專利名稱：：使用扭轉(zhuǎn)嵌入核酸(TINA)穩(wěn)定并選擇性地形成Hoogsteen型三鏈體和雙鏈體以及制備...的制作方法使用扭轉(zhuǎn)嵌入核酸(TINA)穩(wěn)定并選擇性地形成Hoogsteen型三鏈體和雙鏈體以及制備TINA的工藝發(fā)明概述本發(fā)明涉及寡聚核苷酸和被修飾的寡聚核苷酸領(lǐng)域，其中所述寡聚核苦酸和被修飾的寡聚核苷酸具有改進(jìn)的性能，例如形成三鏈體鏈的能力以及對-險測、診斷和/或治療的適合性。特別地，本發(fā)明提供了新型的柔性堿基堆積的單體，其能夠被摻入到寡聚核苷酸中提供形成三鏈體的寡聚核苷酸(TFO),其中所述TFO能夠序列特異性地與目標(biāo)雙鏈或單鏈核酸結(jié)合，以形成具有非常高熱穩(wěn)定性的三鏈螺的應(yīng)用。發(fā)明背景WO2005083084描述了嵌入劑假核苦酸(pseudonucleotide)，其能夠被摻入到寡聚核苷酸或寡聚核苷酸類似物的主鏈中。包含所述嵌入劑假核苷酸的寡聚核苷酸具有降低的形成三鏈體的能力，但具有區(qū)分DNA和RNA的能力，即它們與DNA形成的復(fù)合物比與RNA形成的復(fù)合物更穩(wěn)定。Malakhov等人，2004/2004,1298-1307)公開了用于摻入到寡聚核苷酸或寡聚核苷酸中的單體。該研究的目的是提供一種天然堿基即泛宿主性堿基(promiscuousbase),其適合形成與所有天然存在的堿基相反的Watson-Crick螺旋。還沒有關(guān)于形成三鏈體的研究被報道。雙鏈DNA(dsDNA)的序列特異性識別是分子生物學(xué)、治療學(xué)和生物納米技術(shù)中基于寡聚核苷酸的工具的開發(fā)中吸引相當(dāng)大興趣的主題。如果單鏈的形成三鏈體的寡聚核苷酸(TFO)通過特異性大溝相互作用與dsDNA結(jié)合，則形成三螺旋，逸已經(jīng)成為用于基因耙向的深入研究的課題。這種途徑能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制、基因敲除和對以突變的或者重組的基因為目標(biāo)的基因組DNA進(jìn)行序列選擇性的治療。TFO第三鏈與其目標(biāo)的親和力通常是有問題的，因為它們需要識別dsDNA的同型。票呤序列，以及在相匹配的(嘧咬)結(jié)合基序中在生理條件下不能令人滿意地形成pH敏感C+G-CHoogsteen堿基三鏈體。在過去的幾十年中，已經(jīng)進(jìn)行許多努力以修飾TFO,用于提高與它們的目標(biāo)的結(jié)合親和力，同時改進(jìn)對三鏈體核酸堿基的設(shè)計，其能夠減少dsDNA序列的限制。具有被修飾核酸的寡聚核苷酸例如，能夠誘導(dǎo)提高的結(jié)合親和力的肽核酸(PNA)、鎖定核酸(lockednucleicacid，LNA)、2，-氨乙基-寡聚核糖核香酸(2，-AE-RNA)和N3，々P5，氨基磷酸酯(phosphoramidate)屬于最成功的被化學(xué)修飾的TFO。通過向含有所有三種寡聚核苦酸序列的水溶液加入雜環(huán)化合物(嵌入劑)(有時具有帶正電的側(cè)鏈)也能夠觀察到三鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化。已經(jīng)顯示，共價連接到TFO的3，-或5，-末端的嵌入劑導(dǎo)致了平行三鏈體在+3.0"c+i6.rc范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性，這依賴于連接體的長度和嵌入劑的類型。然而，對于被插入到TFO中部作為凸起的共價附著的嵌入劑已經(jīng)有一定的關(guān)注。這種設(shè)計具有多種優(yōu)點。首先，與合成至少四種核苷酸單體需要糖修飾的核酸相比，只需要合成一種嵌入的假核苷酸亞磷酰胺(phosphoramidite)。第二，與單一插入相比，嵌入劑單體的幾個凸起插入能夠大大地提高雙鏈體和三鏈體的穩(wěn)定性。而且，Watson-Crick和Hoogsteen結(jié)合模式之間的結(jié)構(gòu)差別以及DNA和RNA中2，-OH的缺乏和存在能夠引起各種螺旋類型的不同性能。因此，預(yù)期連接體的凸起插入以及由嵌入劑分裂螺旋以導(dǎo)致用于適當(dāng)選擇的螺旋的獨特性能。這已經(jīng)得到了能夠區(qū)分不同類型單鏈核酸的化學(xué)修飾的寡聚核苷酸。發(fā)明的詳細(xì)描述將(A)-1-C44-(l-芘基乙炔基)苯基曱基]甘油凸起插入到同型嘧啶寡聚脫氧核苷酸(扭轉(zhuǎn)嵌入核酸，TINA)的中部導(dǎo)致Hoogsteen型三鏈體和雙鏈體相當(dāng)高的熱穩(wěn)定性，而相同核香酸內(nèi)容物的Watson-Crick型雙鏈體被去穩(wěn)定化，其中同型嘧啶寡聚脫氧核苷酸是通過合成后Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)獲得的。一方面，本發(fā)明提供了具有下列通用結(jié)構(gòu)的柔性堿基堆積的單體X—L-I,—C-l2其中，X是主鏈單體單元，其能夠被摻入到寡聚核苷酸或寡聚核苦酸類似物或PNA或PNA類似物的主鏈中；L是連接體；I,是第一嵌入劑，其含有至少一種基本平面(flat)的共軛體系，其能夠與DNA、RNA或它們的類似物的核酸堿基(nucleobase)共堆積；C是共軛劑(conjugator);12是第二嵌入劑，其含有至少一種基本平面的共軛體系，其能夠與DNA、RNA或它們的類似物的核酸-咸基共堆積。柔性堿基堆積的單體由至少兩個嵌入體系^和I2構(gòu)成，其中1,和12被通過共軛劑C連接，共軛劑C提供了必要的結(jié)構(gòu)剛性和扭結(jié)柔性(twistingflexibility)。后者被認(rèn)為對于幫助嵌入劑調(diào)節(jié)自身到核酸螺旋內(nèi)部適當(dāng)?shù)奈恢檬侵匾?。在?yōu)選的實施方式中，主鏈X能夠被摻入到下列寡聚核香酸中DNA、RNA、HNA、畫A、ANA、LNA、CAN、INA、CeNA、TNA、(2，-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、卩-D-核糖-LNA、卩-D-木糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-氨基-雙環(huán)-DNA、5-表-雙環(huán)-DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、(3-D-核糖吡喃基-NA、a-L-來蘇糖吡喃基-NA、2，-R-RNA、2,-0R-RNA、2，-AE-RNA、a-L-RNA、(3-D-RNA及它們的組合和修飾。核酸及其類似物提供了能夠通過Watson-Crick或Hoogsteen或反式Hoogsteen堿基配對與互補(bǔ)核酸結(jié)合的寡聚核苦酸。在這些序列的3，-末端和/或5，-末端和/或中部可以引入X。被修飾的核酸堿基、烴、肽鏈、磁珠、瓊脂糖珠、瓊脂糖凝膠珠、玻璃、塑料表面、重金屬和芯片表面被認(rèn)為用作對核酸的額外修飾。在另一種實施方式中，主鏈單體單元X包括亞烷基二醇基(alkylendiol)例如乙二醇基或者l-O-亞甲基丙三醇(l-O-methyleneglycerol)，其可選擇地具有部分包含在環(huán)體系中的亞烷基二醇基(alkylendiol)，例如糖基(glycon)。例如，主鏈單體X可以是四元環(huán)、五元環(huán)或六元環(huán)的一部分，其最終具有選自氮、硫、磷和氧的雜原子。在一種實施方式中，柔性堿基堆積的單體的連接體L包含060個原子。在另一種實施方式中，L含有鏈或環(huán)或它們的組合和/或它們的取代物。在另一種實施方式中，L含有烷基鏈或氧雜烷基鏈或者氮雜烷基鏈或硫代烷基或羧酰胺基或硫代羧酰胺基或者磺酰胺基或它們的組合。X和L的組合提供了將嵌入體系I!-C-l2置于核酸螺旋中心的體系，其能夠與核酸堿基堆積。本發(fā)明柔性堿基堆積的單體的I,是第一嵌入劑，其包含至少一種基本平面的共軛體系，其能夠與DNA、RNA或它們的類似物的核酸石咸基共堆積。在優(yōu)選的實施方式中，L是單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)體系，其可選擇地選自由苯、萘、甘菊環(huán)、雙環(huán)雜芳環(huán)體系及它們的取代物所組成的組中。本發(fā)明柔性堿基堆積的單體的C是共軛劑。在優(yōu)選的實施方式中，C選自由112個碳的烷基、212個碳的烯基、225個碳的炔基、或重氮基或長度不超過25個碳原子和/或氮原子的它們的組合所組成的組中。在另一種實施方式中，C選自由直鏈或支鏈或單環(huán)芳香環(huán)及它們的取代物所組成的組中，其最終具有選自氮、硫、磷和氧的雜原子。在另一種實施方式中，C的蹄基是乙炔基或重復(fù)的乙炔基。在優(yōu)選的實施方式中，含有磷原子的主鏈單體單元X的單元長度小于6個原子，其中，主鏈單元長度為從一個單體到下一個單體之間最短的距離。在優(yōu)選的實施方式中，連接部分L(linkingmoiety)具有至少2個原子的長度，其最終具有選自氮、硫、磷和氧的雜原子。柔性堿基堆積的單體的12是第二嵌入劑，其包含至少一種基本平面的共軛體系，其能夠與DNA、RNA或它們的類似物的核酸堿基共堆積。在優(yōu)選的實施方式中，12選自由雙環(huán)芳香環(huán)體系、三環(huán)芳香環(huán)體系、四環(huán)芳香環(huán)體系、五環(huán)芳香環(huán)體系以及它們的芳雜環(huán)類似物及取代物所組成的組中。在優(yōu)選的實施方式中，柔性堿基堆積的單體是寡聚核苷酸或寡聚核苷酸類似物的一部分。在另一種優(yōu)選的實施方式中，柔性堿基堆積的單體適合摻入到寡聚核苷在優(yōu)選的實施方式中，適合摻入到寡聚核苦酸中的柔性堿基堆積的單體選自由亞石舞酰胺(phosphoroamidite)、亞石粦酰二胺(phosphordiamidite)、石舞酸二酯(phosphordiester)、磷酸三酯(phosphortriester)、膦酸酯、H-膦S菱酯、亞磷酸酯、氯代亞磷酸酯、氯代亞磷酰胺(chlorophosphoramidite)、膦酰胺(phosphonamidite)、膦酰氯(phosphonchloridite)、三石壽酉臾酉旨、二石岸酉臾酯聲斤組成的組中。在另一種實施方式中，本發(fā)明柔性堿基堆積的單體可以由下式描述其中，R選自由芳基乙炔基所組成的組中。本發(fā)明的另一個方面是寡聚核苷酸，其包含本發(fā)明的柔性堿基堆積的單體。所述寡聚核苷酸可以是能夠形成Watson-Crick堿基配對和Hoogstein堿基配對以及反向Hoogstein堿基配對的任何寡聚核苦酸。本發(fā)明寡聚核苷酸的重點是它們能夠形成Watson-Crick堿基配對和Hoogstein堿基配對以及反向Hoogstein石咸基配對。因此，如果將本發(fā)明的柔性石咸基堆積的單體摻入到寡聚核苦酸中，則該寡聚核苦酸能夠形成三鏈體。本發(fā)明的另一個方面是制備柔性堿基堆積的單體的方法，其包括下列步驟提供柔性堿基堆積的單體的前體，其中，所述前體是包含被卣素取代或者被C取代或者被疊氮化物取代的I,的柔性堿基堆積的單體。將步驟a的前體中所述卣素或C取代基或者疊氮化物取代基替換為C-使C-l2取代的柔性堿基堆積的單體的前體適合摻入到寡聚核苷酸中。本發(fā)明的另一個方面是用于制備包含柔性堿基堆積的單體的寡聚核苷酸的方法，其包括下列步驟提供適合摻入到寡聚核苦酸中的柔性堿基堆積的單體；提供用于合成寡聚核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)試劑；在寡聚核普酸的合成中，將一種或者多種柔性4^基堆積的單體摻入到寡聚核苷酸中；這樣產(chǎn)生了包含柔性主鏈單體的寡聚核苦酸。另一個方面是制備包含柔性堿基堆積的單體的寡聚核苷酸的方法，其包括下列步驟提供適合摻入到寡聚核苷酸中的柔性單體的前體，其中，所述前體是包含被卣素取代或者被C取代或者被疊氮化物取代的L的柔性堿基堆積的單體；提供用于合成寡聚核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)試劑；在寡聚核苷酸的合成過程中，將一種或者多種柔性堿基堆積的單體的前體摻入到寡聚核芬酸中；在合成寡聚核苷酸之后，將I,上的所述卣素或C取代基或者疊氮化物取代基替換為C-12;這樣產(chǎn)生了含有柔性堿基堆積的單體的寡聚核苷酸。本發(fā)明的進(jìn)一步方面是含有柔性堿基堆積的單體的寡聚核苷酸用于形成三鏈體核酸結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的通過雜交的4全測相比，使用TFO進(jìn)行檢測不需要變性步驟。因此，本發(fā)明的另一個方面是形成雙鏈體或者三鏈體核酸的方法，其包括下列步驟提供權(quán)利要求16所述的寡聚核苦酸；提供單鏈或雙鏈目標(biāo)核酸；將步驟a的寡聚核苷酸與步驟b的單鏈或雙《連目標(biāo)核酸在雙鏈體或三鏈體形成的條件下進(jìn)行孵育；這樣，形成了雙鏈核酸或者三鏈體核酸結(jié)構(gòu)。重要的是，正如從實施例部分能夠清楚看出的，本發(fā)明的TFO能夠在pH大約7處形成三鏈體。這一特征對于各種應(yīng)用例如作為藥物的應(yīng)用是非常重要的。在優(yōu)選的實施方式中，三鏈體核酸的形成被用于目標(biāo)核酸活性的序列特異性調(diào)節(jié)。在優(yōu)選的實施方式中，目標(biāo)核酸選自由染色體基因、mRNA、rRNA、tRNA和微RNA或它們的任何前體所組成的組中。因此，所述三鏈體核酸結(jié)構(gòu)可以抑制mRNA的翻譯、rRNA或tRNA的功能以及前體-miRNA到成熟微RNA的過程。在另一種優(yōu)選的實施方式中，形成三鏈體核酸結(jié)構(gòu)被用于對目標(biāo)核酸的序列特異性檢測。因此，其能夠凈全測特定的前體微RNA,或者檢測特定的等位基因。這些檢測方法是例如對于診斷目的是有利的。在另一種實施方式中，含有柔性堿基堆積的單體的寡聚核苷酸被用作藥物。這類藥物的作用機(jī)制可以是抑制某種基因的表達(dá)，即通過抗原機(jī)制。其也可以是抑制mRNA或微RNA的水平。因此，本發(fā)明的寡聚核苷酸可以用于制備藥物。項目1.用于穩(wěn)定天然或者被修飾的DNA和RNA三鏈體、雙鏈體和它們的雜交體的嵌入寡聚核苷酸具有式1的通用結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中，R2和R3互相獨立地是單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)體系，、R2和R3可以互相獨立地被取代，寡聚物是由下列亞單元(subunit)構(gòu)成的寡聚核苷酸DNA、RNA、HNA、畫A、ANA、LNA、CAN、INA、CeNA、TNA、(2，-NH)-TNA、(3'畫NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、卩-D-核糖-LNA、(3-D-木糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-氨基-雙環(huán)-DNA、5-表-雙環(huán)-DNA(5-epi-bicyclo-DNA)、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、(3-D-核糖吡喃基-NA、a-L-來蘇糖吡喃基-NA、2'陽R-RNA、2，-OR-RNA、2，-AE-RNA、a-L-RNA、卩畫D-RNA及它們的修飾物。這些亞單元可以含有被修飾的核酸堿基、烴和肽鏈。寡聚核苷酸主鏈可以被修飾。連接體包含160個原子，其可以含有非芳香環(huán)區(qū)域，其中，寡聚物被通過連接連接體(lingkagelingker)連接到芳香環(huán)體系RP接著R,被依次通過確定共軛體系的共軛劑1連接到共軛體系R2,其中，所述共軛劑1包含單環(huán)和/或多環(huán)芳香環(huán)體系和/或烷基、烯基和/或炔基，R2接著被依次通過確定共軛體系的共軛劑2連接到芳香環(huán)體系R3,其中，所述共軛劑2包含單環(huán)和/或多環(huán)芳香環(huán)體系和/或烷基、烯基和/或炔基，其中，所述連接體是主鏈單體單元，其能夠通過磷酸部分、或者糖部分、或者核酸堿基、或者被修飾的寡聚物主鏈，被插入到核酸或者核酸類似物的主鏈中。包含R,、共軛劑1、R2、共軛劑2和R3的共軛體系可以采用非平面體系。根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌入寡聚核苦酸，其中，所述共軛劑l和共軛劑2是相互獨立的。共軛劑1由芳基R4構(gòu)成，其通過x個單鍵、n個雙鍵和/或m個三鍵連接到R,，通過y個單鍵、k個雙鍵和/或1個三鍵連接到R2,其中k、1、m、n、x和y相互獨立地是05的整數(shù)。共軛劑2由芳基115構(gòu)成，其通過z個單鍵、p個雙4定和/或r個三鍵連接到R2，通過v個單鍵、s個雙鍵和/或t個三鍵連接到R3，其中p、r、s、t、v和z相互獨立地是05的整數(shù)。所形成的共軛體系可以形成非平面體系。根據(jù)項目2所述的嵌入寡聚核苷酸，其中所述芳基含有雜原子。根據(jù)項目2或項目3所述的嵌入寡聚核苷酸，其中如式2中所描述的，R3被單原子所取代。所述包含R!、共軛劑1、R2和共軛劑2的共軛體系可以采用非平面體系。共軛劑i~(、R2——共軛劑2寡聚物式2<image>imageseeoriginaldocumentpage13</image>根據(jù)項目2~4中任一項所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述共軛劑l和/或共軛劑2相互獨立地選自由1~12個碳的烷基、2~12個碳的烯基、2~25個碳的炔基及它們的組合所組成的組中。根據(jù)項目2~5中任一項所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述的炔基是重復(fù)的乙炔。根據(jù)項目2~5中任一項所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述炔基是乙炔。根據(jù)項目27中任一項所述的嵌入寡聚核苷酸，根據(jù)式3其不含有R3和共4厄劑2。連接體寡聚物式3根據(jù)前述項目中任意一項所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述連接體選自由直鏈或支鏈或環(huán)基所組成的組中。根據(jù)項目9所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述直鏈或支鏈或環(huán)基具有選自氮、硫、磷和氧的雜原子。根據(jù)前述項目中任意一項所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，主鏈單體包含乙二醇(式4):震聚核苷酸2j式4其中，X由直鏈或支鏈或環(huán)基構(gòu)成，寡聚核苷酸1和寡聚核苷酸2是分別獨立地限定為項目1中的寡聚物。根據(jù)項目11所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述直鏈或支鏈或環(huán)基具有選自氮、硫、磷和氧的雜原子。根據(jù)前述項目中任意一項所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，主鏈單體包含1-0-亞曱基丙三醇(式5):共軛劑l~4R:^~~共軛劑20—o式5根據(jù)項目13所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，R!是由間-、鄰-、或?qū)?取代的苯環(huán)所構(gòu)成的(式6):共軛劑i共軛劑2~[寡聚核苷酸21式6根據(jù)項目14所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，根據(jù)式7，112是芘，而不含有R3和共軛劑2。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>共軛劑i寡聚核苷酸i1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>寡聚核苷酸2式7根據(jù)項目15所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述共軛劑1由重復(fù)的多個乙炔或乙炔或芳基構(gòu)成。根據(jù)項目16所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，所述芳基含有雜原子。根據(jù)項目1117中任意一項所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，取代的乙二醇基(ethylenglycole)是純的立體異構(gòu)體U)或")。式8所限定的嵌入寡聚核苷酸，其中，寡聚核苷酸1和寡聚核苷酸2是獨立地由項目1中的寡聚物所限定的。根據(jù)項目119所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，寡聚核苷酸1和寡聚核苷酸2是單鏈富含嘧啶的寡聚脫氧核糖核苷酸或寡聚核糖核苷酸。項目1~20的嵌入寡聚核苷酸中的共軛劑1和/或共軛劑2是通過合成僅具有最終共軛體系的一部分(前體嵌入寡聚核苷酸)后進(jìn)行裝配的，例如通過Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)(在Pd-催化劑和/或Cul存在下，具有末端乙炔基的芳基和鹵代芳基之間的反應(yīng))或者通過Glazer反應(yīng)(在銅離子存在下，具有末端乙炔基的芳基之間的反應(yīng))或者通過點擊化學(xué)(click-chemistry)(在銅離子存在下，有機(jī)疊氮化物與具有末端乙炔基的有機(jī)分子之間的反應(yīng))。根據(jù)項目21所述的合成是在前體嵌入寡聚核苷酸進(jìn)行的，該前體嵌入寡聚核苷酸具有酸性和/或堿性標(biāo)記保護(hù)基團(tuán)。根據(jù)項目21所述的合成可以對未保護(hù)的前體嵌入寡聚核苷酸進(jìn)行。根據(jù)項目22或23所述的前體嵌入寡聚核苷酸被附著到固體支持物上。根據(jù)項目24所述的方法，其中，所述的固體支持物包括被活化的表面。根據(jù)項目24所述的方法，其中，所述的支持物選自由^茲珠、瓊脂糖珠、瓊脂糖凝膠珠、玻璃、塑料表面、重金屬和芯片表面所組成的組中。項目1~20所述的嵌入寡聚核苷酸是通過逐步寡聚核苷酸合成所獲得寡聚核苷酸2的，其使用連接到最終共軛體系或者最終共軛體系一部分的連接體的單體。所述連接體具有至少兩個反應(yīng)基團(tuán)，所述反應(yīng)基團(tuán)可以可選擇地與寡聚核苷酸或寡聚核苷酸類似物的生長鏈反應(yīng)。所述單體能夠與結(jié)合支持物的核苷酸、寡聚核苷酸、核苷酸類似物或寡聚核苷酸類似物的生長鏈發(fā)生反應(yīng)，并可選擇地通過在寡聚核苦酸類似物的期望序列中摻入一種或多種核香酸、核普酸類似物，以進(jìn)一步延長所述寡聚核苷酸或寡聚核苷酸類似物；從所述固體支持物斷裂所述寡聚核苷酸或寡聚核苷酸類似物；以及斷裂所述堿性/酸性標(biāo)記保護(hù)基團(tuán)，這樣獲得了所述嵌入寡聚核苷酸。根據(jù)項目1~20所述的嵌入寡聚核香酸能夠與雙鏈體鏈之一形成Hoogsteen三鏈體或者反向Hoogsteen三鏈體，其中，所述雙鏈體是DNA雙鏈體、RNA雙鏈體或它們的雜交體。項目1~20的嵌入寡聚核苷酸的寡聚物部分能夠與單鏈形成Hoogsteen雙鏈體或者反向Hoogsteen雙鏈體或者Watson-Crick雙鏈體，其中，所述單鏈?zhǔn)荄NA、RNA或它們的雜交體。根據(jù)項目1~20所述包含R,、共軛劑1和R2以及最終共軛劑2和R3的單體形成凸起時，Hoogsteen三鏈體和Hoogsteen雙鏈體表現(xiàn)出提高的熱穩(wěn)定性。根據(jù)項目1~20所述的嵌入寡聚核苦酸被連接到DNA反應(yīng)試劑上。所述DNA反應(yīng)試劑是能夠介導(dǎo)突變的誘變劑，或者是光誘導(dǎo)交聯(lián)劑，或者是放射性試劑，或者是烷基化基團(tuán)，或者是能夠招募DNA損傷細(xì)胞酶的分子。一種適合用于反義治療和抗原治療的藥物組合物，其中，該組合物包含根據(jù)項目120所述的嵌入寡聚核苷酸。一種治療由存在不期望雙鏈體寡聚核苷酸所介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，其中，該方法包括為需要這種治療的受試者給藥治療有效量的根據(jù)項目1~20所述的嵌入寡聚核苷酸或其藥物組合物。一種用于進(jìn)行化學(xué)選擇性連接的方法，其使用根據(jù)項目1~20所述的嵌入寡聚核苷酸連接到包含DNA、RNA或其雜交體的模板上的DNA反應(yīng)基團(tuán)。所述DNA反應(yīng)基團(tuán)是能夠與其他化學(xué)基團(tuán)在適當(dāng)條件下發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)。根據(jù)項目33所述的方法，其中，所述化學(xué)選擇性連接是生物正交(bioorthogonal)。根據(jù)項目34所述的方法，其中，DNA反應(yīng)基團(tuán)之一是疊氮化物或末端乙炔基或膦(phosphane)。根據(jù)項目1~20所述的嵌入寡聚核香酸能夠用于純化DNA質(zhì)粒(雙鏈DNA)。根據(jù)項目1~20所述的嵌入寡聚核苷酸能夠用于抑制轉(zhuǎn)錄。根據(jù)項目120所述的嵌入寡聚核苷酸能夠用于熒光原位雜交(FISH)以及這種方法的類似方法，例如多^各(多色)熒光原位雜交(M-FISH)、常規(guī)FISH以及COMBO-FISH等。根據(jù)項目1~20所述的嵌入寡聚核苷酸能夠用于基因修復(fù)。根據(jù)項目120所述的嵌入寡聚核苦酸能夠用于核酸納米機(jī)器，該機(jī)器基于雙鏈體-三鏈體的轉(zhuǎn)換，其中，核酸被限定為項目l中的寡聚物。根據(jù)項目120所述的嵌入寡聚核苦酸能夠用于核酸納米機(jī)器，該機(jī)器基于平行雙鏈體-反向平行雙鏈體的轉(zhuǎn)換，其中，核酸被限定為項目1中的寡聚物。根據(jù)項目1~20所述的嵌入寡聚核苷酸，其中，通過雜交到相應(yīng)的DNA、RNA及它們的類似物上，改變了熒光性能。一種體系，其中根據(jù)項目120所述的嵌入寡聚核苷酸被附著到固體支持物上。根據(jù)項目43所述的體系，其中，所述固體支持物是被活化的表面。根據(jù)項目43所述的體系，其中，所述固體支持物選自由磁珠、瓊脂糖珠、瓊脂糖凝膠珠、玻璃、塑料表面、重金屬和芯片表面所組成的組中。圖1在20mM卡可基酸鈉、100mMNaCl、10mMMgCl2，pH7.2中，在260nm處記錄的針對漸增的溫度(rc/分鐘)所做的三鏈體解鏈一階導(dǎo)數(shù)圖；圖26單鏈、反向平行雙鏈體和平行雙鏈體以及平行三鏈體的熒光譜。檢測條件l(TC下緩沖液(20mM卡可基酸鈉、100mMNaCl、10mMMgCl2,pH6.0)中每種鏈ljiM，激發(fā)373nm(激發(fā)狹縫4.0nm);發(fā)射380-600nm(發(fā)射狹縫對于A、B和E為2.5nm，對于C和D是O.Onm)。0N6和ON12被用作在不同條件下記錄光譜中的參照。實施例實施例1最近，我們已經(jīng)報道了為Watson-Crick型雙鏈體設(shè)計的幾種嵌入核酸的合成和性能(方案1)。[9]在寡聚脫氧核苷酸(INA)的中部凸起插入(i)-1-0-(l-芘基曱基)甘油，導(dǎo)致與互補(bǔ)ssDNA的顯著提高的親和力，而INA/RNA雙鏈體和Hoogsteen-型三鏈體和雙鏈體^皮去穩(wěn)定化。[9一其也提到在將嵌入劑凸起插入到寡聚脫氧核苷酸之后，會維持雙鏈體形成的錯配靈敏性。[%]柔性短甘油連接體和適當(dāng)嵌入劑的獨特組合導(dǎo)致目前用于核酸化學(xué)生物學(xué)的有價值的分子，其中所述柔性短甘油連接體會扭曲磷酸酯主鏈，嵌入劑會通過去溶劑化和通過與核酸堿基的堆積而穩(wěn)定INA/DNA。連接體的TFO的穩(wěn)定性，嵌入劑的芳香族結(jié)構(gòu)需要足夠長以將嵌入劑置入三鏈螺旋的dsDNA部分。因此(i)(4-聚芳基-苯基)曱基甘油能夠是好的選擇，因為苯基也能夠模擬三鏈螺旋TFO部分的核酸堿基。聚芳基嵌入劑也能夠通過乙炔橋附著到該苯基上，其提供必要的結(jié)構(gòu)剛性和扭轉(zhuǎn)柔性并仍聯(lián)合芳香族結(jié)構(gòu)。乙炔鍵本身被認(rèn)為會改善嵌入性能。根據(jù)通過MacroModel8.0對U)-1-0-[4-(1-芘基乙炔基)-苯基曱基]甘油的分子建模，在三鍵周圍存在1-芘基和苯基的扭轉(zhuǎn)，其扭轉(zhuǎn)角度為15.3°。相信這種扭轉(zhuǎn)能力能夠有助于嵌入劑調(diào)節(jié)自身到dsDNA內(nèi)部恰當(dāng)?shù)奈恢?。因此，我們將這種類型的核酸稱作扭轉(zhuǎn)嵌入核酸(TINA,方案1)。這里，我們報道了在合成Sonogashira型后，在柱上對寡聚脫氧核苷酸的衍生獲得了不同的TINA，其被發(fā)現(xiàn)在Hoogsteen型雙鏈體和三鏈體中格外高的親和力。還提供了對核酸螺旋的熱穩(wěn)定性和熒光研究，其中所述核酸具有TINA插入作為根據(jù)Watson-Crick或Hoogsteen結(jié)合模式所形成的凸起。INA單體0—1:R:碘R-_^TINA單體2:R-3-乙炔基-l-苯基乙炔基P"773:R-聯(lián)苯基-4-乙炔基4:1^=萘-1-基-乙炔基0_5:R^芘-l-基-乙炔基方案1嵌入核酸(INA)的單體和扭轉(zhuǎn)嵌入核酸(TINA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)合成后對寡聚核苷酸的修飾是對多種假核苷亞磷酰胺常規(guī)和耗時的制備方法的更佳備選，其中假核苦亞磷酰胺對于選擇合適的TNA候選是必需的。已經(jīng)有多項報告關(guān)注在固相合成中鈀(O)催化的寡聚核苷酸修飾。發(fā)現(xiàn)Sonogashira偶聯(lián)條件適合DNA合成，并且對于具有保護(hù)基團(tuán)的核酸堿基沒有觀察到副反應(yīng)。根據(jù)已知的規(guī)程，在序列的5，-末端引入5'-(9-DMT-2，-脫氧-5-碘尿香后，DNA合成會停止，接著在Sonogashira條件下進(jìn)行對寡聚核苷酸支持物的處理。然后，將寡聚物的合成進(jìn)行最后。然而，在繼續(xù)的寡聚核苦酸合成中，在插入后，并不是所有的功能團(tuán)都能夠保存下來。存在標(biāo)準(zhǔn)氨基磷酸酯的偶聯(lián)效率在柱上衍生之后下降的風(fēng)險，這在我們下面描述的實驗中也觀察到了。盡管事實上某些有機(jī)金屬偶聯(lián)劑被用于寡聚核苷酸合成后的修飾，但是對位于序列中部的可轉(zhuǎn)化核苷2，-脫氧-5-碘尿苷的合成后Sonogoshira型反應(yīng)被報道是不成功的。作為替換，我們嘗試在摻入到寡聚物中部之后，在Sonogoshira型反應(yīng)中使用(i)-1-0-(4-碘千基)甘油。在本文中使用許多具有末端三鍵的芳香族結(jié)構(gòu)(2-5)(方案1)。從4-碘千基溴和(<S)-(+)-2,2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-曱醇按照4個步驟合成所需要的亞磷酰胺8，其總產(chǎn)率為47%(方案2，見實驗細(xì)節(jié)的支持信息)。在0.2|imol規(guī)模的DNA合成過程中，使用標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸偶聯(lián)條件(偶聯(lián)2分鐘，4，5-二氰咪唑作為激活劑)以及^t是高的去保護(hù)時間(IOO秒)，化合物8的偶聯(lián)效率被評估為超過99%。DNA合成之后，在室溫干燥條件下，在lmL注射器中使用Sonogoshira偶聯(lián)反應(yīng)混合物對帶具有4-碘苯基部分的DMT-on寡聚核苷酸的CPG-支持物進(jìn)行處理，其中所述偶聯(lián)反應(yīng)混合物在干燥的DMF/Et3N(3.5/1.5,500jiL)中含有Pd(PPh3)4或Pd(PPh3)2C12(7.5mM)，具有末端乙炔基的芳香族結(jié)構(gòu)(22.5mM)和Cul(7.5mM)。在偶聯(lián)反應(yīng)之前使用氬氣而不是氮氣對支持物和注射器進(jìn)行沖洗以避免Glazer氧化二聚是重要的。如果為每種單獨的寡聚物將Sonogashira反應(yīng)混合物直接制備在塑料注射器中，而不是大量制備Sonogashira反應(yīng)混合物用于多次偶聯(lián)反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)化更好。在偶聯(lián)反應(yīng)(3-4小時)之后，使用DMF(2x0.5mL)和CEbCN(2xlmL)沖洗CPG，并干燥。接著使用32%NH40H(2h)從CPG-支持物斷裂寡聚核苷酸，并在55。C下去保護(hù)(過夜)。由于不同的親脂能力，所以通過在C，8柱上的半制備HPLC分離未反應(yīng)的寡聚物和目標(biāo)TINA。在出現(xiàn)重疊的峰(結(jié)構(gòu)2)的情況下，采用更長的HPLC程序(參見支持信息)。在第一次分離后，使用10%AcOH對DMT-on寡聚核苷酸進(jìn)行處理，接著在HPLC上再次純化，并從乙醇沉淀。根據(jù)離子交換HPLC所判斷的，發(fā)現(xiàn)最終TFO的純度對于含有寡聚脫氧核苷酸的純嘧啶超過90。/。，對于具有嘌呤的寡聚脫氧核苷為8588%。通過MALDI-TOF對該組合物進(jìn)行驗證。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>方案2:亞磷酰胺8的合成。試劑和條件(a)4-碘芐基溴、KOH和曱笨；(b)80%的含水(aq.)CF3COOH、室溫(rt)、100%經(jīng)過兩個步驟；(c)DMTC1、吡啶、室溫、70%;(d)NC(CH2)20P(NPr12)2、四唑二異丙銨(diisopropylammoniumtetrazolide)、CH2C12,0。C至室溫,過夜,67%。在Sonogashira偶聯(lián)過程中，該轉(zhuǎn)化依賴于乙炔基的反應(yīng)性以及寡聚物的序列。正如通過使用1-乙炔基芘的大量實驗可以判斷，使用新鮮的反應(yīng)混合物進(jìn)行一次以上處理比延長的時間反應(yīng)(4-16h)更有效。形成了較少量的略溶Glazer副產(chǎn)物，在l-乙炔基芘的情況中，Pd(PPh3)4作為催化劑觀察到了比Pd(PPh3)2Cl2作為催化劑好的寡聚物衍生。與高嘧夂(hom叩yrimidine)序列相比(80-85%),即使在單個處理后再使用Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)混合物對具有寡聚核苷酸的支持物進(jìn)行雙重處理，序列中出現(xiàn)嘌呤也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化成目標(biāo)TINA的較低的轉(zhuǎn)化率(50-60%)，其中所述Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)混合物含有l(wèi)-乙炔基芘。這對于其他芳香族乙炔似乎也是正確的，因為在含有嘌呤的序列中，使用4-乙炔基聯(lián)苯?jīng)]有獲得目標(biāo)寡聚核苷酸，4-乙炔基聯(lián)苯在測試的乙炔中發(fā)現(xiàn)是最有反應(yīng)性的化合物。在ON14的合成中，我們體驗到與在Sonogashira反應(yīng)之后中斷DNA合成第二次插入8后、并繼續(xù)合成DNA相比，使用具有1-乙炔基芘的Sonogashira反應(yīng)混合物處理完整的寡聚核苷酸提供了更純的寡聚物。在前一情況中，根據(jù)離子交換HPLC所判斷的，含芘的短寡聚物污染了最終的TINA。最近，報道了在水中存在吡咯烷(pyrrolidine)的情況下，使用PdCl2進(jìn)行的無銅Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)。與水的兼容性，有氧條件以及痕量的同型偶聯(lián)產(chǎn)物(homocouplingproduct)是本方法非常大的優(yōu)點。我們對完全去保護(hù)的ON2采取類似的條件。然而，在使用1-乙炔基萘和PdCl2在水/吡咯烷(kl)中在5(TC或20。C下處理ON2過夜后，在HPLC純化之后，沒有)C察到期望的核酸的痕跡(trace)。通過熱變性實驗，檢驗具有合成的寡聚核苷酸的三鏈體、DNA/DNA和DNA/RNA雙鏈體的熱穩(wěn)定性。作為解鏈曲線的一階導(dǎo)數(shù)(firstderivative)所確定的解鏈溫度(rm，°C)被列在表1~4中。在pH依賴的Hoogsteen型堿基配對中對具有不同TINA的序列進(jìn)行研究，同時在針對雙鏈體Dl的平行三鏈體中，以及針對ONI5的平行dsDNA中(表1)。相同的序列(ONl-14)被用于針對ONI6的Watson-CrickDNA/DNA反向平行雙鏈體。對于后面的雙鏈體類型，與前面描述的INA類似，混合的嘧啶/噤呤序列也被用于TINA寡聚核香酸以與ssDNA和ssRNA進(jìn)行雜交(表4)。可以從表l中的rm數(shù)據(jù)看出，在pH6.0下與野生型復(fù)合物(〇N1針對Dl和ON15)相比，對具有-1-0-(4-碘苯基曱基)甘油在序列中部作為凸起的ON2觀察到Hoogsteen型三鏈體和雙鏈體相當(dāng)大的去穩(wěn)定化。使用芳基取代基取代碘提供了更穩(wěn)定的三鏈體(ON3-ON6針對Dl，pH6.0)。觀察到最高的rm值46.0。C是在pH6.0下的l-芘基乙炔基取代基，其對應(yīng)于與野生型三鏈體相比的Arm=19.0°C。即使在pH7.2時，盡管高胞嘧啶含量(36%)，單個引入5也會導(dǎo)致三鏈體(ON6/D1)相當(dāng)大的穩(wěn)定化。在該pH下，沒有檢測到野生型三鏈體的雜交(圖1)。對于平行雙鏈體，在pH6.0下，分別檢測到1-萘基乙炔基(ON5)和1-芘基乙炔基(ON6)每種修飾3.0°C和14.5。C的穩(wěn)定化。正如所期待的，在較低pH(pH=5.0)下，發(fā)現(xiàn)平行雙鏈體更穩(wěn)定，因為胞嘧啶的質(zhì)子化。可以得出結(jié)論，在(i)-1-O-(苯基曱基)甘油中苯環(huán)的4-位結(jié)合芳香族結(jié)構(gòu)導(dǎo)致Hoogsteen型螺旋雜交親和力的提高。令人感興趣的，萘環(huán)和芘環(huán)提供了比4-聯(lián)苯和苯好得多的穩(wěn)定性。這支持與小的芳香族結(jié)構(gòu)相比，具有大表面的芳香族結(jié)構(gòu)如芘優(yōu)選用于結(jié)合到(W)_1_6>-(4-取代的苯基曱基)甘油以達(dá)到Hoogsteen型螺旋中好的結(jié)合的觀點。與野生型dsDNA(ON1/ON16,Table1)相比，觀察到了全部所研究被修飾的寡聚脫氧核苷酸的反向平行dsDNA的去穩(wěn)定化，除了在5，-末端(ON10/ON16)安置嵌入劑5外。后一種情況中的穩(wěn)定作用可以歸于芳香族多環(huán)體系堆積在臨近的核酸^5威基上(作為蓋子的作用)，而非環(huán)連接體的這種作用是最小的。雜交親和力還依賴于TINA的結(jié)構(gòu)。最小去穩(wěn)定化的雙鏈體是使用4和5形成的，而引入結(jié)構(gòu)1~3作為該序列中部的凸起的dsDNA的去穩(wěn)定化要更大。在此階段，已經(jīng)可以得出結(jié)論作為凸起被引入螺旋的TINA是改善Hoogsteen型螺旋的穩(wěn)定性，而不是Watson-Crick型雙鏈體的穩(wěn)定性。因此在較不穩(wěn)定的平行三鏈體(0N6/D1)中單個插入(7)-1-0-[4-(1-芘基乙炔基)苯基曱基]甘油在pH6.0會將該三鏈體穩(wěn)定到具有相同核苷酸成分的Watson-Crick雙鏈體(ON6/ON16)的水平。不同TINA的熱穩(wěn)定性促使我們更緊密地研究含有TINA的1-芘基乙炔基的性能。通過將1-芘基乙炔基置于TFO中的不同位置，觀察到了Hoogsteen三鏈體和雙鏈體熱穩(wěn)定性的某些波動。如果胞嘧啶臨近5，-或3，-側(cè)(ON7-ON9),在平行三鏈體和平行雙鏈體都不如5被置于兩個胸腺嘧咬之間(ON6)在pH6.0下穩(wěn)定。這可能是芳香族結(jié)構(gòu)與帶正電的C+.G對之間的相互作用的結(jié)果。令人感興趣的，在pH7.2下，如果胞嘧啶不被質(zhì)子化，則在所測試的具有單個插入1-芘基乙炔基的TFO(ON6-ON10)中檢測到在5，-搖擺末端(danglingend)的TFO(ON10)具有最低的三^1體雜交親和力。令人吃驚的是，這里不存在蓋子作用(lideffect)。這可能是具有目標(biāo)dsDNA的TFO的富含C區(qū)域在生理條件下普遍較低的穩(wěn)定性的結(jié)果。然而，重要的觀察是在中性介質(zhì)中通過將5置于富含C區(qū)域的中部(ON9)，可以達(dá)到有效的雜交親和力。人們可以推測是否嵌入將使質(zhì)子化在生理pH下在三鏈體結(jié)構(gòu)中更有可能，因為所述嵌入劑是分開兩個帶正電的三聚體。使用ON11-ON14研究熱穩(wěn)定性對多個芘嵌入劑5凸起插入之間距離的依賴(表1)。在重疊的三鏈體和雙鏈體轉(zhuǎn)換的情況中，在373nm處進(jìn)行解鏈實驗。然而，在373nm處有時觀察不到非常確定的轉(zhuǎn)換。在這些情況中，對于在pH6.0在雙鏈解鏈溫度附近的溫度下三鏈體的解鏈的假設(shè)，是基于與在pH7.2下260nm處的解鏈的比較。如果插入嵌入劑5作為下一個最近的鄰近者(0N12)，則與未修飾的ONI相比，Hoogsteen三鏈體和雙鏈體在pH6.0被穩(wěn)定化。然而，在兩種情況中，穩(wěn)定性都比單個插入5(ON6)低，并且在pH7.2沒有觀察到形成三鏈體。這可能是由于兩個凸起U)-l-O-曱基甘油連接體互相定位太近所引起的雙鏈和三鏈螺旋的巨大中斷。如果兩個插入的5被兩個或者三個核酸堿基分開(分別為ON13和ON14)，則帶有Dl和ON15的復(fù)合物比具有單個插入的復(fù)合物更穩(wěn)定。在pH7.2下，三鏈體的rm甚至比生理條件37。C還要高(見圖1中的ON14/Dl)。與在中部插入兩個5相似，一個插入在5'-末端并在兩個插入之間有6個石威基對的間隔的雙重插入(ON11)在pH6.0大大地穩(wěn)定Hoogsteen型雙鏈體和三鏈體。與Hoogsteen螺旋相反，與野生型雙鏈體ON1/ON16相比，具有雙重插入5的反向雙鏈體(ON12-14/ON16)表現(xiàn)出降低的穩(wěn)定性，特別在兩個插入之間有一個或者三個核酸堿基時。如果將帶有雙重插入5的平行和反向平行雙鏈體在pH5.0的熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較，則Hoogsteen雙鏈體ON11/ON15和ON14/ON15甚至比相應(yīng)的Watson-Crick雙鏈體(ON11/ON16和ON14/ON16)更穩(wěn)定。對于苯并吡口定并口引"朱(benzopyridoindole,BPI)衍生物，首次才艮道了通過加入嵌入劑，平行三鏈體和平行雙鏈體的穩(wěn)定化。當(dāng)將BPI加入到寡聚脫氧核苷酸的水溶液中時，已經(jīng)檢測到了非完美匹配的Watson-CrickDNA雙《連體重組成完美匹配的Hoogsteen配對的DNA雙鏈體。期望通過將5插入到寡聚脫氧核苷酸中獲得對完全匹配的平行雙鏈體的相似作用。在pH5.0觀察到平行三鏈體超常的穩(wěn)定化。TFO中高含量的胞嘧啶將未修飾的三鏈體的解鏈(Tm=55.0°C)改變?yōu)殡p鏈體的解鏈溫度附近。然而該值仍比pH5.0下雙鏈體的解鏈溫度(Tm(D1)=56.5。C)要低。在TFO中單個凸起插入的1-萘乙炔基(l-naphthalenylethynyl)衍生物4稍微提高了三鏈體的穩(wěn)定性(ATm(0N5/D1—0N1/D1)=2.(TC)。然而，在所有情況中凸起插入5會導(dǎo)致整個復(fù)合物在高于dsDNA(Dl)的rm的溫度下分裂。在373nm處，與260nm相同的溫度下，觀察到了ON11的清楚轉(zhuǎn)換狀態(tài)，這確認(rèn)三鏈體和雙鏈體同時解鏈。在pH5.0下，觀察到了熱穩(wěn)定性對在TFO中雙重插入5在pH6.0時相同的依賴性。因此，作為最近的下一個鄰近者的5的雙重插入(ON12)以及在中部和5-末端(ON11)的5的雙重插入分別是最小和最大被穩(wěn)定化的三鏈體。在pH5.0下，三鏈體ON14/D1分別比相應(yīng)的平行和反向平行雙鏈體更穩(wěn)定16.5。C和20.5。C。重要的是，即使在pH7.2,寡聚核苷酸ON14也會形成比相應(yīng)的WatsonCrickdsDNA(Tm=38.0°C,ON14/ON16)穩(wěn)定的Hoogsteen型三鏈體(rm=43.0°C,ON14/D1)。在pH7.2，平行雙鏈體(ON14/ON15)的解鏈溫度認(rèn)為低于在pH6.0下觀察到的38.0°C,因為這種雙鏈體對pH敏感。該數(shù)據(jù)清楚地證明在序列中部具有三個堿基間隔的多次插入5的寡聚核苷酸的區(qū)分dsDNA和ssDNA的能力。研究對于在序列的中部和5，-末端具有凸起插入的平行三鏈體和雙鏈體，錯配的敏感性(表2)。在三鏈體的情況中，對錯配的敏感性依賴于嵌入劑的插入位置。當(dāng)在嵌入劑3，-位置上嘌呤鏈中的腺嘌呤被鳥嘌呤替換(ON6/D3和ONll/D3，表2)時，；險測到匹配三鏈體和不匹配三鏈體之間最低值的△rm=11.5°C。在所有其他的情況中，4的降低在14.0°C22.0。C的范圍內(nèi)。具有單個插入5的錯配平行雙鏈體在8.0。C13.0。C的范圍內(nèi)被去穩(wěn)定化，這與錯配的野生型平行雙鏈體在相同的范圍內(nèi)。為了比較，敏感性最低的錯配未修飾的雙鏈體表現(xiàn)出在pH6.0下9。C的Arm(rm(ON1/ONI5)(ON1/ON18)乂。我們研究了具有(i)-1-0-[4-(l-芘基乙炔基)苯基曱基]甘油(5)的TFO的熒光特征，其是形成三鏈體并辨別雙鏈體錯配最有效的TINA。將5引入到寡聚核苷酸得到通過373nm處的激發(fā)在400nm和421nm處具有最大值的特征性單體熒光圖譜(圖2,黑色曲線)，這與之前公開插入DNA內(nèi)的4_[4-(1-芘基乙炔基)苯基]-1，3-丁二醇的數(shù)據(jù)類似。間在所有的情況中，通過形成三鏈體或雙鏈體，檢測到4nm的單體熒光的移動。與單鏈ONG相比，形成完全匹配的三鏈體導(dǎo)致提高大約1.5倍的單體熒光(圖2,ON6/D1)。對于非完美匹配的三鏈體，熒光的強(qiáng)度取決于dsDNA的序列。因此，與ON6相比，檢測到TA轉(zhuǎn)換位點(inversionsite)(ON6/D2)幾乎兩倍的提高。相反，當(dāng)在TFO插入5附近的dsDNA中錯配胞嘧啶和鳥嘌呤堿基(D3和D4)時，觀察到與完美匹配的三鏈體相比單體熒光的降低(圖2)。特別地，鳥嘌呤提供了大的影響，其中對于錯配的三鏈體ON6/D3的熒光強(qiáng)度低兩倍。有趣地，與單鏈影響相比，通過形成反向平行雙鏈體檢測到單體熒光的相當(dāng)大的提高(ON6/ON16，圖4)，而平行雙鏈體的形成(ON6/ON15)僅導(dǎo)致稍微提高的熒光(圖4)。當(dāng)另一個4-(l-芘基乙炔基)苯基殘基作為ON12中下一個最近的鄰近者出現(xiàn)時，單鏈的單體熒光大約下降了三倍(圖4,與ON6和ON12相比)，可以觀察到受激子熒光最大值在500nm，強(qiáng)度為單體強(qiáng)度的一半(圖3)。對于相同的寡聚物，在錯配的三鏈體中，觀察到了單體熒光的相當(dāng)大的降低以及受激子帶的消失(圖3,ON12/D1)。這意味著在三鏈體螺旋的環(huán)境中，芘部分不能夠通過結(jié)合到dsDNA上而相互聯(lián)系。類似地，當(dāng)ON12與ON15形成Hoogsteen配對的dsDNA時，則受激子帶消失(圖3)。相反，當(dāng)與單鏈ON12的熒光強(qiáng)度相比時，觀察到反向平行雙鏈體(ON12/ON16)非常高的單體菱光強(qiáng)度和提高的受激子焚光(圖4)。這說明在形成Watson-CrickdsDNA之后，相同帶中的兩個芘基仍然相互緊密接觸，盡管在Hoogsteen型dsDNA中情況似乎不是這樣。以這種方式，雜交和焚光性能都反映了TINA針對Watson-Crick和Hoogsteen型螺旋的不同特征。而且，在富含嘧啶鏈中(i)-l-0-[4-(1-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油(5)作為凸起的下一個最近的鄰近者的熒光數(shù)據(jù)可以被總結(jié)如下單鏈ON12:在400nm和421nm處中等單體熒光和在500nm處的受激子帶；平行三鏈體ON12/D1:低單體熒光，并且沒有受激子帶；平行雙鏈體ON12/ON15:中等單體熒光帶，并且沒有受激子帶；反向平行雙鏈體ON12/ON16:高單體熒光和受激子帶。表3中展示了結(jié)構(gòu)5通過摻入三鏈體的Watson-Crick雙鏈體部分，影響平行三鏈體螺旋穩(wěn)定性的能力。當(dāng)5被插入作為雙鏈體(ONI、ON6和ON9針對D5)。密啶鏈中的凸起，與未修飾的三鏈體(ON1/D1)相比，在所有的情況中三鏈體都被穩(wěn)定化。在熱變性實驗中在373nm[5的U處檢測到三鏈體ON1/D1的兩個轉(zhuǎn)換狀態(tài)(rn^36.5。C和55.5。C),其分別對應(yīng)于三鏈體和雙鏈體的解鏈。通過373nm吸收對解鏈的^H則說明嵌入劑參與了雙鏈體和三鏈體的形成。當(dāng)與僅在三鏈體的雙鏈體部分具有嵌入劑的三鏈體(ON1/D5)相比時，在Watson-Crick和Hoogsteen的嘧口定鏈中都插入5作為凸起相互反向(ON6/D5)不會改變?nèi)滙w的解鏈。當(dāng)兩個芘部分5(每個嘧啶鏈中一個)被放置為被3個堿基對間隔的凸起(ON9/D5)時，則三鏈體的解鏈與雙鏈體的轉(zhuǎn)換狀態(tài)非常相近，這通過雙重?fù)饺?到TFO中也觀察到了上述情況。與未修飾的復(fù)合物相比，當(dāng)化合物5被插入到嘌呤鏈中作為凸起時(ONI針對D6和針對ON21)觀察到了降低的三鏈體和平行雙鏈體穩(wěn)定性。我們還使用已經(jīng)對INA描述的相同序列和條件，研究了具有5的TINA針對Watson-Crick型雙鏈體中ssDNA和ssRNA的混合噤呤/嘧咬序列的雜交親和力(表4)。當(dāng)與野生型雙鏈體相比時，對5作為序列中部的凸起觀察到了TINA/DNA(Arm在-8.0。C-15.5。C的范圍內(nèi))以及TINA/RNA(Arm=-10.0。C)相當(dāng)大的去穩(wěn)定化。第二嵌入劑5作為下一個最近的鄰近者插入到DNA內(nèi)(ON24)導(dǎo)致了雙鏈體的進(jìn)一步去穩(wěn)定化(ON24/ON25和ON24/ON27)。將5相反地?fù)饺氲絻蓷l互補(bǔ)的混合噤呤-嘧咬鏈中作為復(fù)合物ON23/ON26，導(dǎo)致了36.CTC的rm值，這與TINA/DNA雙鏈體(ON23/ON25和ON22/ON26)在相同級別的水平上。然而，當(dāng)INA被插入到INA/INA雙鏈體的相同位置上時，它們(rm=43.6°C)不如INA/DNA(Tm=51.5°C)穩(wěn)定。在單獨作為雙鏈體和作為三鏈體中一部分的Watson-CrickdsDNA中具有4-(1-芘基乙炔基)苯基部分的復(fù)合物的熒光性能被表示在圖4~6中。與插入到嘧啶鏈相比(ssON6，圖5),當(dāng)5被插入到噤呤鏈中(ssON21)時，單體熒光會被相當(dāng)大地提高。通過將三鏈體和雙鏈體與未修飾的DNA和ssON21(數(shù)據(jù)未顯示)進(jìn)行裝配，可以觀察到稍微降低的熒光強(qiáng)度。令人吃驚的發(fā)現(xiàn)是，對于混合的序列，單體熒光4-(l-芘基乙炔基)苯基部分在高嘧啶序列中的強(qiáng)靈敏性通過形成反向平行雙鏈體完全消失(ON23/ON25、ON23/ON27圖6)。這與之前關(guān)于使用相同序列凸起插入(i)(1-芘基曱基)甘油的報道結(jié)果也不同。當(dāng)兩個芘基嵌入劑5被一個堿基對分開時，則所觀察到ssON24的受激子帶(圖6)不會通過形成反向平行雙鏈體而消失(ON24/ON25和ON24/ON27圖6)。這種觀察與上面對具有TINA的平行三鏈體和平行雙鏈體的觀察相反，也與之前獲得的INA的結(jié)果相反。,通過在高嘧啶和混合嘧啶/嘌呤鏈中都形成具有凸起5作為下一個最接近的鄰近者的反向平行雙鏈體(分別為ON12/ON16和ON24/ON25)，出現(xiàn)受激子帶說明兩個芘基殘基被非常近地定位，并且相互聯(lián)系，并且沒有被完全包埋入與鄰近Watson-Crick堿基對的堆積相互作用中。這也可以解釋通過摻入5作為凸起，反向平行雙鏈體穩(wěn)定性的降低。接著我們檢測了，如果將兩種或者三種染料相互相反地置于它們的互補(bǔ)鏈之一中，是否能夠形成雙鏈體和三鏈體的受激子帶。在ON21/ON6(圖5)或反向平行雙鏈體ON20/ON21(圖5)和ON23/ON26(圖6)中都沒有觀察到受激子帶。這種結(jié)果與顯示當(dāng)4-[4-(l-芘基乙炔基)苯基]-1，3-丁二醇在具有混合序列的反向平行dsDNA的互補(bǔ)鏈中被互相相反定位時的工作相關(guān)。只有對于在所有三條鏈中具有相互相反設(shè)置的三個4-(l-芘基乙炔基)苯基部分的三鏈體，才在500nm處檢測到了弱受激子帶(ON6/D7,圖5)。結(jié)論是，定位于平行和反向平行雙鏈體以及平行三鏈體不同鏈上的4-(l-芘基乙炔基)苯基部分之間的聯(lián)系被阻止，這使得與INA發(fā)現(xiàn)的相反，不太可能使嵌入劑被鏈扣(zipping)在一起形成受激子。因此，在雙鏈體中被互相相反定位的INA的兩個芘部分的鏈扣(zipping)已經(jīng)在NMR結(jié)構(gòu)中被觀察到，并且這一雙鏈體結(jié)構(gòu)導(dǎo)致在穩(wěn)態(tài)焚光光譜中通過在343nrn處進(jìn)行激發(fā)，在480nm處形成受激子帶(未公開的數(shù)據(jù))。Watson-Crick型雙鏈體中兩種不同的芘嵌入核酸INA和TINA在熒光光鐠和雜交性能方面的區(qū)別清楚地說明將額外的l-苯基乙炔基部分加入到(7)-1-0-(l-芘基甲基)甘油(INA)的芳香族部分的結(jié)果。根據(jù)這項工作，我們也已經(jīng)顯示芘與三鏈體親和力差的普通意思不是全面的特征，因為我們已經(jīng)成功地將芘適當(dāng)?shù)刂糜贖oogsteen型三鏈體中。對dsDNA的穩(wěn)定性僅有非常小的影響的嵌入劑，其穩(wěn)定平行三鏈體結(jié)構(gòu)的能力是已知的。因此，2-(2-萘基)會啉-4-胺及其類似物的加入導(dǎo)致三鏈體DNA相當(dāng)大的穩(wěn)定化[對于2-(2-萘基)喹啉-4-胺，Arm=35.6°C]，其對雙鏈體DNA雜交親和力提高較低(Arm=5.5°C)。類似的工作報道了寡聚脫氧核苷酸的合成和雜交性能，其中所述寡聚脫氧核苷酸具有二萘嵌苯直接偶聯(lián)或者通過丙基連接體偶聯(lián)到2，-脫氧核糖殘基的異頭位上。具有多環(huán)部分的TINA比單體三鏈體-特異性嵌入劑的優(yōu)點之一是TINA可以被插入到序列期望的位置多次，而不是在溶液中使用過量的嵌入劑。而且這里所描述的對于TINA,平行三鏈體和雙鏈體的高穩(wěn)定化以及反向平行雙鏈體的去穩(wěn)定化，對于共價附著到寡聚脫氧核苷酸的其它嵌入系統(tǒng)，至今還沒有被觀察過。在這種情況中，當(dāng)摻入TINA作為多個凸起插入到寡聚脫氧核苷酸中時，該寡聚脫氧核糖核酸是具有區(qū)分dsDNA和ssDNA能力的獨特的分子。當(dāng)將它們的三鏈體和反向平行雙鏈體的穩(wěn)定性在pH6.0和pH5.0下進(jìn)行比較(表1)時，從ON13和ON14中可以清楚地看出該特征。這揭示了在檢測平行三鏈體形成時，減少來自雙鏈體形成的假陽性數(shù)目的可能性。例如，這種情況可以是在非變性條件下基因組上的熒光原位雜交(FISH),以及用于使用三鏈螺旋親和層析或者三鏈螺旋親和沉淀純化質(zhì)粒DNA,這些是能夠在pH6.0和pH5.0下進(jìn)行的。對平行三鏈體形成和雙鏈體形成的這種類型的區(qū)分不能夠使用已知也能夠穩(wěn)定反向平行雙鏈體的形成三鏈體的寡聚物例如PNA、LNA或N3，-〉P5，氨基磷酸酯達(dá)到。使用Sonogoshira型合成后修飾具有(7)(4-碘苯基)曱基甘油的寡聚核苷酸，我們篩選了幾種扭轉(zhuǎn)嵌入核酸(TINA)，以獲得它們提高Hoogsteen配對的雙鏈體和三鏈體的熱穩(wěn)定性的能力。在寡聚脫氧核苷酸中插入(i)-1-644-(l-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油(5)作為凸起被發(fā)現(xiàn)是最有效的TINA，其具有區(qū)分匹配和錯配的序列的良好性能。與天然雙鏈體相比，通過在該序列的中部插入TINA，可以去穩(wěn)定化Watson-Crick型DNA/DNA和DNA/RNA雙鏈體。我們相信TINA是第一個共價結(jié)合到寡聚脫氧核苷酸上的嵌入體系，其作為凸起表現(xiàn)出對Hoogsteen堿基配對的提高的親和力，以及對Watson-Crick型螺旋降低的親和力。亞磷酰胺8的短合成路線，以及對寡聚核苦酸的合成后Sonogashira修飾時TINA與其他穩(wěn)定三鏈體的核酸相比有竟?fàn)幜Φ膬?yōu)勢。通過在一條鏈上研究雙重插入TINA(5)，可以得出結(jié)論將3個核酸堿基置于兩個凸起的(i)-1-C44-(l-芘基乙炔基)苯基曱基]甘油之間對于HoogsteenDNA螺旋的高熱穩(wěn)定性可以是最佳的。另一方面，通過在嘧啶DNA序列插入5作為下一個最接近的凸起的鄰近者，不同的熒光性能(形成受激子帶)可以用于檢測平行三鏈體、平行dsDNA和反向平行dsDNA的形成。使用單凸起插入5在12-19°C范圍提高熱穩(wěn)定性，可以用于降低所需的TFO長度。而且，在pH7.0下，可以獲得Hoogsteen型雙鏈體和三鏈體的良好熱穩(wěn)定性，即使序列中存在多個胞嘧啶(在本工作中最高達(dá)到36%)。在適當(dāng)條件下(序列、pH、鹽濃度等)，5的多次插入可以用于將較不穩(wěn)定的Hoogsteen雙鏈體的解鏈溫度提高到相同長度的Watson-Crick雙鏈體的水平?？紤]到開發(fā)具有對在dsDNA中C-G和T-A轉(zhuǎn)換位點有高親和力的^皮修飾核酸石威基以及交替鏈(alternate-stranded)三鏈體，我們認(rèn)為三鏈體形成的這類改進(jìn)將擴(kuò)大TINA的適應(yīng)性。通過將5插入到環(huán)狀寡聚脫氧核苷酸的嘧咬鏈或者向目標(biāo)ssDNA和ssRNA插入夾子(clamp)而穩(wěn)定三鏈體的能力也是顯然有可能的。作為下一步，研究致力于插入TINA和INA對不同于經(jīng)典的Watson-Crick和Hoogsteen復(fù)合物的核酸螺旋穩(wěn)定性的影響。因此，核酸類似物仍然有有限的實用性，其能夠穩(wěn)定反向Hoogsteen堿基配對，i-基序(C-C+堿基對)或四鏈體(富含G的序歹'J)。我們相信，TINA穩(wěn)定平行三鏈體和雙鏈體以及區(qū)分Hoogsteen和Watson-Crick型核酸螺旋的能力，可以使TINA在設(shè)計生物和納米技術(shù)中基于DNA的工具中非常有用，其中特異性的識別、高熱穩(wěn)定性和自組織或重組織是極其重要的。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>在VarianGemini2000光譜儀上以對于為300MHz,對于13C為75MHz記錄NMR光譜。在&NMR光語中所使用的內(nèi)標(biāo)是對于CDC13為TMS(&0.00);在13C而R中為CDC13(》77.0)。使用4.7TeslaUltimaFourier轉(zhuǎn)化(FT)質(zhì)譜儀(IonSpec,Irvine,CA)進(jìn)行精確的離子質(zhì)譜測定。使用來自2,5-二羥基苯曱酸(2，5-dihydroxybenzoicacid)基質(zhì)的離子對[M+Na]+離子進(jìn)行峰匹配。使用從Merck購買的TLC板60F254進(jìn)行薄層色譜(TLC)分析，并在UV光(254nm)下進(jìn)行顯影。用于柱層析的硅膠(0.040-0.063mm)是從Merck購買的。用于柱層析的溶劑在使用之前被蒸餾，而試劑是以購買時的狀態(tài)進(jìn)行使用的。實施例2制備(s)-1-(4,4，-二甲氧基三苯基曱氧基)-3-(4-碘芐氧基)丙隱2-醇。在Dean-Stark條件下，在曱苯(80mL)中，存在KOH(8.8g，154.0mmol)的情況下，將(S)-(+)-2，2-二曱基-l,3-二氧戊環(huán)-4-曱醇(6，1.17g，8.9mmol)和4_硪千基溴(2.5g，8.4mmol)回流12小時。使反應(yīng)混合物冷卻，并加入H2O(30mL)。在進(jìn)行相分離后，使用甲苯(2x15mL)將水層進(jìn)行清洗。使用H20(30mL)將組合的有機(jī)相進(jìn)行清洗，并在真空中進(jìn)行濃縮。使用80。/。的含水AcOH(25mL)對殘余物在室溫下處理48小時。在真空中去除溶劑，并使用曱苯/EtOH(30mL,5:1，v/v)共蒸發(fā)兩次。在減低的壓力下對殘余物進(jìn)行干燥以提供作為微黃色油的(A)-3-(4-碘芐氧基)丙-l，2-醇(7，100%，2.3g),其在下一步中直接被使用，而不需要進(jìn)一步純化。將該油(2.3g，8.4mmol)溶解在無水吡啶(25mL)中，并在氮氣中加入4,4，-二曱氧基三苯甲基氯(3.5g,10.4mmol)。24小時后,加入MeOH(2mL)，即接著加入EtOAc(150mL),并使用標(biāo)準(zhǔn)含水NaHC03(40mL><2)對該混合物進(jìn)行萃取。使用EtOAc(20mLx2)對水相進(jìn)行萃取。將組合的有機(jī)層進(jìn)行干燥(Na2S04)、過濾并在減低的壓力下蒸發(fā)。使用曱苯/EtOH(25mL，1:1，v/v)共蒸發(fā)殘余物兩次。殘余物被從EtOAc(30mL)吸附到硅膠(1.5g)上，并使用石油醚中的EtOAc(0-30%,v/v)千燥柱真空層析進(jìn)行純化，以提供作為黃色泡沫的化合物(S)-1-(4，4，-二曱氧基三苯基曱氧基)-3-(4-碘千氧基)丙-2-醇(70%，3.6g)。'HNMR(CDC13)S2.42(br.s"1H,OH),3.20(m,2H,CH(OH)C772OCH2)，3.56(m，2H,CH2ODMT),3.78(s，6H,2><OCH3),3.97(m,1H,CM)H),4.43(s，2H,CH2Ar),6.78(d,4H,8.5Hz，DMT)，7.00(d，2H，/=8.0Hz，碘苯基)，7.30-7.45(m，9H,DMT)，7.63(d,2H,/=8.0Hz,碘苯基)；13C固R(CDC13)55.2(OCH3),62.2(CH2ODMT)，69.9(CH(OH)CH2OCH2),71.6(CHOH),72.6(012-碘苯基)，86.1[C(Ar)3]，93.1，129.4，137.4，137.7(捵苯基)，113.1,126.7,127.8，128.1，130.0，135.9,144.7,158.5(DMT)。HR-MALDI-MS計算為C31H31I05Na[M+Na]+附/z633.1108,實驗結(jié)果為w/z633.1116。實施例3制備(S)-2-0-[2-氰乙氧基(二異丙基氨基)膦基]-l-O-(4,4，-二甲氧基三苯基曱基)-3-0-(4-碘千基)甘油(方案2中的化合物8)。在氮氣中將(S)-1-U,4，-二曱氧基三苯基曱氧基)-3-(4-碘芐氧基)丙--2-醇(2.0g，3.3mmo1)溶解在無水CH2C12(50niL)中。在使用冰水浴進(jìn)行外部冷卻的情況下，力口入AVV-四口坐二異丙銨(diisopropylammoniumtetrazolide)(0.850g,5.0mmol)，并接著逐滴加入2-氰乙基四異丙基亞磷酰二胺(l.lg,3.7mmol)。在16小時后，分析TLC顯示不再有原材料，使用H20(30mL)結(jié)束反應(yīng)。使層分離，并使用H20(30mL)清洗有機(jī)相。使用CH2C12(25mL)清洗組合的水層。干燥(Na2S04)有機(jī)相、過濾，并加入硅膠(1.5g)和吡啶(0.5mL)，在減低的壓力下去除溶劑。使用利用NEt3(0.5%,v/v)/EtOAc(0-25%,)/石油醚的硅膠干燥柱真空層析純化殘余物。將組合的UV-活性餾分進(jìn)行真空蒸發(fā)，這提供了作為泡沫的最終化合物8(1.8g,67%),其被用于ODN合成。32PNMR(CDC13)S149.8，149.9,比例為1:1。HR畫ESI-MS計算為C40H46IO6N2PLi[M+Li]+m/z817.2449,實驗結(jié)果為附/z817.2447。實施例4制備U)-l-O-(4，4，-二曱氧基三苯基曱基)-3-0-[4-(l-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油。向(a)_3—(4國缺千氧基)丙-l,2-二醇(4.2mmol)的dmf(40mL)溶液中，加入EtgN(5.8mL),并將使用氬氣吹泡經(jīng)過溶液30分鐘。之后，在氬氣下，溶解l-乙炔基芘(1.05g,4.65mmol),并將Cul(56mg,0.3mmol)和Pd(PPh3)4(125mg，0.11mmol)加入到該溶液中。在室溫下氬氣中攪拌反應(yīng)混合物過夜，接著加入CH2Cl2(150mL)，并使用0.3MEDTA銨鹽的水溶液(2x75mL)進(jìn)行萃取。使用H20(3x75mL)對有機(jī)層進(jìn)行清洗，干燥(Na2S04),過濾并在真空中蒸發(fā)至干燥。使用甲苯/EtOH(30mL，1:1,v/v)對殘余物共蒸發(fā)兩次，這提供了作為油的1-6>-[4-(l-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油(3.1g)。將該油與吡啶(20mL)進(jìn)行共蒸發(fā)，接著溶解在無水吡。定(50mL)中，并使用冰水浴進(jìn)行冷卻，接著在氬氣下加入4,4，-二甲氧基三苯曱基氯(1.45g，4.41mmo1)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物16個小時，接著加入額夕l、一部分4，4，-二甲氧基三苯曱基氯(0.5g,1.5mmo1)。24小時后,TLC顯示不再有原材料，使用MeOH(2mL)停止反應(yīng)，并使用EtOAc(150mL)進(jìn)行稀釋，使用標(biāo)準(zhǔn)含水NaHC03(100mLx2)進(jìn)行萃取。使用EtOAc(50mLx2)對水相進(jìn)行萃取。將組合的有機(jī)層進(jìn)行干燥(Na2S04)、過濾，并在減低的壓力下進(jìn)行蒸發(fā)。使用曱苯/EtOH(25mL,1:1，v/v)對殘余物共蒸發(fā)兩次。將殘余物從EtOAc(50mL)吸附在硅膠(2.0g)，并使用利用環(huán)己烷中的EtOAc(0-100%，v/v)的干燥柱真空層析進(jìn)行純化，以獲得作為黃色泡沫的")(4,4，-二曱氧基三苯基曱基)-3-0-[4-(l-芘基乙炔基)苯基曱基]甘油(60%，L75g)。'HNMR(CDC13)S2.48(d，lH，J^5.0Hz，OH),3.24(m，2H，CH(OH)O/20CH2),3.31(m,2H,CH2ODMT),3.78(s，6H,2xOCH3),4.00(m,1H,O/0H),4.58(s,2H,CH2Ar)，6.80(d，4H,/=8.5Hz，DMT)，7.10-7.45(m，11H,DMT),7.72(d,2H,/=8.0Hz,苯基)，8.00-8.30(m,9H，芘-l-基)；13CNMR(CDC13)55.2(OCH3),64.3(CH2ODMT),70.0(CH(OH)CH2OCH2)，71.7(CHOH)，苦.9(CH2-苯基)，86.1[C(Ar)3],88.7,94.9(CC),117.7,127.7,138.5，139.4(苯基)，113.1,124.5-131.8,136.0,144.8，158.5(DMT,芘畫l-基)。HR畫MALDI畫MS:附/z計算為C49H40Na+O5[M+Na]+731.2768，實驗結(jié)果為731.2739。實施例5制備U)-2-0-[2-氰乙氧基(二異丙基氨基)膦基]-l-O-(4,4，-二曱氧基三苯基甲基)-3-6>-[4-(l-芘基乙炔基)苯基曱基]甘油。使用與化合物8相同的步驟，利用U)(4,4，-二曱氧基三苯基甲基)-3-0-[4-(l-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油(1.7g，2.4mmo1)、iV，iV-四唑二異丙銨(0.620g，3.6mmo1)、2-氰乙基四異丙基亞磷酰二胺(1.150g，3.8mmol)、無水CH2Cl2(50mL)進(jìn)行24小時，制備該化合物。獲得了作為泡沫的最終化合物(1.8g,83°/。)，其被用于ODN合成。32PNMR(CDC13)S150.3，150.5比例為3:2。HR-MALDI-MS:w/z計算為C58H57N2Na+06P[M+Na]十931.3846，實驗結(jié)果為931.3814。實施例6使用合成后的途徑合成和純化TINA。在來自AppliedBiosystems的ExpediteTM核酸合成系統(tǒng)模型(NucleicAcidSynthesisSystemModel)8909上合成ODN，其使用4，5-二氰基咪唑作為激活劑，以及增加的去保護(hù)時間(IOO秒)和偶聯(lián)時間(2分鐘)，以得到干MeCN/CH2Cl21:1混合物中的0.075M亞磷酰胺8溶液。合成DNA后，在偶聯(lián)反應(yīng)之前，使用氬氣(2分鐘)對具有CPG-支持物和含有4-碘苯基部分的DMT-on寡聚核苷酸的柱進(jìn)行沖洗。在干燥條件，室溫下，在lmL塑料注射器中準(zhǔn)備Sonogashira偶聯(lián)試劑混合物，其含有在干DMF/Et3N(3.5/1.5,500)iL)中的Pd(PPh3)4或Pd(PPh3)2Cl2(7.5mM)、具有末端乙炔基的芳香族結(jié)構(gòu)(22.5mM)以及CuI(7.5mM)。在使用之前，也將注射器使用氬氣進(jìn)行沖洗。將具有Sonogashira偶聯(lián)試劑混合物的注射器連接到具有CPG的柱上，并從柱的另一側(cè)連接另一個空注射器。使用反應(yīng)混合物利用注射器將具有CPG支持物的纟務(wù)飾的寡聚核苷酸清洗多次。每45分鐘后，重復(fù)最后的操作。3~4小時后，將反應(yīng)混合物從支持物去除，并使用DMF(2x0.5mL)和CH3CN(2xlmL)對柱進(jìn)行清洗，并干燥。在ON12-ON14、ON21和ON24的情況中，使用新制的Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)混合物對CPG支持物處理一次或者多次。之后，使用320/。的氨水將5，-DMT-on寡聚核苷酸從固體支持物上斷裂(室溫，2小時)并去保護(hù)(55°C,過夜)。使用反向半制備HPLC在WatersXterraTMMSC"柱上完成純化5，-(9-DMT-onTINA。將ODN在10010%的醋酸水溶液(30min)進(jìn)行DMT去保護(hù)，并在32%的氨水(lmL)進(jìn)行稀釋，并在HPLC上再次純化。將具有ODN的響應(yīng)餾分進(jìn)行蒸發(fā)，使用1M含水NaOAc(150)iL)進(jìn)行稀釋，并從乙醇(550)中沉淀ODN。通過MALDI-TOF分析在來自PerSeptiveBiosystems的VoyagerElite活組織分光度測量術(shù)研究站(BiospectrometryResearchStation)上確認(rèn)被修飾的ODN。使用來自MerckHitachi的LaChrom系統(tǒng)在GenPak-Fax柱(Waters)上，通過離子交換層析;險測最終TFO的純度。實施例7使用U)-2-6>-[2-氰乙氧基(二異丙基氨基)膦基]-l-O-(4,4，-二甲氧基三苯基曱基)-3-(9-[4-(l-芘基乙炔基)苯基甲基]甘油合成和純化TINA。在來自AppliedBiosystems的Expedite核酸合成系統(tǒng)模型(NucleicAcidSynthesisSystemModel)8卯9上合成ODN，其使用4,5-二氰基咪唑作為激活劑，以及增加的去保護(hù)時間(IOO秒)和偶聯(lián)時間(2分鐘)，以得到干MeCN/CH2Cl2l:1混合物中的所述0.075M亞磷酰胺溶液。在完成DNA合成后，使用32。/Q的氨水，將5，-DMT-on寡聚核苷酸從固體支持物上斷裂(室溫，2小時)并去保護(hù)(55°C，過夜)。使用反向半制備HPLC在WatersXterraMSd8柱上完成純化5，-0-DMT-onTINA。將ODN在100|llL80%的醋酸水溶液(30min)進(jìn)行DMT去保護(hù)，并在1M的NaOAc水溶液(150|^L)中進(jìn)行稀釋，并在乙醇(550)_iL)中沉淀。通過MALDI-TOF分析在來自PerSeptiveBiosystems的VoyagerEliteBiospectrometryResearchStation上確i人被修飾的ODN。使用來自MerckHitachi的LaChrom系統(tǒng)在GenPak-Fax柱(Waters)上，通過離子交換層析檢測最終TFO的純度。實施例8檢測解鏈溫度在Perkin-ElmerUV/VIS光譜儀Lambda35上進(jìn)行解鏈溫度的檢測，其被安裝有PTP-6溫度程序儀(programmer)。形成所述三鏈體，通過首先在相應(yīng)的緩沖液溶液中混合Watson-Crick雙鏈體的兩條鏈，每條鏈的濃度都是1.0nM。將溶液加熱到80°C5分鐘，冷卻到室溫，并加入第3鏈(TFO),接著保持在15。C30分鐘。在相應(yīng)的緩沖液溶液中混合兩條鏈，每條鏈的濃度都是1.0nM，接著加熱到70°C5分鐘，然后冷卻到室溫，形成所述雙鏈體。才艮據(jù)通過檢測260nm處的吸光度針對漸增溫度(每1分鐘l.(TC)獲得的解鏈曲線的一階導(dǎo)數(shù)圖的最大值，確定解鏈溫度(4,。C)。較慢速度升高溫度的(每1分鐘0.5°C)獲得了相同的曲線。還在373nm處進(jìn)行實驗。根據(jù)重復(fù)實驗所確定的，所有的解鏈溫度都在士l.(TC的偏差之內(nèi)。實施例9熒光檢測熒光一企測是在Perkin-Elmer熒光光譜儀LS-55上進(jìn)行的，其被裝配JulaboF25溫度控制儀。以與4檢測中相同的方式形成三鏈體和雙鏈體，除了在所有的情況中僅使用1.0|iMTFO。在20mM卡可基酸鈉、100mMNaCl、10mMMgCl2,pH6.0的緩沖液中l(wèi)(TC下記錄光譜。實施例10對所合成寡聚核苷酸的MALDI-TOFMS、反向(DMT-on)和離子交換(DMT-off)HPLC分析寡聚核苷酸/z7/z[M+H]+，m/z[M+H]+，RP-HPLC，7tIE-HPLC，計算值(Da)實驗結(jié)果(Da)(分鐘)w純度["]0N24490.84489.215.190%0N34489.14488.915.2/38.lw90%0N44541.14541.616.295%0N54516.04518.215.895%0N64589.24589.216.096%0N74589.24593.016.193%0N84589.24588.216.195%0N94589.24588.216.397%0N104589.24589.218.791%0N115054.65058.918.694%0N125054.65060.117.4/32.9〔c]93%0N135054.65058.017.197%0N145054.65058.217.093%0N205510.85513.116.295%0N215802.45799.727.86%0N234081.84083.116.288%0N244549.34551.217.491%0N264143.84143.915.885%a]WatersDeltaPrep4000制備型層析系統(tǒng)。緩沖液A[950mL0.1MNH4HC03和50mLCH3CN,(pH=9.0)]以及緩沖液B[250mL0.1NH4HC03和750mLCH3CN，(pH=9.0)]。流速2.5mL/min。梯度4分鐘100%A,11分鐘內(nèi)線性梯度到100%B，5分鐘內(nèi)100%B,接著在2分鐘內(nèi)線性梯度到100%A,以及3分鐘內(nèi)100%A;[b]WatersDeltaPrep4000制備型層析系統(tǒng)，與問的緩沖液相同。流速1.0mL/分鐘。梯度5分鐘100。/。A,30分鐘內(nèi)線性梯度到70%B，在70%B2分鐘，8分鐘內(nèi)到達(dá)100%B，接著在15分鐘內(nèi)到達(dá)100%A;[c]WatersDeltaPrep700半制備型層析系統(tǒng)。緩沖液A[H20中0.05M三乙基醋酸銨(pH=7.0)]和緩沖液B(H20中75%CH3CN)。流速2.5mL/min。梯度2分鐘100%A,38分鐘內(nèi)線性梯度到達(dá)70%B,7分鐘內(nèi)線性梯度到達(dá)100%B，100%B3分鐘，接著IO分鐘內(nèi)100%A;[d]在GenPak-Fax柱上(Waters)的來自MerckHitachi的LaChrom系統(tǒng)。緩沖液A[H20中25mMTris.HCl、10mMEDTA(pH=8.0)]以及緩沖液B(H20中1MNaCl)。流速0.75mL/分鐘。梯度5分鐘97%A和3%B,41分鐘內(nèi)線性梯度到達(dá)35。/。B，3分鐘內(nèi)到達(dá)75。/。B，接著10分鐘內(nèi)97%A和3%B。權(quán)利要求1.一種柔性堿基堆積的單體，其具有下列通用結(jié)構(gòu)X-L-I1-C-I2其中，X是主鏈單體單元，其能夠被摻入到寡聚核苷酸或寡聚核苷酸類似物或PNA或PNA類似物的主鏈中；L是連接體；I1是第一嵌入劑，其含有至少一種基本平面的共軛體系，其能夠與DNA、RNA或它們的類似物的核酸堿基共堆積；C是共軛劑；I2是第二嵌入劑，其含有至少一種基本平面的共軛體系，其能夠與DNA、RNA或它們的類似物的核酸堿基共堆積。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柔性堿基堆積的單體，其中，X能夠被摻入到下列寡聚核苷酸中DNA、RNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、INA、CeNA、TNA、(2，-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、ot-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、p-D-核糖-LNA、卩-D-木糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環(huán)-DNA、6-氨基-雙環(huán)-DNA、5-表畫雙環(huán)-DNA、a-雙環(huán)-DNA、三環(huán)-DNA、雙環(huán)[4.3.0]-DNA、雙環(huán)[3.2.1]-DNA、雙環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA、(3-D-核糖吡喃基-NA、a-L-來蘇糖吡喃基-NA、2，-R-RNA、2'-0R-RNA、2'-AE-RNA、a-L-RNA、(3-D-RNA以及它們的組合和修飾。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的柔性堿基堆積的單體，其中，所述主鏈單體單元X包括亞烷基二醇基例如乙二醇基或者l-O-亞曱基丙三醇，其可選擇地具有部分包含在環(huán)體系中的亞烷基二醇基例如糖基。4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其中，所述L包含0~60個原子。5.根據(jù)權(quán)利要求14中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其中，所述L含有鏈或環(huán)或它們的組合和/或它們的取代物。6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其中，所述L含有烷基鏈或氧雜烷基鏈或者氮雜烷基鏈或硫代烷基或羧酰胺基或硫代羧酰胺基或者磺酰胺基或它們的組合。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其中，所述I,是單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)體系，其可選擇地選自由苯、萘、甘菊環(huán)、雙環(huán)雜芳環(huán)體系以及它們的取代物所組成的組中。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其中，所述C選自由112個碳的烷基、212個碳的烯基、2-25個碳的炔基、或重氮基或長度不超過25個碳原子和/或氮原子的它們的組合所組成的組中。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的柔性堿基堆積的單體，其中，所述炔基是乙炔基或重復(fù)的乙炔基。10.根據(jù)權(quán)利要求1或8中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其中，11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其中，所述主鏈單體單元X的單元長度小于6個原子。12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其中，所述L的長度為至少2個原子。13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其中，所述12選自由雙環(huán)芳香環(huán)體系、三環(huán)芳香環(huán)體系、四環(huán)芳香環(huán)體系、五環(huán)芳香環(huán)體系以及它們的芳雜環(huán)類似物和它們的取代物所組成的組中。14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其適合摻入到寡聚核苷酸中，其中，所述單體選自由亞磷酰胺、亞磷酰二胺、磷酸二酯、磷酸三酯、膦酸酯、H-膦酸酯、亞磷酸酯、氯代亞磷酸酯、氯代亞磷酰胺、膦酰胺、膦酰氯、三磷酸酯、二磷酸酯所組成的組中。15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的柔性堿基堆積的單體，其具有下式0=p-O'其中，R選自由芳基乙炔基所組成的組中。16.—種寡聚核苷酸，其包含前述權(quán)利要求中任一項所述的柔性堿基堆積的單體。17.—種制備柔性堿基堆積的單體的方法，其包括下列步驟提供柔性堿基堆積的單體的前體，其中，所述前體是包含被卣素取代或被C取代或被疊氮化物取代的Ii的柔性堿基堆積的單體；將步驟a的前體中所述卣素或C取代基或者疊氮化物取代基替換為C-i2;使C-l2取代的柔性堿基堆積的單體的前體適合摻入到寡聚核苷酸中。18.—種制備包含柔性堿基堆積的單體的寡聚核香酸的方法，其包括下列步驟提供適合摻入到寡聚核苷酸中的柔性堿基堆積的單體；提供用于合成寡聚核香酸的標(biāo)準(zhǔn)試劑；在寡聚核苷酸的合成中，將一種或者多種柔性堿基堆積的單體摻入到寡聚核苷酸中；這樣產(chǎn)生了包含柔性主鏈單體的寡聚核苷酸。19.一種制備包含柔性堿基堆積的單體的寡聚核香酸的方法，其包括下列步驟提供適合摻入到寡聚核苷酸中的柔性單體的前體，其中，所述前體是包含被面素取代或者被C取代或者被疊氮化物取代的I,的柔性堿基堆積的單體；提供用于合成寡聚核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)試劑；在寡聚核苷酸的合成過程中，將一種或者多種柔性^喊基堆積的單體的前體摻入到寡聚核苷酸中；在合成寡聚核苷酸之后，將^上的所述閨素或C取代基或者疊氮化物取代基替換為C-12;這樣產(chǎn)生了含有柔性堿基堆積的單體的寡聚核苷酸。20.權(quán)利要求16所述的寡聚核苷酸在雙鏈核酸結(jié)構(gòu)或三鏈體核酸結(jié)構(gòu)形成中的應(yīng)用。21.—種形成雙鏈核酸和三鏈體核酸的方法，其包括下列步驟提供權(quán)利要求16所述的寡聚核苷酸；提供單鏈或雙鏈目標(biāo)核酸；將步驟a的寡聚核苷酸與步驟b的單鏈或雙鏈目標(biāo)核酸在雙鏈體或三鏈體形成的條件下進(jìn)行孵育；這樣，形成了雙鏈核酸或者三鏈體核酸結(jié)構(gòu)。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，雙鏈體或三鏈體核酸結(jié)構(gòu)的形成被用于對目標(biāo)核酸的活性進(jìn)行序列特異性的調(diào)節(jié)。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述目標(biāo)核酸選自由染色體基因、mRNA、rRNA、tRNA和微RNA所組成的組中。24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，形成雙鏈體或三鏈體核酸結(jié)構(gòu)被用于對目標(biāo)核酸的序列特異性檢測。25.權(quán)利要求16所述的寡聚核苷酸作為藥物的應(yīng)用。26.權(quán)利要求16所述的寡聚核苷酸用于制備藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明描述了一種柔性堿基堆積的單體，其可以被摻入到寡聚核苷酸或寡聚核苷酸的類似物中，以及形成三鏈體的包含柔性堿基堆積的單體的寡聚核苷酸中。本發(fā)明中形成三鏈體的寡聚核苷酸能夠序列特異性地結(jié)合到雙鏈目標(biāo)核酸上，并因此可以用于目標(biāo)核酸活性的調(diào)節(jié)以及目標(biāo)核酸的檢測。文檔編號C07H21/00GK101238213SQ200680022963公開日2008年8月6日申請日期2006年5月24日優(yōu)先權(quán)日2005年5月25日發(fā)明者埃里克·比耶勒高·彼澤森,維亞切斯拉夫·V·菲利切夫申請人:蒂納控股有限責(zé)任公司