專利名稱：：癌癥特異性pcna同種型結(jié)合性抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文的公開內(nèi)容涉及惡性細(xì)胞的檢測和治療，包括使用特異性結(jié)合癌癥特異性蛋白的抗體。
背景技術(shù)：
：在細(xì)胞變成惡性細(xì)胞時發(fā)生的轉(zhuǎn)化是了解得最少且最復(fù)雜的疾病過程之一。該過程涉及遺傳突變和蛋白體轉(zhuǎn)化，其結(jié)果是使細(xì)胞逃脫正常控制；阻止不適宜的細(xì)胞分裂。所有癌癥都是獨一無二的，與其它細(xì)胞以及其它癌癥截然不同。盡管存在這種獨特性，但癌細(xì)胞共有某些相同特性。大部分癌細(xì)胞在正常的細(xì)胞周期控制之外增殖，表現(xiàn)出形態(tài)變化，并表現(xiàn)出對細(xì)胞過程的各種生物化學(xué)破壞。通常在開始出現(xiàn)細(xì)胞變化后腫瘤變得充分可見時診斷出癌癥。許多癌癥在依據(jù)組織學(xué)檢驗活檢樣品的形態(tài)異常后被診斷出來，形態(tài)異常證明細(xì)胞增殖和遺傳無規(guī)律。惡性腫瘤的有效治療經(jīng)常依賴于在疾病早期可靠地檢測惡性細(xì)胞的存在情況的能力，使得有效治療可在疾病對此治療最敏感的階段開始。因此，需要能夠可靠地檢測潛在的惡性細(xì)胞，此惡性細(xì)胞還沒有發(fā)展至被看作惡性腫瘤的組織學(xué)階段，但可發(fā)展至惡性腫瘤狀態(tài)。還需要快速的、侵入性最低的技術(shù)，該技術(shù)能夠可靠地檢測或治療惡性細(xì)胞或潛在的惡性細(xì)胞。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是一種29kDa的核蛋白，其在細(xì)胞周期的S期和G2期時于細(xì)胞中的表達(dá)使該蛋白成為良好的細(xì)胞增殖標(biāo)記。還已經(jīng)表明，在許多分子途徑中的配偶體負(fù)責(zé)細(xì)胞的生命和死亡。其在S期細(xì)胞核中的周期性出現(xiàn)提示與DNA復(fù)制有關(guān)聯(lián)。PCNA后來被鑒別為哺乳動物細(xì)胞中的DNA聚合酶輔助因子和體外SV40DNA復(fù)制的必需因子。除了在哺乳動物細(xì)胞中用作DNA滑動鉗蛋白和DNA聚合酶輔助因子以外，PCNA還與涉及轉(zhuǎn)錄、細(xì)月^周期關(guān)卡、重組、凋亡和其它形式的DNA修復(fù)的眾多其它蛋白相互作用。除了作用不同之外，PCNA的許多結(jié)合配偶體還通過其對每種新一代細(xì)胞的細(xì)胞功能的精確遺傳的影響而連鎖。PCNA可用作協(xié)調(diào)染色體加工的主要分子。惡性癌細(xì)胞表達(dá)一種稱為癌癥特異性PCNA(csPCNA)的PCNA同種型，而非惡性細(xì)胞表達(dá)一種稱為非惡性細(xì)胞PCNA(nmPCNA)的同種型。癌癥的診斷和治療需要辨別兩種同種型的有效組合物和方法。發(fā)明概述本發(fā)明公開了增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)癌癥特異性同種型的抗體及其用途?？贵w特異性結(jié)合癌癥特異性PCNA同種型，但不結(jié)合非惡性PCNA同種型(nmPCNA)?？贵w由含肽的免疫原產(chǎn)生，所述肽包含的氨基酸序列存在于與著色性干皮病群G(XPG)蛋白相互作用的csPCNA蛋白區(qū)上。對應(yīng)于人PCNA蛋白的氨基酸殘基126-133的肽區(qū)SEQIDNO.:1(LeuGlylleProGluGlnGluTyr)是一種適于產(chǎn)生csPCNA抗體的抗原性肽。本文公開的抗原性肽可包含改善肽的免疫原性而不顯著干擾所獲csPCNA抗體的特異性的額外氨基酸殘基。例如，所述肽可具有SEQIDNO:2(CysGlyGlyGlyLeuGlylleProGluGlnGluTyr)的氨基酸序列。所獲抗體可為多克隆抗體或單克隆抗體或其片段。本文公開的分離抗體特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型。csPCNA同種型包含SEQIDNO:3的氨基酸序列以及不影響csPCNA特異性抗體的特異性的任意變異、突變，包括置換、插入和缺失。csPCNA特異性抗體不結(jié)合nmPCNA同種型。在一個實施方案中，抗體結(jié)合的表位包含的氨基酸序列處于結(jié)合著色性干皮病群G(XPG)蛋白的csPCNA蛋白中。在一個實施方案中，抗體結(jié)合的csPCNA表位包含的氨基酸序列選自LGIPEQEY(SEQIDNO:l)、VEQLGIPEQEY(SEQIDNO:5)、LGIPEQEYSCVVK(SEQEDNO:6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(SEQIDNO:7)、EQLGIPEQEY(SEQIDNO:8)、QLGIPEQEY(SEQIDNO:9)、LGIPEQEYSCWKMPS(SEQIDNO:IO)、LGIPEQEYSCWKMP(SEQIDNO:ll)、LGIPEQEYSCWKM(SEQIDNO:12)、LGIPEQEYSCVV(SEQIDNO:13)、LGIPEQEYSCV(SEQIDNO:14)和LGIPEQEYSC(SEQIDNO:15)。在一個實施方案中，抗體包括單克隆抗體或嵌合抗體或重組抗體或單鏈抗體。在一個實施方案中，所述抗體是選自Fab、Fab'或F(ab')2的抗體片段。所述抗體可結(jié)合可檢測物質(zhì)，所述可檢測物質(zhì)選自熒光標(biāo)記、方丈射寸生沖示^己、發(fā)光才示i己和酶才示i己。一種組合物包含分離的且大致純化的抗體，所述抗體特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)的表位，其中所述表位包含氨基酸序列LeuGlylleProGluGlnGluTyr(SEQIDNO:1)。一種檢測生物樣品中的癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的方法包括以下步驟使生物樣品與特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的抗體接觸；提供用于抗體結(jié)合的條件；以及檢測抗體與csPCNA同種型的結(jié)合。在一個實施方案中，所述生物樣品是體液，選自血液、.血漿、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、胃液、胰液、腹水、滑液、乳液和精液。任意體液都是適宜的，只要懷疑其含有csPCNA同種型或PCNA同種型。在一個實施方案中，所述生物樣品是組織樣品，選自乳腺、前列腺、肺、結(jié)腸、上皮、結(jié)締組織、子宮頸、食道、腦、胸腺、甲狀腺、胰腺、睪丸、卵巢、腸、膀胱、胃、軟組織瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、癌、腺癌、胎盤、纖維組織、胚細(xì)胞組織及其提取物。在一個實施方案中，所述抗體檢測步驟在體內(nèi)或體外進(jìn)行。在一個實施方案中，所述抗體檢測通過提供標(biāo)記的二抗進(jìn)行。在另一個實施方案中，標(biāo)記特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的抗體。在另一個實施方案中，結(jié)合csPCNA特異性抗體的csPCNA同種型的檢測使用質(zhì)譜分析進(jìn)行。在一個實施方案中，csPCNA同種型的檢測使用酶聯(lián)免疫吸附測定進(jìn)行。在一個實施方案中，csPCNA同種型的檢測使用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行。結(jié)合csPCNA特異性抗體或使用csPCNA特異性抗體分離的csPCNA同種型的檢測不限于任何具體的檢測技術(shù)。一種診斷或預(yù)后惡性腫瘤的方法包括以下步驟通過特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的抗體檢測由動物獲得的生物樣品中的csPCNA;并基于生物樣品中的csPCNA檢測診斷惡性腫瘤。在一個實施方案中，所述動物是脊推動物或哺乳動物。一種生產(chǎn)癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的特異性抗體的方法包括以下步驟-給予抗體生產(chǎn)源免疫原性量的肽，所述肽代表僅暴露在csPCNA同種型上而不暴露在非惡性腫瘤同種型(nmPCNA)上的表位，其中所述肽選自與著色性干皮病群G(XPG)蛋白相互作用的csPCNA區(qū)上的連續(xù)或不連續(xù)氨基酸殘基；提供用于抗體產(chǎn)生的條件；以及分離和純化所述抗體。在一個實施方案中，所述抗體由雜交瘤細(xì)胞分離和純化。在一個實施方案中，所述免疫原性肽包含氨基酸序列CGGGLGIPEQEY(SEQIDNO:2)。在一個實施方案中，所述肽結(jié)合載體蛋白。在一個實施方案中，所述載體蛋白是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。任意合適的栽體蛋白都可與本文公開的肽一起使用。一種鑒別體內(nèi)腫瘤位置的方法，該方法包括以下步驟'給予結(jié)合csPCNA的癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型特異性抗體，其中所述抗體用可檢測物質(zhì)標(biāo)記；以及通過纟全測標(biāo)記的csPCNA-特異性抗體在腫瘤部位的累積確定腫瘤位置。，.一種使受試者中腫瘤演進(jìn)的降低增大的方法包括以下步驟提供一種藥物可接受的組合物，其包含治療有效量的癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型特異性抗體和傳遞組分的制劑；給予所述制劑給受試者；以及通過將含csPCNA-特異性抗體的制劑傳遞至腫瘤部位降低肺瘤演進(jìn)，其中所述csPCNA特異性抗體與存在于腫瘤細(xì)胞中的csPCNA同種型反應(yīng)。在一個實施方案中，所述制劑包含脂質(zhì)體或納米顆粒。在一個實施方案中，所述制劑包含腫瘤殺傷劑或免疫增強(qiáng)劑。一種鑒別抗癌劑的方法包括以下步驟使癌細(xì)胞群與物質(zhì)接觸；通過測定csPCNA特異性抗體與csPCNA同種型的結(jié)合檢測癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的水平；以及如果與所述物質(zhì)接觸的癌細(xì)胞中的csPCNA同種型水平低于未與所述物質(zhì)接觸的癌細(xì)胞中的csPCNA同種型水平，則確定所述物質(zhì)是抗癌劑。在一個實施方案中，所述物質(zhì)是小分子或肽或核酸。在一個實施方案中，所述癌細(xì)胞群選自癌細(xì)胞系、異種移植物和癌癥的同位模型系統(tǒng)。在一個實施方案中，確定所述物質(zhì)是否是抗癌劑包括檢測與所述物質(zhì)接觸的正常細(xì)胞和未與所述物質(zhì)接觸的正常細(xì)胞中的非惡性胂瘤PCNA同種型的水平。在一個實施方案中，抗癌劑的鑒別在高通量系統(tǒng)中進(jìn)行。一種檢測PCNA的csPCNA同種型的免疫測定試劑盒包含以下組分一種抗體制備物，其僅特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型，而不特異性結(jié)合正常增殖細(xì)胞核抗原(nmPCNA)同種型，由此所述抗體和csPCNA形成復(fù)合物；以及檢測所述復(fù)合物的試劑。所述試劑盒中的陽性對照肽可包括其氨基酸序列選自以下的肽LGIPEQEY(SEQIDNO:l)、VEQLGIPEQEY(SEQIDNO:5)、LGIPEQEYSCWK(SEQIDNO:6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(SEQIDNO:7)、EQLGIPEQEY(SEQIDNO:8)、QLGIPEQEY(SEQIDNO:9)、LGIPEQEYSCVVKMPS(SEQIDNO:IO)、LGIPEQEYSCVVKMP(SEQIDNO:11)、LGIPEQEYSCVVKM(SEQIDNO:12)、LGIPEQEYSCW(SEQIDNO:13)、LGIPEQEYSCV(SEQIDNO:14)和LGIPEQEYSC(SEQIDNO:15)。在一個實施方案中，csPCNA同種型在免疫測定試劑盒中用作陽性對照。公開了一種對癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型有特異性的分離的自身抗體。在一個實施方案中，所述自身抗體與csPCNA同種型的表位復(fù)合。一種測定惡性細(xì)胞的存在情況的方法包括以下步驟使疑似含自身抗體的生物樣品與含結(jié)合的癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型或其片段的底物接觸，其中所述自身抗體對csPCNA同種型是特異性的；、提供用于csPCNA-自身抗體復(fù)合物形成的條件；以及檢測生物樣品中自身抗體-csPCNA復(fù)合物的存在情況。在一個實施方案中，自身抗體-csPCNA復(fù)合物的存在情況使用抗人二抗檢測。在一個實施方案中，自身抗體-csPCNA復(fù)合物的存在情況使用標(biāo)記的生物樣品檢測。一種檢測循環(huán)性癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的存在情況的方法，所述方法包括以下步驟檢測生物樣品中對csPCNA同種型特異性的自身抗體，并由此確定循環(huán)csPCNA同種型的存在情況。.一種監(jiān)測個體的癥狀緩解情況的方法包括以下步驟在癌癥治療之前和之后檢測個體中的增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的存在情況；以及通過比較癌癥治療之前和之后循環(huán)csPCNA同種型的水平確定所述個體的癥狀緩解情況。.在一個實施方案中，通過測定csPCNA同種型自身抗體的存在情況檢測csPCNA同種型。在一個實施方案中，csPCNA同種型用csPCNA同種型特異性抗體檢測。在考慮以下詳述的實施方案時，本文公開內(nèi)容的其它特征對本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見，實施方案的詳述例舉了實施目前所認(rèn)識到的公開內(nèi)容主題的最佳方式。附圖簡述圖l顯示了序列表，包括SEQIDNO:1-4。圖2顯示了使用PC10、Abl21和Abl26抗體的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。圖3-4顯示了使用PC10和Abl26抗體免疫熒光染色培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞的結(jié)果。圖5顯示了使用Abl26抗體免疫組織化學(xué)染色石蠟包埋組織切片中的細(xì)胞的結(jié)果。圖6表明csPCNAab抗體特異性識別csPCNA。對60昭MCF7細(xì)胞提取物進(jìn)行2D-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。在蛋白質(zhì)印跡分析中PC10和csPCNAab抗體以1:1000的稀釋度使用。圖7表明csPCNAab抗體特異性識別在惡性細(xì)胞中特有地表達(dá)的PCNA形式。泳道1,MCF細(xì)胞提取物(用作PCNA的標(biāo)記)。泳道2-9,乳癌組織提取物。泳道10-12,正常乳腺組織提取物。膠片過夜曝光。圖8表明，在蛋白質(zhì)印跡分析中高濃度csPCNAab不識別存在于非惡性乳腺組織中的PCNA同種型。使用公開的方法對由患乳癌婦女或無病婦女制備的200昭組織提取物進(jìn)行2D-PAGE,蛋白質(zhì)印跡分析。在蛋白質(zhì)印跡分析中PC10和csPCNAab抗體以l:"O、l:500或1:1000的稀釋度使用。泳道1，MCF細(xì)胞提取物(用作PCNA標(biāo)記)。泳道2、4、6,分別使用以1:1000、1:500或1:250的稀釋度使用的PC10抗體探測的乳癌組織提取物。泳道3、5、7,分別使用以1:1000、1:500或1:250的稀釋度使用的PC10抗體探測的非惡性乳腺組織提取物。泳道8、10、12,分別使用以1:1000、1:500或1:250的稀釋度使用的csPCNAab探測的乳癌組織提取物。泳道9、11、13，分別使用以1:1000、1:500或1:250的稀釋度使用的csPCNAab探測的非惡性乳腺組織提取物。圖9表明，致瘤性乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)csPCNA,而非致瘤性乳腺上皮細(xì)胞不表達(dá)csPCNA。用于這些實驗的人乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)在無血清條件下培養(yǎng)。為獲得還沒有致瘤性的永生化細(xì)胞系，由一名31歲的Li-Fraumeni綜合癥(LFS)患者的非癌性乳腺組織獲得HMEC(在兩個p53基因等位基因的其中一個的密碼子133處含種系突變(Met變?yōu)門hr[M133T])，該突變影響野生型p53蛋白構(gòu)象)。這些細(xì)胞以約50-60的群體倍增(PD)水平經(jīng)歷危機(jī)期，并以千萬分之五的頻率自發(fā)地永生化。轉(zhuǎn)化的HME細(xì)胞系如下建立用hTERT和H'-RasV12感染前永生化HME細(xì)胞，然后收集在軟瓊脂和棵小鼠異種移植物中生長的克隆(Herbert等，尚未付印)。MCF-7乳癌細(xì)胞在含10%加強(qiáng)型小牛血清(HyClone,Logan,UT)和50|ig/ml慶大霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中生長。用小鼠抗PC10(識別所有形式的PCNA)或兔csPCNAab(識別csPCNA)對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。在蓋玻片上生長的細(xì)胞用4%多聚曱醛固定，并用0.1%TritonX-100透化，之后用3%BSA封閉。用含0.5%疊氮化鈉的PBS稀釋的PCNA抗體和Alexa-Fluor468抗小鼠IgG或Alexa-Fluor568抗兔IgG綴合二抗(MolecularProbes,Eugene,Oregon)進(jìn)行染色。蓋玻片用含DAPI的Vectashield(VectorLaboratories,Burlingame,CA)封片，并使用Leica焚光顯^L鏡檢驗細(xì)胞。細(xì)胞用DAPI復(fù)染，并用使用20X物鏡的Leica熒光顯耀:鏡觀察。圖10表明csPCNAab抗體特異性識別乳癌細(xì)胞。正常乳腺組織切片來自3名不同患者(a-b,e隱f)、(c-d，g-h)、(i-j,k國l);乳癌組織切片來自3名不同患者(m-n,q-r)、(o-p,s-t)、(u-v,w-x)。將切成3切片并置于載玻片上的石蠟包埋組織在二曱苯中溫育2次，每次10分鐘，以去除石蠟。用連續(xù)乙醇清洗液(100-90-80-70-0%的dH20溶液)各自再水合載玻片10分鐘。使用抗原暴露溶液(VectorLaboratories,Burlmgame,CA)進(jìn)行抗原修復(fù)。將載玻片置于封閉緩沖液(3%BSA的PBS溶液)中于室溫達(dá)30-60分鐘。將在封閉緩沖液中1:200稀釋度的小鼠PC10、C20、100_478抗體或兔csPCNAab直接置于組織上，用石蠟覆蓋，并在濕潤室中于室溫溫育60分,。在用PBS進(jìn)行3次5分鐘清洗后，將載玻片與在封閉緩沖液中1:600稀釋度的適宜熒光二抗溫育，用石蠟覆蓋，并置于暗處的濕潤室中于室溫達(dá)30-60分鐘。用PBS進(jìn)行另一個連續(xù)的3次5分鐘清洗，用含DAPI的VectashieldTM封裝載玻片。使用具有20X物鏡的Leica熒光顯孩么鏡檢查組織切片。DAPI用作復(fù)染劑。圖11表明，csPCNAabIHC檢測組織中的乳癌細(xì)胞。結(jié)果代表在縮乳術(shù)后獲得的正常乳腺組織、DCIS患者的乳腺組織、4!襲性乳癌或轉(zhuǎn)移性疾病。箭頭指示惡性細(xì)胞的csPCNAab染色。選擇20個乳癌病例。另外，選擇顯示出正常乳腺組織或良性纖維嚢性變化的10個病例。用DAB作為發(fā)色團(tuán)的csPCNAab進(jìn)行石蠟包埋的惡性和非惡性乳腺組織標(biāo)本的IHC染色(褐色)；切片用蘇木精染色復(fù)染(藍(lán)色)，以鑒別細(xì)胞核。.圖12顯示了針對csPCNA抗原性肽的肽特異性鼠多克隆抗體的產(chǎn)生。將用于制備兔多克隆抗體的PCNA肽片段偶聯(lián)至匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。使用100pg綴合肽腹膜內(nèi)免疫小鼠，在免疫后12天通過尾部取血收集血清。按照指示將血清稀釋在PBS中，并與捕獲在ELSIA板上的抗原性肽溫育。在用PBS清洗板后，將捕獲的鼠抗體與抗小鼠IgG溫育，并顯色。定量針對csPCNA的多克隆抗體滴度，然后選擇產(chǎn)生最高水平的csPCNA抗體的小鼠。取出小鼠脾臟，將脾細(xì)胞融合至NS-0細(xì)胞，并在HAT培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。圖13表明，csPCNAab抗體特異性識別csPCNA。對60pgMCF7細(xì)胞提取物進(jìn)行2D-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。針對不同的PCNA肽片段制備的兔多克隆抗體和市售PC10抗體各以1:1000的稀釋度用于蛋白質(zhì)印跡分析。csPCNA同種型遷移至凝膠的酸性區(qū)，該區(qū)域定向于所示凝膠板的左側(cè)，而nmPCNA同種型解析至凝膠的堿性區(qū)，該區(qū)定向于每塊凝膠板的右側(cè)。這些凝膠代表至少3個不同的實驗。圖14顯示了癌癥患者中的自身抗體水平。圖1S(A-C)顯示了csPCNA抗體("Abl26")的特異性和敏感性。圖16顯示了癌細(xì)胞提取物中的csPCNA同種型的檢測。發(fā)明詳述增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白在癌細(xì)胞中被改變。PCNA是一種28kD的蛋白，具有的電泳遷移率等于36kDa蛋白的電泳遷移率。PCNA是DNA聚合酶5介導(dǎo)高效DNA復(fù)制活性所需的輔助因子。由惡性細(xì)胞純化的DNA合成體(synthesome)包含至少兩種形式的PCNA。根據(jù)特異性結(jié)合PCNA的市售抗體(PC10,OncogeneScience,CambridgeMA)染色的雙向聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質(zhì)印跡的檢測，兩種形式具有相同分子量。但是，兩種PCNA物質(zhì)的總電荷明顯不同。因此，惡性肺瘤或癌癥特異性的酸性PCNA形式csPCNA和非惡性或正常的堿性PCNA形式nmPCNA可在雙向聚丙埽酰胺凝膠上得以辨別。酸性csPCNA在惡性細(xì)胞系中表達(dá)，例如HeLa(人宮頸癌)、Hs578T(乳癌)、HL-60(人原粒細(xì)胞白血病)、FM3A(小鼠乳癌)、PC10(前列腺癌)、LNCaP(前列腺癌)、LN99(前列腺癌)、MD-MB468(人乳癌)、MCF-7(乳癌)、KGE90(食道-結(jié)腸癌)、KYE"0(食道-結(jié)腸癌)、SW48(食道-結(jié)腸癌)和丁98(惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤)。酸性csPCNA還在得自人乳腺肺瘤、前列腺腫瘤、腦腫瘤、人胃腸腫瘤或食道-結(jié)腸腫瘤、鼠乳腺腫瘤的惡性細(xì)胞中和人慢性原粒細(xì)胞白血病中表達(dá)。在非惡性細(xì)胞系(例如乳腺細(xì)胞系Hs57犯st和MCF-10A)中或在非惡性血清或組織(例如乳腺)的樣品中未檢測到酸性csPCNA。市售抗體不能辨別csPCNA和nmPCNA。因此，市售抗PCNA抗體不能用于僅特異性地檢測惡性腫瘤形式的PCNA。提供可特異性檢測csPCNA同種型的分離和純化的抗體制備物。本文公開的抗體制備物是大致純的，例如csPCNA特異性抗體制備物為約90%純或約95%純。所述制備物包含僅特異性結(jié)合csPCNA同種型而不結(jié)合nmPCNA同種型的抗體。csPCNA抗體和csPCNA抗原結(jié)合的親和常數(shù)可在約lOVmol至10"/mo1以上的因數(shù)范圍內(nèi)?？贵w制備物包含結(jié)合csPCNA上存在的表位而不結(jié)合nmPCNA上存在的表位的抗體。在一個方面，所述表位由結(jié)合著色性干皮病群G(XPG)蛋白的csPCNA蛋白區(qū)中連續(xù)或不連續(xù)的氨基酸殘基組成。術(shù)語"表位"在本文指抗體分子可鑒別和結(jié)合的抗原表面上的局部區(qū)域。另一方面，抗體制備物包含的抗體結(jié)合含SEQIDNO:l的氨基酸序列的表位。在另一個實施方案中，提供一種生產(chǎn)csPCNA特異性抗體的方法。該方法包括給測試動物給予免疫原性量的肽的步驟，所述肽代表僅存在于csPCNA上而不存在于nmPCNA上的表位。所述肽包含的氨基酸序列含有結(jié)合XPG蛋白的csPCNA區(qū)中的5-50個氨基酸殘基。所述肽可包含5-12個連續(xù)的氨基酸殘基，或包含13-20個或30個不連續(xù)的氨基酸殘基，還可包含結(jié)構(gòu)域間連接環(huán)區(qū)中的氨基酸殘基(氨基酸殘基121-135)。所述肽可根據(jù)需要多次給予，以確保在測試動物中有效生產(chǎn)多克隆抗體。隨后純化多克隆抗體。在一個另外的實施方案中，提供一種生產(chǎn)單克隆抗體的方法。所述方法包括給予測試動物(通常為小鼠)免疫原性量的肽的步驟，所述肽代表僅存在于csPCNA上而不存在于nmPCNA上的表位。所述肽包含的氨基酸序列選自結(jié)合XPG蛋白的csPCNA區(qū)中的5-12個連續(xù)氨基酸殘基或13-50個不連續(xù)氨基酸殘基。所述肽可根據(jù)需要多次給予，以確保在小鼠中有效生產(chǎn)抗體。隨后收集測試動物的脾細(xì)胞，并準(zhǔn)備用于生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞。對生產(chǎn)csPCNA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行選擇。選定的雜交瘤細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中生長，并由雜交瘤培養(yǎng)基純化單克隆抗體。在一個具體的實施方案中，所述肽用做免疫原，以產(chǎn)生含SEQE)NO:1的氨基酸序列(LeuGlylleProGluGlnGluTyr)的抗體。具有SEQIDNO:l的氨基酸序列(LeuGlylleProGluGlnGluTyr)和一個或多個額外氨基酸殘基的肽適于產(chǎn)生抗體，只要對csPCNA的特異性得以保持。額外的氨基酸可包括來源于PCNA或另一個來源的氨基酸或隨機(jī)選定的氨基酸。額外的氨基酸還可包括改善穩(wěn)定性和免疫原性的氨基酸。例如，在一個更具體的實施方案中，用做免疫原產(chǎn)生抗體的肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列(CysGlyGlyGlyLeuGlylleProGluGlnGluTyr)。此外，可通過本領(lǐng)域眾所周知的任意方法純化抗體。例如，通過使抗血清或培養(yǎng)基穿過將結(jié)合抗體的層析柱或改性濾膜親和純化單克隆或多克隆抗體。然后可例如使用具有高鹽濃度或改變了pH的緩沖液由所述柱洗脫結(jié)合的抗體。在另一個實施方案中，能夠產(chǎn)生csPCNA特異性抗體的肽包括以下氨基酸序列的肽其在SEQIDNO:l(LGIPEQEY)的NH2末端上含有約+3個連續(xù)或不連續(xù)的額外氨基酸，在LGIPEQEY的COOH末端上含有約+9個連續(xù)或不連續(xù)的氨基酸。例如，這些肽中有一些包含氨基酸序列VEQLGIPEQEY(+3—NH2末端，SEQIDNO:5)、LGIPEQEYSCVVK(+5—COOH末端，SEQIDNO:6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(+9—COOH末端，SEQIDNO:7)、EQLGIPEQEY(+2—NH2末端，SEQIDNO:8)、QLGIPEQEY(+l—NH2末端，SEQIDNO:9)、LGIPEQEYSCVVKMPS(+8—COOH末端，SEQIDNO:IO)、LGIPEQEYSCVVKMP(+7—COOH末端，SEQIDNO:ll)、LGIPEQEYSCVVKM(+6—COOH末端，SEQIDNO:12)、LGIPEQEYSCVV(+4—COOH末端，SEQIDNO:13)、LGIPEQEYSCV(+3—COOH末端，SEQIDNO:14)、LGIPEQEYSC(+2—COOH末端，SEQIDNO:15)、LGIPEQEYS(+l—COOH末端，SEQIDNO:16)和側(cè)接LGIPEQEY(SEQIDNO:l)的額外NH2和COOH末端氨基酸的組合。包括置換的氨基酸突變在本文公開內(nèi)容的范圍之內(nèi)，該置換不影響產(chǎn)生csPCNA特異性抗體的肽的特異性。肽中的一個或多個氨基酸殘基可用氨基酸類似物或非天然氨基酸替換。另外，基于本文公開的肽序列開發(fā)的肽模擬物也可用于產(chǎn)生針對csPCNA同種型的抗體。在另一個實施方案中，提供一種檢測癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的方法。所述方法包括使含csPCNA同種型的生物樣品接觸抗體制備物的步驟，由此抗體和csPCNA同種型形成復(fù)合物；以及檢測所述復(fù)合物的步驟。'生物樣品可為體液樣品，其可包括血液、血漿、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、精液、淚液、滑液或可測試csPCNA同種型存在情況的任意體液?；蛘?，所述生物樣品可為組織樣品，其中組織樣品的細(xì)胞可被懷疑是惡性的。例如，組織切片或細(xì)胞培養(yǎng)物可封裝在玻璃或塑料載玻片上，并按照標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞化學(xué)方法與抗體接觸。組織提取物或細(xì)胞濃縮物或細(xì)胞提取物也是適宜的?？贵w可包括可檢測標(biāo)記，例如比色、放射性、熒光、化學(xué)發(fā)光、酶或生物素化部分?？贵w和csPCNA之間的特異性結(jié)合可使用二抗檢測。許多檢測結(jié)合抗體的系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的?；蛘?，可使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、比色、熒光和表面等離子體共振(SPR)檢測溶解的細(xì)胞、細(xì)胞提取物、液體樣品中的抗體的特異性結(jié)合以及結(jié)合至固體基質(zhì)的抗體的特異性結(jié)合。本公開的抗體還可用于單向或雙向聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質(zhì)印跡，所述凝膠已用于由待測細(xì)胞或組織分離蛋白。這些方法是相似的，并在本領(lǐng)域得到廣泛實踐。使用對csPCNA同種型特異性的抗體捕獲循環(huán)性csPCNA同種型或其片段，csPCNA同種型或其片段的特征可使用質(zhì)-潛法i正實。在另一個實施方案中，提供一種診斷惡性腫瘤的方法。所述方法包括以下步驟免疫檢測生物樣品中的csPCNA,所述生物樣品得自人，或者具體地說是疑似具有惡性胂瘤病癥的患者，其中免疫檢測csPCNA的步驟包括使用本文公開的抗體制備物。在另一個實施方案中，提供一種有助于診斷惡性腫瘤的方法。所述方法包括免疫檢測組織樣品中的csPCNA的步驟，其中組織樣品的細(xì)胞疑似為惡性的，其中免疫檢測csPCNA的步驟包括使用本文公開的抗體制備物。但是，要理解的是，可使用所述抗體檢測的惡性細(xì)胞不限于諸如乳腺、前列腺、血液、腦、胰腺、平滑肌或橫紋肌、肝臟、脾臟、胸腺、肺、卵巢、皮膚、心臟、結(jié)締組織、腎臟、膀胱、腸、胃、腎上腺、淋巴結(jié)或子宮頸的組織中的惡性細(xì)胞，或例如Hs578T、MCF-7、MDA陽MB468、HeLa、HL60、FM3A、BT國474、MDA國MB畫453、T98、LNCaP、LN99、PC10、SK-OV畫3、NiKN曙7、KGE90、KYE350或SW48的細(xì)胞系中的惡性細(xì)胞。在另一個實施方案中，提供一種有助于預(yù)后惡性腫瘤發(fā)展的方法。該方法包括使用本文公開的抗體免疫檢測組織樣品中的csPCNA，其中組織樣品的細(xì)胞可被懷疑是惡性的，并將csPCNA的水平與具體惡性腫瘤疾病的演進(jìn)相關(guān)聯(lián)。而且，所述抗體可用于預(yù)后已發(fā)展出惡性腫瘤的患者的潛在存活結(jié)果。要理解的是，可使用所述抗體診斷或預(yù)后的疾病包括但不限于惡性腫瘤，例如各種形式的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)"交質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、黑素瘤、結(jié)腸癌、肺癌、腺癌、宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、成淋巴細(xì)胞瘤、白血病、骨肉瘤、乳癌、肝癌、腎瘤、腎上腺癌或前列腺癌、食道癌。如果惡性細(xì)胞表達(dá)csPCNA同種型，則本文公開的抗體能夠檢測csPCNA同種型。本文公開的抗體還檢測乳腺組織某些腫瘤類型中的惡,腫瘤，這些胂瘤類型包括管嚢腫、頂泌腺化生、硬化性腺病、管上皮細(xì)胞增生、非典型管內(nèi)乳頭瘤病、柱狀細(xì)胞改變、放射狀-更化病(放射狀瘢痕)、乳頭腺瘤、管內(nèi)乳頭瘤、纖維腺瘤、乳腺乳頭瘤、非典型管上皮細(xì)胞增生、非典型小葉增生、原位管癌一再分類為核級1、2和3、原位小葉癌、原位多形性小葉癌、乳腺內(nèi)脂瘤、乳腺錯構(gòu)瘤、粒細(xì)胞瘤、乳腺內(nèi)脂肪壞死、假血管瘤樣間質(zhì)增生(PASH)、涉及乳腺的惡性黑素瘤、涉及乳腺的惡性淋巴瘤、葉狀瘤一良性、臨界和惡性亞型以及乳腺肉瘤。在另一個實施方案中，本文公開的抗體用于通過比專交隨時間變化的腫瘤中的csPCNA水平確定腫瘤的惡性程度、跟蹤惡性腫瘤疾病的演進(jìn)或患者對治療的響應(yīng)。通過使用抗體測定血樣的csPCNA同種型存在情況，抗體還可用于檢測已脫離腫瘤并存在于患者血流中的惡性細(xì)胞。生物樣品可得自人類患者或脊推動物患者。'要理解的是，使用的抗體濃度取決于具體抗體及其對csPCNA的親和性。典型地，抗體親和性為約104M一至約109M—1。用于以上討論的免疫化學(xué)方法的抗體濃度例如可為約50至約2000ng抗體/ml,或直到50-500fxg/ml。，在另一個實施方案中，提供一種檢測csPCNA同種型的免疫測定試劑盒。該試劑盒包含僅結(jié)合csPCNA的抗體，并可包含額外的組分，例如試劑，如用于實施采用所述抗體的免疫化學(xué)染色、ELISA或RIA的封閉抗血清、二抗、緩沖液或標(biāo)記試劑。所述試劑盒還可包含陽性對照(例如惡性組織或細(xì)胞樣品的csPCNA同種型或其肽)和陰性對照(例如非惡性組織樣品)。所述試劑盒還可包含使用試劑盒作為惡性腫瘤的診斷或預(yù)后輔助的說明書。在另一個實施方案中，提供一種篩選測試化合物抑制細(xì)胞惡性表型的能力的測定系統(tǒng)。所述試劑盒包含本文公開的僅結(jié)合csPCNA的抗體和存活惡性細(xì)胞的樣品。在另一個實施方案中，csPCNA特異性抗體可用于篩選測試化合物抑制細(xì)胞惡性表型的能力的測定，或用于篩選潛在抗腫瘤或抗癌癥化合物。所述測定包括使惡性細(xì)胞與測試化合物接觸，并使用本文公開的抗體觀測csPCNA水平。測試化合物可為本領(lǐng)域已知對惡性表型具有作用或具有其它藥理作用的藥學(xué)化合物，或者可為以前不知道具有任何藥理學(xué)活性的化合物。測試化合物可為天然的，或在實驗室設(shè)計的。測試化合物可分離自^:生物、動物或植物，或者可重組生產(chǎn)，或者通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)方法合成生產(chǎn)。測試化合物還包括核酸、肽、肽核酸(PNA)、反義寡核苷酸、siRNA核酸和其它抗體。降低csPCNA同種型表達(dá)、降低純化合成體的DNA合成活性水平或增加純化DNA合成體的復(fù)制保真度水平的測試化合物是抑制惡性表型和治療惡性腫瘤的潛在治療劑。在再另一個實施方案中，抗體還可用作治療劑，以恢復(fù)惡性細(xì)胞中的PCNA的正常功能?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法將所述抗體傳遞至人類或脊推動物患者中的惡性細(xì)胞中。例如，可將特異性結(jié)合惡性細(xì)胞中的csPCNA的全長抗體、抗體片段或抗體融合蛋白給予所述患者。包含csPCNA特異性抗體的治療混合物可傳遞到腫瘤中。治療組合物在使用本文公開的診斷方法獲得陽性結(jié)果后不久給予。治療組合物的給予劑量和方法都可基于組合物的具體量、患者的病況、年齡和體重、待治療的具體疾病的演進(jìn)和其它相關(guān)因素來確定。給予可為局部的或全身的，包括注射、口服給予、導(dǎo)管給予和局部給予。要理解的是，含抗體的治療組合物的受體介導(dǎo)性靶向傳遞用于傳遞抗體至特定組織。包括乳癌、肺癌和卵巢癌在內(nèi)的許，腫瘤過表達(dá)惡性細(xì)胞特異性的抗原，例如糖蛋白pl85HER2。特異性結(jié)合這些抗原的抗體可結(jié)合至含csPCNA特異性抗體的脂質(zhì)體?？筽l85HER2抗體在注射入患者血流中時將脂質(zhì)體導(dǎo)向目標(biāo)癌細(xì)胞，在癌細(xì)胞中脂質(zhì)體被胞吞，因此傳遞其內(nèi)容物至惡性細(xì)胞(Kirpotin等，說0c/2em.36:66,1997)。脂質(zhì)體可載荷本領(lǐng)域已知的抗體(參見Papahadjopoulos等，iVoc.A^/.y4owf.88:11640,1991;Gabizon,C朋cw化&52:891,1992;Lasic和Martin,S加欣Z^oso艦s,1995;Lasic禾口Papahadjopoulos,Sde"ce267:1275,1995;和Park等，/Voc.JVa".爿cad92:1327,1995)。這種脂質(zhì)體含約O.O2-O.I5mgcsPCNA特異性抗體/pmol脂質(zhì)體，可以約5mg/kg的范圍給予給患者。治療性組合物可包含藥物賦形劑，例如但不限于依托泊苷或阿糖胞苷或阿霉素。針對與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的特異性細(xì)胞蛋白的自身抗體在許多類型的腫瘤生長期間出現(xiàn)。這些抗體基于以下事實用于鑒別惡性腫瘤的存在情況在健康個體中一般沒有發(fā)現(xiàn)自由循環(huán)的產(chǎn)生自身抗體的抗原性蛋白。因此，這些自由循環(huán)蛋白的存在指示疾病，并可直接用作疾病標(biāo)記，或者針對這些蛋白中的一種或多種的自身抗體的檢測可用作存在疾病的指示。在釆用化療的治療前取樣的IV期乳癌患者血清中存在csPCNA自身抗體表明存在自由循環(huán)的csPCNA。在另一方面，鑒別和分離csPCNA特異性的自身抗體。術(shù)語自身抗體在本文指由機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體。csPCNA可被發(fā)現(xiàn)于晚期或末期癌癥患者血流中循環(huán)的認(rèn)知以及表明csPCNA抗體可用于以單細(xì)胞水平鑒別癌細(xì)胞存在情況的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)表明，癌癥個體的表達(dá)也產(chǎn)生csPCNA自身抗體。因為此癌癥特異性蛋白一般不會遭遇健康個體的機(jī)體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，所以csPCNA不被識別為"自身的"。這些csPCNA自身抗體因此還用作存在惡性腫瘤的指示劑。另外，這些自身抗體的存在表明，有可能建立針對產(chǎn)生csPCNA的癌細(xì)胞的強(qiáng)免疫應(yīng)答，它們可用作鑒別機(jī)體中癌細(xì)胞存在部位的工具。而且，與抗原相比，抗體生產(chǎn)一般表現(xiàn)出數(shù)倍的數(shù)量增加，因此，csPCNA的自身抗體增加了檢測實驗的檢測靈敏度?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任意合適方法，由生物樣品如惡性組織或血清中分離csPCNA特異性的自身抗體。自身抗體還可以自身抗體-csPCNA復(fù)合物的形式被分離。結(jié)合的csPCNA同種型可分離自復(fù)合物，并使用本文描述的csPCNA特異性抗體鑒別。在一個實施方案中，可使用人抗IgG或其它合適的檢測試劑鑒別csPCNA同種型特異性的自身抗體。例如，csPCNA可用于結(jié)合csPCNA同種型特異性的自身抗體，然后再使用本文描述的csPCNA特異性抗體免疫檢測結(jié)合的csPCNA同種型?；蛘?，csPCNA蛋白可在結(jié)合測定前用可檢測物質(zhì)如熒光染料標(biāo)記。在另一個實施方案中，在流體或組織中檢測的csPCNA同種型特異性自身抗體的存在情況可用作惡性腫瘤的指示劑。csPCNA特異性自身抗體的檢測還可指示惡性細(xì)胞的組織部位。另外，此特異性自身抗體的存在可用作評價長期存活可能性的預(yù)后指示劑，或用作確定腫瘤去除術(shù)或癌癥治療后的患者癥狀緩解狀態(tài)的監(jiān)^L工具。預(yù)期在去除原發(fā)性腫瘤時的抗體轉(zhuǎn)換和CSPCNA表達(dá)損失會顯著降低循環(huán)性csPCNA自身抗體的水平。此外，此特異性自身抗體提供了一種基本原理，意味著靶向csPCNA和在一些位置將所述蛋白分泌入血流中的細(xì)胞的疫苗其目標(biāo)可為通過產(chǎn)生細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答實施破壞作用。術(shù)語"抗體"包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性或特異性。"抗體片段"包含全長抗體的一部分，一般來說包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"(mAb)指由基本同源的抗體群獲得的抗體，即群體所包含的個體抗體是相同的，只是有可能存在少量的天然突變。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原性位點或表位。而且，每種單克隆抗體都針對抗原上的單個決定簇位點。單克隆抗體可通過各種方法制備，包括但不限于Kohler等，//Wwre256:495(1975)描述的雜交瘤法，或者可通過重組DNA法制備(例如美國專利第4，816，567號)。單克隆抗體還可使用描述于Clackson等，Nature352:624-626(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)的技術(shù)由噬菌體抗體展示文庫分離。生產(chǎn)單克隆抗體一般需要免疫動物，例如小鼠；由其脾臟獲得免疫細(xì)胞；并將所述細(xì)胞與癌細(xì)胞(例如來自骨髓瘤的細(xì)胞)融合以使其永生化。融合細(xì)胞的腫瘤叫做雜交瘤，這些細(xì)胞分泌mAb。永生化雜交瘤的生長一般需要使用動物。選擇分泌的mAb與csPCNA同種型或其片段強(qiáng)反應(yīng)的雜來瘤細(xì)胞系。細(xì)胞生長和復(fù)制，以形成將產(chǎn)生期望的mAb的克隆。一般有兩種方法用于培養(yǎng)這些細(xì)胞一將它們注射入小鼠腹腔，或使用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。當(dāng)注射入小鼠或任意合適的動物中時，雜交瘤細(xì)胞復(fù)制并在其腹部產(chǎn)生流體(腹水)。此腹水液包含高濃度的抗體。另一種替代方法是以小規(guī)模分批系統(tǒng)或大規(guī)模分批反應(yīng)器在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。mAb的體外生產(chǎn)通常需要雜交瘤培養(yǎng)物分批生長，并由培養(yǎng)基純化mAb?？墒褂门渲朴糜谥С蛛s交瘤細(xì)胞系生長的無血清組織培養(yǎng)基。使細(xì)胞培養(yǎng)物與常用的組織培養(yǎng)瓶在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下溫育約10天。然后由培養(yǎng)基收集mAb。雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長至較高密度產(chǎn)生較大量的mAb，它們可由培養(yǎng)基收集。使用隔層如具有低截流分子量(10,000-30,000kD)的中空纖維或膜適于以高密度培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。這些基于半透膜的系統(tǒng)分離細(xì)胞，mAb在通過隔層與含培養(yǎng)基的較大區(qū)室分開的小室中產(chǎn)生。培養(yǎng)物可補(bǔ)加幫助優(yōu)化雜交瘤生長的生長因子。關(guān)于抗體生產(chǎn)和純化方法的一般性綜述，參見C群加尸ratoco/s//7M/ecw/ar說o/ogv,Ausubel等編輯,JohnWiley&SonsInc,(1988)。本文的單克隆抗體包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈部分與來源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w類型或亞型的抗體中的對應(yīng)序列相同或同源，而鏈的余下部分與來源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞型的抗體中的對應(yīng)序列相同或同源，以及包括這種抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性(美國專利笫4，816,567號；和Morrison等，尸roc.廳.USA81:6851-6855(1984》。噬菌體展示方法也可用于生產(chǎn)csPCNA特異性抗體。該技術(shù)使用細(xì)菌和稱為噬菌體的細(xì)菌病毒，以產(chǎn)生和選擇合成抗體，此合成抗體具有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體的全部靶識別特異性。這些合成抗體^f吏用編碼哺乳動物系統(tǒng)的天然抗體中靶識別區(qū)或可變區(qū)的相同基因生產(chǎn)。對噬菌體進(jìn)行遺傳工程改造，使得特定抗體融合至噬菌體外殼上的蛋白，而編碼展示抗體的基因包含在噬菌體顆粒中。該技術(shù)因此使展示抗體表型與其基因型匹配，允許編碼選定抗體的DNA被回收，易于將來使用。這些抗體覆蓋的噬菌體的集合稱為文庫。為由文庫選擇具有目標(biāo)抗體的噬菌體，使噬菌體結(jié)合連接至固體表面的靶分子。具有識別靶分子的抗體的噬菌體緊密結(jié)合，余下的(未結(jié)合的)噬菌體被簡單地洗除。噬菌體展示允許選擇對給定靶具有不同結(jié)合特征的抗體。包含在目標(biāo)噬菌體中的DNA然后可用于生產(chǎn)更多的選定抗體，用于研究或醫(yī)學(xué)診斷。噬菌體肽展示方法可用于鑒別結(jié)合csPCNA特異性抗體的肽。例如，在約6個氬基酸至約12或15個氨基酸范圍內(nèi)的各種肽(包括肽變體或蛋白)的文庫在噬菌體病毒體外部表達(dá)，而編碼這些肽中每一種的遺傳物質(zhì)位于噬菌體顆粒內(nèi)部。這在每個變體蛋白序列和編碼其的DNA之間產(chǎn)生物理連接，有利于基于對給定靶分子的結(jié)合親和性快速鑒別，例如通過稱為淘選的選擇方法鑒別csPCNA特異性抗體。例如，如下進(jìn)行淘選將噬菌體展示肽的文庫與包被csPCNA特異性抗體的板或珠或任意固體基質(zhì)溫育，洗去未結(jié)合的噬菌體，并洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。然后擴(kuò)增洗脫的噬菌體，接著進(jìn)行額外的結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán)，以富集結(jié)合序列的混合物。在3-4輪席，通過DNA測序和ELISA表征個體克隆。csPCNA抗體還可用于鑒別合成肽文庫中結(jié)合csPCNA特異性抗體的肽或肽i^莫擬物。核糖體展示是一種無細(xì)胞展示技術(shù)，其使用參與蛋白合成的體外細(xì)胞組分，建立含數(shù)十億不同人抗體片段的文庫，又可由該文庫快速地分離針對目標(biāo)分子的抗體。核糖體展示技術(shù)還可用于鑒別靶分子如csPCNA的抗體。該技術(shù)基于穩(wěn)定的抗體-核糖體-mRNA復(fù)合物的形成，與噬菌體展示具有相似性，因為抗體蛋白與其編碼DNA序列直接連接?？截愑扇思?xì)胞提取的抗體基因文庫，并通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增。在轉(zhuǎn)錄后，mRNA分子群各自編碼不同的抗體基因。mRNA分子然后與基于裂解物的核糖體溫育(細(xì)菌來源的核糖體及其蛋白生產(chǎn)機(jī)器)，核糖體將mRNA翻譯成蛋白復(fù)合物一一核糖體展示文庫。各自展示不同抗體的這種復(fù)合物與耙抗原性肽混合，例如來源于csPCNA同種型的肽，對所述靶特異性的抗體結(jié)合靶，未結(jié)合物被洗除。一抗(如csPCNA抗體)或二抗與針對其Fc區(qū)的染料或酶標(biāo)記的二抗Fab片段的復(fù)合或綴合屬于本文公開內(nèi)容的范圍。多種標(biāo)記可用于偶聯(lián)或綴合至一抗或二抗，包括但不限于氨基曱基香豆素(AMCA)、焚光素(FITC)、焚光素(DTAF)、羅丹明(TRITC)、TexasRedTM、Cy2TM、Cy3TM、Cy5TM、Cy7TM、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、C-藻青蛋白、R-藻青蛋白。對于辣根過氧化物酶(HRP)—3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，紅色)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB，褐色)；對于堿性磷酸酶(AP)—Fastred(粉色)、溴氯吲味磷酸鹽(BCIP，黃色)、碘硝基四唑紫(INT)(紅棕色)、氮藍(lán)四唑(NBT，紫色)、NewFuchsin(紅色)、TNBT(紫色)和Vegared(粉色)?？膳c抗體結(jié)合的任意可檢測標(biāo)記都適于和csPCNA特異性抗體一起使用。實施例提供以下的實施例僅是為了解釋目的，無意限制上文廣義上已描述的公開內(nèi)容。實施例l:csPCNA特異性抗體的生產(chǎn)該實施例闡述了僅結(jié)合csPCNA但不結(jié)合nmPCNA的肽特異性抗體的生產(chǎn)。人csPCNA和nmPCNA同種型具有相同的氨基酸序列，該序列在本文標(biāo)識為SEQIDNO:3。如圖1中的序列所示，csPCNA或nmPCNA包含261個氨基酸殘基。本文公開的PCNA免疫原可為肽，其具有的氨基酸序列選自跨越SEQIDNO:3的氨基酸殘基75-150的區(qū)域。PCNA氨基酸序列可包括諸如插入、缺失、置換的突變，其不影響csPCNA抗體結(jié)合的特異性。PCNA或csPCNA的肽或片段與PCNA中連續(xù)或不連續(xù)的短序列相關(guān)。所述肽可包含至少含PCNA的Leul26至Tyrl33的序列或SEQIDNO:l(LeuGlylleProGluGlnGluTyr)的氨基酸序列。還可加入額外的氨基酸，用于增加免疫原性或抗原性，而不顯著影響特異性。例如，可實施保守氨基酸置換，而不改變特異性?；诒疚奶峁┑闹敢?，還可制備合成肽，以產(chǎn)生對csPCNA同種型特異性的抗體。生產(chǎn)肽的任意合適方法都可用于生產(chǎn)本文公開的免疫原。實施例1A:肽特異性抗體制備兩種合成肽，其具有鑒別為SEQIDNO:2(CysGlyGlyGlyLeuGlylleProGluGlnGluTyr)的序列，笫二種肽具有鑒別為SEQIDNO:5(CysAspValGluGlnLeuGlylleProGluGlnGluTyr)的序列。SEQIDNO:5包含PCNA的一部分免疫顯性區(qū)(AspValGluGln)。兩種合成肽用于使用本領(lǐng)域已知的方法在兔中產(chǎn)生多克隆抗體。獲得的抗體鑒別為Abl26(由SEQIDNO:l產(chǎn)生)和Abl21(由SEQIDNO:5產(chǎn)生)。實施蛋白質(zhì)印跡分析，以評價抗體特異性識別csPCNA的能力。通過2D-PAGE解析由MCF-7乳癌細(xì)胞系和PA-1卵巢癌細(xì)胞系的高速上清液(S3)制備的蛋白樣品。然后使用Abl26、AM21或PC10(—種市售抗-PCNA抗體)進(jìn)行已解析多肽的蛋白質(zhì)印跡分析。如在圖2中所示，PCIO抗體同其它市售PCNA抗體一樣，既識別存在于非惡性細(xì)胞中的堿性同種型nmPCNA，也識別特有地存在于癌細(xì)胞中的酸性同種型csPCNA。要指出的是，用于本實驗的兩種癌細(xì)胞系MCF-7(圖2A)和PA-I(圖2B)都產(chǎn)生可檢測的nmPCNA。市售抗體的非特異性結(jié)合特性使它們不能分辨惡性和非惡性細(xì)胞。抗體的對比性研究表明了Abl26抗體在乳癌細(xì)胞和卯巢癌蛋白這二者的蛋白質(zhì)印跡中特異性識別csPCNA的能力。但是，使用Abl21的蛋白質(zhì)印跡未顯示出對csPCNA的特異性。同PC10抗體一樣，Abl21既識別csPCNA，也識別nmPCNA同種型。因此，出乎意料的是，含一部分PCNA免疫顯性區(qū)的肽產(chǎn)生非特異性抗體，而不含任何部分的PCNA免疫顯性區(qū)的肽產(chǎn)生csPCNA特異性抗體。使用上述肽制備單克隆抗體。可使用傳統(tǒng)的單克隆抗體生產(chǎn)方法以及使用HuCalGOLD⑧重組抗體文庫和噬菌體展示技術(shù)的方法，以鑒別人抗-csPCNA抗體。獲得的單克隆抗體應(yīng)當(dāng)也特異性地僅識別csPCNA同種型。實施例IB.AB126抗體特異性識別在培養(yǎng)物中生長的癌細(xì)胞實施兩種不同類型的細(xì)胞染色分析，以評價AM26抗體(后文可稱為csPCNAab)是否能辨別惡性和非惡性乳腺腫瘤細(xì)胞。結(jié)果表明，AM26抗體對癌細(xì)胞具有高特異性，用作惡性腫瘤的早期檢測劑。使用Abl26抗體實施免疫熒光細(xì)胞染色實驗(圖3)。使用非惡性人乳腺上皮細(xì)胞(HME)和用端粒酶基因(HME50hTERT)永生化的非惡性HME細(xì)胞。HME和HME50hTERT細(xì)胞均不具有在棵鼠中產(chǎn)生肺瘤的能力。另外，使用來源于乳癌(HME腫瘤)患者的惡性HME細(xì)胞以及惡性MCF-7細(xì)胞。這些不同的細(xì)胞類型用綠色熒光標(biāo)記的抗-PCNA(PCIO)抗體和紅色標(biāo)記的Abl26染色。PC10和任意其它市售的PCNA抗體或Abl21均不能用于辨別非惡性人細(xì)胞與惡性人細(xì)胞，或csPCNAab針對遠(yuǎn)離免疫顯性區(qū)的PCNA區(qū)制備。由圖3可見，標(biāo)記的PC10抗體容易染色惡性和非惡性的所有不同檢驗細(xì)胞類型。但是，特異性地針對csPCNA制備的標(biāo)記Abl26不染色非惡性細(xì)胞，但能夠容易地檢測癌細(xì)胞。非惡性細(xì)胞的DAPI染色染色這些細(xì)胞的細(xì)胞核，的確表明在視野中存在細(xì)胞，用PC-10染色表明在這些正常細(xì)胞中存在PCNA，其不是PCNA的癌癥特異性同種型。該實施例表明，Abl26特異性檢測癌細(xì)胞，并由此支持csPCNA是惡性腫瘤標(biāo)記這一前才是。實施例1C.AB126抗體識別早期癌細(xì)胞該實施例表明，Abl26抗體識別早期癌細(xì)胞，用于更快速的診斷。非惡性HME50hTERT細(xì)胞以及惡性HME-腫瘤和MCF-7細(xì)胞用于免疫熒光染色實驗。另外還評價用端粒酶、cdk4和Ras轉(zhuǎn)染的HME細(xì)胞(HME5+cdk4、hTERT+Ras)。當(dāng)導(dǎo)入小鼠中時，這些細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤，但僅在長時間之后。一般認(rèn)為，它們可代表非常早轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在該實驗中，如圖4所示，所有細(xì)胞類型都用DAPI染色，以表明在每個放大視野中的細(xì)胞存在情況。標(biāo)記的PC10抗體染色所有不同的細(xì)胞類型。但是，癌癥特異性的AM26抗體不標(biāo)記非惡性細(xì)胞，但確實容易標(biāo)記惡性細(xì)胞。另外，Abl26抗體標(biāo)記HME5+cdk4+hTERT+Ras細(xì)胞，表明在早期轉(zhuǎn)化細(xì)胞中存在csPCNA。實施例ID.AB126抗體特異性識別組織中的癌細(xì)胞石蠟包埋的惡性和非惡性乳腺組織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)染色也用Abl26抗體進(jìn)行。結(jié)果示于圖5(圖A和B)。結(jié)果表明了所述抗體僅特異性識別僅存在于圖B的癌細(xì)胞的能力。兩幅圖中的細(xì)胞還用蘇木精和曙紅(H&E)染色復(fù)染，以鑒別細(xì)胞核。用Abl26抗體染色的細(xì)胞以褐色呈現(xiàn)(圖B)。該實施例表明，按照本文公開的方法生產(chǎn)的Abl26或其它抗體可用于特異性地鑒別csPCNA同種型，csPCNA同種型是惡性腫瘤的真實標(biāo)記。因此，Abl26抗體等用于監(jiān)測待治療個體的癌癥的癥狀緩解狀況。Abl26等是開發(fā)篩選用途的ELISA和免疫組織化學(xué)測定的有用試劑。另外，Abl26等用于通過鑒別個體的體液或細(xì)胞或組織中的惡性腫瘤潛力來鑒別早期癌癥個體。所述抗體還通過放射性或熒光標(biāo)記抗體并使其與腫瘤細(xì)胞釋放在腫瘤附近的csPCNA反應(yīng)，用于鑒別腫瘤位置。Abl26等是一組抗體的有用成員，該組抗體能夠識別當(dāng)前用于評價腫瘤的惡性腫瘤潛力的標(biāo)記。實施例2:csPCNA特異性抗體識別惡性乳癌細(xì)胞該實施例表明，抗csPCNA抗體選擇性識別乳癌細(xì)胞與正常細(xì)胞。使用來源于PCNA的氨基酸序列，與商業(yè)抗體銷售商(Zymed,Inc.，SanFrancisco,CA)訂立合約來生產(chǎn)csPCNA特異性抗體。生產(chǎn)選擇性識別csPCNA同種型而不識別nmPCNA同種型的兔多克隆抗體。csPCNA特異性抗體的此特異性通過人乳腺細(xì)胞系和人腫瘤/正常組織的蛋白質(zhì)印跡、免疫熒光染色以及基于DAB的免疫組織化學(xué)染色(IHC)證實。動物免疫使用偶聯(lián)至匙孔血藍(lán)蛋白的PCNA肽片段，匙孔血藍(lán)蛋白通過4個半胱氨酸加至所述肽的氨基末端部分。將100嗎KLH綴合的肽片段(選自跨越PCNA的氨基酸100-160的區(qū)域)重懸浮在完全弗氏佐劑中，并皮下注射入2只雌性新西蘭白兔的多個部位中。讓兔休息1個月，然后用笫二劑在不完全佐劑中的100.嗎KLH偶聯(lián)抗原加強(qiáng)免疫動物。針對抗原的抗體滴度在免疫后約10-14天通過ELISA實驗來測定，在另外的14天休息期后，動物接受KLH偶聯(lián)抗原的第二次強(qiáng)化。12天后，由各只兔收集25ml抗血清，并儲存于-20。C。抗血清對更換兩次的20mM磷酸緩沖鹽水，pH7.0透析，并加樣至用相同緩沖鹽水預(yù)平衡的G蛋白Sepharose柱。凝膠的結(jié)合能力是19mg兔IgG/ml填裝膠床。柱用10倍柱體積的PBS清洗，并用IO倍體積的0.1M甘氨酸緩沖液，pH3.0洗脫。由柱洗脫出來的1ml級分以l國2ml/分鐘的流速收集入0.25ml的0.25MTris畫HClpH8.0中。通過Bradford實驗測定由柱洗脫的含蛋白峰級分中的蛋白濃度，合并這些級分，并對含10mMNaN3的磷酸緩沖鹽水透析，然后儲存于4°C,直至用于各種實驗。然后使用市售抗PCNAPC10抗體或兔多克隆抗體進(jìn)行已解析多肽的蛋白質(zhì)印跡分析(圖6)。和市售PCNA抗體一樣，PC10抗體既識別存在于非惡性細(xì)胞中的PCNA堿性同種型(nmPCNA)，也識別特有地存在于乳癌細(xì)胞中的PCNA酸性同種型(csPCNA)。在癌細(xì)胞提取物的2D-PAGE蛋白質(zhì)印跡分析中，csPCNA抗體特異性識別csPCNA同種型。實施例2A:使用csPCNAab對比選擇性分析乳癌組織標(biāo)本使用市售抗體或csPCNAab通過蛋白質(zhì)印跡分析一組正常乳腺組織和乳癌組織標(biāo)本的PCNA存在情況(圖7)。市售抗體包括針對PCNAC末端的抗體C20和針對完整大鼠PCNA蛋白制備的'PCIO。市售抗體識別存在于正?；驉盒匀橄俳M織中的PCNA。但是，csPCNAab抗體僅檢測惡性組織中的PCNA存在情況。csPCNAab的這種能力歸因于csPCNA在惡性細(xì)胞中表達(dá)而不在正常細(xì)胞中表達(dá)。csPCNA同種型抗體的特異性在實驗中得到進(jìn)一步證實，在該實驗中，增加濃度的市售PC10抗體或csPCNAab在非惡性和惡性組織提取物的蛋白質(zhì)印跡分析中用于檢測PCNA(圖8)。該實驗的結(jié)果表明，在蛋白質(zhì)分析中csPCNAab濃度即便很高，抗體也僅檢測癌組織中的csPCNA存在情況。然而，PC10抗體在所有濃度都容易檢測惡性和非惡性乳腺組織中的PCNA蛋白。實施例2C:csPCNAab特異性檢測培養(yǎng)物和組織中的乳癌細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光分析，以評價csPCNAab是否能辨別細(xì)胞培養(yǎng)物和組織標(biāo)本中的惡性和非惡性乳腺細(xì)胞。結(jié)果表明，抗體對癌細(xì)胞具有高特異性(圖9-10)。檢驗csPCNAab染色培養(yǎng)物中生長的非惡性和惡性乳腺細(xì)胞的能力(圖9)。在該實驗中，所有的不同細(xì)胞類型都用DAPI染色，以證實在各個放大視野中的細(xì)胞存在情況。檢驗的細(xì)胞是正常人乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)和非致瘤性的自發(fā)永生化HMEC。還評價了攜帶p"突變并已用人端粒酶催化組分(hTERT)和Ras癌基因(H-Ras-V12)轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化HMEC。另外，由在無胸腺小鼠中生長的腫瘤培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化HMEC以及MCF-7細(xì)胞用作圖9中的乳腺腫瘤細(xì)胞。由圖9可見，市售PC10抗體容易染色檢驗的所有不同細(xì)胞類型，(即惡性的和非惡性的)。PC10抗體已廣泛地用于定量PCNA表達(dá)。與市售抗體不同，選擇性識別csPCNA的csPCNAab不染色非惡性細(xì)胞，但能夠容易地檢測乳癌細(xì)胞。非惡性細(xì)胞的DAPI染色顯示了視野中的細(xì)胞存在情況。在用csPCNAab染色的非惡性腫瘤培養(yǎng)物中觀察到的少量大紅色熒光"斑點"，這緣于與碎片的非特異性結(jié)合，因為在用綠色標(biāo)記的PC10抗體染色的培養(yǎng)物中的相同位置觀察到這些"斑點"。該實驗表明，csPCNAab特異性檢測培養(yǎng)的乳癌細(xì)胞。在另一個實施方案中，還通過使用市售抗體和csPCNAab抗體的對比性免疫焚光染色評價新鮮冷凍的一^惡性和惡性乳腺纟且織標(biāo)本(圖10)。在該研究中，評價市售PCIO、C20和100-478(Novus)抗體。如圖10中所示，所有市售抗體都容易染色非惡性和惡性乳腺組織。與PCIO、C20和478抗體相反，csPCNAab僅染色惡性乳腺組織。使用在培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞以及人組織的這些實驗表明，csPCNAab僅特異性檢測乳癌細(xì)胞，并提供了csPCNA是乳腺惡性腫瘤的真正標(biāo)記的支持。實施例3.針對csPCNA抗原性肽的鼠多克隆和單克隆抗體的產(chǎn)生用100pg綴合KLH的csPCNA肽片段免疫兩種小鼠品系(3只小鼠/品系)。使用來源于csPCNA的肽片段，其包含人PCNA蛋白的氨基酸位置126-133，SEQIDNO:l(LeuGlylleProGluGlnGluTyr)。使小鼠休息，在免疫后12天進(jìn)行檢驗取血，以測定小鼠是否對肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答。通過使用偶聯(lián)至ELISA板的抗原性肽的ELISA，定確定針對csPCNA肽的抗體生產(chǎn)。將小鼠抗血清的稀釋液與固定化肽溫育，并在與綴合辣根過氧化物酶(HRP)的抗鼠IgG抗體溫育后定量捕獲的抗-csPCNA抗體。所有小鼠都休息30天，在抗體滴度降至基線附近后，用第二劑csPCNA舦加強(qiáng)免疫小鼠。重復(fù)該過程3次，在定量針對csPCNA肽的免疫應(yīng)答后，由具有最大免疫應(yīng)答的小鼠中取出脾臟(圖12)，將脾細(xì)胞融合至NS-0骨髓瘤細(xì)胞。鼠抗血清不結(jié)合隨機(jī)肽序列，csPCNA的不同免疫顯性區(qū)的肽用作篩選過程中的對照，并產(chǎn)生基線吸光度值，該值未顯示在直方圖上(圖12)。在HAT培養(yǎng)基中選擇雜交瘤。對HAT選擇存活的雜交瘤進(jìn)行針對csPCNA肽的抗體生產(chǎn)的篩選，選擇生產(chǎn)抗csPCNA抗體的29個克隆。這些克隆在HAT培養(yǎng)基中再持續(xù)2周，通過ELISA再選擇15個克隆，并鑒別為穩(wěn)定的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系。這些細(xì)胞系通過有限稀釋亞克隆，選擇生產(chǎn)csPCNA抗體的克隆，培養(yǎng)至高密度，制備親和純化的抗csPCNA抗體，在2D-PAGE解析PCNA同種型和IHC分析后用于蛋白質(zhì)印跡；證實對csPCNA的特異性。這些親和純化的單克隆抗體有5種用于檢測生物樣品中的惡性細(xì)胞。實施例4:石蠟包埋的乳腺組織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)aHC)染色該實施例表明，本文公開的csPCNA特異性抗體和方法檢測包埋組織標(biāo)本中的惡性細(xì)胞。還用csPCNAab進(jìn)行石蠟包埋乳腺組織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)染色。檢驗的組織是在縮乳術(shù)后獲得的井惡性組織以及原位管癌(DCIS)患者的組織，原位管癌是一種前癌疾病，特征在于乳腺管襯層中的惡性樣細(xì)胞的克隆增殖，沒有擴(kuò)散到管外部至乳腺中的其它組織或乳腺外的證據(jù)。DCIS是侵入性或轉(zhuǎn)移性疾病的前體。顯示了代表性結(jié)果(圖11)。這些結(jié)果表明，csPCNAab特異性地識別癌細(xì)胞核中的表位，并檢測早期(DCIS)疾病。csPCNA表達(dá)在正常乳腺小葉中未觀察到。在一個方面，陽性對照載玻片包括已知侵入性乳腺腫瘤中心區(qū)的雙份切片以及用作陰性對照的空白石蠟切片。簡單地講，將5pm組織標(biāo)本的石蠟切片固定至帶正電荷的栽玻片，并在二曱苯(更換3次)中去除石蠟，然后用分級乙醇和蒸餾水水合。使用微波爐在檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中進(jìn)行10分鐘的抗原修復(fù)，隨后冷卻20分鐘。此后用Peroxo-block(Zymed)封閉內(nèi)源過氧化物酶活性。在用磷酸緩沖鹽水(PBS)淋洗載玻片后，將載玻片與生物素化csPCNAab(稀釋度l:400)或市售的生物素化PC10抗體(BioScience,稀釋度l:"0)溫育1小時。通過使綴合過氧化物酶的抗生物素蛋白(ZymedPicturePlusKit:HRP/Fab聚合物綴合物，Invitrogen,Carlsbad,CA)結(jié)合至生物素化一抗，并使抗體-過氧化物酶復(fù)合物與二氨基聯(lián)苯胺(DABplus,Dako,Carpinteria，CA)反應(yīng)，顯現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)。載玻片用蘇木精(VectorLabs)復(fù)染，用乙醇和二曱苯澄清，用Histomount(Zymed,Invitrogen，Carlsbad,CA)封片，然后觀察。以磷酸緩沖鹽水(PBS)或同種型特異性對照抗體替換csPCNAab—抗或PC10抗體也用作陰性對照。組合的H&E染色用于確定細(xì)胞結(jié)構(gòu)并鑒別各個組織切片中的細(xì)胞核，提供了一種在組織病理學(xué)評價中確定惡性腫瘤的存在情況的標(biāo)準(zhǔn)方法。在用csPCNAab或PC10抗體IHC染色石蠟包埋的標(biāo)本后將H&E應(yīng)用于組織切片。如本文所述進(jìn)行IHC評價和記分。在用PC10和csPCNAab抗體完成病理標(biāo)本和組織陣列的染色和反應(yīng)性初始記分后，獨立地評價染色的載玻片，以證實染色結(jié)果。篩選每種組織學(xué)切片，并評價展示免疫染色的正常和瘤細(xì)胞核的百分率。對csPCNAab的免疫反應(yīng)性分類為陰性、低、中或高，條件分別是<2%、2-20%、2"70%或71-100%的細(xì)胞核被陽性染色。這些選定的免疫反應(yīng)性范圍值與采用其它乳癌生物標(biāo)記的臨床病理評價所使用的范圍值一致。除了本文描述的記分方法以外，任意合適的記分方法都可使用。計數(shù)每個標(biāo)本的10個未重疊高倍顯微鏡視野，當(dāng)csPCNAab染色至少2%的細(xì)胞核時將標(biāo)本歸類為乳癌。如果需要達(dá)到一致的話，則可再評價分析結(jié)果。預(yù)期使用DAB作為底物用csPCNAab和PC10抗體將增殖惡性細(xì)胞染成褐色。預(yù)期正常組織標(biāo)本不與csPCNAab反應(yīng)，由于H&E染色而仍保持藍(lán)色/紫色，但正常組織中的增殖細(xì)胞應(yīng)僅在用PC10抗體探測時染成褐色，與其增殖速率無關(guān)(圖9-10)。實施例4A:惡性乳癌細(xì)胞的臨床診斷免疫熒光細(xì)胞和組織染色用于表明csPCNAab選擇性結(jié)合乳癌細(xì)胞的能力，所述乳癌細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長(圖9),或存在于惡性組織中(圖10)。惡性乳癌的臨床診斷也通過^f吏用csPCNA特異性抗體的癌組織免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行。對商業(yè)陣列來源的組織陣列載玻片和由組織標(biāo)本制備的個體載玻片結(jié)合csPCNAab和/或PC10抗體的能力進(jìn)行分析。將切威3-5pm切片的石蠟包埋組織在二甲苯中溫育2次，每次10分鐘，以去除石蠟。用連續(xù)乙醇清洗液(100-90-80-70-0%的dH20溶液)各自再水合載玻片IO分鐘。4吏用抗原暴露液(VectorLaboratories,Burlingame,CA)按照說明書進(jìn)行抗原修復(fù)。然后將載玻片置于封閉緩沖液(3%BSA的PBS溶液)中于室溫達(dá)30-60分鐘。將在封閉緩沖液中1:200稀釋度的小鼠抗PCNA(PC10)抗體(識別所有的PCNA同種型)或兔csPCNAab直接置于組織上，用石蠟覆蓋，并在濕潤室中于室溫溫育60分鐘。在用PBS進(jìn)行3次5分鐘清洗后，將載玻片與在封閉緩沖液中l(wèi):600稀釋度的適宜焚光二抗(Alexa468(綠色熒光)(Calbiochem,SanDiego，CA)抗小鼠IgG或Alexa568(紅色熒光)抗兔IgG;(MolecularProbes,Invitrogen,Carlsbad,CA))溫育，用石蠟覆蓋，并置于暗處的濕潤室中于室溫達(dá)30-60分鐘。用PBS進(jìn)行另一個連續(xù)的3次5分鐘清洗，用含DAPI的Vectashield(VectorLabratories,Burlingame,CA)封裝載玻片。組織切片使用具有20X(和40X)物鏡的Leica焚光顯微鏡檢驗。DAPI用作復(fù)染劑。在增殖的正常和惡性乳腺細(xì)胞與csPCNA和PC10抗體溫育后，評價Alexa468和Alexa568抗體與這些細(xì)胞的結(jié)合。Leica熒光顯艱么鏡配有紅色-綠色濾光片，以能夠辨別一種或兩種抗體是否結(jié)合至相同的乳腺細(xì)胞。篩選各個組織切片，并評價展示出紅色或綠色免疫熒光的正常和瘤細(xì)胞核的百分率。對csPCNAab的免疫反應(yīng)性分類為陰性、低、中或高，條件分別是<2%、2-20%、21-70%或71-100%的細(xì)胞核發(fā)紅色熒光。IHC記分和評價如本文所述進(jìn)行。正常組織標(biāo)本僅發(fā)綠色熒光，因為其僅能與PC10抗體反應(yīng)，而惡性細(xì)胞表達(dá)兩種PCNA同種型，參與合PC10和csPCNAab這二者的反應(yīng)。另外，預(yù)期正常組織標(biāo)本中緩慢和快速增殖的細(xì)胞僅結(jié)合PC10抗體(圖9-10)。使用csPCNA特異性抗體分析檢測csPCNA同種型不受與抗體結(jié)合的特定標(biāo)記的限制。例如，免疫熒光染色比DAB染色更靈敏，因為免疫熒光標(biāo)記的連續(xù)組織切片的數(shù)字圖象可彼此重疊，對于每個分析組織標(biāo)本，很容易證實紅色和綠色染色細(xì)胞的共定位，預(yù)期該共定位選擇性指示分析的癌癥標(biāo)本中僅惡性細(xì)胞的存在情況。僅在乳腺腫瘤標(biāo)本中存在紅色熒光證實了csPCNAab對惡性乳腺細(xì)胞的選擇性。在培養(yǎng)物中生長或存在于正常組織中的增殖非惡性乳腺細(xì)胞不表達(dá)csPCNA，因此不與csPCNAab反應(yīng)。相反，它們確實與非選擇性PCIO抗體反應(yīng)。本文公開的抗體組合物和方法還檢測各種乳腺腫瘤類型，包括管囊腫、頂泌腺化生、硬化性腺病、管上皮細(xì)胞增生、非典型管內(nèi)乳頭瘤病、柱狀細(xì)胞改變、放射狀硬化病(放射狀瘢痕)、乳頭腺瘤、管內(nèi)乳頭瘤、纖維腺瘤、乳腺乳頭瘤、非典型管上皮細(xì)胞增生、非典型小葉增生、原位管癌一再分類為核級1、2和3、原位小葉癌、原位多形性小葉癌、乳腺內(nèi)脂瘤、乳腺錯構(gòu)瘤、粒細(xì)胞瘤、乳腺內(nèi)脂肪壞死、假血管瘤樣間質(zhì)增生(PASH)、涉及乳腺的惡性黑素瘤、涉及乳腺的惡性淋巴瘤、葉狀瘤一良性、臨界和惡性亞型以及乳腺肉瘤。乳癌已與各種生物標(biāo)記連鎖，這些生物標(biāo)記包括表達(dá)改變的p53、ER、PR、細(xì)胞周期蛋白、B72.3、a-乳清蛋白、乳脂肪球、乳腺珠蛋白、Maspin和HER2。但是，不是所有的乳癌都同時或以相同水平表現(xiàn)出所有這些生物標(biāo)記的表達(dá)改變。還可運用csPCNA和任何其它預(yù)后/診斷因子Ki67、p53、ER、PR、B72.3、oc-乳清蛋白、乳脂肪多求、乳腺多朱蛋白、Maspin和HER2的表達(dá)狀態(tài)。csPCNAab或其它生物標(biāo)記的市售一抗以及其它生物標(biāo)記的適宜二抗用于評4介csPCNA表達(dá)與其它乳癌生物標(biāo)記的關(guān)聯(lián)。csPCNA同種型的單克隆抗體也用于檢測和診斷乳癌組織。如果需要獲得優(yōu)化的靈敏度，則調(diào)整抗原-抗體結(jié)合條件。實施例4C:確定csPCNAab的靈敏度和特異性的統(tǒng)計學(xué)方法開始使用合適的統(tǒng)計方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)(IHC)數(shù)據(jù)的分析(參見S.C.Chuah等，2005,尸W/20/ogy37(2):169-171頁)，用于計算csPCNAab檢測組織標(biāo)本中的惡性乳腺細(xì)胞的靈敏度和特異性。除了csPCNAab的這些特征之外，使用csPCNAab將惡性和非惡性乳腺細(xì)胞彼此區(qū)分開來的陽性(PPV)和陰性(NPV)預(yù)測值使用以T公式確定。[靈敏度-a/(a+c);特異性-d/(b+c);PPV=[a/(a+b)〗xl00;而NPV-[d/(c+d)]xlOO;其中a-真陽性，b-假陽性，c-假陰性，而d=真陰性]。個體標(biāo)本的真/假陽性和真/假陰性染色在染色組織切片的目測檢查當(dāng)中由病理學(xué)家確認(rèn)。開始還通過卡方檢驗分析.IHC數(shù)據(jù)，并對使用本文描述的IHC分級系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(參見H.Brustmann，2005,Gy"eco/ogz'c0"co/ogy98:396-402)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量分析，評價csPCNAab區(qū)分惡性和非惡性乳腺標(biāo)本的能力。使用GraphPadPrism4和StatMate統(tǒng)計分析軟件(GraphPad,SanDiego,CA)分析用正常乳腺組織標(biāo)本和良性乳腺病灶獲得的數(shù)據(jù)，以便定量csPCNAab選擇性和特異性地鑒別患者組織標(biāo)本中的惡性乳腺細(xì)胞的能力。當(dāng)csPCNAab用于鑒別人乳腺活檢物質(zhì)中的惡性乳腺細(xì)胞的存在情況時，該抗體應(yīng)提供>90%的選擇性和>95%的置信水平。csPCNAab甚至與分類為I期疾病的組織標(biāo)本強(qiáng)反應(yīng)。還用本文公開的csPCNAab評價了乳癌病灶的不同亞類。實施例5.csPCNA特異性肽設(shè)計和特異性針對csPCNA的抗體的產(chǎn)生市售PCNA抗體的表位作圖表明，大部分抗體結(jié)合在PCNA蛋白大約中部的40個氨基酸(aa)段中(aa85-125)。該區(qū)域代表PCNA多肽中的免疫顯性區(qū)。兔多克隆抗體由供應(yīng)商(ZymedInc,SanFrancisco,CA)制備為包含連接物間結(jié)構(gòu)域的PCNA肽片段(aall8-135)(表1)，這有利于PCNA的蛋白-蛋白相互作用。每種肽都偶聯(lián)至匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，匙孔血藍(lán)蛋白通過4個半胱氨酸殘基加至每個肽的氨基末端部分。將100jig的每種KLH綴合肽片段重懸浮在完全弗氏佐劑中，并將每種肽皮下注射入2只雌性新西蘭白兔的多個部位中。讓兔休息1個月，然后用第二劑在不完全佐劑中的100昭的KLH偶聯(lián)抗原加強(qiáng)免疫動物。針對抗原的抗體滴度在免疫后約10-14天通過ELISA實驗來測定，在另外的14天休息期后，動物接受第二次KLH偶聯(lián)抗原的加強(qiáng)。12天后，由各只兔收集25ml抗血清，并儲存于-20。C?？寡鍖Ω鼡Q兩次的20mM磷酸緩沖鹽水，pH7.0透析，并加樣至用相同緩沖鹽水預(yù)平衡的G蛋白Sepharose柱上。由柱洗脫出來的1ml級分收集入0.25ml的0.25MTris-HClpH8.0中。合并含抗體的級分，透析并儲存于4'C，直至用于各種實驗。進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，以評價各種抗體特異性識別csPCNA的能力。MCF7乳癌細(xì)胞提取物通過2D-PAGE解析。然后使用不同的多克隆抗體或市售PC10抗體進(jìn)行解析多肽的蛋白質(zhì)印跡分析(圖13)。PC10抗體同所有市售PCNA抗體一樣，既識別存在于非惡性細(xì)胞中的堿性同種型nmPCNA(nmPCNA),也識別特有地存在于乳癌細(xì)胞中的酸性同種型csPCNA(csPCNA)。所有抗體的對比性研究表明了其中僅一種抗體(針對PCNA肽aal26-133制備的抗體)在癌細(xì)胞提取物的2D-PAGE蛋白質(zhì)印跡分析中唯一識別csPCNA的能力。數(shù)據(jù)表明針對完整連接物間結(jié)構(gòu)域(aall8-135)產(chǎn)生的抗體識別csPCNA和nmPCNA這二者。另外，針對PCNAaal21-133產(chǎn)生的抗體結(jié)合csPCNA和nmPCNA這二者。數(shù)據(jù)還提示，csPCNA抗原性位點位于PCNAaal22-142之間的某處。針對PCNAaal26-133產(chǎn)生的抗體(特異性識別csPCNA的抗體)已被稱為csPCNAab。另外，肽#126"33已成功地用于在4只另外的新西蘭白兔中和2種不同的小鼠品系中產(chǎn)生csPCNA特異性抗體。表1:用于產(chǎn)生兔多克隆抗體的PCNA肽序列。(使用的肽標(biāo)以下劃線)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實施例5A.抗體對csPCNA的特異性該實施例表明了所述抗體對csPCNA的特異性。進(jìn)行直接EUSA測定，其中使抗原性肽和純化的csPCNA作為抗PCNA抗體("Abl26抗體，，)結(jié)合的靶彼此竟?fàn)?。如果抗體對csPCNA使特異性的，則預(yù)期以足夠的濃度用于產(chǎn)生該抗體的肽與純化的csPCNA有效竟?fàn)幗Y(jié)合實驗中投入的Abl26抗體。如下進(jìn)行實驗將O.l昭重組PCNA固定至偶聯(lián)緩沖液(碳酸鹽緩沖液，pH9.6)中的ELISA板，然后與在偶聯(lián)緩沖液中的1%牛血清白蛋白溫育1小時，以封閉每個孔中余下的殘余結(jié)合位點。然后，將一系列濃度(0.024ng/孔-2400ng/孑L)的抗原性肽(UMPB6-相當(dāng)于PCNA氨基酸126-133)在水上與Abl26抗體混合，并置于每個孔中于室溫振搖1小時。此一抗通過用PBS-0.05%Tween20清洗去除，將綴合至堿性磷酸酶的抗兔IgG二抗加至每個孔。這些孔用'PBS清洗，將在反應(yīng)緩沖液中的100pl磷酸對硝基苯酚(lmg/ml)溫育20分鐘，以水解底物，然后于405nm波長讀取反應(yīng)混合物的光密度。示于圖15A的結(jié)果表明了所述肽抑制Abl26抗體與固定在ELISA板上的csPCNA結(jié)合的能力，該能力隨增加的肽濃度而變化，表觀IC50稍《效超過0.1|ug/ml。該數(shù)據(jù)表明了Abl26抗體對所述蛋白的csPCNA同種型的特異性。實施例5B:AB126抗體在夾心ELISA中的特異性該實施例表明了本文公開的抗體在夾心ELISA中對csPCNA的特異性。實施夾心ELISA，其中csPCNA特異性Abl26抗體(1pg/孑L)或非特異性PCNA抗體C20(1pg/孑g固定至ELISA板，并用于捕獲測定中使用的重組PCNA。ELISA板上殘余的結(jié)合位點用BSA封閉，在一系列濃度的竟?fàn)幮噪?UMPB6-(0.024叫/孔-2400ng/孔))存在下將重組PCNA與固定化捕獲抗體溫育。在洗去未結(jié)合的PCNA后，在笫一種情況下用C20抗體檢測結(jié)合蛋白，在笫二種情況下用Abl26檢測結(jié)合蛋白。將這些檢測抗體加入ELISA板的每個孔。將綴合適宜堿性磷酸酶的抗兔或抗山羊IgG二抗與ELISA板的每個孔中的結(jié)合抗體溫育，并在用PBS-0.05%Tween20洗去非特異性結(jié)合的結(jié)合抗體后，通過將每個孔中剩余的二抗與1mg/ml磷酸對硝基苯酚溫育30分鐘確定結(jié)合捕獲PCNA的檢測抗體的量。示于圖15B的結(jié)果表明，當(dāng)使用特異性捕獲抗體(Abl^6-菱形)捕獲測定中加入的重組PCNA中存在的csPCNA同種型時，UMPB6肽有效竟?fàn)幉东@抗體；在該類型測定中的表觀IC50稍微高于1fig/孔。相反，UMPB6對C20抗體(粉色方塊)捕獲重組PCNA的能力沒有可檢測的影響。這可能歸因于以下事實非同種型特異性C20抗體的結(jié)合位點未將UMPB6肽識別為其耙表位。兩種抗體之間結(jié)合量的整體差異可能由兩種抗體對重組PCNA蛋白的親和性差異引起，或者是重組蛋白中PCNA分子混合物(包括重組蛋白的csPCNA和非csPCNA同種型)的結(jié)果。實施例5C.針對csPCNA的ELISA的靈敏度該實施例表明了本文公開的csPCNA特異性抗體的靈敏度。ELISA測定的靈敏度通過檢測該測定在一系列濃度范圍內(nèi)檢測csPCNA的能力來確定。如上文概述使用非特異性抗PCNA抗體(C20抗體)進(jìn)行夾心ELISA，以捕獲在測定中使用的純化重組PCNA中存在的csPCNA同種型。使用Abl26抗體特異性地顯現(xiàn)結(jié)合抗體，以檢測結(jié)合C20抗體的csPCNA的存在情況。綴合至石威性磷酸酶的抗兔IgG用于鑒別結(jié)合至捕獲csPCNA的AM26抗體的存在情況。如圖15C所示，所述測定檢測跨越3-200ng/孔的濃度范圍內(nèi)的csPCNA。實施例5D.癌細(xì)胞^是取物中csPCNA的4企測該實施例表明了csPCNA特異性抗體檢測癌細(xì)胞提取物中的csPCNA同種型的能力。業(yè)已表明卵巢癌細(xì)胞(包括PA-1細(xì)胞系)表達(dá)csPCNA同種型。使用本文描述的夾心ELISA,溫育由PA-1細(xì)胞制備的濃度漸增的核提取物，表明在跨越0-100嗎/孔的核,取物濃度范圍內(nèi)，檢測提取物中的csPCNA存在情況。如圖16所示，csPCNA檢測在使用Abl26抗體檢驗的蛋白范圍內(nèi)是線性的。PA-1細(xì)胞表達(dá)的PCNA由固定至ELISA孔的C20抗體捕獲。實施例6:csPCNA參與DNA復(fù)制和與POL5相互作用PCNA是合成體的一種功能組分。另外，合成體對DNApola和S抑制劑、pola抗體的功能響應(yīng)以及對PCNA的需要提示，合成體的體外復(fù)制活性由pola和S這二者介導(dǎo)。現(xiàn)在為確定csPCNA實際上是否在乳癌細(xì)胞DNA復(fù)制中起作用和與其pol5—起發(fā)揮作用，在有和沒有csPCNAab的情況下，使用MCF7細(xì)胞提取物進(jìn)行DNApol5和體外SV40DNA復(fù)制測定(表2)。觀察到csPCNAab在乳癌細(xì)胞提取物中抑制DNApolS和體外SV40DNA復(fù)制活性。加入牛血清白蛋白(BSA),以控制反應(yīng)，沒有觀察到抑制作用。這些結(jié)果表明，csPCNA可積極地參與乳癌細(xì)胞DNA復(fù)制，并容易與DNApolS—起發(fā)揮作用。表2.增加csPCNAab濃度對體外SV40DNA復(fù)制和DNApolS<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>在反應(yīng)開始前，將合成體組分與濃度漸增的csPCNAab于4"C溫育1小時。數(shù)據(jù)代表3個獨立實驗的平均值。#，未測定。*,SV40DNA復(fù)制實驗，DNA聚合酶實驗按照公開的方法實施(Malkas，L.H.等,(1990),說oc/^w.29:6362-6374;Waleed等，(2004),歷oc/zew,'cff//Vw腦co/ogy68:11-21;和Han等，(2000),說oc/zemz'ca/Pto脂co/ogy60:403-411)。結(jié)果表明，csPCNA特異性抗體可選擇性抑制DNA復(fù)制，并用作抑制癌細(xì)胞復(fù)制的治療工具。csPCNA特異性抗體還影響csPCNA同種型的蛋白-蛋白相互作用，并由此影響癌細(xì)胞復(fù)制途徑。實施例7:csPCNA的自身抗體該實施例表明了csPCNA同種型的自身抗體作為檢測循環(huán)性csPCNA同種型以及診斷早期和晚期癌癥的工具的用途。實驗設(shè)計包括用含csPCNA同種型的重組PCNA包被酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)板，用BSA封閉ELISA孔，并使包被的孔與IV期患者的人血清溫育。將患者分為兩組。一組包含在入選實驗后存活少于200天的個體，而另一組在入選后存活超過1300天。然后用PBS清洗孔，并與綴合辣根過氧化物酶(HRP)的抗人抗體溫育。如果針對PCNA的循環(huán)抗體存在于患者血清標(biāo)本中，則這些抗PCNA抗體應(yīng)與結(jié)合至板的PCNA結(jié)合，并在清洗步驟后保留在板上。預(yù)期抗人二抗應(yīng)結(jié)合孔(含表達(dá)抗PCNA抗體的患者的血清)中的抗體。抗人抗體的存在應(yīng)由磷酸對硝基苯酚底物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色產(chǎn)物指示。產(chǎn)物的豐度通過檢測其405nm的吸光度來確定。結(jié)果表明，其中一個長期存活者具有可觀的自由循環(huán)抗PCNA抗體量，而一名短期存活者產(chǎn)生少量的該相同類型的抗體。各組的1名患者具有不可檢測水平的抗PCNA抗體，該抗體看起來與長期或短期存活無關(guān)聯(lián)。圖14顯示了原始數(shù)據(jù)、對照以及實驗值減去來源于對照的背景。本文概述了用于自身抗體的ELISA法。簡單地講，ELISA板用0.2PCNA包被，用偶聯(lián)緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖液pH9.6;10mMNaN。使體積達(dá)到100pi,于37。C振搖板2小時。PCNA的濃度為約0.250^ig/pl。200pl封閉緩沖液(lXPBS,pH7.4;1%BSA;0.05%Tween20)用于在37。C封閉未結(jié)合位點1小時。用清洗緩沖液(1XPBS,pH7.4;0.05%Tween20)進(jìn)行3次清洗。加入50μl人血清(IV期乳癌患者)，于37。C溫育1小時。去除初始血清，代之以50μl新鮮血清，并于37。C溫育1小時。然后用清洗緩沖液清洗々反3次。在清洗后，加入100μl的二抗抗人AP(1:1000),將板于37。C溫育1小時。用清洗緩沖液進(jìn)行3次清洗。為了顯色，加入100μl的1mg/ml磷酸對硝基苯酚(pNPP)(在10mM二乙醇胺，pH9.0;0.5mMMgCl2中)，根據(jù)顯色程度于室溫溫育約10-30分鐘。通過加入50μl的1%SDS終止顯色，并于405nm檢測吸光度。吸光度單位與血清中自身抗體的量相關(guān)聯(lián)。csPCNA同種型的自身抗體的存在指示個體中自由循環(huán)的csPCNA同種型的存在情況，因此指示惡性細(xì)胞的存在情況。循環(huán)csPCNA同種型的量可隨癌癥階^R和癌癥類型而變化。實施例8:癌細(xì)胞的體內(nèi)檢測和csPCNA抗體向腫瘤細(xì)胞的傳遞與csPCNA相互作用的抗體、噬菌體展示抗體或XPG片段可如下用于鑒別受試者或患者中腫瘤的位置將放射性同位素標(biāo)記(例如圖18)或熒光標(biāo)記加入到試劑中，并將csPCNA特異性試劑注射入受試者中，以允許腫瘤細(xì)胞與標(biāo)記試劑(抗體、噬菌體顆粒)反應(yīng)。然后，通過合適的裝置如CCD照相機(jī)或PET掃描儀監(jiān)測標(biāo)記試劑在受試者中特定位置的累積，這樣，以標(biāo)記試劑的累積定位腫瘤。同樣，將與csPCNA相互作用的抗體、噬菌體展示抗體或XPG片段摻入到脂質(zhì)體傳遞嚢泡中，用于傳遞至腫瘤。當(dāng)摻入到脂質(zhì)體中的抗體、噬菌體顆粒或XPG片段與csPCNA反應(yīng)時實現(xiàn)傳遞。釋放入癌細(xì)胞中的物質(zhì)會與癌細(xì)胞中的csPCNA相互作用，并竟?fàn)幧婕癱sPCNA的細(xì)胞生物化學(xué)反應(yīng)。當(dāng)csPCNA結(jié)合配偶體與竟?fàn)幮詂sPCNA肽相互作用時，或者通過與csPCNA形成復(fù)合物由癌細(xì)胞去除csPCNA時，這些反應(yīng)被減慢或石皮壞，因此防止csPCNA與其天然目標(biāo)結(jié)合配偶體(例如但不限于DNA聚合酶S、DNA修復(fù)蛋白、轉(zhuǎn)錄機(jī)器和涉及DNA重組的蛋白)相互作用。脂質(zhì)體還可用臨床環(huán)境下使用或測試的治療各種惡性野瘤的傳統(tǒng)化療藥物的特定混合物包裹。摻入csPCNA特異性抗體、噬菌體顆?；騒PG片段或已知結(jié)合csPCNA的蛋白片段(例如但不限于p21cip/wafl)應(yīng)允許治療性脂質(zhì)體在腫瘤部位累積，并在腫瘤中或鄰近腫瘤與腫瘤融合。由于csPCNA試劑對csPCNA的選擇性，所以這些試劑不破壞nmPCNA-蛋白相互作用，因此使非惡性細(xì)胞免于遭受由破壞csPCNA蛋白特異性相互作用介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用。脂質(zhì)體還可用特異性免疫系統(tǒng)刺激分子或物質(zhì)包裹，在將刺激分子傳遞至腫瘤細(xì)胞或腫瘤部位的細(xì)胞時這些分子或物質(zhì)能夠刺激肺瘤部位的免疫應(yīng)答。通過將csPCNA特異性抗體、噬菌體顆粒、XPG或其它蛋白片段摻入到脂質(zhì)體表面中，并在將這些治療性脂質(zhì)體注射入具有腫瘤的受試者中后允許脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞和腫瘤環(huán)境反應(yīng)，實現(xiàn)腫瘤部位特異性傳遞。盡管已根據(jù)其具體實施方案詳細(xì)描述了與csPCNA同種型相關(guān)的肽、抗體及其用途，但對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員顯而易見的是，可對本發(fā)明實施各種變更和修改，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。本文提及的所有參考文獻(xiàn)都通過引用整體結(jié)到本文中。權(quán)利要求1.一種分離的抗體，所述抗體特異性地結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型。2.權(quán)利要求l的抗體，其中所述csPCNA同種型包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體結(jié)合的表位含csPCNA蛋白中結(jié)合著色性干皮病群G(XPG)蛋白的氨基酸序列。4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體結(jié)合csPCNA的表位，所述表位包含的氨基酸序列選自LGIPEQEY(SEQIDNO:l)、VEQLGIPEQEY(SEQIDNO:5)、LGIPEQEYSCVVK(SEQIDNO:6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(SEQIDNO:7)、EQLGIPEQEY(SEQIDNO:8)、QLGIPEQEY(SEQIDNO:9)、LGIPEQEYSCVVKMPS(SEQIDNO:IO)、LGIPEQEYSCWKMP(SEQIDNO:ll)、LGIPEQEYSCWKM(SEQIDNO:12)、LGIPEQEYSCVV(SEQIDNO:13)、LGIPEQEYSCV(SEQIDNO:14)和LGIPEQEYSC(SEQIDNO:15)。5.權(quán)利要求1的抗體，所述抗體為單克隆抗體。6.權(quán)利要求l的抗體，所迷抗體為嵌合抗體。7.權(quán)利要求l的抗體，所迷抗體為重組抗體。8.權(quán)利要求l的抗體，所述抗體為單鏈抗體。9.權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體為選自Fab、Fab'或F(ab')2的抗體片段。10.權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體結(jié)合可檢測物質(zhì)。11.權(quán)利要求10的抗體，其中所述可檢測物質(zhì)選自熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、顯色標(biāo)記和酶標(biāo)記。12.—種含分離和大致純化的抗體的組合物，所述抗體特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)的表位，其中所述表位包含氨基酸序列LeuGlylleProGluGlnGluTyr(SEQIDNO:l)。13.csPCNA特異性抗體檢測生物樣品中的癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的用途，所迷用途包括使生物樣品與特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的權(quán)利要求1的抗體接觸；提供用于抗體結(jié)合的條件；以及檢測抗體與csPCNA同種型的結(jié)合。14.權(quán)利要求13的用途，其中所述生物樣品是體液。15.權(quán)利要求14的用途，其中所述體液選自血液、血漿、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、胃液、胰液、腹水、滑液、乳液和精液。16.權(quán)利要求13的用途，其中所述生物樣品是組織樣品。17.權(quán)利要求16的用途，其中所述組織選自乳腺、前列腺、肺、結(jié)腸、上皮、結(jié)締組織、子宮頸、食道、腦、胸腺、曱狀腺、胰腺、睪丸、卵巢、腸、膀胱、胃、軟組織瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、癌、腺癌、胎盤、纖維組織、胚細(xì)胞組織及其提取物。18.權(quán)利要求13的用途，其中所述抗體檢測在體內(nèi)進(jìn)行。19.權(quán)利要求13的用途，其中所述抗體檢測通過提供標(biāo)記的二抗進(jìn)行。20.權(quán)利要求13的用途，其中對所述特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的抗體進(jìn)行標(biāo)記。21.權(quán)利要求13的用途，其中所述csPCNA同種型的檢測使用質(zhì)譜分析進(jìn)行。22.權(quán)利要求13的用途，其中所述csPCNA同種型的檢測使用酶聯(lián)免疫吸附測定進(jìn)行。23.權(quán)利要求13的用途，其中所述csPCNA同種型的檢測使用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行。24.csPCNA特異性抗體診斷或預(yù)后惡性腫瘤的用途，所述用途包括以下步驟通過特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的抗體檢測生物樣品中的csPCNA;以及基于生物樣品中的csPCNA^r測診斷惡性腫瘤。25.權(quán)利要求24的用途，其中所述生物樣品是生物組織或流體。26.—種生產(chǎn)癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的特異性抗體的方法，所述方法包括給予抗體生產(chǎn)源免疫原性量的肽，所述肽代表csPCNA同種型特異性表位，其中所述肽選自與著色性干皮病群G(XPG)蛋白相互作用的csPCNA區(qū)上的連續(xù)或不連續(xù)氨基酸殘基；提供用于抗體產(chǎn)生的條件；以及分離和純化j抗體。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述抗體由雜交瘤細(xì)胞分離和純化。28.權(quán)利要求26的方法，其中所述肽包含的氨基酸序列選自LGIPEQEY(SEQIDNO:l)、VEQLGIPEQEY(SEQIDNO:5)、LGIPEQEYSCVVK(SEQIDNO:6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(SEQIDNO:7)、EQLGIPEQEY(SEQIDNO:8)、QLGIPEQEY(SEQIDNO:9)、LGIPEQEYSCVVKMPS(SEQIDNO:IO)、LGIPEQEYSCWKMP(SEQIDNO:ll)、LGIPEQEYSCVVKM(SEQIDNO:12)、LGIPEQEYSCVV(SEQIDNO:13)、LGIPEQEYSCV(SEQIDNO:14)和LGIPEQEYSC(SEQIDNO:15)。29.權(quán)利要求26的方法，其中所述肽包含氨基酸序列CGGGLGIPEQEY(SEQIDNO:2)。30.權(quán)利要求26的方法，其中所述肽結(jié)合載體蛋白。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述載體蛋白是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。32.csPCNA特異性抗體鑒別體內(nèi)腫瘤位置的用途，所述方法包括給予權(quán)利要求1的特異性結(jié)合csPCNA的癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型特異性抗體，其中所述抗體用可檢測物質(zhì)標(biāo)記；以及通過檢測標(biāo)記的csPCNA特異性抗體在肺瘤部位的累積確定腫瘤位置。33.csPCNA特異性抗體使腫瘤演進(jìn)的降低增大的用途，所述用途包括提供一種藥物可接受的組合物，所述組合物包含治療有效量的權(quán)利要求1的癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型特異性抗體和傳遞組分的制劑；給予所述制劑；以及通過將含csPCNA特異性抗體的制劑傳遞至腫瘤部位降低腫瘤演進(jìn)，其中所述csPCNA特異性抗體與存在于腫瘤細(xì)胞中的csPCNA同種型反應(yīng)。34.權(quán)利要求33的用途，其中所述制劑包含脂質(zhì)體或納米顆粒。35.權(quán)利要求33的方法，其中所述制劑包含腫瘤殺傷劑或免疫增強(qiáng)劑。36.csPCNA特異性抗體鑒別抗癌物質(zhì)的用途，所述用途包括使癌細(xì)胞群與物質(zhì)接觸；通過測定權(quán)利要求1的csPCNA特異性抗體與csPCNA同種型的結(jié)合，檢測癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的水平；以及如果與所述物質(zhì)接觸的癌細(xì)胞中的csPCNA同種型水平低于未與所述物質(zhì)接觸的癌細(xì)胞中的csPCNA同種型水平，則確定所述物質(zhì)是抗癌物。37.權(quán)利要求36的用途，其中所述物質(zhì)是小分子。38.權(quán)利要求36的用途，其中所述癌細(xì)胞群選自癌細(xì)胞系、異種移植物和癌癥的同位模型系統(tǒng)。39.權(quán)利要求36的用途，其中所述測定步驟包括檢測與所述物質(zhì)接觸的正常細(xì)胞和未與所述物質(zhì)接觸的正常細(xì)胞中的非惡性PCNA同種型水平。40.權(quán)利要求36的用途，其中所述抗癌物的鑒別在高通量系統(tǒng)中進(jìn)行。41.一種檢測PCNA的csPCNA同種型的免疫測定試劑盒，所述試劑盒包含僅特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型而不結(jié)合正常增殖細(xì)胞核抗原(nmPCNA)同種型的權(quán)利要求1的抗體制備物，由此所述抗體和csPCNA形成復(fù)合物；以及檢測所述復(fù)合物的試劑。42.權(quán)利要求41的免疫測定試劑盒，所述試劑盒包含的肽的氨基酸序列選自LGIPEQEY(SEQIDNO:1)、VEQLGIPEQEY(SEQIDNO:5)、LGIPEQEYSCVVK(SEQIDNO:6)、LGIPEQEYSCVVKMPSG(SEQIDNO:7)、EQLGIPEQEY(SEQIDNO:8)、QLGIPEQEY(SEQIDNO:9)、LGIPEQEYSCWKMPS(SEQIDNO:10)、LGIPEQEYSCWKMP(SEQIDNO:ll)、LGIPEQEYSCVVKM(SEQIDNO:12)、LGIPEQEYSCVV(SEQIDNO:13)、LGIPEQEYSCV(SEQIDNO:14)和LGIPEQEYSC(SEQIDNO:15),其中所述肽用做陽性對照。43.權(quán)利要求41的免疫測定試劑盒，所述試劑盒包含的csPCNA同種型制備物含有SEQIDNO:3的氨基酸序列，其中所述csPCNA同種型用作陽性對照。44.一種分離的自身抗體，所述抗體對癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型是特異性的。45.權(quán)利要求44的自身抗體，其中所述自身抗體與csPCNA同種型的表位復(fù)合。46.—種測定惡性細(xì)胞的存在情況的方法，所述方法包括使疑似含自身抗體的生物樣品與包含結(jié)合的癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型或其片段的底物接觸，其中所述自身抗體對csPCNA同種型是特異性的；提供用于csPCNA-自身抗體復(fù)合物形成的條件；以及檢測生物樣品中自身抗體-csPCNA復(fù)合物的存在情況。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述自身抗體-csPCNA復(fù)合物的存在情況使用抗人二抗檢測。48.權(quán)利要求46的方法，其中使用標(biāo)記的生物樣品檢測自身抗體-csPCNA復(fù)合物的存在情況。49.權(quán)利要求46的方法，其中所述生物樣品選自血液、血漿、淋巴液、血清、胸膜液、脊髓液、唾液、痰、尿液、胃液、胰液、腹水、滑液、乳液和精液。50.—種檢測循環(huán)性癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的存在情況的方法，所述方法包括檢測生物樣品中對csPCNA同種型特異性的自身抗體，并由此測定循環(huán)性csPCNA同種型的存在情況。51.—種監(jiān)測個體的癥狀緩解情況的方法，所述方法包括在癌癥治療之前和之后檢測個體中增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型的存在情況；以及通過比較癌癥治療之前和之后循環(huán)性csPCNA同種型的水平確定所述個體的癥狀緩解情況。52.權(quán)利要求51的方法，其中所述csPCNA同種型通過測定csPCNA同種型自身抗體的存在情況檢測。53.權(quán)利要求51的方法，其中所述csPCNA同種型用csPCNA同種型特異性抗體檢測。54.權(quán)利要求51的方法，其中所述csPCNA同種型通過酶聯(lián)免疫吸附測定檢測。全文摘要抗體僅特異性結(jié)合癌癥特異性增殖細(xì)胞核抗原(csPCNA)同種型，而不結(jié)合非惡性增殖細(xì)胞核抗原(nmPCNA)同種型。公開了檢測csPCNA同種型存在情況的方法和組合物。文檔編號C07K16/18GK101208356SQ200680022868公開日2008年6月25日申請日期2006年4月27日優(yōu)先權(quán)日2005年4月27日發(fā)明者L·H·馬卡斯,L·施納佩,R·J·?；暾埲?印第安納大學(xué)研究及科技有限公司;Cs-凱斯有限公司