質(zhì)上記錄信息，以產(chǎn)生包含本發(fā)明核苷酸序列信息的介質(zhì)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，多種不同的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)是可獲得的，用于制造記錄本發(fā)明核苷酸序列的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。對(duì)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)的選擇通常將基于選用來(lái)存取被存儲(chǔ)信息的手段。此外，多種不同的數(shù)據(jù)處理器程序和格式可用于將本發(fā)明核苷酸序列存儲(chǔ)到計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上。序列信息可展示于字處理文本文檔中，以可通過(guò)商業(yè)途徑獲得的軟件，例如WordPerfect和MicrosoftWord的格式，或者其可展示為ASCII文本文檔的形式，存儲(chǔ)于數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用中，例如DB2、Sybase、Oracle等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地改編任何數(shù)量的數(shù)據(jù)處理器結(jié)構(gòu)化格式(例如，文本文檔或數(shù)據(jù)庫(kù))，以獲得記錄有本發(fā)明核苷酸序列信息的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。允許本領(lǐng)域技術(shù)人員存取計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中提供的序列信息的計(jì)算機(jī)軟件是公眾可獲得的。在Sybase系統(tǒng)上執(zhí)行BLAST(Altschul等人，1990)和BLAZE(Bmtlag等人，1993)檢索算法的軟件可被用于鑒定序列中的讀碼框(ORF),例如，本文提供的、含有與來(lái)自其它生物的ORF或蛋白的同源性的Umgene和EST。此類ORF是本發(fā)明序列中編碼蛋白質(zhì)的片段，可用于生產(chǎn)商業(yè)上重要的蛋白，例如，用于氨基酸生物合成、代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA加工、核酸和蛋白降解、蛋白質(zhì)修飾和DNA復(fù)制、限制、》爹飾、重組和4務(wù)復(fù)的酶。本發(fā)明還提供了含有本文所述的序列信息的系統(tǒng)，特別是基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)。此類系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為能鑒定出本發(fā)明的核酸分子中的商業(yè)上重要的片段。本文中使用的"基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)"指用于分析本發(fā)明核苷酸信息的硬件設(shè)備、軟件設(shè)備和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備。本發(fā)明的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)的最小硬件設(shè)備包含中央處理器單元(CPU)、輸入設(shè)備、輸出設(shè)備和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地指導(dǎo)，目前可獲得的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)中任何一種都適合用于本發(fā)明。本文中使用的"靶結(jié)構(gòu)基序"或"靶基序"指，合理選出的任何序列或序列組合，其中，基于耙基序折疊時(shí)形成的三維構(gòu)型來(lái)選擇一種或多種序列。本領(lǐng)域已知多種靶基序。蛋白靶基序包括但不限于，酶活性位點(diǎn)和信號(hào)序列。核酸耙基序包括但不限于，啟動(dòng)子序列、順式作用元件、發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及誘導(dǎo)型表達(dá)元件(蛋白結(jié)合序列)。B.重組載體和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化重組DNA載體可以是例如線性的或封閉的環(huán)狀質(zhì)粒。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質(zhì)粒，或兩種或多種載體或質(zhì)粒，它們一起含有將被引入細(xì)菌宿主基因組中的總DNA。此外，細(xì)菌載體可以是表達(dá)載體。序列表中的SEQIDNO:1-SEQIDNO:906所示的核酸分子或其片l殳或其互補(bǔ)序列可以，例如，合適地插入到載體中，所述載體處于合適啟動(dòng)子的控制之下，所述啟動(dòng)子在一種或多種微生物宿主中發(fā)揮作用，以驅(qū)動(dòng)所連接的編碼序列或其它DNA序列的表達(dá)。為此目的，很多載體都是可獲得的，對(duì)合適載體的選擇將主要取決于要插入到載體中的核酸的大小以及將用載體轉(zhuǎn)化的特定宿主細(xì)胞。每種載體都含有多種組分，這取決于其功能(擴(kuò)增DNA或表達(dá)DNA)以及與其相容的特定宿主細(xì)力包。用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的載體組分通常包括但不限于下述組分中的一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種選擇標(biāo)記基因以及允許外源DNA表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。表達(dá)和克隆載體通常含有選擇基因，其也被稱為選擇標(biāo)記。該基因編碼在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞存活或生長(zhǎng)所必需的蛋白。典型的選擇基因編碼下述蛋白，所述蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素，例如，氨千青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素的抗性，(b)補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)缺陷，或(c)提供無(wú)法從復(fù)合培養(yǎng)基中獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如，編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。這些被異源蛋白或其片段成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能產(chǎn)生賦予對(duì)藥物抗性的蛋白，由此能在選擇方案中存活。用于生產(chǎn)mRNA的表達(dá)載體還可含有下述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能被宿主細(xì)菌生物識(shí)別，并與下述核酸可操作地連接，所述核酸例如，編碼Av.v/rgz/eramRNA或其感興趣的片段的核酸。適合用于細(xì)菌宿主的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括P-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子，大腸桿菌入噬菌體PL和PR啟動(dòng)子，以及大腸桿菌半乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酶啟動(dòng)子、色氨酸(trp)啟動(dòng)子以及乳糖操縱子啟動(dòng)子及其變體和雜交啟動(dòng)子，例如，tac啟動(dòng)子。但是，其它已知的細(xì)菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也是合適的。在提到調(diào)節(jié)序列和結(jié)構(gòu)核苷酸序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"指，調(diào)節(jié)序列導(dǎo)致相連的結(jié)構(gòu)核苷酸序列的受調(diào)節(jié)的表達(dá)。"調(diào)節(jié)序列"或"控制元件"指位于結(jié)構(gòu)核苷酸序列上游(5'非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3'非翻譯序列)的核苷酸序列，其能影響到相關(guān)結(jié)構(gòu)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯的時(shí)機(jī)和水平或數(shù)量。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、阻遏物結(jié)合序列以及聚腺苷化識(shí)別序列等?；蛘撸磉_(dá)構(gòu)建體可隨整合載體被整合進(jìn)細(xì)菌基因組。典型地，整合載體含有與允許載體整合的細(xì)菌染色體同源的至少一種序列。整合看起來(lái)是載體DNA和細(xì)菌染色體中同源DNA之間的重組導(dǎo)致的。例如，用來(lái)自多種芽孢桿菌菌抹的DNA構(gòu)建的整合載體能整合進(jìn)芽孢桿菌染色體(EP0,127，328)。整合載體還可包含噬菌體或轉(zhuǎn)座子序列。自殺載體也是本領(lǐng)域已知的。對(duì)含有一種或多種上面列出的組分的合適載體的構(gòu)建利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)來(lái)進(jìn)行。對(duì)經(jīng)過(guò)分離的質(zhì)粒或DNA片段加以切割，剪切，并重新連接為產(chǎn)生所需質(zhì)粒想要的形式?？色@得的細(xì)菌表達(dá)載體的例子包括但不限于，多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，例如，Bluescript(Stratagene，LaJolla,CA),其中，例如,D.v.virgifera蛋白或其片段能被連接進(jìn)載體，所述連接是以符合用于P-半乳糖苷酶氨基末端Met和隨后七個(gè)殘基的讀碼框的方式進(jìn)行的，由此產(chǎn)生雜合蛋白；pIN載體(VanHeeke和Schuster,1989)等。典型地，酵母重組構(gòu)建體包括下述組分中的一種或多種啟動(dòng)子序列、融合配偶體序列、前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、選一奪標(biāo)記。這些元件可以組合進(jìn)表達(dá)盒，表達(dá)盒可被保持于復(fù)制子中，例如染色體外元件(例如，質(zhì)粒)，其能穩(wěn)定保持于宿主(例如酵母或細(xì)菌)中。復(fù)制子可以具有兩套復(fù)制系統(tǒng)，由此允許其被保持于例如，酵母中用于表達(dá)，以及保持于原核生物宿主中用于克隆和擴(kuò)增。此類酵母-細(xì)菌穿梭載體的例子包括YEp24(Botstem等人，1979)、pCl/1(Brake等人，1984)和YRpl7(Stinchcomb等人，1982)。此外，復(fù)制子可以是高或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒將通常具有大約5至大約200范圍內(nèi)的拷貝數(shù)，典型地，大約IO至大約150。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主將優(yōu)選具有至少大約10,更優(yōu)選至少大約20個(gè)拷貝。有用的酵母啟動(dòng)序列可從編碼代謝途徑中酶的基因獲得。此類基因的例子包括醇脫氫酶(ADH)(EP0284044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸酯變位酶和丙酮酸激酶(PyK)(EP03215447)。編碼酸性磷酸酶的酵母PH05基因也提供了有用的啟動(dòng)子序列(Myanohara等人，1983)。此外，天然不存在的合成啟動(dòng)子也可作為酵母啟動(dòng)子發(fā)揮作用。此類雜交啟動(dòng)子的例子包括與GAP轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域相連的ADH調(diào)節(jié)序列(美國(guó)專利號(hào)4,876,197和4,880,734)。轉(zhuǎn)錄終止子序列和其它酵母識(shí)別的終止序列，如編碼編碼糖酵解酶的那些的例子，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?；蛘撸磉_(dá)構(gòu)建體可隨整合載體被整合進(jìn)酵母基因組。典型地，整合載體含有與允許載體整合的酵母染色體同源的至少一種序列，并且優(yōu)選含有側(cè)翼于表構(gòu)建體的兩種同源序列。整合看起來(lái)是載體和酵母染色體中同源DNA之間的重組導(dǎo)致的(Orr-Weaver等人，1983)。整合載體可以針對(duì)酵母中的特定基因座，這是通過(guò)選擇合適的同源序列包括進(jìn)載體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。見(jiàn)上文所述的Orr-Weaver等人的文獻(xiàn)。一種或多種表達(dá)構(gòu)建體可以整合，可能影響產(chǎn)生的重組蛋白的水平(Rine等人，1983)。本發(fā)明還考慮將本發(fā)明的核苷酸序列轉(zhuǎn)化進(jìn)植物，使得一種或多種dsRNA分子能以害蟲(chóng)抑制水平表達(dá)。使用本領(lǐng)域可獲得的方法，可以容易地制備轉(zhuǎn)化載體。轉(zhuǎn)化載體包含一種或多種下述核苷酸序列，所述序列能被轉(zhuǎn)錄為RNA分子，并且與昆蟲(chóng)基因組編碼的一種或多種核苷酸序列顯著同源和/或互補(bǔ)，使得攝取RNA時(shí)，會(huì)對(duì)昆蟲(chóng)基因組中各個(gè)核苷酸序列中的至少一種的表達(dá)進(jìn)行下調(diào)。轉(zhuǎn)化載體還可稱作dsDNA構(gòu)建體，其還可被定義為重組分子、昆蟲(chóng)控制劑、遺傳分子或嵌合遺傳構(gòu)建體。本發(fā)明的嵌合遺傳構(gòu)建體可包含，例如，編碼一種或多種反義轉(zhuǎn)錄物、一種或多種有義轉(zhuǎn)錄物、上述一種或多種物質(zhì)的核苷酸序列，其中，來(lái)自其的轉(zhuǎn)錄物的全部或部分與下述RNA分子的全部或部分同源，所述RNA分子包含昆蟲(chóng)基因組中核普酸序列編碼的RNA序列。在一種實(shí)施方式中，植物轉(zhuǎn)化載體包含分離和純化的DNA分子，其中包含與本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列可操作地相連的啟動(dòng)子。核苷酸序列選自序列表中的SEQIDNO:1-SEQIDNO:906。核苷酸序列包括下述片段，其編碼草巴害蟲(chóng)RNA轉(zhuǎn)錄物中存在的RNA的全部或部分，還包含靶害蟲(chóng)RNA全部或部分的反向重復(fù)序列。包含表達(dá)載體的至在編碼序列之中)，所述分子還可以含有五撇(5，)非翻譯前導(dǎo)序列(即，UTR或5，-UTR),其定位于啟動(dòng)子和翻i奪起始4立點(diǎn)之間。植物轉(zhuǎn)化載體可以含有來(lái)自一種以上基因的序列，由此允許一種以上的dsRNA產(chǎn)生，用于抑制靶害蟲(chóng)細(xì)胞中兩種或多種基因的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，具有相應(yīng)于不同基因中存在的序列的序列的DNA片段可組合成單一的復(fù)合DNA片段，用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)?；蛘撸蓪?duì)已含有至少一種DNA片段的本發(fā)明質(zhì)粒加以修飾，這是通過(guò)將額外DNA片段順序插入到增強(qiáng)子和啟動(dòng)子和終止子序列之間來(lái)進(jìn)行的。在設(shè)計(jì)用來(lái)抑制多種基因的本發(fā)明昆蟲(chóng)控制劑中，待抑制基因可從同一昆蟲(chóng)物種中獲得，以增強(qiáng)昆蟲(chóng)控制劑的效率。在某些實(shí)施方式中，基因可從不同的昆蟲(chóng)獲得，以拓寬試劑的有效昆蟲(chóng)范圍。當(dāng)為了阻抑或針對(duì)表達(dá)和阻抑的組合而靶定多種基因時(shí)，可以按照Fillatti,申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)US2004-0029283所闡述和公開(kāi)的，來(lái)制造多順?lè)醋覦NA元件。在不同植物物種中具有功能的啟動(dòng)子也是本領(lǐng)域公知的?？捎糜谠谥参镏斜磉_(dá)多肽的啟動(dòng)子包括，Odell等人(1985)所述的誘導(dǎo)型、病毒、合成或組成型啟動(dòng)子，和/或被從時(shí)間上調(diào)節(jié)、空間上調(diào)節(jié)以及空間-時(shí)間調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子以及FMV35S啟動(dòng)子。就本發(fā)明的目的而言，例如，對(duì)在才艮部4聶食的物種的最優(yōu)控制而言，優(yōu)選在植物根部中獲得這些基因的最高水平表達(dá)。大量的根部增強(qiáng)啟動(dòng)子已被鑒定出來(lái)，它們是本領(lǐng)域已知的(Lu等人，2000;美國(guó)專利號(hào)5,837,848和6,489,542)。典型地，本發(fā)明的重組DNA載體或構(gòu)建體將包含選擇標(biāo)記，其能在植物細(xì)胞上賦予選沖奪表型。選擇標(biāo)記還可用于選出含有編碼本發(fā)明多肽或蛋白的外源核酸的植物或植物細(xì)胞。標(biāo)記可以編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、G418博來(lái)霉素、潮霉素等)或除草劑抗性(例如，草甘膦等)。選^f標(biāo)記的例子包括但不限于，編碼卡那霉素霉素抗性的膨o基因，可使用卡那霉素、G418等進(jìn)行選擇；編碼雙丙氨膦抗性的bar基因；突變EPSP合酶基因，其編碼草甘膦抗性；腈水解酶基因，其賦予對(duì)溴苯腈的抗性；突變乙酰乳酸合酶基因(ALS),其賦予對(duì)咪唑啉酮或石黃脲的抗性；以及抗甲氨喋呤的DHFR基因。所述選自標(biāo)記的實(shí)例說(shuō)明于美國(guó)專利5,550,318;5,633,435;5,780,708和6,118,047。本發(fā)明的重組載體或構(gòu)建體還可包括篩選標(biāo)記。篩選標(biāo)記可#皮用于監(jiān)視表達(dá)。示例性的篩選標(biāo)記包括，(3-葡萄糖苷酸酶或mJA基因(GUS)，其編碼已知有多種發(fā)色底物的酶(Jefferson，1987;Jefferson等人，1987);R-基因座基因，其編碼能對(duì)植物組織中花青素色素(紅色)的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)節(jié)的產(chǎn)物(Dellaporta等人，1988);P-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe等人，1978),該基因編碼已知有多種發(fā)色底物(例如，PADAC,發(fā)色頭孢菌素)的酶；螢光素酶基因(Ow等人，1986);矽/E基因(Zukowsky等人，1983),其編碼兒茶酚加雙氧酶，所述酶能轉(zhuǎn)化發(fā)色的兒茶酚；a-淀粉酶基因(Ikatu等人，1990);酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)，其編碼能將酪氨酸氧化為DOPA以及多巴醌的酶，多巴醌隨后縮合為黑色素；oc-半乳糖苦酶，其能催化發(fā)色的cx-半乳糖底物。優(yōu)選的植物轉(zhuǎn)化載體包括來(lái)自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒(例如，美國(guó)專利號(hào)4,536,475、4,693,977、4,886,937、5,501,967和EP0122791)。發(fā)根土壤桿菌質(zhì)粒(或"Ri")也可使用，它們是本領(lǐng)域已知的。其它優(yōu)選的植物轉(zhuǎn)化載體包括Herrera-Estrdla(1983)、Bevan(1983)、Klee(1985)和EP0120516所乂>開(kāi)的那些。通常，優(yōu)選在植物基因組中非特異性位置引入功能性重組DNA。在特殊情況下，可通過(guò)定點(diǎn)整合插入重組DNA構(gòu)建體。存在一些已知能使植入具有功能的多種定點(diǎn)重組系統(tǒng)，其包括美國(guó)專利4,959,317公開(kāi)的cre-lox和美國(guó)專利5,527,695公開(kāi)的FLP-FRT。用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的合適方法包括幾乎任何可以將DNA引入細(xì)月包的方法，例如DNA的直接送遞，例如通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等人，1993)、干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取(Potrykus等人，1985)、電穿孔(美國(guó)專利號(hào)5,384,253)、用碳化硅纖維攪拌(Kaeppler等人，1990;美國(guó)專利號(hào)5,302,523;和美國(guó)專利號(hào)5,464,765)、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國(guó)專利號(hào)5,591,616和美國(guó)專利號(hào)5,563,055)和DNA包被的粒子加速(美國(guó)專利號(hào)5,550,318;美國(guó)專利號(hào)5,538，877;和美國(guó)專利號(hào)5,538,880)等。通過(guò)諸如上述的技術(shù)，可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化幾乎任何物種的細(xì)胞。在多細(xì)胞物種的情況下，可以使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生為轉(zhuǎn)基因生物。建立轉(zhuǎn)基因植物，特別是在植物中表達(dá)異源核酸的方法是已知的，并且可以用本文提供的核酸制備轉(zhuǎn)基因植物，其對(duì)靶害蟲(chóng)生物，如玉米根蟲(chóng)的攝食的易感性降低。例如，可以通過(guò)將本文公開(kāi)的產(chǎn)生dsRNA的核酸插入植物轉(zhuǎn)化載體并且將其？I入植物，可以制備植物轉(zhuǎn)化載體。通過(guò)修飾根癌土壤桿菌的天然基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，得到了一種已知的載體系統(tǒng)。天然系統(tǒng)包含大Ti(腫瘤誘導(dǎo))質(zhì)粒，其含有稱作T-DNA的大片段，其轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化的植物中。Ti質(zhì)粒的另一個(gè)片段，即vir區(qū)，負(fù)責(zé)T-DNA轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)的邊界是末端重復(fù)序列。在修飾的二元載體中，去除了腫瘤誘導(dǎo)基因，并且利用vir區(qū)的功能轉(zhuǎn)移邊界為T-DNA邊界序列的外來(lái)DNA。T區(qū)也可以含有用于有效回收轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)胞的選才奪標(biāo)記和多個(gè)克隆位點(diǎn)，所述位點(diǎn)用于插入一些序列，所述序列用于轉(zhuǎn)移例如dsRNA編碼核酸。典型地，使用土壤桿菌轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物含有插入到一條染色體中的單個(gè)簡(jiǎn)單重組DNA序列，其被稱為轉(zhuǎn)基因事件。此類轉(zhuǎn)基因植物可被稱為對(duì)于插入的外源序列是雜合的。對(duì)于轉(zhuǎn)基因體來(lái)說(shuō)純合的轉(zhuǎn)基因植物可以通過(guò)使獨(dú)立分離的轉(zhuǎn)基因植物自交產(chǎn)生Fl種子而獲得。產(chǎn)生的Fl種子中的四分之一將是對(duì)于轉(zhuǎn)基因體來(lái)說(shuō)純合的。使F1種子發(fā)芽，就產(chǎn)生了可被測(cè)試雜合性或純合性的植物，典型地，使用SNP測(cè)定或熱擴(kuò)增測(cè)定來(lái)進(jìn)行，所述測(cè)定允許雜合體和純合體之間的區(qū)別(即，接合性測(cè)定)。C.核酸表達(dá)和靶基因阻抑作為轉(zhuǎn)化的宿主或或共生體害蟲(chóng)靶生物的例子，本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化的植物和它們的后代。轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的植物可以工程化，以表達(dá)本文公開(kāi)的一種或多種dsRNA或siRNA序列，以提供害蟲(chóng)防護(hù)作用。這些序列可以用于害蟲(chóng)生物中的基因阻抑，從而減少受保護(hù)的轉(zhuǎn)化宿主或共生體生物上害蟲(chóng)的侵襲。本文中使用的詞匯"基因阻抑"用來(lái)表示用于降低基因轉(zhuǎn)錄成mRNA和/或隨后mRNA翻譯的水平的任何y〉知方法。基因阻抑還用來(lái)指來(lái)自基因或編碼序列的蛋白表達(dá)的降低，包括轉(zhuǎn)29錄后基因阻抑和轉(zhuǎn)錄阻抑。轉(zhuǎn)錄后基因阻抑是從阻抑所靶定的基因或編碼序列轉(zhuǎn)錄來(lái)的mRNA的全部或一部分與用于阻抑的對(duì)應(yīng)雙鏈RNA之間的同源性介導(dǎo)的，其指在細(xì)胞中可獲得的用于與核糖體結(jié)合的mRNA的量顯著的或可測(cè)量到的降低。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄的RNA可以是有義方向的，發(fā)揮所謂的共阻抑作用，或者可以是反義方向的，發(fā)揮所謂反義阻抑作用，或者以兩種方向產(chǎn)生dsRNA,發(fā)揮所謂的RNA干擾作用(RNAi)。轉(zhuǎn)錄阻抑是細(xì)胞中dsRNA基因阻抑劑的存在所介導(dǎo)的，所述dsRNA基因阻抑劑展示出與啟動(dòng)子DNA序列或其互補(bǔ)序列的顯著序列同一性，發(fā)揮被稱為啟動(dòng)子反向抑制的作用?；蜃枰挚梢葬槍?duì)與性狀相關(guān)的天然植物基因發(fā)揮作用，例如，給植物提供具有降低水平的、由天然基因編碼的蛋白，或者具有增加或降低水平的受影響的代謝物?；蜃枰诌€可針對(duì)下述植物害蟲(chóng)的靼基因發(fā)揮作用，所述害蟲(chóng)能攝取或接觸含有基因阻抑劑的植物材料，所述基因阻抑劑被特別設(shè)計(jì)為能抑制或阻抑害蟲(chóng)細(xì)胞中一種或多種同源序列或互補(bǔ)序列的表達(dá)。美國(guó)專利號(hào)5，107,065、5,759，829、5,283,184和5，231,020中公開(kāi)了反義或有義定向的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因阻抑，以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的基因表達(dá)。dsRNA用于阻抑植物中基因的用途^皮公開(kāi)于WO99/53050、WO99/49029、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0175965和2003/0061626、美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/465,800和美國(guó)專利號(hào)6,506,559以及6,326,193中。在植物中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因阻抑的有益方法使用有義定向和反義定向的、穩(wěn)定化的轉(zhuǎn)錄的RNA,例如，作為發(fā)夾和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。用于進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因阻抑的優(yōu)選DNA構(gòu)建體是下述這樣的，其中，第一段片段編碼展示出反義方向的RNA(其展示出與待阻抑的靶基因片段之間的顯著同一性)，所述第一段片段與第二段片段相連，第二段片段編碼展示出與第一段片段具有高度互補(bǔ)性的RNA。此類構(gòu)建體被預(yù)計(jì)會(huì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(這是通過(guò)第一段片段與第二段片段雜交形成的)和來(lái)自連接兩者段片段的核苷酸序列的環(huán)結(jié)構(gòu)(見(jiàn)WO94/01550、WO98/05770、US2002/0048814和US2003/0018993)。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，提供了一種核苷酸序列，其體外表達(dá)導(dǎo)致穩(wěn)定化RNA序列的轉(zhuǎn)錄，所述RNA序列與昆蟲(chóng)中靶基因的RNA分子顯著同源，所述RNA分子包含昆蟲(chóng)基因組中的核苷酸序列編碼的RNA序列。因此，昆蟲(chóng)攝取食物中摻入的或植物表面噴灑的穩(wěn)定化RNA序列之后，將導(dǎo)致靼昆蟲(chóng)細(xì)胞中對(duì)應(yīng)于耙基因的核普酸序列被下調(diào)。利用本發(fā)明的穩(wěn)定化dsRNA技術(shù)來(lái)抑制靶基因是序列特異性的，因?yàn)椋cRNA的雙鏈體區(qū)域?qū)?yīng)的核苷酸序列是為了遺傳抑制而被輩巴相對(duì)靶序列具有插入、缺失和單點(diǎn)突變的RNA序列也纟皮發(fā)現(xiàn)能夠有效抑制。在本發(fā)明的性能方面，優(yōu)選地，抑制性dsRNA和耙基因的一部分共享至少大約80%以上的序列同一性，或者大約90%以上的序列同一性，或者大約95%以上的序列同一性，或者大約99%以上的序列同一性，或者甚至大約100%的序列同一性。或者，RNA的雙鏈體區(qū)域可被功能性地定義為能與靶基因轉(zhuǎn)錄物的一部分雜交的核苷酸序列。展示出更高的同源性的小于全長(zhǎng)的序列可補(bǔ)償較長(zhǎng)卻僅有較少同源性的序列。相同核苷酸序列的長(zhǎng)度可以為至少大約25、50、100、200、300、400、500或者至少大約1000個(gè)堿基。通常，應(yīng)當(dāng)使用超過(guò)20-100個(gè)核苦酸的序列，但超過(guò)大約200-300個(gè)核苷酸的序列是優(yōu)選的，超過(guò)大約500-1000個(gè)核苷酸的序列是尤其優(yōu)選的，這取決于靶基因的大小。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)其能耐受序列變異，所述變異可能是由于遺傳突變、菌抹多態(tài)性或進(jìn)化趨異造成的。相對(duì)于草巴基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或經(jīng)過(guò)完全加工的mRNA,引入的核酸分子可能不需要絕對(duì)同源，可能不需要是全長(zhǎng)的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員需要認(rèn)識(shí)到，如本文所公開(kāi)的，RNA和靼基因之間的100%序列同一性對(duì)于實(shí)施本發(fā)明來(lái)說(shuō)并非必須。對(duì)靶基因表達(dá)的抑制可被定量，這是通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)源靶RNA或靼RNA翻譯所產(chǎn)生的蛋白來(lái)進(jìn)行的，抑制的結(jié)果可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞或生物外在性質(zhì)的檢查來(lái)驗(yàn)證。用于對(duì)RNA和蛋白定量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。賦予對(duì)氨千青霉素、博來(lái)霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、曱氨蝶呤、草丁膦、噤呤霉素、壯觀霉素、利福平和四環(huán)素等的抗性的多種選擇標(biāo)記是可獲得的。在某些實(shí)施方式中，基因表達(dá)被抑制了至少10%,優(yōu)選地，至少33%,更優(yōu)選地，至少50%,進(jìn)一步更優(yōu)選地，至少80%。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)被抑制了至少80%,更優(yōu)選地，至少90%,更優(yōu)選地，至少95%,或者至少99%，〗吏得顯著的抑制發(fā)生。顯著的抑制被用來(lái)指足夠的抑制，其導(dǎo)致可被檢測(cè)到的表型(例如，幼蟲(chóng)生長(zhǎng)停止、麻痹或死亡等)或被抑制的靶基因所對(duì)應(yīng)的RNA和/或蛋白質(zhì)的可檢測(cè)到的減少。雖然在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，抑制在昆蟲(chóng)的基本所有的細(xì)胞中發(fā)生，但是在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，抑制僅在表達(dá)該基因的細(xì)胞亞組中發(fā)生。例如，如果將要抑制的基因在昆蟲(chóng)消化道的細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，對(duì)這些細(xì)胞內(nèi)基因的抑制就足以對(duì)昆蟲(chóng)施加有害的作用。dsRNA分子可以體內(nèi)或體外合成。dsRNA可以由單條自身互補(bǔ)的RNA鏈形成，或者可以由兩條互補(bǔ)的RNA鏈形成。細(xì)胞的內(nèi)源RNA聚合酶可以介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，或者克隆的RNA聚合物可被用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄?？梢酝ㄟ^(guò)下述方法來(lái)靶定抑制在器官、組織或細(xì)胞類型中的特異性轉(zhuǎn)錄；環(huán)境條件(例如，感染、脅迫、溫度、化學(xué)誘導(dǎo)劑)的刺激；和/或在發(fā)育階段或年齡進(jìn)行的工程化轉(zhuǎn)錄。RNA鏈可以是或不是聚腺苷化的；RNA鏈可以能或不能被細(xì)胞的翻譯裝置翻譯為多肽。本發(fā)明的RNA、dsRNA、siRNA或miRNA由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)化學(xué)方法或酶方法來(lái)生產(chǎn)，這是通過(guò)人工或自動(dòng)的反應(yīng)或在另一生物體內(nèi)來(lái)進(jìn)行的。還可通過(guò)部分或完全的有機(jī)合成來(lái)制造RNA;可通過(guò)體外酶合成或有4幾合成引入任何經(jīng)過(guò)4務(wù)飾的核糖核苷酸。可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶或噬菌體RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)來(lái)合成RNA。表達(dá)構(gòu)建體的使用和制造是本領(lǐng)域已知的(見(jiàn)，例如，WO97/32016、美國(guó)專利號(hào)5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693)。如果通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)體外酶合成，可在引入細(xì)胞之前對(duì)RNA進(jìn)行純化。例如，可以通過(guò)用溶劑或樹(shù)脂提取、沉淀、電泳、色譜或其組合，從混合物中純化出RNA。或者，可以在不純化或僅進(jìn)行最小限度的純化的情況下來(lái)使用RNA,以避免由于樣品加工導(dǎo)致的損失。RNA可被干燥以儲(chǔ)存，或者溶解于水溶液中。溶液可以含有緩沖劑和鹽，以促進(jìn)雙鏈體鏈的退火和/或穩(wěn)定。為在體內(nèi)從轉(zhuǎn)基因體或表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，可使用調(diào)節(jié)區(qū)域(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子和聚腺苷化)來(lái)轉(zhuǎn)錄一條(或多條)RNA鏈。因此，在一種實(shí)施方式中，用于制造RNA分子的核苷酸序列可與在微生物、真菌或植物宿主細(xì)胞中具有功能的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子序列可操作地相連。理想地，核苦酸序列被置于內(nèi)源啟動(dòng)子的控制之下，所述內(nèi)源啟動(dòng)子通常處于宿主基因組中。處于可操作地連接的啟動(dòng)子序列控制下的本發(fā)明核苷酸序列，側(cè)翼還可以有額外的序列，所述額外的序列能有利地影響其轉(zhuǎn)錄和/或得到的轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性。此類序列通常位于可操作地連接的啟動(dòng)子的上游，和/或表達(dá)構(gòu)建體3，末端的下游，可以同時(shí)存在于啟動(dòng)子上游和表達(dá)構(gòu)建體3，末端的下游，但也考慮僅僅有所述上游序列。本文中使用的"昆蟲(chóng)控制劑"或"基因阻抑劑"指特定的RNA分子，其包含第一個(gè)RNA片段和第二個(gè)RNA片段，其中第一個(gè)和第二個(gè)RNA片段之間的互補(bǔ)性導(dǎo)致兩個(gè)片段在體內(nèi)或體外雜交形成雙鏈分子的能力。可能通常優(yōu)選包括第三個(gè)RNA片段，其連接并且穩(wěn)定第一個(gè)和第二個(gè)序列，使得整個(gè)結(jié)構(gòu)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，或甚至更緊密雜交的結(jié)構(gòu)可以形成莖環(huán)打結(jié)(knotted)結(jié)構(gòu)?；蛘撸梢栽跊](méi)有第三個(gè)片段的條件下形成對(duì)稱發(fā)夾，其中沒(méi)有設(shè)計(jì)的環(huán)，但是出于空間排列的原因，當(dāng)莖的長(zhǎng)度足夠穩(wěn)定其自身，發(fā)夾將建立其自身的環(huán)。第一和第二個(gè)RNA片段通常位于RNA分子的長(zhǎng)度內(nèi)，并且彼此呈顯著反向重復(fù)，并且由第三個(gè)RNA片段連接在一起。第一和第二個(gè)片段總是、并且并非分別地對(duì)應(yīng)于草巴RNA的有義和反義序列，所述靶RNA是靼昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的耙基因轉(zhuǎn)錄來(lái)的，所述草巴基因能被dsRNA分子的攝取所阻抑。昆蟲(chóng)控制劑還可以是高度純化(或分離)的核酸分子，更特別地，來(lái)自基因組DNA(gDNA)或cDNA文庫(kù)的核酸分子或其核酸片段分子?；蛘?，所述片段可以包含更小的寡核苦酸，其具有大約15至大約250個(gè)核苷酸殘基，更優(yōu)選地，大約15至大約30個(gè)核苷酸殘基。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"基因組，，在用于昆蟲(chóng)或宿主細(xì)胞的時(shí)候，不僅包含核內(nèi)發(fā)現(xiàn)的染色體DNA，其還包含在細(xì)胞的亞細(xì)胞組分中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器DNA。因此，本發(fā)明的DNA被引入到植物細(xì)胞中的過(guò)程可以通過(guò)染色體整合或者通過(guò)細(xì)胞器定位來(lái)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"基因組"應(yīng)用到細(xì)菌的時(shí)候包括細(xì)菌宿主細(xì)胞中的染色體和質(zhì)粒。因此，本發(fā)明的DNA一皮引入到細(xì)菌宿主細(xì)胞中的過(guò)程可以通過(guò)染色體整合或者通過(guò)質(zhì)粒定位來(lái)進(jìn)行。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"害蟲(chóng)"指昆蟲(chóng)、蜘蛛、甲殼類動(dòng)物、真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲(chóng)、扁形蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、錐形蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、馬蠅、跳蚤、扁虱、螨、虱等，它們是自然界普遍存在的，可以攝取或接觸一種或多種由害蟲(chóng)宿主或共生體(被轉(zhuǎn)化為能表達(dá)或包被雙鏈基因阻抑劑)產(chǎn)生的細(xì)胞、組織或流體，或者可以攝取含有基因阻抑劑的植物材料。本文中使用的"害蟲(chóng)抗性"是轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因宿主或轉(zhuǎn)基因共生體的特征，其使得所述植物、動(dòng)物、宿主或共生體對(duì)于害蟲(chóng)的攻擊具有抗性，所述攻擊典型地能對(duì)所述植物、動(dòng)物、宿主或共生體造成損害或損失。此類害蟲(chóng)抗性可能產(chǎn)生自天然突變，或者更為典型地，產(chǎn)生自賦予害蟲(chóng)抗性的重組DNA的摻入。為使轉(zhuǎn)基因植物具有昆蟲(chóng)抗性，重組DNA可以例如4爭(zhēng)錄為RNA分子，在重組才直物的組織或流體中形成dsRNA分子。dsRNA分子部分包含與偏好在重組植物上攝食的有害昆蟲(chóng)中DNA序列編碼的相應(yīng)RNA片段相同的RNA片段。靼昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中基因的表達(dá)受dsRNA阻抑，對(duì)靶昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中基因表達(dá)的阻抑導(dǎo)致植物具有昆蟲(chóng)抗性。Fire等人(美國(guó)專利號(hào)6,506,599)—般性地描述了對(duì)害蟲(chóng)侵襲的抑制，僅針對(duì)在線蟲(chóng)種秀麗新桿線蟲(chóng)中具有抑制基因功能作用的若干中核苷酸序列提供了細(xì)節(jié)。類似地，Plaetmck等人(US2003/0061626)描述了dsRNA用于在多種線蟲(chóng)害蟲(chóng)種抑制基因功能的用途。Mesa等人(US2003/0150017)描述了使用dsRNA序序列，并且特別描述了構(gòu)建重組植物，其表達(dá)這些dsRNA序列(被多種植物害蟲(chóng)攝取)，促進(jìn)對(duì)害蟲(chóng)基因組中基因的下調(diào)，并且提高植物對(duì)害蟲(chóng)侵襲的抗性。本發(fā)明提供了使用穩(wěn)定化的dsRNA抑制靶害蟲(chóng)中一種或多種靶基因的基因表達(dá)的方法。本發(fā)明特別有用于調(diào)節(jié)真核基因表達(dá)，特別是調(diào)節(jié)害蟲(chóng)中存在的基因的表達(dá)，所述害蟲(chóng)展示出大約4.5至大約9.5、更優(yōu)選地大約5.0至大約8.0、進(jìn)一步更優(yōu)選地大約6.5至大約7.5的消化系統(tǒng)pH。對(duì)于具有這些范圍之外的pH水平的消化系統(tǒng)的植物害蟲(chóng)，可能需要采用不要求攝取dsRNA分子的送遞方法。dsRNA的調(diào)節(jié)作用適用于在害蟲(chóng)中表達(dá)的多種基因，例如，負(fù)責(zé)細(xì)胞代謝或細(xì)胞轉(zhuǎn)化的內(nèi)源基因，包括管家基因、轉(zhuǎn)錄因子和編碼細(xì)胞代謝涉及到的多肽的其它基因。本文中使用的短語(yǔ)"基因表達(dá)的抑制"或"抑制昆蟲(chóng)細(xì)胞中靶基因的表達(dá)"指，靶基因的蛋白和/或mRNA產(chǎn)物水平不存在(或可觀察到的降低)。特異性指抑制靶基因而對(duì)細(xì)胞其它基因無(wú)作用并且對(duì)產(chǎn)生dsRNA分子的細(xì)胞內(nèi)任何基因沒(méi)有影響的能力。對(duì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中靶基因的基因表達(dá)的抑制可能導(dǎo)致昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中的新表型性狀。本發(fā)明的一部分提供了一種送遞系統(tǒng)，用于將昆蟲(chóng)控制劑送遞到昆蟲(chóng)中，這是通過(guò)將它們暴露于含有本發(fā)明昆蟲(chóng)控制劑的食物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)實(shí)施方式之一，穩(wěn)定化的dsRNA或siRNA分子可被摻入昆蟲(chóng)食物，或者可被覆蓋在昆蟲(chóng)消耗的食物的頂部。本發(fā)明的一部分還提供了用于將昆蟲(chóng)控制劑送遞到昆蟲(chóng)中的送遞系統(tǒng)，這是通過(guò)將它們暴露于含有本發(fā)明昆蟲(chóng)控制劑的微生物或宿主，例如，植物，這是通過(guò)攝取微生物或宿主細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)容物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物，其中含有能轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的穩(wěn)定化dsRNA分子的重組DNA構(gòu)建體。本文中使用的短語(yǔ)"制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物"指下述方法，其包括使用本領(lǐng)域中易于獲得的重組DNA技術(shù)(例如，見(jiàn)Sambrook，等人)，構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的穩(wěn)定化dsRNA分子的植物轉(zhuǎn)化載體，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，以及制備含有經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄的、穩(wěn)定化dsRNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物。在又一種實(shí)施方式中，微生物的非致病性的減毒抹可被用作為昆蟲(chóng)控制劑的載體，在這種情況下，攜帶此類試劑的微生物也被稱為昆蟲(chóng)控制劑?？蓪?duì)微生物加以工程改造，使其表達(dá)靶基因的核苷酸序列，以產(chǎn)生下述RNA分子，所述RNA分子包含與昆蟲(chóng)細(xì)J包內(nèi)典型存在的RNA序列同源或互補(bǔ)的RNA序列。將昆蟲(chóng)暴露于所述微生物，使得微生物被攝取，以及由RNA分子或其片段或衍生物直接或間接介導(dǎo)對(duì)靶基因表達(dá)的下調(diào)?；蛘?，本發(fā)明提供了將昆蟲(chóng)暴露于本發(fā)明的昆蟲(chóng)控制劑，所述控制劑4^摻入噴霧混合器中，應(yīng)用到宿主，例如，宿主植物的表面。在一種示例性的實(shí)施方式中，昆蟲(chóng)對(duì)昆蟲(chóng)控制劑的攝取，將昆蟲(chóng)控制劑送遞到昆蟲(chóng)消化道，隨后送遞到昆蟲(chóng)體內(nèi)的細(xì)胞中。在另一種實(shí)施方式中，昆蟲(chóng)控制劑通過(guò)其它方式(例如注射或其它物理方法)對(duì)昆蟲(chóng)的感染也能允許昆蟲(chóng)控制劑的送遞。在又一種實(shí)施方式中，RNA分子自身被封裝進(jìn)合成的基質(zhì)，例如聚合物，并被應(yīng)用到宿主，例如植物的表面。昆蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞的攝取允許昆蟲(chóng)控制劑被送遞到昆蟲(chóng)，導(dǎo)致對(duì)宿主中耙基因的下調(diào)。還可預(yù)見(jiàn)，本發(fā)明的組合物可,皮摻入植物物種的種子，其可以作為被摻入植物細(xì)胞基因組的重組基因的表達(dá)產(chǎn)物，或者被摻入在種植前施用到種子上的涂層或種子處理中。含有重組基因的植物細(xì)胞在本文中被看作轉(zhuǎn)基因事件。認(rèn)為當(dāng)與提供用于抵抗鞘翅目害蟲(chóng)的侵襲的保護(hù)作用的轉(zhuǎn)基因事件組合時(shí)，殺蟲(chóng)種子處理可以提供顯著的優(yōu)點(diǎn)，所述事件在針對(duì)靶害蟲(chóng)的優(yōu)選有效性范圍內(nèi)。此外，我們相信，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，存在有下述情況，其中，具有在優(yōu)選的有效性范圍內(nèi)的此類轉(zhuǎn)基因事件是有利的。本發(fā)明一部分提供了一種送遞系統(tǒng)，用于向昆蟲(chóng)送遞昆蟲(chóng)控制劑。本發(fā)明的穩(wěn)定化dsRNA或siRNA分子可被直接引入昆蟲(chóng)的細(xì)胞，或者引入到細(xì)胞外的腔、間質(zhì)間隙、淋巴系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、昆蟲(chóng)的循環(huán)系統(tǒng)，于通過(guò)口服引入的方法包括將RNA與昆蟲(chóng)的食物直接混合，以及下述工程方法，其中，被用作為食物的物種經(jīng)過(guò)了工程改造，得以表達(dá)dsRNA或siRNA,然后將其喂祠給待影響的昆蟲(chóng)。在一種實(shí)施方式中，例如，dsRNA或siRNA分子可摻入昆蟲(chóng)食物中，或覆蓋在其表面。在另一實(shí)施方案中，RNA可以噴霧在植物表面。在又一種實(shí)施方式中，可以由微生物表達(dá)dsRNA或siRNA,并且可以將微生物施用到植物表面，或者通過(guò)物理手段如注射引入根、莖。在另一實(shí)施方案中，可對(duì)植物進(jìn)行遺傳工程改造，使其表達(dá)足以殺死已知會(huì)感染植物的昆蟲(chóng)的量的dsRNA或siRNA。特別地，在WCR中實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，可將穩(wěn)定化dsRNA或siRNA引入到昆蟲(chóng)體內(nèi)的中腸，獲得理想的對(duì)靶基因的抑制。如上文所述，dsRNA或siRNA分子可被包括進(jìn)食物或覆蓋于食物上，可被昆蟲(chóng)攝取。在任何情況下，本發(fā)明的dsRNA都被提供于靶害蟲(chóng)的食物中。本發(fā)明的靶害蟲(chóng)將展示出大約4.5至大約9.5、或大約5至大約8.5、或大約6至大約8、或大約6.5至大約7.7、或大約7.0的消化道pH。耙害蟲(chóng)的消化道在本文中被定義為害蟲(chóng)中的下述位置，在該位置，害蟲(chóng)所攝取的食物被暴露于能有利于吸收本發(fā)明的dsRNA分子的環(huán)境，而不會(huì)遭遇極端到使得dsRNA雙鏈之間的氫鍵解離從而形成單鏈分子的pH。還可預(yù)見(jiàn)到，可用與常少見(jiàn)農(nóng)業(yè)實(shí)踐一致的方式來(lái)配制通過(guò)4b學(xué)或酶合成生產(chǎn)的dsRNA,將其用作為噴霧產(chǎn)品，以控制昆蟲(chóng)侵襲。所述配方可以包括有效葉片覆蓋所需的合適的膠粘劑和潤(rùn)濕劑，以及用于保護(hù)dsRNA免受UV損害的UV防護(hù)劑。此類添加劑是生物殺昆蟲(chóng)劑工業(yè)中常用的，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。此類應(yīng)用可與其它噴霧殺昆蟲(chóng)劑(是或不是基于生物的)應(yīng)用組合，以增強(qiáng)植物保護(hù)，免收昆蟲(chóng)攝食。本發(fā)明的發(fā)明人考慮，生產(chǎn)殺昆蟲(chóng)蛋白的細(xì)菌菌株可被用于生產(chǎn)用于昆蟲(chóng)控制目的的dsRNA。這些菌抹可以展示出提高的昆蟲(chóng)控制性質(zhì)。多種不同的細(xì)菌宿主可^皮用于生產(chǎn)昆蟲(chóng)控制dsRNA。示例性的細(xì)菌可以包括大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、假單孢菌種、光桿菌種、致病桿菌種、嗜蟲(chóng)沙雷氏菌和相關(guān)的沙雷氏菌種、球形芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、曰本甲蟲(chóng)芽孢桿菌、雙酶梭菌和其它梭菌種，或其它形成孢子的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。在某些實(shí)施方案中，細(xì)菌可以工程改造，用于控制害蟲(chóng)，如蚊子。本發(fā)明還涉及用于在微生物中表達(dá)的重組DNA構(gòu)建體?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法，將可以轉(zhuǎn)錄得到感興趣的RNA的外源核酸引入微生物宿主細(xì)胞，例如，細(xì)菌細(xì)力包或真菌細(xì)月包。本發(fā)明的核苷酸序列可被引入到廣范圍的原核和真核宿主中，產(chǎn)生穩(wěn)定化dsRNA或siRNA分子。術(shù)語(yǔ)"微生物"包括原核和真核微生物物種，例如細(xì)菌、真菌和藻類。真菌包括酵母和絲狀真菌等。示例性的原核生物，既有革蘭氏陰性也有革蘭氏陽(yáng)性的，包括腸桿菌科，例如埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和變形菌屬；芽孢桿菌科；根瘤菌科，例如根瘤菌屬；螺菌科，例如光細(xì)菌屬、發(fā)酵單孢菌屬、沙雷氏菌屬、氣單孢菌屬、弧菌屬、脫硫弧菌屬、螺菌屬；乳桿菌科；假單胞菌科，例如假單胞菌屬和醋桿菌屬；固氮菌科，放線菌科和竭化桿菌科。真核生物包括真菌，例如須霉屬，和子嚢菌，其包括酵母，例如，糖酵母屬和裂殖酵母屬；以及擔(dān)子菌，例如，紅酵母屬、短柄霉屬、擲孢酵母屬等。就保護(hù)植物抗昆蟲(chóng)的目的而言，已知棲息于多種不同重要農(nóng)作物的葉面(植物葉子的表面)和/或根圍(植物根部周圍的土壤)的大量微生物也可以是用于對(duì)本文公開(kāi)的重組構(gòu)建體進(jìn)行操縱、繁殖、貯藏、送遞和/或誘變的理想宿主細(xì)胞。這些微生物包括細(xì)菌，藻類和真菌。特別感興趣的是微生物，例如，細(xì)菌，例如下述的屬芽孢桿菌屬(包括下述種和亞種蘇云金芽孢桿菌庫(kù)爾斯塔克HD-I亞種、蘇云金芽孢桿菌庫(kù)爾斯塔克HD-73亞種、蘇云金芽孢桿菌猝倒亞種、蘇云金芽孢桿菌柏林那亞種、蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種、蘇云金芽孢桿菌多窩亞種、蘇云金芽孢桿菌松蜀亞種、蘇云金芽孢桿菌阿萊亞種、蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種、蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種、蘇云金芽孢桿菌亞毒亞種、蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)亞種、蘇云金芽孢桿菌tenebrionis亞種和蘇云金芽孢桿菌圣地亞哥亞種)；假單胞菌屬，歐文氏菌屬，沙雷氏菌屬，克雷白氏菌屬，黃單胞菌屬，鏈霉菌屬，根瘤菌屬，紅假單胞菌屬，嗜甲基菌屬，土壤桿菌屬，醋桿菌屬，乳桿菌屬，節(jié)桿菌屬，固氮菌屬，明串珠菌屬和產(chǎn)堿菌屬；真菌，特別是酵母，例如，下述的屬糖酵母屬，隱球酵母屬，克魯維氏酵母屬，擲孢酵母屬，紅酵母屬和短柄霉屬。特別感興趣的是此類植物周圍的細(xì)菌物種，例如丁香假單胞菌，熒光假單胞菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，木醋桿菌，根癌土壤桿菌，類球紅細(xì)菌，野油菜黃單胞菌，苜蓿根瘤菌，真養(yǎng)產(chǎn)堿菌和維涅蘭德固氮菌；以及植物周圍的酵母物種-,例如，深紅酵母，膠粘紅酵母，海濱紅酵母，橙黃紅酵母，淺白色隱球酵母，流散隱球酵母，羅侖氏隱球酵母，羅萏糖酵母，善地糖酵母，啤酒糖酵母，紅色擲孢酵母，香氣擲孢酵母，佛地克魯維氏酵母和出芽短柄霉。D.轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明提供具有超過(guò)一種或多種轉(zhuǎn)基因事件的種子和植物。所述事件的組合被稱為"堆疊的，，轉(zhuǎn)基因事件。所述堆疊的轉(zhuǎn)基因事件可以是針對(duì)同樣的靶害蟲(chóng)的事件，或者它們可以針對(duì)不同的靶害蟲(chóng)。在一種實(shí)施方式中，具有表達(dá)本文提供的核酸的能力的種子還具有表達(dá)至少一種其它殺昆蟲(chóng)劑的能力，其包括但不限于下述RNA分子，所述RNA分子的序列來(lái)自在靶害蟲(chóng)中表達(dá)的RNA的序列，當(dāng)其在種子或從種子長(zhǎng)出的植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，其中，輩巴害蟲(chóng)對(duì)植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的攝取導(dǎo)致了對(duì)單巴害蟲(chóng)細(xì)胞中RNA表達(dá)的阻抑。在某些實(shí)施方案中，具有表達(dá)下述dsRNA能力的種子還具有提供除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因事件，所述dsRNA的序列來(lái)自耙害蟲(chóng)。除草劑耐受性基因的一個(gè)有益的實(shí)例是提供對(duì)草甘膦，即N-(膦酰甲基)甘氨酸(包括此類除草劑的異丙胺鹽形式)的抗性。在本發(fā)明的方法中，轉(zhuǎn)基因種子或從種子生長(zhǎng)的植物中殺昆蟲(chóng)量的dsRNA的表達(dá)與用某些化學(xué)或蛋白殺蟲(chóng)劑處理種子或植物的組合，可以用于提供出乎意料的協(xié)同優(yōu)點(diǎn)，包括保護(hù)得到的轉(zhuǎn)基因植物免受靶害蟲(chóng)損害的出乎意料優(yōu)越的效力。在特定實(shí)施方案中，用每100kg種子大約100gm至大約400gm的殺蟲(chóng)劑，對(duì)能表達(dá)某些會(huì)形成dsRNA分子(其序列是從玉米根蟲(chóng)中表達(dá)的一種或多種序列獲得的)的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行處理，提供了抗玉米根蟲(chóng)的意想不到的出眾保護(hù)。此外，認(rèn)為此類組合還有效保護(hù)緊急狀態(tài)的植物抗其它害蟲(chóng)的損害。本發(fā)明的種子還用于降低殺蟲(chóng)劑使用成本，因?yàn)檩^之沒(méi)有使用所述方法的情況，為獲得需要量的保護(hù)，可以使用更少的殺蟲(chóng)劑。此外，因?yàn)槭褂昧烁俚臍⑾x(chóng)劑，并且因?yàn)槠涫窃诜N植之前應(yīng)用的，沒(méi)有單獨(dú)的大田應(yīng)用，我們相信，本發(fā)明的方法因此對(duì)于操作者和環(huán)境來(lái)說(shuō)都更為安全，并且潛在地專交之傳統(tǒng)方法更為^f更宜。"協(xié)同"表示包括轉(zhuǎn)基因事件和殺蟲(chóng)劑的組合對(duì)于殺蟲(chóng)活性(或效力)的組合協(xié)同作用。但是，這并不表示將此類協(xié)同作用限制為殺蟲(chóng)活性，它們還應(yīng)當(dāng)包括下述意想不到的優(yōu)點(diǎn)，例如，增加的活性范圍、有利的活性鐠(相關(guān)于損害減少的類型和數(shù)量)、殺蟲(chóng)劑和應(yīng)用成本的降低、殺蟲(chóng)劑環(huán)境分布減少、殺蟲(chóng)劑向生產(chǎn)操作以及種植玉米種子的人員的暴露減少，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它優(yōu)點(diǎn)?？捎糜谂c本發(fā)明的方法和組合物組合的組合物中的殺蟲(chóng)劑和殺昆蟲(chóng)劑(包括作為種子處理和涂布)以及使用此類組合物的方法可在例如美國(guó)專利號(hào)6,551,962中找到，其全文通過(guò)引用并入本文。優(yōu)選地，種子處于足夠持久穩(wěn)定的狀態(tài)，不會(huì)在處理過(guò)程中招致?lián)p害。典型地，種子可以是已從大田收獲的、從轉(zhuǎn)基因植物上除下的、以及與任何其它非種子植物材料分離的。優(yōu)選地，種子還將是在生物學(xué)上穩(wěn)定到下述程度的，即使得處理不會(huì)導(dǎo)致對(duì)種子的生物學(xué)損害。在一種實(shí)施方式中，例如，處理可應(yīng)用到下述玉米種子上，所述種子已被收獲、清潔并被干燥至水份含量按重量計(jì)小于大約15%。在另一種實(shí)施方式中，種子可以是下述種子其已被干燥，然后再涂上水和/或另外的材料，然后在用殺蟲(chóng)劑處理前或處理期間再進(jìn)行干燥。在描述的限制中，認(rèn)為可在收獲種子和播種種子之間的任何時(shí)間，將處理施用到種子上。本文所用的術(shù)語(yǔ)"未播種的種子"用于包括處于種子收獲和在地面播種種子(為了植物發(fā)芽和生長(zhǎng)的目的)之間的任何時(shí)期。當(dāng)提到未播種的種子被殺蟲(chóng)劑"處理"的時(shí)候，此類處理不用于包括下述操作其中，殺蟲(chóng)劑被施用到土壤，而非施用到種子。例如，在與種子播種的同時(shí)，在土地帶、"T"帶或犁溝中應(yīng)用此類處理，不認(rèn)為是本發(fā)明所包括的。殺蟲(chóng)劑或殺蟲(chóng)劑的組合可以"純粹地"施用，即，沒(méi)有任何稀釋或存在其它組分。但是，典型地，殺蟲(chóng)劑以殺蟲(chóng)劑配方的形式施用到種子上。該配方可以含有一種或多種想要的其它組分，其包括但不限于，液體稀釋劑，用作為殺蟲(chóng)劑基質(zhì)的粘合劑，用于在脅迫條件下保護(hù)種子的填料以及用于提高涂層彈性、粘附和/或延展性的增塑劑。本發(fā)明殺蟲(chóng)劑組合的實(shí)施方式之一進(jìn)行改良之后，可以使用本領(lǐng)域已知的種子涂布方法和組合物。為其應(yīng)用的這類涂布方法和設(shè)備被公開(kāi)于，例如，美國(guó)專利號(hào)5,918,413、5,891,246、5,554,445、5,389,399，5，107,787、5,080,925、4,759,945和4,465，017中。種子涂層組合物被公開(kāi)于，例如美國(guó)專利號(hào)5,939,356、5,882,713、5,876,739、5,849,320、5,834,447、5,791,084、5,661,103、5,622，003、5,580,544、5，328,942、5,300,127、4,735,015、4,634,587、4,383,391、4，372,080、4，339,456、4,272,417和4,245,432等中。在涂層中使用的殺蟲(chóng)劑是本文所述的那些殺蟲(chóng)劑。在對(duì)種子的處理中使用的殺蟲(chóng)劑的量將取決于種子類型和活性成分的類型而變化，但是所述處理將包含，將種子與殺蟲(chóng)有效的量的殺蟲(chóng)劑組合相接觸。當(dāng)昆蟲(chóng)是耙害蟲(chóng)時(shí)，所述的量將是殺蟲(chóng)有效的殺昆蟲(chóng)劑的量。本文中使用的殺蟲(chóng)有效量表示，殺昆蟲(chóng)劑的量將能殺死處于生長(zhǎng)的幼蟲(chóng)或蛹階段的害蟲(chóng)，或者將持續(xù)減少或延遲昆蟲(chóng)害蟲(chóng)產(chǎn)生的損害的量。通常，處理中向種子施用的殺蟲(chóng)劑的量在下述范圍內(nèi)變動(dòng)對(duì)每100kg種子重量而言，大約100gm至大約2000gm的殺蟲(chóng)劑活性成分。優(yōu)選地，殺蟲(chóng)劑的量在下述范圍內(nèi)對(duì)每100kg種子而言大約50gm至大約1000gm的活性成分；更優(yōu)選地，在下述范圍內(nèi)對(duì)每100kg種子而言大約100gm至大約600gm的活性成分；進(jìn)一步更優(yōu)選地，在下述范圍內(nèi)對(duì)每100kg種子而言大約200gm至大約500gm的活性成分?；蛘?，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于每100kg種子而言超過(guò)大約60gm的殺蟲(chóng)劑活性成分的殺蟲(chóng)劑的量是優(yōu)選的，更優(yōu)選地，超過(guò)大約80gm(每100kg種子)。用于處理中的殺蟲(chóng)劑必須不能抑制種子發(fā)芽，并且應(yīng)當(dāng)能在靶昆蟲(chóng)生命周期中能導(dǎo)致對(duì)種子或植物損害的時(shí)期，有效保護(hù)種子和/或植物。通常，播種后，涂層將有效大約0至120天。本發(fā)明的殺蟲(chóng)劑可以以涂層的形式施用到種子上。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可以包括但不限于易于將dsRNA引入昆蟲(chóng)細(xì)胞，可使用低濃度的dsRNA,dsRNA的穩(wěn)定性以及抑制的有效性。使用低濃度的、穩(wěn)定化dsRNA的能力避免了反義干擾的很多缺點(diǎn)。本發(fā)明并不被限制為體外使用，或被限制為特殊的序列組合物，特定的耙基因的組，輩巴基因核苷酸序列的特定部分，或特定的轉(zhuǎn)基因或特定的送遞方法，這是與本領(lǐng)域已知的可獲得的方法中的一些，例如，反義和共抑制相反。此外，遺傳操縱在并非經(jīng)典遺傳模型的生物中也是可行的。在對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐中，可以進(jìn)行選4奪，以確保/人重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列的存在對(duì)于非害蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)害。這可以通過(guò)靶定與植物或脊稚動(dòng)物中相應(yīng)基因具有低程度序列同一性的基因而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，序列同一性程度小于大約80%。更優(yōu)選地，序列同一性程度小于大約70%。最優(yōu)選地，序列同一性程度小于大約60%。除了用重組DNA構(gòu)建體對(duì)植物進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化之外，可通過(guò)將具有重組DNA構(gòu)建體的第一種植物與缺乏該構(gòu)建體的第二種植物雜交來(lái)制備轉(zhuǎn)基因植物。例如，用于基因阻抑的重組DNA可被引入到第一種植物品系中，所述品系容易轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生可與第二種植物品系雜交的轉(zhuǎn)基因植物，以將用于基因阻抑的重組DNA漸滲到第二種植物品系中。在實(shí)踐中，本發(fā)明可與植物中的其它昆蟲(chóng)控制性狀組合，以獲得想要的用于增加對(duì)昆蟲(chóng)侵襲的控制的性狀。將利用不同作用模式的昆蟲(chóng)控制性狀組合，可以提供針對(duì)昆蟲(chóng)進(jìn)行保護(hù)的轉(zhuǎn)基因植物，其較之使用單一昆蟲(chóng)控制性狀的植物具有出眾的耐力，因?yàn)樵谔镩g發(fā)展出抗性的概率降低。過(guò)去數(shù)十年中，已對(duì)蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白的殺昆蟲(chóng)機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究。已經(jīng)顯示，僅在攝取蛋白之后，晶體蛋白才會(huì)對(duì)昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)形式有毒。在鞘翅目幼蟲(chóng)中，昆蟲(chóng)中腸中的堿性pH和蛋白水解酶會(huì)溶解蛋白，由此使得對(duì)昆蟲(chóng)有毒的組分釋放。這些毒性組分破壞中腸細(xì)胞，導(dǎo)致昆蟲(chóng)停止攝食，并且最終，致使昆蟲(chóng)死亡。就此原因而言，已經(jīng)證實(shí)了蘇云金芽孢桿菌毒素自身在處理多種昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的過(guò)程中是有效的，并且是對(duì)環(huán)境安全的殺昆蟲(chóng)劑。鞘翅目和半翅目昆蟲(chóng)，以及很可能地，雙翅目、草盲蝽和其它鉆孔式和吸吮式昆蟲(chóng)展示出了微酸的腸道pH,所以有效抵擋鞘翅目幼蟲(chóng)的Bt毒素對(duì)上述害蟲(chóng)不起作用。這些昆蟲(chóng)微酸的腸道pH也被相信是對(duì)本發(fā)明的組合物更為有益，在不欲限制到特定理論的情況下，看起來(lái)，鞘翅目幼蟲(chóng)腸道的堿性pH是之前企圖展示dsRNA效果的嘗試失敗的原因(Fire等人美國(guó)專利號(hào)6,506,559;Mesa等人專利公開(kāi)號(hào)US2003/0150017;Rajagopal等人，2002;Tabara等人，1998)。因此我們相信，本文公開(kāi)的dsRNA方法應(yīng)當(dāng)優(yōu)先用于控制鞘翅目、雙翅目、半翅目、草盲蝽、鉆孔式和吸吮式昆蟲(chóng)的植物和組合物中。本文示出的方法和組合物特別有用于靶定下述昆蟲(chóng)中的基因來(lái)進(jìn)行阻抑，所述昆蟲(chóng)展示出大約4.5至大約9.5、大約5.0至大約9.0、大約5.5至大約8.5、大約6.0至大約8.0、大約6.5至大約7.7、或大約6.8至大約7.6、或大約7.0的腸道pH。但是，展示出大約7.5至大約11.5,或大約8.0至大約11.0，或大約9.0至大約10.0的腸道pH的昆蟲(chóng)和其它害蟲(chóng)物種，例如鞘翅目昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)在幼蟲(chóng)食物中與一種或多種Bt蛋白一起提供特異于抑制鞘翅目幼蟲(chóng)基因的dsRNA時(shí)，這尤其正確，當(dāng)以閾值或高于闊值的水平提供時(shí)，Bt蛋白會(huì)按照常規(guī)途徑對(duì)該鞘翅目幼蟲(chóng)產(chǎn)生毒性。對(duì)于同種昆蟲(chóng)物種具有毒性的一種或多種Bt毒素的存在，將有效降低腸道pH,提供針對(duì)雙鏈RNA分子的穩(wěn)定環(huán)境，以施加它們對(duì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)靶基因的抑制作用?？梢灶A(yù)見(jiàn)到，某些穩(wěn)定化dsRNA構(gòu)建體與一種或多種昆蟲(chóng)控制蛋白基因的組合將產(chǎn)生協(xié)同作用，能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的昆蟲(chóng)控制表型。利用人工食物或整個(gè)植物組織進(jìn)行的昆蟲(chóng)生物測(cè)定可用于確定使用dsRNA和昆蟲(chóng)控制蛋白時(shí)對(duì)于幼蟲(chóng)死亡率或生長(zhǎng)抑制的劑量反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在生物測(cè)定中對(duì)dsRNA分子和昆蟲(chóng)蛋白的混合物加以檢驗(yàn)，以鑒定出活性組合，所述組合是針對(duì)昆蟲(chóng)保護(hù)植物中的應(yīng)用有協(xié)同性的并且是人們想要的(Tabashmk,1992)。已經(jīng)報(bào)道了不同的昆蟲(chóng)控制蛋白之間殺死昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的協(xié)同性(綜述參見(jiàn)Schnepf等人，1998)?？梢灶A(yù)見(jiàn)到，在某些dsRNA之間和某些dsRNA和某些昆蟲(chóng)控制蛋白之間存在有協(xié)同性。本發(fā)明還涉及含有一種或多種本發(fā)明序列的農(nóng)產(chǎn)品制品，以及從含有一種或多種本發(fā)明核苷酸序列的重組植物或種子制造的農(nóng)產(chǎn)品制品，它們作為本發(fā)明的實(shí)施方式被特別包括。含有一種或多種本發(fā)明序列的農(nóng)產(chǎn)品制品包括^旦不限于，植物的粗4分、油、碾i爭(zhēng)的或整個(gè)的谷?；蚍N子，或者包含重組植物或種子的任何粗粉、油、碾碎的或整個(gè)的谷粒的任何食品，所述重組植物或種子含有一種或多種本發(fā)明的序列。在本文包括的一種或多種農(nóng)產(chǎn)品或農(nóng)產(chǎn)品制品中對(duì)本發(fā)明的一種或多種序列的檢測(cè)用事實(shí)證明，農(nóng)產(chǎn)品或農(nóng)產(chǎn)品制品由轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)成，所述轉(zhuǎn)基因植物被設(shè)計(jì)為能表達(dá)本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列，用于通過(guò)使用dsRNA介導(dǎo)的基因阻抑方法來(lái)控制昆蟲(chóng)侵襲的目的。D.獲得核酸本發(fā)明還提供了一種方法，用于獲得包含生產(chǎn)dsRNA或siRNA的核普酸序列的核酸。在一種實(shí)施方式中，所述方法包括(a)用雜交探針探測(cè)cDNA或gDNA文庫(kù)，所述探針包含來(lái)自把定的昆蟲(chóng)的核苷酸序列或其同源物的全部或部分；(b)鑒定出能與雜交探針雜交的DNA克??；(c)分離步驟(b)中鑒定的DNA克?。灰约?d)對(duì)包含在步驟(c)中分離的克隆的cDNA或gDNA片段進(jìn)行測(cè)序，其中，測(cè)序的核酸分子能轉(zhuǎn)錄RNA核苷酸序列或其同源物的全部或主要部分。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的用于獲得核酸片段(其中包含用于生產(chǎn)本發(fā)明dsRNA或siRNA的主要部分的核苷酸序列)的方法包4舌如下步驟(a)合成第一和第二寡核苦酸引物，它們與來(lái)自靶定的昆蟲(chóng)的核苷酸序列之一的一部分對(duì)應(yīng)；以及(b)使用步驟(a)的第一和第二寡核苷酸引物，擴(kuò)增克隆載體中存在的cDNA或gDNA插入，其中，擴(kuò)增的核酸分子能轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的dsRNA或siRNA的主要部分。在對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐中，耙基因可從玉米根蟲(chóng)(CRW),例如WCR或SCR獲得，或者從能導(dǎo)致農(nóng)作物植物被損害以及隨后的減產(chǎn)的任何昆蟲(chóng)物種獲得。本發(fā)明認(rèn)為，若干種標(biāo)準(zhǔn)可被用于選擇優(yōu)選的靶基因。所述基因是這樣的基因其蛋白產(chǎn)物具有快速的更新速率，使得dsRNA抑制可導(dǎo)致蛋白水平的快速降低。在某些實(shí)施方式中，選用表達(dá)水平少量下降即可導(dǎo)致對(duì)昆蟲(chóng)的有害作用的基因是有利的。如果想靶定廣鐠昆蟲(chóng)物種，那么要選擇在這些物種間高度保守的基因。相反，為了帶來(lái)特異性，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，選擇含有在各種昆蟲(chóng)物種間或在昆蟲(chóng)與其它生物間保守程度低的區(qū)域的基因。在某些實(shí)施方式中，選擇沒(méi)有其它生物的已知同源物的基因是人們想要的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"來(lái)源于"指，可從特定的特別來(lái)源或物種獲得的特別的核苷酸序列，雖然無(wú)須直接來(lái)自該特別來(lái)源或物種。在一種實(shí)施方式中，選用在昆蟲(chóng)消化道中表達(dá)的基因。耙定在消化道中表達(dá)的基因避免了在昆蟲(chóng)內(nèi)部散布dsRNA的需要。用于本發(fā)明的耙基因可以包括，例如，與編碼液泡和質(zhì)膜質(zhì)子V-ATP酶的蛋白組分的已知消化道表達(dá)基因的核苷酸序列顯著同源的那些(Dow等人，1997;Dow,1999)。該蛋白復(fù)合體是上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)的唯一能量提供者，負(fù)責(zé)中腸腔的堿化。V-ATP酶還在馬爾皮基(Malpighian)管中表達(dá)，所述馬爾皮基管是昆蟲(chóng)后腸的向外生長(zhǎng)物(outgrowth)，其以與哺乳動(dòng)物腎器官類似的方式，在流體平衡以及對(duì)外源化合物的解毒中發(fā)揮作用。在另一實(shí)施方案中，V-ATP酶可以是Vha68-2或其同源物或直向同源物(例如，SEQIDNO:821)。在另一種實(shí)施方式中，選用主要參與昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的基因。示例性的基因包括但不限于，CHD3基因、P-微管蛋白基因和編碼預(yù)測(cè)參與轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白的基因。黑腹果蠅中的CHD3基因編碼具有ATP依賴型DNA螺旋酶活性的蛋白，其參與細(xì)胞核中的染色質(zhì)組裝/解組裝。類似的序列還發(fā)現(xiàn)于多種生物中，例如擬/^不、fi,勞^f錄i和學(xué)踏潛發(fā)#。(3-微管蛋白基因家族編碼與微管相關(guān)的蛋白，所述蛋白是細(xì)胞骨架的構(gòu)成部分。相關(guān)序列也發(fā)現(xiàn)于多種生物中，例如fi豸Vf錄^和乂效享犬喊。預(yù)測(cè)作為轉(zhuǎn)運(yùn)(ESCRT)-III所需的內(nèi)體分選復(fù)合物的亞基的蛋白(Babste/a/.，2002),例如Dv49,存在于多種生物中，包括哺乳動(dòng)物、酵母和昆蟲(chóng)，如D.virgifera。另一種轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白是(3-外被體蛋白，縮寫(xiě)為(3'Cop，其編碼參與逆行(高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng))轉(zhuǎn)運(yùn)的產(chǎn)物。在秀麗新桿線蟲(chóng)和D.wgz/era中都鑒別了相似或預(yù)測(cè)的序列，如Dv248(SEQIDNO:。用于本發(fā)明的其它靶基因可以包括，例如，在存活、生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和感染力中起重要作用的那些。這些靶基因可以是下述之一管家基因、轉(zhuǎn)錄因子和昆蟲(chóng)特異性基因或果蠅中的致死性敲除突變。在本發(fā)明中使用的靶基因還可以是來(lái)自其它生物的那些，例如，來(lái)自線蟲(chóng)(例如秀麗新桿線蟲(chóng))。此外，用于本發(fā)明的核苦酸序列還可來(lái)自植物、病毒、細(xì)菌或真菌基因，所述基因的功能已被建立于文獻(xiàn)中，其核普酸序列與昆蟲(chóng)基因組中靶基因具有顯著相似性。根據(jù)本發(fā)明的一方面，為了WCR控制，耙序列可以基本從耙WCR昆蟲(chóng)獲得。編碼與已知蛋白同源的D.v.virgifera蛋白或其片段的、來(lái)自WCRcDNA文庫(kù)的一些示例性靶序列可從序列表中找到。編碼已知蛋白的同源物的來(lái)自D.virgifera的核酸分子是已知的(Andersen等人，美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)10/205,189)。就本發(fā)明的目的而言，dsRNA或siRNA分子可以從CRW獲得，這是通過(guò)對(duì)來(lái)源于玉米根蟲(chóng)gDNA或cDNA文庫(kù)的靶CRW基因序列或其部分進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?PCRTM)擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)的。可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來(lái)制備WCR幼蟲(chóng)，可以提取DNA/RNA?？蓪⒉煌笮〉挠紫x(chóng)，從第1齡至完全長(zhǎng)成的CRW用于本發(fā)明的目的，進(jìn)行DNA/RNA提取。從WCR產(chǎn)生的基因組DNA或cDNA文庫(kù)可被用于PCRTM擴(kuò)增，以生產(chǎn)dsRNA或siRNA。然后可使用本領(lǐng)域中容易獲得的方法，對(duì)靶基因進(jìn)行PCRTM擴(kuò)增和測(cè)序。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)PCRTM條件加以改動(dòng)，以確保最優(yōu)的PCRTM產(chǎn)物形成。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的PCRTM產(chǎn)物可被用作為模板，用于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)生具有被包括進(jìn)來(lái)的最小啟動(dòng)子的有義和反義RNA。本發(fā)明的發(fā)明人考慮，從昆蟲(chóng)界的任何昆蟲(chóng)物種鑒定和分離的核酸序列可用于本發(fā)明，以控制WCR和其它草巴昆蟲(chóng)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，核酸可以來(lái)源于鞘翅目物種。特別地，核酸可以來(lái)源于屬于葉曱屬(鞘翅目，葉曱科)的葉甲，更特別地，本發(fā)明的核酸分子可以來(lái)源于w^/era纟且。最4爭(zhēng)另lli也，本發(fā)明的牙亥f復(fù)來(lái)源于Z)z"Zra"cawgz/eravz>gz/eraLeConte,其通常被稱為WCR。經(jīng)過(guò)分離的核酸可用于，例如鑒定靶基因，以及構(gòu)建重組載體，所述載體能生產(chǎn)本發(fā)明的穩(wěn)定化dsRNA或siRNA,用于保護(hù)才直物4氐擋WCR昆蟲(chóng)J曼襲。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明包含來(lái)自WCR或草盲蝽的分離和純化的核苷酸序列，其可一皮用作為昆蟲(chóng)控制劑。經(jīng)過(guò)分離和純化的核苷酸序列可以包含序列表中列出的那些。來(lái)自WCR或其它昆蟲(chóng)的、可用于本發(fā)明的核酸還可包含經(jīng)過(guò)分離和高度純化的Umgenes和EST核酸分子或其核酸片段分子。EST核酸分子可以編碼多肽的顯著區(qū)域，或者事實(shí)上，多肽的大部分?；蛘?，所述片段可以包含更小的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有大約15至大約250個(gè)核苷酸殘基，更優(yōu)選地，大約15至大約30個(gè)核苷酸殘基?；蛘撸糜诒景l(fā)明的核酸分子可以來(lái)自WCR、草盲蝽或任何其它鞘翅目害蟲(chóng)物種的cDNA文庫(kù)。來(lái)自WCR或其它鞘翅目害蟲(chóng)物種的核酸分子和其片段可被用于獲得來(lái)自其它物種的其它核酸分子，用于本發(fā)明中，以產(chǎn)生想要的dsRNA和SlRNA分子。此類核酸分子包括下述核酸分子，所述核酸分子編碼蛋白質(zhì)的完整編碼序列，以及此類分子的啟動(dòng)子和側(cè)翼序列。此外，此類核酸分子包含編碼基因家族成員的核酸分子。使用上述核酸分子或其片l爻去篩選例如,人Z).v.Wrgz/era或其它鞘翅目物種如,人/z^;eras獲得的cDNA或gDNA文庫(kù)，可以容易得獲得此類分子。用于制成此類文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域^^知的。本文中使用的短語(yǔ)"編碼序列，，、"結(jié)構(gòu)核苷酸序列，，或"結(jié)構(gòu)核酸分子"指，置于合適的調(diào)節(jié)序列控制下時(shí)，能被翻譯為多肽的核苷酸序列，通常這是通過(guò)mRNA進(jìn)行的。編碼序列的邊界是由5'末端的翻"i奪起始密碼子和3，末端的翻i奪終止密碼子來(lái)確定的。編碼序列可以包括l旦不限于，基因組DNA、cDNA、EST和重組核苦酸序列。術(shù)語(yǔ)"重組DNA"或"重組核苦酸序列"指，含有遺傳工程修飾的DNA,所述修飾是通過(guò)誘變、限制酶等的操縱來(lái)進(jìn)行的。對(duì)于是通過(guò)本發(fā)明加以控制的潛在靶的昆蟲(chóng)中的很多而言，關(guān)于大多數(shù)基因的序列和從對(duì)特定基因的突變得到的表型的信息可能是有限的。因此，本發(fā)明人考慮，從昆蟲(chóng)害蟲(chóng)選出合適的基因用于本發(fā)明的過(guò)程，可以通過(guò)使用可從對(duì)才莫式生物(例如^超)，一些其它昆蟲(chóng)物種，或者甚至線蟲(chóng)物種、真菌物種、植物物種(這些物種中的相應(yīng)基因已被表征)中相應(yīng)基因的研究獲得的信息來(lái)進(jìn)行。在一些情況下，將可能通過(guò)使用來(lái)自，例如果蠅、另外的昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)、真菌或植物(其中已經(jīng)克隆了基因)的序列或基因名，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，例如GenBank,來(lái)獲得耙昆蟲(chóng)相應(yīng)基因的序列。一旦獲得了序列，可以使用PCRTM來(lái)擴(kuò)增合適地選出的昆蟲(chóng)中的基因片段，用于本發(fā)明。為了獲得來(lái)自昆蟲(chóng)物種中相應(yīng)基因的DNA片段，基于在WCR或基因已克隆的其它昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的序列來(lái)設(shè)計(jì)PGR引物。引物被設(shè)計(jì)為能擴(kuò)增足夠長(zhǎng)度的DNA片段，用于本發(fā)明。DNA(基因組DNA或cDNA)制備自昆蟲(chóng)物種，用PCRTM引物來(lái)擴(kuò)增DNA片段。擴(kuò)增條件被選用為即使在引物不能精確匹配靶序列的情況下，擴(kuò)增也能得以進(jìn)行?；蛘?，可以使用WCR基因或其它已知的昆蟲(chóng)基因作為探針，從制備自昆蟲(chóng)害蟲(chóng)物種的gDNA或cDNA文庫(kù)，克隆出基因(或其一部分)。用于實(shí)施PCRTM和從文庫(kù)中克隆的技術(shù)是已知的?；谝郧皬腤CR或其它昆蟲(chóng)物種中克隆出的基因序列，從靶昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中分離DNA片段的方法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，在實(shí)施例中有所提供。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，多種不同的技術(shù)可用于從昆蟲(chóng)害蟲(chóng)物種中分離出與以前從其它物種種分離的基因相對(duì)應(yīng)的基因片段。當(dāng)昆蟲(chóng)是本發(fā)明的靶害蟲(chóng)時(shí)，此類害蟲(chóng)包括但不限于，來(lái)自鱗翅目(Lepidoptera),例如，長(zhǎng)翅巻蛾(Aclerisspp.),褐帶巻蛾(Adoxophyesspp.),透翅蛾(Aegeriaspp.),夜蟲(chóng)我(Agrotisspp.),棉葉〉皮纟丈夜蟲(chóng)我(Alabamaargillaceae),Amyloisspp.,黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis),黃巻蛾(Archipsspp),帶巻蛾(Argyrotaeniaspp.),纟丈夜蛾(Autographaspp.),玉米蟲(chóng)主莖褐夜蛾(Busseolafusca),干果斑螟(Cadracautella),Carposinanipponensis,二化螟(Chilospp.),色巻蛾(Choristoneuraspp.),Clysiaambiguella,縱巻葉野螟(Cnaphalocrocisspp.),巻蛾(Cnephasiaspp.),細(xì)巻蛾(Cochylisspp.),革肖蛾(Coleophoraspp.),Crocidolomiabinotalis,Apple異形小巻蟲(chóng)我(Cryptophlebialeucotreta),小巻蟲(chóng)我(Cydiaspp.),灰才干草蟲(chóng)冥(Diatraeaspp.),展葉+>夜蟲(chóng)我(Diparopsiscastanea),實(shí)蛾(Eariasspp.),干果斑螟(Ephestiaspp.),白小巻蛾(Eucosmaspp.)，Eupoeciliaambiguella,茶黃毒蟲(chóng)我(Euproctisspp.),士刀才艮蟲(chóng)(Euxoaspp.),小食心蟲(chóng)(Grapholitaspp.),Hedyanubiferana,夜蛾(Heliothisspp.),菜心野螟(Hellulaundalis),美國(guó)白蟲(chóng)我(Hyphantriacunea),癡莖麥蟲(chóng)我(Keiferialycopersicella),旋纟丈潛蛾(Leucopterascitella)，細(xì)蛾(Lithocollethisspp.),Lobesiabotrana,毒蟲(chóng)我(Lymantriaspp.)，;脊蟲(chóng)我(Lyonetiaspp.),天幕毛蟲(chóng)(Malacosomaspp.),甘藍(lán)夜蟲(chóng)我(Mamestrabrassicae),火因草天蟲(chóng)我(Manducasexta),尺蠖蛾(Operophteraspp.),玉米螟(OstrmiaNubilalis),超小巻蛾(Pammenespp.),褐巻蛾(Pandemisspp.),小目艮夜蛾(Panolisflammea),纟工鈴麥蟲(chóng)我(Pectmophoragossypiella),馬鈴薯麥蟲(chóng)我(Phthorimaeaoperculella)，小菜4分蝶日本亞種(Piensrapae),毛連菜(Pierisspp.),菜蛾(Plutellaxylostella),巢蛾(Praysspp.),白螟(Scirpophagaspp.),大螟(Sesamiaspp.),長(zhǎng)須巻蛾(Sparganothisspp.),夜蛾(Spodopteraspp.),猛透翅蛾(Synanthedonspp.),帶蛾(Thaumetopoeaspp.)，巻葉蛾(Tortrixspp.),粉纟丈夜蛾(Trichoplusiani)和巢蛾(Yponomeutaspp.);來(lái)自鞘翅目(Coleoptera),例如，金4十蟲(chóng)(Agnotesspp.),花象曱(Anthonomusspp.),*計(jì)菜隱食甲(Atomarialinearis),甜菜莖跳曱(Chaetocnematibialis),象甲(Cosmopolitesspp.),栗象(Curculiospp.),皮蠹(Dermestesspp.),葉曱(Diabroticaspp.),豆孤蟲(chóng)(Epilachnaspp.)，Eremnusspp.,馬鈴薯葉曱(Leptinotarsadecemlineata),稻象(Lissorhoptmsspp.),鰓角金龜(Melolonthaspp.),Orycaephilusspp.,草莓根象甲(Otiorhynchusspp.),Phlyctmusspp.,弧麗拔(Popilliaspp.),^兆曱(Psylliodesspp.),谷蠹(Rhizoperthaspp.),金龜甲禾牛(Scarabeidae),米象(Sitophilusspp.),麥蟲(chóng)我(Sitotrogaspp.),并分蟲(chóng)(Tenebriospp.),4以古盜(Triboliumspp.)禾口皮蠹(Trogodermaspp.);來(lái)自直翅目(Orthoptera),例如，蠊(Blattaspp.),小蠊(Blattellaspp.)，螻姑(Gryllotalpaspp.),馬德4立蜚蠊(Leucophaeamaderae),飛蟲(chóng)皇(Locustaspp.),大蠊(Periplanetassp.),和蟲(chóng)乍蟲(chóng)孟(Schistocercaspp.);來(lái)自等翅目(Isoptera),例如，犀白議(Reticulitemesspp);來(lái)自嚙蟲(chóng)目(Psocoptera),例如，書(shū)虱(Liposcelisspp.);來(lái)自虱目(Anoplum),例如，血虱(Haematopinusspp.),長(zhǎng)顎虱(Linognathusspp.),虱(Pediculusspp.)，天痕癡(Pemphigusspp.)和才艮瘤蟲(chóng)牙(Phylloxeraspp.);來(lái)自食毛目(Mallophaga),例如Damalmeaspp.和噴毛虱(Trichodectesspp.);來(lái)自纓翅目(Thysanoptera),例如，花薊馬(Franklinellaspp.),條薊馬(Hercinothripsspp.),帶薊馬(Taeniothripsspp.),薊馬(Thripspalmi),煙薊馬(Thripstabaci)和非洲枯石更莉馬(Scirtothripsaurantii);來(lái)自異翅目(Heteroptera),例如，臭蟲(chóng)(Cimexspp.),可可瘤盲蟲(chóng)春(Distantiellatheobroma),蟲(chóng)它莓(Dysdercusspp.),Euchistusspp.，扁盾棒(Eurygasterspp.),稻緣漆(Leptocorisaspp.),綠棒(Nezaraspp.),網(wǎng)棒(Piesmaspp.),長(zhǎng)紅獵蝽(Rhodniusspp.),可可褐盲蝽(Sahlbergellasingularis),黑棒(Scotmopharaspp.)，錐蝽(Triatomaspp.)，盲蝽科物種，例如豆莢草盲蝽和美洲牧草盲蝽，長(zhǎng)蝽科物種，例如美洲毛谷桿長(zhǎng)蝽，和蝽科物種；來(lái)自同翅目(Homoptera),例^口，綿粉虱(Aleurothrixusfloccosus),Aleyrodesbrassicae,圓盾蟲(chóng)介(Aonidiellaspp.),蟲(chóng)牙科(Aphididae),蟲(chóng)牙(Aphisspp.),圓盾蟲(chóng)介(Aspidiotusspp.),團(tuán)扇芥(Bemisiatabaci),蟲(chóng)普蟲(chóng)介(Ceroplasterspp.),茶褐圓蟲(chóng)介(Chrysomphalusaonidium),薔薇軟蟲(chóng)介(Chrysomphalusdictyospermi),褐軟蟲(chóng)介(Coccushesperidum),微葉蟬(Empoascaspp.),Apple綿蟲(chóng)牙(Eriosomalarigemm)，斑葉蟬(Erythroneuraspp.),Gascardiaspp.,飛H(Laodelphaxspp.),Lacani鵬comi,牡蟲(chóng)厲盾蟲(chóng)介(Lepidosaphesspp.),長(zhǎng)管蟲(chóng)牙(Macrosiphusspp.)，瘤蟲(chóng)牙(Myzusspp.),Nehoteftixspp.,飛氛(Nilaparvataspp.),Paratoriaspp.,瘦綿蟲(chóng)牙(Pemphigusspp.),粉蟲(chóng)介(Planococcusspp.),白蟲(chóng)介(Pseudaulacaspisspp.),粉蟲(chóng)介(Pseudococcusspp.),木IUPsyllassp.),Pulvinariaaethiopica,圓盾蟲(chóng)介(Quadraspidiotusspp.),縊管蟲(chóng)牙(Rhopalosiphumspp.),盔蟲(chóng)介(Saissetiaspp.)，葉蟬(Scaphoideusspp.),二叉蟲(chóng)牙(Schizaphisspp.),Sitobionspp.,溫室粉IUTrialeurodesvaporariomm),Triozaerytreae和桔盾蟲(chóng)介(Unaspiscitri);來(lái)自膜翅目(Hymenoptera),例如，Acromyrmex,切葉議(Attaspp.),莖4居蟲(chóng)奪(Cephusspp.),葉蟲(chóng)奪(Diprionspp.),4居節(jié)葉蟲(chóng)奪科(Dipriomdae),云杉葉蟲(chóng)奪(Gilpiniapolytoma),實(shí)蜂(Hoplocampaspp.),黑蟻(Lasmsspp.),Monomoriumpharaonis,4居角葉蟲(chóng)奪(Neodiprionspp),7K議(Solenopsisspp.)和胡蜂(Vespassp.);來(lái)自只又翅目(Diptera),例^口，伊蟲(chóng)文(Aedesspp.),Antherigonasoccata，Bibioho加lanus,紅頭麗蟲(chóng)龜(Calliphoraerythrocephala),蠟實(shí)繩(Ceratitisspp.),金錄(Chrysomyiaspp.),庫(kù)蚊(Culexspp.),黃錄(Cuterebraspp.),大實(shí)錄(Dacusspp.),果錄(Drosophilamdanogaster),廁繩(Fanniaspp.),胃錄(Gastrophilusspp.),舌錄(Glossinaspp.),皮繩(Hypodermaspp.),Hyppoboscaspp.,潛葉蟲(chóng)龜(Liriomysaspp.),綠蟲(chóng)龜(Luciliaspp.),潛錄(Melanagromyzaspp.)，舍錄(Muscassp.),狂錄(Oestrusspp.),Orseoliaspp.,瑞典麥稈錄(Oscmellafrit),黎泉繩(Pegomyiahyoscyami),麥錄(Phorbiaspp.),Apple實(shí)繩(Rhagoletispomonella),潭繩(Sciaraspp.)，螯鮑(Stomoxysspp.),虻(Tabanusspp.),Tanniaspp.和稻大蚊(Tipulaspp.),來(lái)自蚤目(Siphonaptera),例如，角葉蚤(Ceratophyllusspp.)和東方鼠蚤(Xenopsyllacheopis)，以及來(lái)自嬰尾目(Thysanura),例如，西洋衣魚(yú)(Lepismasaccharina)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)是葉甲物種，特別是當(dāng)害蟲(chóng)是Z)zWra"cavzrgz/erawrg^^Y7(西部玉米才艮蟲(chóng)，WCR)，Dz"Z)TO"ca/^Aen(北部玉米才艮蟲(chóng)，NCR)，Z)/a^o"c"Wrg〖/erazea(墨西哥玉米才艮蟲(chóng)，MCR)，Z)w6ra"caZ><3/fe<3to(巴西玉米才艮蟲(chóng)(BZR)或由D/a6ro/7.cavz力'(iw/"和Dz'"6n9〃C(2組成的巴西玉米根蟲(chóng)復(fù)合體(BCR)),或Dz"Z)TO"ca朋6fec冊(cè);麗ctoto/zowwA(南部玉米根蟲(chóng)，SCR)時(shí)，本發(fā)明特別有效。實(shí)施例發(fā)明人在本文中鑒定了用于控制鞘翅目害蟲(chóng)侵襲的方法，這是通過(guò)在害蟲(chóng)食物中提供雙鏈核糖核酸分子來(lái)進(jìn)行的。令人吃驚地，發(fā)明人已經(jīng)揭示，在被害蟲(chóng)攝取時(shí)，雙鏈核糖核酸分子會(huì)發(fā)揮作用，抑制害蟲(chóng)的生物功能，導(dǎo)致下述特征中的一種或多種害蟲(chóng)進(jìn)食減少，害蟲(chóng)存活率降低，害蟲(chóng)死亡，害蟲(chóng)的分化和發(fā)育被抑制，害蟲(chóng)的有性繁殖能力的降低或消失，肌肉形成，保幼激素的形成，保幼激素的調(diào)節(jié)，離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞膜電位的保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素傳感，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卯形成，幼蟲(chóng)成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴的保持，神經(jīng)傳遞，細(xì)胞分裂，能量代謝，呼吸，凋亡，以及真核細(xì)胞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的任何組分，例如，肌動(dòng)蛋白和微管蛋白。這些特性中任何一種或任何組合可以導(dǎo)致對(duì)害蟲(chóng)侵襲的有效抑制，在植物害蟲(chóng)的情況下，導(dǎo)致對(duì)植物侵襲的抑制。例如，當(dāng)用作為以局部方式提供給植物的、含有足以抑制害蟲(chóng)的量的一種或多種雙鏈核糖核酸分子的食物組合物時(shí)，用作為種子處理，作為才直物周圍的土i裏施用，或者從植物細(xì)胞內(nèi)存在的重組DNA分子來(lái)通過(guò)植物生產(chǎn)時(shí)，對(duì)植物害蟲(chóng)侵襲會(huì)出人意料地顯著地降低。當(dāng)應(yīng)用于單種害蟲(chóng)時(shí)，本文示出的實(shí)施例用于闡述本發(fā)明。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，實(shí)施例中的方法、配方和想法不作限制之用，其可用于可以消耗下述食物來(lái)源的所有鱗翅目害蟲(chóng)物種，以抑制與害蟲(chóng)相關(guān)或在其內(nèi)部發(fā)揮作用的一些重要特征，所述食物來(lái)源是可被配制為含有足夠量的害蟲(chóng)抑制劑，其由至少一種或多種雙鏈RNA分子構(gòu)成。實(shí)施例l用于控制玉米根蟲(chóng)的dsRNA的制備中用到的靶核苷酸的鑒定從整個(gè)幼蟲(chóng)、蛹以及從切開(kāi)的中腸切段來(lái)構(gòu)建玉米根蟲(chóng)cDNA文庫(kù)(LIB149,LIB150,LD33027,LIB3373),獲得核苦酸序列信息(見(jiàn)，Andersen等人，提交于2002年7月24日的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/205,189,其整體通過(guò)引用被特別并入本文)。此外，從處于不同發(fā)育階段以及每個(gè)發(fā)育階段中不同時(shí)間的整個(gè)幼蟲(chóng)，來(lái)構(gòu)建cDNA文庫(kù)，以最大化來(lái)自葉曱物種的不同EST序列的數(shù)量。分別由從第一齡(l克)和第三齡(2.9克)的西部玉米根蟲(chóng)幼蟲(chóng)獲得的mRNA集合構(gòu)建出文庫(kù)LIB5444和LIB5462。通過(guò)插入到液氮中，將得到的昆蟲(chóng)迅速冷凍。在保持于-20。C的研缽和碾槌中磨碎昆蟲(chóng)，溫度保持是通過(guò)在干冰上冷藏和/或向研缽中加入液氮直到組織被磨碎為細(xì)粉來(lái)實(shí)現(xiàn)的。使用TRIzol試劑(Invitrogen),按照廠商說(shuō)明書(shū)，提取RNA。使用DynabeadsOligodT(DynalInc.,NY),按照廠商說(shuō)明書(shū)，從總RNA制劑中分離出PolyA+RNA。使用SuperScriptTM質(zhì)粒系統(tǒng)(Invitrogen)從PolyA+RNA來(lái)構(gòu)建cDNA文庫(kù)。使用色譜對(duì)cDNA進(jìn)行大小分級(jí)分離。第四級(jí)分和第五級(jí)分片段被收集，并被連接進(jìn)pSPORTl載體(LifeTechnologiesInd.,GaithersburgMD)的&z/l和A^1限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)之間，通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH10B電感受態(tài)細(xì)胞。第一齡幼蟲(chóng)文庫(kù)產(chǎn)生了大約420,000個(gè)菌落形成單位。第三齡幼蟲(chóng)文庫(kù)產(chǎn)生了大約2.78x106個(gè)菌落形成單位。^v平澤反上洗下來(lái)自LIB149、LIB150的菌落，通過(guò)短暫振蕩均勻混合，再倒進(jìn)Tris-EDTA緩沖液。洗下來(lái)的物質(zhì)中的一半被裝入10%的甘油，分裝進(jìn)冷凍小管，貯存于-7(TC。另一半被用于用Qmagen微量純化柱或其等同物來(lái)產(chǎn)生質(zhì)粒DNA。將經(jīng)過(guò)純化的質(zhì)粒DNA分裝進(jìn)微離心管，貯存于-2(TC。在高粘度培養(yǎng)基中分別擴(kuò)增來(lái)自DiabroticavirgiferacDNA文庫(kù)LIB5444和LIB5462的菌落。37。C下，分別在攪拌平板的500mlLB培養(yǎng)基(含有0.3%SeaPrepagarose⑧和50mg/1羧芐青霉素)中，混合來(lái)自LIB5444的大約200,000個(gè)菌落形成單位和來(lái)自LIB5462的600,000個(gè)菌落形成單位，然后在水/水浴中迅速冷卻1小時(shí)，使得細(xì)菌菌落均勻懸浮。然后在30。C使經(jīng)過(guò)接種的文庫(kù)生長(zhǎng)42小時(shí)。溫育之后，在攪拌平板上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行5分鐘的混合。然后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到兩個(gè)250ml的離心瓶中。在10,000xg沉淀細(xì)菌細(xì)胞10分鐘。從瓶中移出培養(yǎng)基，將細(xì)胞重新懸浮于總共20ml的LB培養(yǎng)基中，其中含有50mg/1的羧芐青霉素。加入二曱亞砜至10%,以將細(xì)胞保持為冷凍狀態(tài)。對(duì)兩種文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，至每毫升108個(gè)菌落形成單位的最終滴度。組合Z)w^^zcawgz/eracDNA文庫(kù)LIB5444和LIB5462的樣品，在經(jīng)過(guò)滅菌蒸餾和去離子的水中，將其調(diào)節(jié)為每微升大約1.25微克的DNA濃度，分裝進(jìn)25個(gè)冷凍小管，每個(gè)冷凍小管含有大約8.75微克的DNA。申請(qǐng)人/發(fā)明人于2004年6月10日將這些樣品保藏到位于10801UniversityBoulevard,Manassas,VirginiaUSAZIP20110-2209的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),其被稱為L(zhǎng)IB5444/62。ATCC向申請(qǐng)人提供了保藏證明，其指定ATCC保藏號(hào)為PTA-6072?；景凑丈衔乃龅挠糜诋a(chǎn)生玉米根蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的方法，制備玉米根蟲(chóng)高分子量cDNA文庫(kù)，即LIB5496和LIB5498。分別從由第一齡(1克)和第二以及第三齡(1克)西部玉米根蟲(chóng)幼蟲(chóng)獲得的mRNA庫(kù)來(lái)構(gòu)建文庫(kù)LIB5496和LIB5498。簡(jiǎn)言之，在液氮中迅速冷凍昆蟲(chóng)，通過(guò)在研缽和碾槌中進(jìn)行碾磨，將冷凍的昆蟲(chóng)變?yōu)榧?xì)粉。使用TRIzo膨試劑(Invitrogen),按照廠商i充明書(shū)，提取RNA。使用DynabeadsOligodT(DynalInc.,NY),按照廠商說(shuō)明書(shū)，從總RNA制劑中分離出PolyA+RNA。4吏用SuperScnpfMPlasmidSystem(Invitrogen),人20孩i克的PolyA+RNA來(lái)構(gòu)建高分子量cDNA文庫(kù)。在TAE中的1%瓊脂糖凝膠上，對(duì)cDNA進(jìn)行大小分級(jí)分離。收集1Kb至10Kb范圍內(nèi)的cDNA,將其連接進(jìn)pSPORTl載體的和限制性位點(diǎn)之間，通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH10B電感受態(tài)細(xì)月包。LIB5496產(chǎn)生了大約3.5x106個(gè)菌落形成單位。LIB5498產(chǎn)生了大約1.0乂106個(gè)菌落形成單位。在高粘度培養(yǎng)基中單個(gè)擴(kuò)增來(lái)自玉米根蟲(chóng)高分子量cDNA文庫(kù)LIB5496和LIB5498的菌落。37°C下，分別在攪拌平板的500mlLB培養(yǎng)基(含有0.3%SeaPrepagarose⑧和50mg/1羧芐青霉素)中，混合來(lái)自LIB5496和LIB5498的大約600,000個(gè)菌落形成單位，然后在水/水浴中迅速冷卻1小時(shí)，使得細(xì)菌菌落均勻懸浮。然后在30。C使接種的文庫(kù)生長(zhǎng)42小時(shí)。溫育之后，在攪拌平板上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行5分鐘的混合。然后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到兩個(gè)250ml的離心瓶中。在10,000xg處理IO分鐘，沉淀細(xì)菌細(xì)胞。從瓶中移出培養(yǎng)基，將細(xì)胞重新懸浮于總共20ml的LB培養(yǎng)基中，其中含有50mg/l的羧千青霉素。加入二曱亞砜至10°/。，以將細(xì)胞保持為冷凍狀態(tài)。對(duì)兩種文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，至每毫升108個(gè)菌落形成單位的最終滴度。從玉米根蟲(chóng)物種特異性質(zhì)粒文庫(kù)獲得插入的cDNA序列信息。Andersen等人的玉米根蟲(chóng)文庫(kù)以及來(lái)自LIB5444和LIB5462文庫(kù)的額外序列最初產(chǎn)生來(lái)大約18,415個(gè)單獨(dú)的EST序列，其由大約1.0x107個(gè)核苷酸殘基構(gòu)成。EST序列的平均長(zhǎng)度為大約586個(gè)核苷酸殘基。這些EST序列被用于生物信息學(xué)算法，得到了重疊群(contig)序列的組裝，這在本文中被稱為UNIGENE序列，不能通過(guò)重疊同一性與其它EST序列組裝的各個(gè)EST序列在本文中被稱為單態(tài)(singleton)。然后對(duì)LIB5444和LIB5462文庫(kù)進(jìn)行更為深度的測(cè)序，得到額外的個(gè)體EST序列。將從文庫(kù)，即LIB149、LIB150、LIB3027、LIB3373、LIB5444、LIB5462、LIB5496和LIB5503獲得的EST序列選用于下文所述的攝食生物測(cè)定的進(jìn)一步研究，并且相應(yīng)的序列示于序列表中。如果可能，將從CRWcDNA文庫(kù)分離得到的EST序列組裝為UNIGENE組，這些裝備的Umgene序列被包括于序列表中。UNIGENE是基因定向的簇，其形成自單個(gè)EST序列在序列同一性區(qū)域內(nèi)的重疊，以形成更大的序列。Pontius等人(2003)。對(duì)序列表中示出的每條核苷酸序列加以分析，鑒定出讀碼框的存在。將從讀碼框推斷出的氨基酸序列信息與可從公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的已知氨基酸序列信息比較，以推斷出氨基酸序列與這些已知氨基酸序列同一性或相似性的程度。如果存在，用與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已知氨基酸序列相關(guān)的生物功能，給從cDNA文庫(kù)核苷酸序列信息推斷出的氨基酸序列加上下述注釋。注釋提供了暗示性的蛋白質(zhì)(可能從給出特定cDNA序列的特定基因表達(dá)的)功能信息，但是這并非決定性的結(jié)果?；诎凳拘缘淖⑨屝畔ⅲ承ヽDNA序列被鑒定為編碼可能涉及玉米根蟲(chóng)細(xì)胞中一些生物學(xué)功能的蛋白，所述功能對(duì)生命來(lái)說(shuō)是很重要的，或者對(duì)確保細(xì)胞的健康和存活來(lái)說(shuō)是必要的，或者可能涉及細(xì)胞完整、細(xì)胞保持、繁殖能力等。將選擇用于進(jìn)一步研究的序列用于構(gòu)建雙鏈RNA分子，摻入CRW食物?；赾DNA和EST起始序列來(lái)設(shè)計(jì)熱擴(kuò)增引物對(duì)，獲得用于攝食測(cè)定的序列。引物對(duì)或者被構(gòu)建為一對(duì)核普酸序列，引物對(duì)的每個(gè)成員都展示出與有義或反義序列的完全互補(bǔ)性。構(gòu)建一些引物對(duì)序列，使得該對(duì)中的每個(gè)成員展示出在5'端含有T7噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子的序列。優(yōu)選地，使用CRW基因組DNA作為模板，用缺少T7啟動(dòng)子的第一引物對(duì)進(jìn)行高保真第一次擴(kuò)增，產(chǎn)生第一擴(kuò)增子。優(yōu)選地，cDNA或mRNA序列被用作為模板，用于合成本發(fā)明中使用的dsRNA分子，的序列。i后將從高保2第一次擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的第一擴(kuò)增子樣品在第二次熱擴(kuò)增反應(yīng)中用作為模板，用含有T7啟動(dòng)子序列的第二對(duì)引物對(duì)來(lái)生產(chǎn)第二擴(kuò)增子，其中，在第二擴(kuò)增子的每條鏈的5，末端處含有或其中嵌有T7啟動(dòng)子。以兩個(gè)方向獲得第二擴(kuò)增子的完整核苷酸序列，將其與針對(duì)cDNA報(bào)道的核苷酸序列進(jìn)行比較，并且，如果存在，指出兩條序列之間的差異。通常，使用基因組DNA作為模板制備的序列與用于獲得顯著水平阻抑的、作為dsRNA分子的進(jìn)一步使用并不一致，因?yàn)橛性趍RNA或cDNA序列中不存在的基因組序列的變異。典型地，體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)含有大約1至大約2微克的線性化DNA模板，來(lái)自IOX濃縮液的T7聚合酶反應(yīng)緩沖液，核并唐核普酸ATP、CTP、GTP和UTP(其中濃度為各50至100mM)以及1個(gè)單位的T7RNA聚合酶。按照廠商說(shuō)明書(shū)，在大約37。C將RNA聚合酶反應(yīng)溫育一段時(shí)間(數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí))，這取決于所用的RNA聚合酶的最佳溫度。通常，反應(yīng)進(jìn)行大約2至大約6小時(shí)，用于轉(zhuǎn)錄最長(zhǎng)長(zhǎng)達(dá)大約400個(gè)核苷酸的^t板序列，以及進(jìn)行最長(zhǎng)達(dá)20小時(shí)，用于轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度大于大約400個(gè)核苷酸的模板序列。將反應(yīng)加熱至65°C，持續(xù)15分鐘，以終止RNA轉(zhuǎn)錄。在乙醇中沉淀RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，洗滌，在空氣中干燥，將其重新懸浮于不含RNA酶的水中，至濃度為每毫升大約1微克。利用反向T7啟動(dòng)子RNA,^旦是，通過(guò)將經(jīng)過(guò)純化的RNA加熱至65°C,然后緩t曼冷卻至室溫以確保有義和反義RNA片段的正確退火，獲得了高產(chǎn)量的雙鏈RNA。然后用DNA酶I和RNA酶在37°C對(duì)雙鏈RNA產(chǎn)物進(jìn)行一'j、時(shí)的溫育，以去除混合物中存在的任何DNA或單鏈RNA。按照廠商說(shuō)明書(shū)(AMBIONMEGAscriptRNAiKIT),在柱子上純4t雙《連RNA產(chǎn)物，將其重新懸浮于10mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)或不含RNA酶的水中，至每微升O.l至l.O微克的濃度。下述核苦酸序列最初作為在玉米#^蟲(chóng)中腸cDNA文庫(kù)中鑒定出的cDNA序列被獲得(Andersen等人，同上)，將其用于構(gòu)建雙鏈RNA分子，用于檢驗(yàn)通過(guò)在害蟲(chóng)食物中攝食雙鏈RNA分子對(duì)害蟲(chóng)生物功能的抑制效果。A.Chd3同源序列在多種真核生物中鑒定了CHD基因，其對(duì)應(yīng)的蛋白被認(rèn)為作為染色質(zhì)重構(gòu)因子發(fā)揮作用。術(shù)語(yǔ)CHD來(lái)自CHD蛋白中發(fā)現(xiàn)的三種序列同源性結(jié)構(gòu)域chromo(染色質(zhì)組構(gòu)修飾物)結(jié)構(gòu)域、SNF2-相關(guān)螺旋酶/ATP酶結(jié)構(gòu)域以及DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，每種都纟皮相信能賦予不同的染色質(zhì)相關(guān)活性?；诹硪环N序列同源性結(jié)構(gòu)域(PHD鋅指結(jié)構(gòu)域，典型地，與染色體相關(guān)活性相關(guān))的是否存在，CHD蛋白被分為兩類。CHD3相關(guān)蛋白具有PHD鋅指結(jié)構(gòu)域，但是CHD1相關(guān)蛋白則并非如此。實(shí)驗(yàn)觀察暗示了CHD3蛋白在抑制轉(zhuǎn)錄中的作用，其在一些物種中已顯示為含有組蛋白去乙酰酶作為亞基的復(fù)合體的成分。組蛋白的去乙?；c轉(zhuǎn)錄滅活相關(guān)，所以CHD3蛋白已^L暗示為利用作為組氨酸去乙酰酶復(fù)合體的成分的性質(zhì)，能作為轉(zhuǎn)錄抑制劑發(fā)揮作用(Ogas等人，1999)。因此，對(duì)CHD3蛋白合成的阻抑可以作為有用的靶，用于雙鏈RNA介導(dǎo)的對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)的抑制。B.P-微管蛋白同源序列微管蛋白是所有真核細(xì)胞中多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要結(jié)構(gòu)性組分，主要用于形成微管。對(duì)細(xì)胞中微管形成的抑制會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重后果，包括，對(duì)有絲分裂紡錘體形成的干擾，對(duì)細(xì)胞分裂的阻斷等。因此，對(duì)微管蛋白形C.40kDaV-AT酶同源序列真核生物系統(tǒng)中亞細(xì)胞器內(nèi)的能量代謝是非常重要的功能。液泡ATP合酶參與在液泡內(nèi)保持足夠水平的ATP。因此，液泡ATP合酶可以是雙鏈RNA介導(dǎo)的抑制的有用耙。D.EFloc同源序列轉(zhuǎn)錄延伸和轉(zhuǎn)錄終止因子對(duì)于代謝來(lái)說(shuō)^f艮重要，它們可以是用于雙鏈RNA介導(dǎo)的抑制的有利耙。E.26S蛋白體亞基p28同源序列26S蛋白體是大的、依賴ATP的、多亞基蛋白酶，其在所有真核生物中高度保守。其在選擇性除去多種短壽命蛋白的過(guò)程中具有通用的功能，所述蛋白先是與泛素共價(jià)連接，然后被26S蛋白酶復(fù)合體降解。泛素途徑在對(duì)細(xì)胞周期的控制中有著重要的作用，所述控制通過(guò)對(duì)多種調(diào)節(jié)蛋白的特異性降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述蛋白包括有絲分裂細(xì)胞周期蛋白和對(duì)依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶的抑制劑，例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的p27。因此，對(duì)26S蛋白體合成的阻抑以及對(duì)其組成亞基合成的抑制可以是雙鏈RNA介導(dǎo)的抑制的優(yōu)選靶(Smith等人，1997)。F.保幼激素環(huán)氧化物水解酶同源序列昆蟲(chóng)保幼激素對(duì)昆蟲(chóng)生命周期中多種必要的生物學(xué)過(guò)程加以控制和調(diào)節(jié)，所述過(guò)程包括但不一定限于變態(tài)、繁殖和滯育。在合適的時(shí)候，保幼激素(JH)濃度需要在昆蟲(chóng)害蟲(chóng)幼蟲(chóng)(特別是鱗翅目和鞘翅目幼蟲(chóng))形式的血淋巴中達(dá)到峰值，然后其必須被降解，以終止激素應(yīng)答作用。降低保幼激素濃度的過(guò)程中涉及的酶通過(guò)代謝降解的兩條主要途徑發(fā)揮作用。一條途徑涉及保幼激素酯酶(JHE)，其能水解甲酯，提供相應(yīng)的酸。第二種途徑利用保幼激素環(huán)氧化物水解酶(JHEH),以獲得對(duì)環(huán)氧化物的水解，導(dǎo)致二醇形成。JHE在JH降解中的貢獻(xiàn)已被很好地了解，已發(fā)現(xiàn)，其在鱗翅目和鞘翅目物種之間是不變的。對(duì)JH酯酶的抑制與嚴(yán)重的外形變化相關(guān)，包括但不限于，幼蟲(chóng)游走(larvalwandering)、化蛹推遲以及畸形中間態(tài)的發(fā)育。相反，人們對(duì)JHEH在JH代謝中的作用了解不夠，并且，其已經(jīng)顯示出在物種之間會(huì)有變化，但是近來(lái)的研究指出了暗示JHEH可能是JH代謝的主要途徑的證據(jù)(BrandonJ.Fetterolf，DoctoralDissertation,NorthCarolinaStateUniversity(Feb.10,2002)SynthesisandAnalysisofMechanismBasedInhibitorsofJuvenileHormoneEpoxideHydrolasefromInsect7>zc/20//wwaw)。在任何時(shí)間中，用基因阻抑技術(shù)對(duì)任意JH降解途徑的干擾可以是用于雙鏈RNA介導(dǎo)的害蟲(chóng)抑制的有效靼。G.依賴溶脹(swellingdependent)的氯通道蛋白同源序列依賴溶脹的氯通道蛋白被假設(shè)為在真核動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的滲透調(diào)節(jié)中扮演關(guān)鍵角色。因此，展示出能表達(dá)下述氨基酸序列的能力的核苦酸56序列可以是用于在害蟲(chóng)中進(jìn)行RNA抑制的有用靶，所迷氨基酸序列展示出與以前鑒定出的依賴溶脹的氯通道蛋白的同源性。H.葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶蛋白同源序列葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶蛋白(G6PD)催化葡萄糖-6-磷酸氧化為6-磷酸葡萄糖酸酯，同時(shí)伴隨將煙酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸(NADP+)的氧化形式還原為NADPH。NADPH本領(lǐng)域中已知作為^艮多種真核生物合成反應(yīng)中的必需輔助因子，已知其能保持谷胱甘肽為其還原形式。被還原的谷胱甘肽在真核生物中作為危險(xiǎn)氧化代謝產(chǎn)物的清除劑發(fā)揮作用，并且，在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的協(xié)助下，將有害的過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為水(Beutler等人，1991)。因此，G6PD可以是雙鏈RNA介導(dǎo)的在鞘翅目害蟲(chóng)中的抑制的優(yōu)選靶。I.Act42A蛋白同源序列肌動(dòng)蛋白是普遍存在的、高度保守的真核生物蛋白，其是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和定位所需要的(Lovato等人，2001)。鑒定出了大量的CRWcDNA序列，它們被預(yù)測(cè)為可能編碼肌動(dòng)蛋白或者展示出與肌動(dòng)蛋白相關(guān)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)的蛋白。因此，害蟲(chóng)細(xì)胞中編碼肌動(dòng)蛋白同源物的基因可以是雙鏈RNA介導(dǎo)的抑制的有用靶。J.ADP-核糖基化因子1同源序列ADP核糖基化因子1已被展示為在細(xì)胞功能中很重要的，因?yàn)?，它們?cè)贒NA損傷修復(fù)、致癌、細(xì)胞死亡和基因組穩(wěn)定性的過(guò)程中體現(xiàn)完整的作用。因此，用雙鏈RNA介導(dǎo)的抑制，在鞘翅目害蟲(chóng)物種中選擇性地破壞ADP-核糖基化因子的轉(zhuǎn)錄，將是有用的。K.轉(zhuǎn)錄因子IIB蛋白同源序列如前文所述，轉(zhuǎn)錄延伸和翻譯終止因子對(duì)于代謝來(lái)說(shuō)非常重要，可以是雙鏈RNA介導(dǎo)的抑制的有利靶，用于控制或消除鞘翅目害蟲(chóng)的侵L.幾丁質(zhì)酶蛋白幾丁質(zhì)是N-乙酰氨基葡萄糖的P(1—4)同聚物，其被發(fā)現(xiàn)在昆蟲(chóng)外骨骼中。幾丁質(zhì)在幾丁質(zhì)合酶催化的反應(yīng)中從UDP-N-乙酰氨基葡萄糖形成。幾丁質(zhì)是結(jié)構(gòu)性的同聚多糖，在對(duì)這種高度分支和交聯(lián)的結(jié)構(gòu)的構(gòu)建中，涉及很多酶促步驟。幾丁質(zhì)給予昆蟲(chóng)形狀、硬度和支持，提供內(nèi)部器官，例如肌肉得以附著的支架。幾丁質(zhì)還被降解至一定程度，以介導(dǎo)昆蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中涉及的步驟。因此，人們相信，雙鏈RNA介導(dǎo)的、對(duì)這些途徑中蛋白的抑制，將可以作為控制鞘翅目害蟲(chóng)侵襲的手段。M.泛素綴合酶同源序列泛素途徑在對(duì)細(xì)胞周期的控制中有著重要的作用，這是通過(guò)對(duì)大量調(diào)節(jié)蛋白的特異性降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述蛋白包括有絲分裂細(xì)胞周期蛋白，和依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶的抑制劑，例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的p27。因此，編碼泛素和相關(guān)組分的基因可以是雙嗜連RNA介導(dǎo)的抑制的優(yōu)選靼(Smith等人，1997)。依賴泛素的蛋白水解途徑是真核生物中對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白選擇性破壞的主要途徑之一。泛素與底物蛋白的綴合受明顯呈多樣性的酶陣列調(diào)節(jié)。蛋白水解耙定還可在底物的泛素化和其被多亞基26S蛋白酶降解為肽之間的步驟受到調(diào)節(jié)。泛素系統(tǒng)的復(fù)雜性暗示了其對(duì)于真核細(xì)胞調(diào)節(jié)中蛋白更新的中心作用，并且牽涉到途徑中的其它蛋白，包括泛素激活酶、泛素結(jié)合酶、泛素綴合酶以及26S蛋白體亞基組分。因此，人們相信，雙鏈RNA介導(dǎo)的對(duì)該途徑蛋白的抑制將可作為控制鞘翅目害蟲(chóng)侵襲的手段使用。N.甘油醛-3-磷酸脫氬酶同源序列糖酵解途徑在大多數(shù)生物中是很重要的途徑，其涉及從葡萄糖的降解來(lái)產(chǎn)生代謝能量。在糖酵解途徑的第二階段中，一個(gè)重要的酶是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)，在存在NAD+和無(wú)機(jī);粦酸的情況下，其能催化3-磷酸甘油醛氧化為3-磷酸甘油-磷酸，隨之形成NADH。該反應(yīng)的重要組分是，能量通過(guò)NADH的形成而儲(chǔ)存。編碼與糖酵解途徑相關(guān)的酶的基因，以及特別地，編碼參與用于形成能量?jī)?chǔ)存的步驟中的酶的基因，可以成為在鞘翅目害蟲(chóng)物中進(jìn)行雙鏈RNA介導(dǎo)的抑制的特別有用的靶。O.泛素B同源序列如上所述，泛素蛋白降解途徑在對(duì)細(xì)胞周期的控制中有著重要的作用，這是通過(guò)對(duì)大量調(diào)節(jié)蛋白的特異性降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述蛋白包括有絲分裂細(xì)胞周期蛋白，或依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶的抑制劑，例如，哺乳動(dòng)物細(xì)^^的p27。因此，編碼泛素和相關(guān)組分的基因可以是用于雙鏈RNA介導(dǎo)的抑制的優(yōu)選靶(Smith等人,1997)。P.保幼激素酯酶同源物如上文所述，昆蟲(chóng)保幼激素對(duì)昆蟲(chóng)生命周期中多種必要的生物學(xué)過(guò)程加以控制和調(diào)節(jié)，其包括但不限于，變態(tài)、繁殖和滯育。使用基因抑制技術(shù)對(duì)JH合成或降解途徑的干擾可能是雙鏈RNA介導(dǎo)的害蟲(chóng)控制的有效乾。Q.a微管蛋白同源序列真核生物細(xì)胞通常利用細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)元件，它們是重要的，不僅作為機(jī)械支架，還保持細(xì)胞形狀。半柔性的微絲使得細(xì)胞能夠移動(dòng)，幫助它們?cè)谟薪z分裂(胞質(zhì)分裂)中分裂，以及，在脊推動(dòng)物和無(wú)脊推動(dòng)物中，用于肌肉收縮。相對(duì)較硬的微管由a和卩微管蛋白構(gòu)成，它們?cè)谙率鲞^(guò)程中有著重要的作用作為送遞液泡和細(xì)胞器的一套高速公路發(fā)揮作用，以及用于在有絲分裂(核分裂)期間使染色體分開(kāi)。柔性的中間絲提供了對(duì)于整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的至少額外的強(qiáng)度。還已知，細(xì)胞骨架參與跨細(xì)胞質(zhì)的信號(hào)傳遞過(guò)程?？紤]到這些功能，我們相信，對(duì)細(xì)胞骨架的任何破壞或者甚至對(duì)其完整性的微小改變都可能導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞的病理結(jié)果。R.轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)序列如上文所述，在細(xì)胞內(nèi)分選和轉(zhuǎn)運(yùn)多種分子，包括分選和轉(zhuǎn)運(yùn)到合適的細(xì)胞器，以及它們的分泌，是一種重要的生理功能。所述分選途徑可以包括依賴于轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)體分選復(fù)合物(ESCRT),即復(fù)合物i-ni的那些。因此，與多肽和其它分子的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的功能也可以是dsRNA介導(dǎo)的抑制的優(yōu)選靶。'實(shí)施例2昆蟲(chóng)喂飼生物測(cè)定對(duì)雙鏈RNA(dsRNA)樣品進(jìn)行測(cè)定，該測(cè)定釆用選定數(shù)目的靶害蟲(chóng)。從根據(jù)實(shí)施例1鑒定的序列制備dsRNA，其中使用完整重疊群序列(在SEQIDNos:l-6的情況下)，或用序列表所示引物對(duì)從組裝的重疊群擴(kuò)增的序列。根據(jù)下述程序，將不同劑量的dsRNA作為覆蓋層施用到玉米才艮蟲(chóng)人工食物上。/人CropCharacteristics,Inc.,Farmington,Minnesota獲得Z)/"6ra"c"v,/^/erav,rg,/era(WCR)的卵。在土壤中，于24°C,60%的相對(duì)濕度，完全黑暗下，對(duì)非滯育期的WCR卵進(jìn)行大約13天的培養(yǎng)。在第13天，將含有WCR卵的土壤放置到#30-#60目的篩中，使用高壓花園水管洗去土壤。通過(guò)在LYSOL中泡三分鐘對(duì)卵的表面進(jìn)行消毒，用滅菌水洗三次，用10%的福爾馬林溶液洗一次，再用滅菌水洗額外的三次。將用這種方法處理的卵分散到滅菌咖啡過(guò)濾器中，在27°C,60%的相對(duì)濕度，完全黑暗下，孵化過(guò)夜。為了制備dsRNA，將選擇的序列的擴(kuò)增子克隆到能夠在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒載體中，回收足夠量的質(zhì)粒DNA,以允許從克隆片段任意末端的包埋的趨同T7啟動(dòng)子進(jìn)行體外的T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)生雙鏈RNA，進(jìn)行生物測(cè)定；一條RNA片段包含序列表中所示的序列，另一RNA片段基本是該核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列，其中，鳥(niǎo)苷適當(dāng)?shù)厝〈剀?。用DICER或RNA酶III處理雙鏈RNA(dsRNA)的樣品，以產(chǎn)生足夠量的小干擾RNA(siRNA)。將含有siRNA或dsRNA的樣品;f隻蓋在上文描述的CRW食物測(cè)定上，按照下文使幼蟲(chóng)攝食。將雙鏈RNA樣品直接加入到含有上文指出的昆蟲(chóng)食物的每個(gè)孔中，或者在加入到昆蟲(chóng)食物之前對(duì)其進(jìn)行修飾。對(duì)雙鏈RNA的修飾按照廠商提供的針對(duì)RNA酶III(AMBIONCORPORATION,Austin,Texas)或DICER(STRATAGENE,LaJolla,California)的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。RNA酶III對(duì)雙鏈RNA的消化產(chǎn)生了二十一和二十二個(gè)核苷酸的雙鏈體，其含有5，磷酸化的末端和具有2-3個(gè)堿基突出端的3，羥基末端，類似于大約21-26個(gè)堿基對(duì)的雙鏈短干擾RNA(siRNA)片段，這是Hamilton等人(1999)和Elbashir等人(2001a)鑒定的、真核途徑中的dicer酶產(chǎn)生的。對(duì)這種收集到的短干擾RNA雙鏈體進(jìn)行進(jìn)一步純化，用聚丙烯酰胺凝月交電泳對(duì)樣品進(jìn)行分析，以測(cè)定雙鏈體形成的完整性和效率。然后在250納米的波長(zhǎng)下通過(guò)分光光度法來(lái)測(cè)定樣品的純度和數(shù)量，未使用的樣品貝i存于-20。C，用于進(jìn)一步使用?；景凑誔leau等人(2002)所述來(lái)制造昆蟲(chóng)食物，其中做出了如下改動(dòng)。將9.4克的SERVA瓊脂分散到540毫升純凈水，攪拌直至瓊脂完全分散。將水/瓊脂混合加熱至沸騰，以完全溶解瓊脂，然后傾倒進(jìn)WARING攪拌機(jī)。將攪拌機(jī)保持為低速，此時(shí)將62.7克BIO-SERVD正T混合物(F9757)、3.75克凍干的玉米根部、1.25毫升綠色食用顏料以及0.6毫升福爾馬林加入到熱的瓊脂混合物中。然后通過(guò)加入10%的氬氧化鉀貯液將混合物pH調(diào)節(jié)為9.0。在磁力攪拌熱板上，使用滅菌NALGENE涂布的磁力攪棒，以高速對(duì)大約600毫升體積的液體食物連續(xù)混合，并且將其保持為大約48。C至大約60°C,并將其分散為FALCOM96孔圓底微滴定板每個(gè)孔中的200微升等份。在滅菌的生物抽風(fēng)櫥(biohood)中使平板中的食物凝固及空氣干燥大約IO分鐘。使用連發(fā)型微量移液器，取三十(30)微升體積的試驗(yàn)樣品，其中含有不同數(shù)量的對(duì)照試劑或者雙鏈RNA，將其覆蓋到每個(gè)孔中的昆蟲(chóng)食物表面。在應(yīng)用試驗(yàn)樣品之后，昆蟲(chóng)食物被允許在滅菌的生物抽風(fēng)櫥中保持長(zhǎng)達(dá)一個(gè)半小時(shí)，以使試劑擴(kuò)散進(jìn)食物，以及允許食物表面干燥。用畫(huà)刷向每個(gè)孔中放入一只WCR新生幼蟲(chóng)。然后用MYLAR密封平板，用昆蟲(chóng)針來(lái)通風(fēng)。針對(duì)每種劑量，對(duì)12-72只昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)進(jìn)行試驗(yàn)，數(shù)量取決于試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在27匸，60%的相對(duì)濕度和完全黑暗下對(duì)生物測(cè)定平板進(jìn)4亍12-14天的溫育。在12-14天的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)每種劑量下存活幼蟲(chóng)的數(shù)量加以記錄。使用合適的微量天平，針對(duì)每只存活的幼蟲(chóng)，測(cè)定幼蟲(chóng)質(zhì)量。使用JMP4統(tǒng)計(jì)軟件(SASInstitue,1995)來(lái)分析數(shù)據(jù)，用Dunnet檢-險(xiǎn)來(lái)進(jìn)行完全階乘ANOVA,以4交之未處理對(duì)照來(lái)尋找處理的效果(PO.05)。進(jìn)行Tukey-Kramer事后(posthoc)才僉驗(yàn)，來(lái)比較所有的處理對(duì)(P<0.05)。CRW幼蟲(chóng)喂飼測(cè)定的結(jié)果顯示了相對(duì)于對(duì)照的顯著的生長(zhǎng)抑制和死亡，如下文的解釋。實(shí)施例3昆蟲(chóng)喂飼生物測(cè)定的結(jié)果通過(guò)施用采用實(shí)施例2描述的生物測(cè)定，按照實(shí)施例l的描述鑒定的雙鏈RNA序列的樣品，制備足以飼養(yǎng)玉米根蟲(chóng)幼蟲(chóng)的人工食物。典型地，使玉米根蟲(chóng)幼蟲(chóng)攝食上述食物12天，監(jiān)測(cè)相對(duì)于僅僅喂飼陰性和陽(yáng)性對(duì)照食物的根蟲(chóng)的死亡和發(fā)育遲緩。研究結(jié)果證明用含與多種不同基因類型同源的序列部分的dsRNA，產(chǎn)生顯著水平(pO.05)的幼蟲(chóng)發(fā)育遲緩和/或死亡。下表l-5顯示了產(chǎn)生顯著發(fā)育遲緩和/或死亡的序列和載體，以及表達(dá)為dsRNA的序列的相應(yīng)序列編號(hào)。表l:用南部玉米根蟲(chóng)或西部玉米根蟲(chóng)進(jìn)行的昆蟲(chóng)喂飼生物測(cè)定中證實(shí)了顯著發(fā)育遲緩和/或死亡的dsRNA構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>RNAi陽(yáng)pMON96174:001Dv.86—CG5055;推定的bazooka:CG5055直向同源物318RNAi-pMON97126:001Dv.88—CG8756;功能未知；含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域CG8756直向同源物326RNAi-pMON97130:001Dv.93—CG8515;推定的表皮結(jié)構(gòu)組分；含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域CG8515直向同源物342RNAi陽(yáng)pMON97109:001Dv.99—CG2446;未知的；在果蠅中致死并且與人具有^f氐同源性CG2446直向同源物366RNAi-pMON97111:001Dv.105—CG1250—1;GTP酶激活劑，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)CG1250直向同源物3卯RNAi-pMON97112:001Dv.105—CG1250—2;GTP酶激活劑，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)CG1250直向同源物394RNAi-pMON97107細(xì)Dv.107—CG14813;COPI液泡被膜；參與高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)CG14813直向同源物398RNAi-pMON97115:001Dv.108—CG17248;n-synaptobrevin;參與纟田胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)CG17248直向同源物402RNAi-pMON97133:001Dv.ll3;功能未知；WCR獨(dú)特序列422RNAi-pMON97121:001Dv.122—CG3164;推定的ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性CG3164直向同源物454RNAi-pMON97134:001Dv.l27;功能未知;與人不具有同源性470RNAi-pMON97171:001Dv.l46;功能未知，WCR獨(dú)特序列514RNAi-pMON97166:001Dv.147;功能未知，WCR獨(dú)特序列518RNAi-pMON97167:001Dv.l49;功能未知，WCR獨(dú)特序列526RNAi-pMON97169:001Dv.155;功能未知，WCR獨(dú)特序列550RNAi-pMON97173:001Dv.l62;功能未知，WCR獨(dú)特序列578RNAi-pMON97170駕Dv.l70;功能未知，WCR獨(dú)特序列610表2:在采用西部玉米根蟲(chóng)(WCR)幼蟲(chóng)的喂飼生物測(cè)定中導(dǎo)致顯著發(fā)育遲緩水平的dsRNA構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>RNAi-pMON96160:001Dv.74—CG6375;推定的pitchoune:CG6375直向同源物RNAi陽(yáng)pMON97137:001Dv.77—CG4214;推定的突觸融合蛋白5;參與細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)CG4214直向同源物R藍(lán)-pMON96167:001Dv.82—CG8264;推定的Bx42:CG8264直向同源物R藍(lán)-pMON96187:002Dv.85—CG4494;推定的蛋白結(jié)合活性CG4494直向同源物RNAi-pMON97126:001Dv.88—CG8756;功能未知；含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域CG8756直向同源物RNAi-pMON97130:001Dv.93—CG8515;推定的表皮結(jié)構(gòu)組分；含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域CG8515直向同源物RNAi畫(huà)pMON97111:001Dv.105—CG1250—1;GTP酶激活劑,參與細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)CG1250直向同源物RNAi-pMON97107:001Dv.107—CG14813;COPI液泡被膜；參與高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)CG14813直向同源物R藍(lán)-pMON97115:001Dv.l08一CG17248;n-synaptobrevm;參與細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)CG17248直向同源物RNAi-pMON97133:001Dv.ll3;功能未知；WCR獨(dú)特序列RNAi-pMON97121:001Dv.122—CG3164;推定的ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性CG3164直向同源物RNAi-pMON97134:001Dv.l27;功能未知；與人無(wú)同源性<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>RNAi-pMON97107:001Dvl07—CG14813;COPI液泡被膜；參與高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)CG14813直向同源物實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化和生物測(cè)定簡(jiǎn)言之，將上述編碼dsRNA構(gòu)建體的序列在5，端與由可操作連接于玉米hsp70內(nèi)含子的35S啟動(dòng)子構(gòu)成的序列相連，在3，端與NOS3，轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苦化序列相連。將該表達(dá)盒置于草苷膦選擇盒的下游。然后將這些相連的盒置于根癌土壤桿菌植物轉(zhuǎn)化功能載體，用于轉(zhuǎn)化玉米組織，使其具有草苷膦耐受性，選擇事件，轉(zhuǎn)移進(jìn)土壤。R。植抹的根被喂祠^合西部玉米才艮蟲(chóng)幼蟲(chóng)(WCR,Z)w/>ro^"w,z/era)。^j奪轉(zhuǎn)基因玉米根轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿上，其上具有含抗生素和草苷膦的MSOD培養(yǎng)基，進(jìn)行體外選擇。用細(xì)頭畫(huà)筆使每個(gè)皿中每個(gè)根受到兩只WCR幼蟲(chóng)的感染。用石蠟?zāi)?Pamfilm)密封這些皿，防止幼蟲(chóng)逃逸。試-瞼在27。C,60%的RHPercival培養(yǎng)箱中于完全黑暗下進(jìn)^f亍。對(duì)污染和幼蟲(chóng)質(zhì)量加以監(jiān)測(cè)。在喂銅根部組織六天之后，將幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到96孔板中的WCR食物中。幼蟲(chóng)被允許攝食該食物八天，使得總的測(cè)定為十四天長(zhǎng)。對(duì)幼蟲(chóng)質(zhì)量和存活加以記錄，用于分析。對(duì)幼蟲(chóng)總體數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析和Dunnett檢驗(yàn)，尋找與未轉(zhuǎn)化的陰性對(duì)照相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在兩種事件上喂銅后測(cè)量幼蟲(chóng)發(fā)育遲緩，并且與喂飼陰性對(duì)照植物的幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)進(jìn)行比較。將轉(zhuǎn)基因玉米植抹(R0)種植到含有Metromix土壤的10英寸罐中。當(dāng)植抹達(dá)到V4生長(zhǎng)階—度，使大約1000個(gè)西部玉米才艮蟲(chóng)(WCR,Z^Wto"c"wrz/era)卯侵襲進(jìn)根部區(qū)域。同樣基因型的非轉(zhuǎn)基因玉米在相似的生長(zhǎng)階段被侵襲，以用作為陰性對(duì)照。對(duì)卵進(jìn)行預(yù)孵育，使得能在侵襲的24小時(shí)內(nèi)發(fā)生孵化。幼蟲(chóng)被允許在根系攝食3周。從土壤移開(kāi)植林，對(duì)其進(jìn)行清洗，使得可針對(duì)幼蟲(chóng)進(jìn)食評(píng)估根部。使用結(jié)節(jié)損傷評(píng)分(NIS)對(duì)根部損傷加以分級(jí)，其中0表示沒(méi)有損傷，l表示根的一節(jié)短了1.5英寸以內(nèi)，2表示兩節(jié)短了，3表示3節(jié)短了。因?yàn)橛糜谠u(píng)測(cè)的植抹是轉(zhuǎn)化之后直接來(lái)自組織培養(yǎng)物的，還因?yàn)檗D(zhuǎn)化事件是獨(dú)特的，所以此時(shí)針對(duì)每種事件僅評(píng)測(cè)單抹植株，不能獲得統(tǒng)計(jì)結(jié)果。測(cè)定中的所有78植抹都展示出了幼蟲(chóng)攝食的征兆和癥狀，這表明獲得了成功的侵襲。陰性對(duì)照植林平均是中度至嚴(yán)重?fù)p傷，而轉(zhuǎn)基因植物的根提供了對(duì)幼蟲(chóng)攝食的顯著控制，結(jié)節(jié)損傷評(píng)分為大約0.2或更小。實(shí)施例5用ta-siRNA介導(dǎo)的沉默方法實(shí)現(xiàn)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)基因阻抑使植物害蟲(chóng)中的基因沉默的一種替代方法采用最近發(fā)現(xiàn)的一類反式作用小干擾RNA(ta-siRNA)(Dalmay等人，2000;Mourram等人，2000;Pemgme等人，2004;Vazquez等人，2004)。ta-siRNA是從細(xì)胞中天然存在的miRNA靼向的單鏈RNA轉(zhuǎn)錄物獲得的。使用微RNA以誘發(fā)ta-siRNA用于在植物中進(jìn)行基因沉默的方法被描述于美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/643,136(Camngton等人2004)中，其通過(guò)引用整體并入本文。鑒定出了至少一種在玉米根蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道上皮細(xì)胞中表達(dá)的害蟲(chóng)特異性miRNA。然后用該害蟲(chóng)特異性miRNA鑒定至少一種乾RNA轉(zhuǎn)錄物序列，所述序列與細(xì)胞中表達(dá)的miRNA互補(bǔ)。對(duì)應(yīng)的耙序列是不超過(guò)21個(gè)相鄰核苷酸的短序列，當(dāng)在具有功能性RNAi途徑的細(xì)胞類型中作為RNA轉(zhuǎn)錄物的一部分并且與其對(duì)應(yīng)的miRNA接觸時(shí)，所述短序列導(dǎo)致切割物介導(dǎo)的對(duì)所述轉(zhuǎn)錄物的切割。一旦鑒定出了miRNA革巴序列，將至少一種miRNA靶序列與第二條序列融合，所述第二條序列對(duì)應(yīng)于將使用該方法進(jìn)行沉默的害蟲(chóng)基因的一部分。例如，將miRNA草巴序列與SEQIDNO:l-SEQIDNO:906中的任意序列或其部分，例如玉米根蟲(chóng)液泡ATP酶(V-ATP酶)基因的序列融合。miRNA靶序列可置于V-ATP酶基因的5'端，3，端或嵌入到該基因中間。使用對(duì)應(yīng)于多種miRNA基因的多種miRNA把序列，或者在imRNA革巴序列和耙基因序列的嵌合體中多次使用同一種miRNA靶序列，可能是優(yōu)選的。靶基因序列可以是任意長(zhǎng)度的，但最小為21bp。使用任何大量合適的啟動(dòng)子或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，將miRNA耙序列耙基因序列的嵌合體表達(dá)于植物細(xì)胞中，只要在將被提供于害蟲(chóng)食物的細(xì)胞類型(例如，用于控制玉米根蟲(chóng)的玉米根部)中能發(fā)生轉(zhuǎn)錄即可。該方法可以具有額外優(yōu)點(diǎn)能將較長(zhǎng)的RNA分子送遞至草巴害蟲(chóng)。典型地，在植物中產(chǎn)生的dsRNA會(huì)被Dicer容易地加工為短RNA,當(dāng)以外源方式喂飼給一些害蟲(chóng)時(shí)，這可能無(wú)效。在該方法中，在植物細(xì)胞中產(chǎn)生單鏈轉(zhuǎn)錄物，其被害蟲(chóng)攝取，在害蟲(chóng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化為dsRNA,在細(xì)胞中，其再被加工為能對(duì)一種或多種靶害蟲(chóng)中的一種或多種基因造成轉(zhuǎn)錄后沉默的ta-siRNA。實(shí)施例6提供用于dsRNA介導(dǎo)的基因沉默的DNA序列的方法本實(shí)施例說(shuō)明了提供用于dsRNA介導(dǎo)的基因沉默的DNA序列的方法。更具體地，本實(shí)施例描述了對(duì)可用于dsRNA介導(dǎo)的基因沉默中的改進(jìn)的DNA的選擇，這是通過(guò)下迷步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)的(a)從靶基因選擇最初的DNA序列，其包括多于21個(gè)相鄰的核苷酸；(b)鑒定出至少一個(gè)更短的DNA序列，其來(lái)源于最初DNA序列的區(qū)域，由,皮預(yù)測(cè)為不產(chǎn)生不想要的多肽并且與諸如同源物/直向同源物的已知序列不具有同一性的區(qū)域構(gòu)成；以及(c)選擇用于dsRNA介導(dǎo)的基因沉默的DNA序列，其包括至少一個(gè)更短的DNA序列。不想要的多肽包括但不限于，與致敏性多肽同源的多肽以及與已知的多肽毒素同源的多肽。WCRV-ATP酶已證明能在玉米根蟲(chóng)喂飼測(cè)定中發(fā)揮作用，以檢驗(yàn)dsRNA介導(dǎo)的沉默(作為控制幼蟲(chóng)生長(zhǎng)的手段)。來(lái)自西部玉米根蟲(chóng)(WCR)(Dw/)ra〃c"czrgz/erawrgz/eraLeConte)的、液泡ATP酶基因(V-ATP酶)的cDNA序列被選出，用作為最初的DNA序列。篩選最初的DNA序列，用于鑒定以下區(qū)域在所述區(qū)域中，每一個(gè)包含至少21個(gè)核苷酸的相鄰片,殳僅與已知脊推動(dòng)物序列中21個(gè)相鄰的核苷酸中的小于21個(gè)匹配。鑒定了超過(guò)大約100個(gè)相鄰核苷酸的序列片段，其中不含所述21/21命中。因此，可以用包括片段長(zhǎng)度、GC含量、序列、基于模型生物中的相應(yīng)基因的序列或功能而預(yù)測(cè)的功能和預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)(例如Elbashir等人，2001b)可以用于選一奪和設(shè)計(jì)使用的序列。組合了這些序列片段的不同組合，用于構(gòu)建表達(dá)為dsRNA并且用于上文描述的昆蟲(chóng)喂飼生物測(cè)定中的嵌合DNA序列。實(shí)施例7用選自EST數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行的昆蟲(chóng)喂銅生物測(cè)定的其它結(jié)果本實(shí)施例說(shuō)明了發(fā)現(xiàn)作為雙鏈RNA序列在根蟲(chóng)幼蟲(chóng)侵襲時(shí)能夠有效導(dǎo)致幼蟲(chóng)發(fā)育遲緩和/或死亡的其它序列。飼養(yǎng)玉米根蟲(chóng)幼蟲(chóng)的方法、dsRNA的施用和昆蟲(chóng)生物測(cè)定如實(shí)施例1-3的描述。研究結(jié)果證實(shí)了用含有與多種不同基因類型同源的序列的部分導(dǎo)致的顯著水平(pO.05)的幼蟲(chóng)發(fā)育遲緩和/或死亡。產(chǎn)生顯著發(fā)育遲緩和/或死亡的序列和載體，以及表達(dá)為dsRNA的序列的相應(yīng)序列編號(hào)示于下表6。用于玉米轉(zhuǎn)化中的示例性二元載體pMON98503含有用于轉(zhuǎn)移到才直物細(xì)胞中的右側(cè)和左側(cè)T-DNA邊緣之間的以下元件e35S-HSP70-DV49(反義方向)-通用間隔基DV49(有義方向)-hspl7;ACT(啟動(dòng)子和內(nèi)含子)-CTP2運(yùn)輸信號(hào)-CP4-NOS。用于玉米轉(zhuǎn)化中的另一種示例性二元載體pMON98504含有位于右側(cè)和左側(cè)邊緣之間的以下元件e35S-HSP70-Cl(反義方向)-通用間隔基C1(有義方向)-hspl7;ACT(啟動(dòng)子和內(nèi)含子)-CTP2運(yùn)輸信號(hào)-CP4-NOS。表6:用南部玉米根蟲(chóng)或西部玉米根蟲(chóng)進(jìn)行的昆蟲(chóng)喂銅生物測(cè)定中證實(shí)了顯著發(fā)育遲緩和/或死亡的其它dsRNA構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>如下進(jìn)行效力測(cè)試，其中利用玉米植物的后代，所述玉米植物是用選定的昆蟲(chóng)控制構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的1.種植后7天25°C,60。/。RH下在完全黑暗的條件下針對(duì)每個(gè)事件溫育10,000個(gè)WCR卵(每個(gè)事件10個(gè)植林)，溫育7天。2.侵襲后14天將植抹從4"泥罐移植到8"罐中；可以取v4根尖樣品進(jìn)行基因表達(dá)研究。3.種植后14天將WCR卵從土壤中洗出。將卵和土壤置于60目的篩子中，并且將一個(gè)30目的篩子放置在60目的篩子上面，以保護(hù)卯防止水流。采用噴嘴用溫水徹底沖洗，直到除去土壤。4.將卵懸浮于2。/。(w/v)Difco瓊脂溶液中，每lml卵25mL溶液。采用例如Eppendorf連發(fā)型微量移液器，以約3或4等分，將卵侵襲到土壤中，每個(gè)植抹約1000個(gè)卵。在侵襲前用壓舌板在土壤中挖洞，侵襲后蓋上。5.種植后28天，可以取出v8根尖樣品進(jìn)行基因表達(dá)研究。6.種植后35天，評(píng)估該測(cè)定。用修枝剪切斷植抹，留下約6"莖。在含有事件信息的植株樁上打洞，打結(jié)(ziptied)到莖。從根系除去盡可能多的土壤。用噴水管洗去其余的土壤。7.檢查根，用WCR幼蟲(chóng)損害的Olsen(0-3)NIS標(biāo)準(zhǔn)對(duì)根損害分級(jí)。圖l和圖2說(shuō)明用WCR/f曼襲Fl玉米植物(來(lái)源于用pMON98503或pMON98504轉(zhuǎn)化的植物)后獲得的昆蟲(chóng)控制結(jié)果。在基本按上文所述進(jìn)行的生長(zhǎng)室效力測(cè)試中，在用pMON98503或pMON98504轉(zhuǎn)化得到的事件的后代中觀察到了等于或低于經(jīng)濟(jì)損害閾值的NIS評(píng)分。對(duì)實(shí)施例3和7描述的展示顯著抗西部玉米根蟲(chóng)活性的選定基因組裝全長(zhǎng)ESTDNA序列。這些EST序列列于表7:表7:針對(duì)WCR靶組裝的EST序列組裝的序列SEQIDNODv9全長(zhǎng)(akaApple);推定的CG2331直向同源物813DvlO全長(zhǎng)(Rpl9);推定的CG6141直向同源物814Dvll全長(zhǎng)(Rpll9);推定的CG2746直向同源物815Dvl3全長(zhǎng)(Rps4);推定的CG11276直向同源物816Dv35全長(zhǎng)v-ATP酶A;CG3762直向同源物817CG8055的Dv49全長(zhǎng)直向同源物818CG6699的Dv248全長(zhǎng)推定直向同源物819實(shí)施例8Dv49和Dv248序列的制備和效力結(jié)果型、片段長(zhǎng)度、GC含量、與已知序列的相似性和預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如Elbashir等人，2001b)的標(biāo)準(zhǔn)，選擇組裝的EST以及Dv49(SEQIDNO:818)和Dv248(SEQIDNO:819)的相鄰序列的部分進(jìn)行進(jìn)一步生物活性測(cè)定。基于單獨(dú)抗WCR的預(yù)測(cè)活性，體外合成各個(gè)Dv49和Dv248序列，并iU要照?qǐng)D3-4和表8所示分組，并且施用于WCR幼蟲(chóng)。表8:針對(duì)抗WCR效力組裝的Dv49和Dv248片段<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>片段Fl-F3相應(yīng)于全長(zhǎng)Dv49轉(zhuǎn)錄物的部分。片段F4-F6相應(yīng)于Dv248轉(zhuǎn)錄物的部分或側(cè)翼區(qū)。片段F7-F13是片段F"F6中的兩個(gè)或更多個(gè)片段的串聯(lián)體，如圖4所示。片段F13(SEQIDNO:834)代表C38(Dv49-Dv248)串聯(lián)體。Fl-F13的劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)如圖5-7所示。如圖5所示，當(dāng)以0.1ppm喂飼給WCR幼蟲(chóng)時(shí)，片段F4-F6,包括來(lái)源于Dv248的序列(圖4)的活性(幼蟲(chóng)死亡％),顯著高于對(duì)照。當(dāng)以0.02ppm喂飼時(shí)，片段F6也展示顯著活性。在最低劑量下的片段F5的活性可能是偽跡，因?yàn)榇婊畹挠紫x(chóng)沒(méi)有展示發(fā)育遲緩。如圖6所示，當(dāng)以O(shè).lppm喂祠WCR幼蟲(chóng)時(shí)，F(xiàn)7-F10的每個(gè)片段都展示了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的活性。當(dāng)以0.02ppm喂飼WCR幼蟲(chóng)時(shí)，片段F9和F10也展示了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的活性，當(dāng)以O(shè).Olppm喂飼WCR幼蟲(chóng)時(shí)，片段FIO也展示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的活性。0.01ppm時(shí)的F8活性可能是偽跡。如圖7所示，當(dāng)以0.02ppm或更高濃度喂飼WCR幼蟲(chóng)時(shí)，片段Fll-F13展示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的活性。此外，最大的片段(F12和F13)在0.005卯m和更高的濃度顯示活性。實(shí)施例9來(lái)源于串聯(lián)體C6的其它活性串聯(lián)體序列如表9所示，在食物覆蓋生物測(cè)定中(按照例如實(shí)施例2進(jìn)行)鑒定了來(lái)源于pMON98368的活性串聯(lián)體C6(SEQIDNO:806)的部分能夠抑制玉米根蟲(chóng)(WCR)生長(zhǎng)和/或存活。C6全長(zhǎng)串聯(lián)體含有7個(gè)粑亞片段，每個(gè)長(zhǎng)度是70bp,如表6和表9所示。表9全長(zhǎng)C6串聯(lián)體和選定的亞部分(SEQIDNOs:806,847-873)在根蟲(chóng)食物生物測(cè)定中的,支力<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>全長(zhǎng)串聯(lián)體C7含有8個(gè)革巴亞片段，每個(gè)亞片段長(zhǎng)度是70bp,如表6所示。類似地，全長(zhǎng)串聯(lián)體(:12含有從0￥23-0￥13-0￥26-0￥18-0￥49-Dv22-Dv20的7個(gè)靶亞片段，長(zhǎng)度是53-80bp,如表6和表10所示。表IO全長(zhǎng)C12串聯(lián)體和選定的亞片段(SEQIDN0s:811,887-892)的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>表ll:其它鞘翅目靶序列<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>才艮據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，可以制備和實(shí)施本文公開(kāi)和要求保護(hù)的所有組合物和方法，而不需要過(guò)度實(shí)驗(yàn)。盡管已經(jīng)根據(jù)上述示例性實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明確，在不背離本發(fā)明的真實(shí)概念、精神和范圍的前提下，可以對(duì)本文描述的組合物、方法和步驟或方法的步驟的順序進(jìn)行變化、改變、1"奮飾和變更。更具體地，可以明確，某些化學(xué)和生理相關(guān)的試劑可以取代本文描述的試劑，而能夠獲得相同或相似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明確的所有這些相似的取代和修飾都認(rèn)為包含在所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。參考文獻(xiàn)以下文獻(xiàn)，只要它們提供了補(bǔ)充本文所述內(nèi)容的示例性程序或其它細(xì)節(jié)，就特別通過(guò)引用結(jié)合到本文中。美國(guó)專利4,245,432;美國(guó)專利4,272,417;美國(guó)專利4,339,456;美國(guó)專利4,372,080;美國(guó)專利4,383，391;美國(guó)專利4,465,017;美國(guó)專利4,536,475;美國(guó)專利4，634,587;美國(guó)專利4,693,977;美國(guó)專利4,735,015;美國(guó)專利4,759,945;美國(guó)專利4,876，197;美國(guó)專利4,880，734;美國(guó)專利4，886，937;美國(guó)專利4,959,317;美國(guó)專利5,080,925;美國(guó)專利5,107,065;美國(guó)專利5,107,787;美國(guó)專利5,231,020;美國(guó)專利5,283,184;美國(guó)專利5,300,127;美國(guó)專利5,302,523;美國(guó)專利5,328,942;美國(guó)專利5,384,253;美國(guó)專利5,389，399;美國(guó)專利5,464,765;美國(guó)專利5,501,967;美國(guó)專利5,527,695;美國(guó)專利5,538,877;美國(guó)專利5,538,880;美國(guó)專利5,550,318;;美國(guó)專利5,554,445;美國(guó)專利5,563,055;美國(guó)專利5,580,544;美國(guó)專利5,591,616;美國(guó)專利5,593,874;美國(guó)專利5,622，003;美國(guó)專利5,633,435;美國(guó)專利5,661,103;美國(guó)專利5,698,425;美國(guó)專利5,712,135;美國(guó)專利5,759,829;美國(guó)專利5,780,708;美國(guó)專利5,789,214;美國(guó)專利5,791,084;美國(guó)專利5,804,693;美國(guó)專利5,834,447;美國(guó)專利5,837,848;美國(guó)專利5,849,320;美國(guó)專利5,876,739;美國(guó)專利5，882，713;美國(guó)專利5,891,246;美國(guó)專利5,918,413;美國(guó)專利5,939,356;美國(guó)專利6，118,047;美國(guó)專利6,326,193;美國(guó)專利6，489,542;美國(guó)專利6,506,559;美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/205,189;美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/465,800;美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/643,136美國(guó)專利申請(qǐng)開(kāi)號(hào)2002/0048814;美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2002/0048814;美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0018993;;美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2003/0061626;美國(guó)專利申請(qǐng)7>開(kāi)號(hào)2003/0150017;美國(guó)專利申請(qǐng)7>開(kāi)號(hào)2003/0175965;美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2004/0029283;Altschul"a/.,乂Mo/.Bw/.,215:403-410,1990.AusubelW"/.,Cw/re"/尸ro/oco/sz力Mo/ecw/arBzo/ogy,John,Wiley&Sons,Inc,NewYork,1998.Babst"a/.，Dev.Ce〃'3:271-282,2002.Beutler"a/.,M乂Md，324(19):1370,1991.BevanWa/.,iV^wre，304:184-187,1983.Botstein8(1):17-24,1979.Brake"a/"尸roc.淑/.Xcad81(15):4642-4646,1984.BrutlagW"/"G9/w戸/e/^CV綴/.敗少，17:203-207,1993.CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel"(Eds.),GreenePublishingandWiley-Interscience,NY,1989.DalmayCe〃，101:543-553，2000.Dellaporta"a/.，CVzrawc^swweSVrw"wre/ot戸c/1o/iVewCo膨盧，l她StadlerGeneticsSymposium,11:263-282,1988.Dowa/.,￡;cp.Bw/.,200(Pt2):237-245,1997.Dow,丄Bz函，Z)r,31(l):75-83,1999.Elbashira/.，Ge薦Z)ev.，5(2):188-200,2001a.ElbashirWa/.,￡A/5(920:6877-6888,2001b.Elbashir"a/.，M"o&,26:199-213,2002.歐洲申請(qǐng)0120516歐洲申請(qǐng)0122791歐洲申請(qǐng)0127,328HamiltonandBaulcombe,S"墜e，286(5441):950陽(yáng)952,1999.Harnione,"/.，《/,Mo/.TVewroy".,18(l-2):15-27,2002.Haymes"a/.,In:7Vwc/e/ca".(i/2j^rW::加'0w,"/rac/7c"/"，ra"c/,IRLPress,Washington,DC,1985.Herrera-EstrellaWa/.,A^m^e,303:209-213,1983.Ikatu"fl/.,飾Te由o/.，8:241-242,1990.Jefferson"a/.，E雄(9丄，6:3901-3907,1987a.JeffersonWa/.，尸/a^A^fo/.Sw/,i^/.,5:387-405，1987b.Kaeppler"a/.，P/滅Ce〃，8:415418,1990.Katz"a/,,/G饑M蹈固.，129:2703-2714,1983.KennerdellandCarthew,Ce〃，95:1017-1026,1998.KennerdellandCarthew,淑S她c/脂/.,18:896-898,2000.Kleea/.,Bw-rec/wo/ogy,3(7):637-642，1985.Lovato/騰"M。/.說(shuō)o/.，10(4):333-340,2001.Lu"a/.，尸一oc/z麵,，53(8):941-946,2000.Mou訓(xùn)n"a/.，Ce〃，101:533,2000.Myanohara""/.，尸roc.胸/.JedS".園，80(l):l-5,1983.delle"/.,淑臟，313:810-812，1985.Ogas尸roc.Ato/.爿cac/.96(24):13839-13844,1999.Omirulleha/.,尸/am1Jkfo/.Szo/.,21(3):415-428,1993.rr-Weaver"a/.，尸roc.Ato/.Jc"dS".80(14):4417-4421,1983.PCT申請(qǐng)WO97/32016PCT申請(qǐng)WO99/53050PCT申請(qǐng)WO99/49029PCT申請(qǐng)WO94/01550PCT申請(qǐng)WO98/05770Peragine"a/，Ge腦Z)ev.，18(19):2368-2379,2004.Pleau"a/"五"/歸o/.￡x/7.j///.105:1-11,2002.Pontiusa/.，In:6^m.Gewe:jvwwo//7ze/r(mycnWcwe.NCBIhandbook.NationalCenterforBiotechnologyInformation,Bethesda,MD,2003.Potrykus"a/,，M/,G饑Ge威，199(2):169-177，1985.Rajagopal".a/.,丄Bzo/.C/zem.,277:46849-46851，2002.Rme胸/.JcW.80(22):6750隱6754.1983.SambrookWa/.,In:Mo/ecw/arc/om'wg.'a/a6on^orymawwa/，2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989.SchnepfWa/.，A/,c'/yZ>,o/.A/o/.Sw/.^￡v.，62(3):775-806,1998.SmithCe〃Dev.33:75-79;1997.Stmchcomb"a/.'丄A/o/.158(2):157陽(yáng)190,1982.SutchffeWa/.，Ato/.」caJ.Scz.75:3737-3741，1978.Tabaraef"/.,S"ewce,282(5388):430畫(huà)431,1998.Tabashmk,^t//.￡Vmra".A^cra^o/"58(10):3343-3346,1992.VanHeekeandSchuster,腸/.C7認(rèn)，264(33):19475-19477,1989.VazquezWa/,A^fo/.Ce〃，16(l):69-79,2004.YadavMo/ec.Z/oc/zem.PanxvzYo/.,doi:10.1016/丄molbiopara.2006.03.013;inpress,2006.Zukowsky""/.,尸rac淑/.血m/.S"./7&4,80:1101-]105,1983.9權(quán)利要求1.一種分離的多核苷酸，選自下組(a)包含SEQIDNO1-SEQIDNO906的核酸序列的多核苷酸；(b)在5XSSC，50％甲酰胺和42℃下10分鐘的洗滌條件下與SEQIDNO1-SEQIDNO906的核酸序列雜交的多核苷酸；(c)包含與SEQIDNO1-SEQIDNO906的核酸序列的至少70％序列同一性的多核苷酸；(d)SEQIDNO1-SEQIDNO906的核酸序列的至少21個(gè)相鄰核苷酸的片段，其中鞘翅目植物害蟲(chóng)攝入包含與所述片段互補(bǔ)的至少一條鏈的雙鏈核糖核苷酸序列，抑制所述害蟲(chóng)的生長(zhǎng)；和(e)上述(a)、(b)、(c)或(d)的序列的互補(bǔ)序列。2.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，選自SEQIDNO:697、SEQIDNOs:813畫(huà)819、SEQIDNO:841和SEQIDNO:874。3.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其與異源啟動(dòng)子可操作地連接。4.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其包含在植物轉(zhuǎn)化載體上。5.由權(quán)利要求1的多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生的雙鏈核糖核苷酸序列，其中鞘翅目植物害蟲(chóng)攝入所述核糖核苷酸序列，抑制所述害蟲(chóng)的生長(zhǎng)。6.權(quán)利要求5的雙鏈核糖核苷酸序列，通過(guò)制備包含第一、第二和第三多核苷酸序列的重組多核苷酸序列產(chǎn)生，其中所述第一多核苷酸序列包含權(quán)利要求l的分離的多核苷酸，其中第三多核苷酸序列通過(guò)第二多核苷酸序列與第一多核苷酸序列連接，并且其中第三多核苷酸序列基本是笫一多核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列，使得當(dāng)轉(zhuǎn)錄為核糖核酸時(shí)，所述第一和第三多核苷酸序列雜交，形成由連接的第二核糖核苷酸序列穩(wěn)定^:的雙一逸核糖核苦酸序列。7.權(quán)利要求5的雙鏈核糖核苷酸序列，其中害蟲(chóng)攝入多核苷酸序列，抑制與所述多核苷酸序列基本互補(bǔ)的核苦酸序列的表達(dá)。8.用權(quán)利要求l的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。9.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其是原核細(xì)胞。10.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其是真核細(xì)胞。11.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其是植物或細(xì)菌細(xì)胞。12.用權(quán)利要求1的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。13.權(quán)利要求12的植物的種子，其中所述種子包含多核苦酸。14.用權(quán)利要求2的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。15.權(quán)利要求12的植物，其中所述多核苷酸在植物細(xì)胞中表達(dá)為雙鏈核糖核苷酸序列，并且，攝入存在于食物中的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)抑制量的所述雙鏈核糖核苷酸序列，抑制害蟲(chóng)進(jìn)一步攝食所述食物。16.權(quán)利要求15的植物，其中所述昆蟲(chóng)害蟲(chóng)選自Z^"6ra〃caWrgz/em、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>Z)勵(lì)廠ohca謝dec/w/7朋c加(2。17.權(quán)利要求15的植物，其中攝入昆蟲(chóng)害蟲(chóng)抑制量的雙鏈核糖核苷酸序列，使害蟲(chóng)生長(zhǎng)停止。18.從權(quán)利要求12的植物生產(chǎn)的農(nóng)產(chǎn)品制品，其中所述農(nóng)產(chǎn)品制品包含可檢測(cè)量的權(quán)利要求1的多核苷酸或由其表達(dá)的核糖核苦酸。19.控制鞘翅目害蟲(chóng)侵襲的方法，包括在鞘翅目害蟲(chóng)的食物中提供一種試劑，該試劑包含第一多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在害蟲(chóng)攝入后起作用，抑制所述害蟲(chóng)內(nèi)的生物功能，其中所述多核苷酸序列沿至少約19-約25個(gè)相鄰核苷酸與來(lái)源于所述害蟲(chóng)的編碼序列具有約95%-約100%的核苷酸序列同一性，并且雜交于與所述第一多核普酸序列互補(bǔ)的第二多核苷酸序列，并且其中來(lái)源于所述害蟲(chóng)的所述編碼序列選自SEQIDNO:l—SEQIDNO:906及其互補(bǔ)序列。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述鞘翅目害蟲(chóng)是葉曱物種，選自Z)za6ra/7'caW，yfera、Z)/a6ro/7cflv/rg(/5rawgz/era、Z)勵(lì)ro"'caWrgi/fera21.控制鞘翅目害蟲(chóng)侵襲的方法，包括在鞘翅目害蟲(chóng)的食物中提供表達(dá)權(quán)利要求l的多核苷酸序列的植物細(xì)胞，其中表達(dá)所述多核苷酸，產(chǎn)生雙鏈核糖核苦酸，其在害蟲(chóng)攝入后起作用，抑制靶序列在所述害蟲(chóng)中表達(dá)，并且導(dǎo)致相對(duì)于缺乏所述植物細(xì)胞的食物，害蟲(chóng)對(duì)所述食物的攝食減少。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述害蟲(chóng)在攝入細(xì)胞后生長(zhǎng)減少。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述植物細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼選自下組的殺蟲(chóng)劑的多核苷酸序列馬鈴薯塊莖儲(chǔ)藏蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白、致病桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白、光桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白、側(cè)孢芽孢桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白和球形芽孢桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白選自Cryl、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、二元?dú)⒗ハx(chóng)蛋白CryET33和CryET34、二元?dú)⒗ハx(chóng)蛋白CryET80和CryET76、二元?dú)⒗ハx(chóng)蛋白TIC100和TICIOI、殺昆蟲(chóng)蛋白ET29或ET37與殺昆蟲(chóng)蛋白TIC810或TIC812的組合，以及二元?dú)⒗ハx(chóng)蛋白PS149B1。25.權(quán)利要求21的方法，其中所述靼序列編碼蛋白，所述蛋白的預(yù)測(cè)功能選自肌肉形成、保幼激素的形成、保幼激素的調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)、消化酶合成、細(xì)胞膜電位保持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素傳感、觸角形成、翅膀形成、腿形成、發(fā)育和分化、卵形成、幼蟲(chóng)成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴的保持、神經(jīng)傳遞、細(xì)胞分裂、能量代謝、呼吸，以及凋亡。26.權(quán)利要求21的方法，其中所述鞘翅目害蟲(chóng)是葉甲物種，選自Wa6ro".cawgz/era、D勵(lì);-o"'cavz'rg〖/eravzrgz/era'Dz.(3/)TO"cawrgz/era27.權(quán)利要求21的方法，其中害蟲(chóng)攝入后所述多核苷酸起作用，阻抑行使昆蟲(chóng)存活所必須的功能的基因，所述功能選自害蟲(chóng)攝食、害蟲(chóng)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化和發(fā)育、有性繁殖能力或需要、肌肉形成、肌肉顫搐、肌肉收縮、保幼激素的形成、保幼激素的調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞膜電位的保持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素傳感、觸角形成、翅膀形成、腿形成、卵形成、幼蟲(chóng)成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴的保持、神經(jīng)傳遞、幼蟲(chóng)階段轉(zhuǎn)變、化蛹、破蛹、細(xì)胞分裂、能量代謝、呼吸和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的形成。28.改進(jìn)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)侵襲的農(nóng)作物植物產(chǎn)生的農(nóng)作物產(chǎn)量的方法，所述方法包括以下步驟a)將權(quán)利要求1的多核苷酸引入所述農(nóng)作物植物，b)培養(yǎng)所述農(nóng)作物植物，使所述多核苦酸表達(dá)，其中所述多核苷酸的表達(dá)抑制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)攝食和由于害蟲(chóng)侵襲導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生RNA分子，所述RNA分子至少阻抑?jǐn)z入所述農(nóng)作物植物的部分的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中的第一靶基因，其中所述靶基因行使選自下組的至少一種必須功能害蟲(chóng)攝食、害蟲(chóng)存活力、害蟲(chóng)細(xì)胞凋亡、害蟲(chóng)或任何害蟲(chóng)細(xì)胞的分化和發(fā)育、害蟲(chóng)的有性繁殖、肌肉形成、肌肉顫搐、肌肉收縮、保幼激素的形成和/或減少、保幼激素的調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞膜電位的保持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素傳感、觸角形成、翅膀形成、腿形成、卵形成、幼蟲(chóng)成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴保持、神經(jīng)傳遞、幼蟲(chóng)階段轉(zhuǎn)變、化蛹、破蛹、細(xì)胞分裂、能量代謝、呼吸、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)合成和保持、核苷酸代謝、氮代謝、水利用、水保持，以及感覺(jué)感知。30.權(quán)利要求28的方法，其中所述昆蟲(chóng)害蟲(chóng)是選自下組的玉米根蟲(chóng)害蟲(chóng)Z)z"Z)n9/icaww(ie"'w/wwctoto/2(9warti/(南邵玉米才艮蟲(chóng)(SCR))、D&6to〃c"wrgz/eravz.rgz/era(西鄰玉米才艮蟲(chóng)(WCR))、Dw6to〃.C(26ar6en'(北部玉米根蟲(chóng)(NCR))、D,^w"cawrg(/era"a(墨西哥玉米才艮蟲(chóng)(MCR))、Z)/"6n9〃ca6<2//e<2to(巴西玉米才艮蟲(chóng)(BZR))、Z)/aZ)ra"c'awWc/w/"(巴西玉米根蟲(chóng)(BZR))和Z)w6ra"ca5/e"a^(巴西玉米根蟲(chóng)(BZR》。31.改進(jìn)由昆蟲(chóng)害蟲(chóng)侵襲的農(nóng)作物植物產(chǎn)生的農(nóng)作物的干旱耐受性的方法，所述方法包括以下步驟a)將權(quán)利要求1的多核苷酸引入所述農(nóng)作物植物，b)培養(yǎng)所述農(nóng)作物植物，使所述多核苷酸表達(dá)，其中所述多核苷酸的表達(dá)抑制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)攝食以及由于害蟲(chóng)侵襲導(dǎo)致的干旱耐受性降低。32.生產(chǎn)農(nóng)產(chǎn)品制品的方法，包括獲得權(quán)利要求12的植物或其部分，并且從所述植物或其部分制備農(nóng)產(chǎn)品制品。33.生產(chǎn)食品或飼料的方法，包括獲得權(quán)利要求12的植物或其部分，并且從所述植物或其部分制備食品或祠料。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述食品或飼料是油、粗粉、蛋白、淀粉、細(xì)粉或青貯飼料。全文摘要本發(fā)明涉及通過(guò)抑制一種或多種生物功能來(lái)控制害蟲(chóng)侵襲。本發(fā)明提供了用于所述控制的方法和組合物，這是通過(guò)將一種或多種本發(fā)明提供的重組雙鏈RNA分子喂飼給害蟲(chóng)，通過(guò)對(duì)基因表達(dá)的阻抑獲得害蟲(chóng)侵襲的減少來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還涉及制造表達(dá)雙鏈RNA分子的轉(zhuǎn)基因植物的方法，以及用于保護(hù)植物抵擋害蟲(chóng)侵襲的轉(zhuǎn)基因殺蟲(chóng)劑的特定組合。文檔編號(hào)C07K14/435GK101310020SQ200680042881公開(kāi)日2008年11月19日申請(qǐng)日期2006年9月15日優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日發(fā)明者C·A·卡亞科布,G·R·赫克,G·普萊丁克,I·努倫,J·A·鮑姆,P·費(fèi)爾德曼,T·T·沃恩,W·馬德萊因申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司