專利名稱：用于降低細胞因子免疫原性和去除細胞表面標記的方法
用于降低細胞因子免疫原性和去除細胞表面標記的方法01本發(fā)明要求2005年4月27日提交的美國臨時專利申請 序歹ll號 (United States Provisional Patent Application Serial No.) 60/675,156的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領域02本發(fā)明提供了對蛋白酶的相對變應原性進行評估的方法。 具體而言，本發(fā)明提供用于定性評估任何蛋白酶在人體誘導過敏反應的潛能的方法。另外，本發(fā)明提供選擇具有降低的變應原性的蛋白酶、 用于各種不同應用中的方法。發(fā)明背景03
蛋白質(zhì)(proteins),包括蛋白酶(proteases),具有誘導 潛在的威脅生命的免疫反應的能力。該局限性阻礙了它們在消費者終 端應用中和產(chǎn)品中的廣泛使用。事實上，該誘導免疫反應的潛能已引 起了美國食品和藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration(FDA))的注意，因此要求新的蛋白質(zhì)治療劑在批準前和批準后都 要進行變應原性測試。雖然有很多動物模型可用于評估蛋白質(zhì)的變應 原性，然而，還沒有有效的方法可用于辨別人體內(nèi)的相對變應原性。04事實上，蛋白質(zhì)，包括蛋白酶的變應原性(allergenidty)， 一直受到酶生產(chǎn)工業(yè)的關注。有記錄顯示，職業(yè)上暴露給蛋白質(zhì)(例如 蛋白酶)導致產(chǎn)業(yè)工人和實驗室人員致敏。對特定蛋白的致敏(sensitization),通常通過測試來評估(例如皮膚點刺試驗)，這可以 顯示個體是否對該蛋白發(fā)動免疫應答。05
已經(jīng)表明工業(yè)蛋白酶的生產(chǎn)可以誘導被暴露工人的致敏(參見，例如Novey et al, J. Allergy Clin. Immunol" 63:98 [1979]; Pepys et al， Clin. Allergy 15:101 [1985]; Vanhanen et al， Occup. Environ. Med.， 57:121 [2000]; Schweigert et al， Clin. Exp. Allergy 30:1511 [2000];和Sarlo et al， Fund. Appl. Toxicol" 39:44 [1997])。美國政府工業(yè)衛(wèi)生學家 學會(American College of American Government Industrial Hygienists)制 定的職業(yè)暴露指導劑量，現(xiàn)在是60ng/m3 (Groux et al， Nature 389:737 [1997])。操作規(guī)程和管理措施的貫徹執(zhí)行降低了職業(yè)暴露工人的過敏 反應病例數(shù)(參見Sarlo， Ann. Allergy Asthma Immunol" 90:32 [2003];禾口 Yamagiwaetal， J. Immunol, 166:7282 [2001])。依據(jù)加工原料的不同，每 年報道的致敏率從3%到11%的范圍上變化(參見，例如Sarlo, Ann. Allergy Asthma Immunol., 90:32 [2003]禾n Robinson et al, Toxicol. ScL, 43:39 [1998])。兩種高度相關的蛋白酶，緩慢芽孢桿菌(5. 枯 草桿菌蛋白酶和BPN，Y217L，已知在接觸的操作工人中引起完全不同 的致敏率。然而，在職業(yè)暴露期間所遇到的蛋白酶數(shù)量，與體內(nèi)和體 外對細胞表面標記產(chǎn)生作用并起動Th2反應所必須的酶量不一致。因 此，對于與T細胞分化、尤其是Th細胞分化有關的因子，以及關于該 過程與蛋白水解活性的關系，很多東西還是未知狀態(tài)。06
抗原呈遞細胞所產(chǎn)生的抗原特異性信號傳遞(antigen-specific signaling),導致CD4+T細胞沿著它們的分化途徑的 激活?？刂瓶乖盘杺鬟f所致分化結(jié)果的因子很復雜，但包括細胞因 子介導的信號傳遞(cytokine-mediated signaling)。細胞因子IL-4和IL-12 分別參與指導天然CD4+T細胞成為Th2和Thl細胞；IL-4是進行Th2 反應的必需因子(Le Gros et al, J. Exp. Med., 172:921 [1990])。 T細胞激 活(T-cell activation)的另一個結(jié)果，是無反應性(non-responsiveness) 的誘導。確立抗原耐受性(tolerance to antigen)的機制很多，包括 缺失機制，在發(fā)育過程中的胸腺內(nèi)和在應答外源抗原的外周中，所述 缺失機制可以起作用；克隆"不應答(ignorance)",其中，具有抗原 特異性的T細胞對隱蔽抗原(sequestered antigens)不應答；以及通過 調(diào)節(jié)T細胞對應答的活性抑制作用。調(diào)節(jié)T細胞的分化也受到細胞因 子信號傳遞的影響，如已表明TGF-J3和IL-10對它們的誘導是必需的(參見，例如，Chen et al， J. Exp. Med" 198:1875 [2003];禾口 Levings et al" Blood, 105:1162 [2005])。 IgE介導的超敏反應是一連串以Th2 CD4+T 細胞優(yōu)選分化為特征的免疫反應的結(jié)果。過敏反應的誘導傾向于在粘 膜表面(例如，在肺和腸中)發(fā)生。肺和腸中的調(diào)節(jié)T細胞被認為控
制非過敏個體的過敏型反應。因此，抗原特異性反應的失調(diào)導致過敏反應(allergy)。對于可以將免疫反應從對普通蛋白的正常的非過敏反 應轉(zhuǎn)變成Th2型反應的過敏原的特性，目前還不完全了解。然而，許 多過敏原，包括許多呼吸過敏原，己被發(fā)現(xiàn)具有蛋白水解活性 (proteolytic activity)。例如，花粉過敏原是包括多種肽酶在內(nèi)的多蛋 白復雜混合物。而且，許多重組過敏原蛋白也顯示了蛋白水解活性(參 見，例如Hewitt etah, Allergy 53:60 [1998];和Bagarozzi et al., Phytochem.， 47:593[1998])。07
已經(jīng)研究了蛋白水解活性(proteolytic activity)對于致 敏潛能的貢獻。發(fā)現(xiàn)蛋白水解活性是誘導過敏反應所必需的，因為滅 活的蛋白酶不致敏(參見，例如Shakib and Gough， Clin. Exp. Allergy 30:751 [2000]; Pollock et al， J. Immunol., 170:1746 [2003];和Kheradmand etal.， J. Immunol., 169:5904 [2002])。在一些實驗中，蛋白水解過敏原 與正常非過敏原蛋白結(jié)合起來進行共施用，誘導了對該第二蛋白的IgE 反應，這證明蛋白水解活性(proteolytic activity)是反式作用。蛋白 水解活性影響免疫反應的機制被描述為由于對細胞表面的調(diào)節(jié)分子的 影響。根據(jù)這些和其它的報道，從反應細胞的表面除去CD23和CD25， 可以給蛋白水解活性對于免疫反應提供非常令人滿意的解釋。然而， 現(xiàn)在本領域所使用的方法，沒有充分注意蛋白酶活性對于蛋白變應原 性所起的作用。發(fā)明概述08本發(fā)明提供對蛋白酶的相對變應原性進行評估的方法。 具體而言，本發(fā)明提供用于定性評估任何蛋白酶在人體誘導過敏反應可能性的方法。另外，本發(fā)明提供選擇低變應原性蛋白酶用于不同應 用中的方法。09
在一些特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了用于確定 蛋白酶對細胞因子之活性的方法和組合物，這些細胞因子來自于人體 和其它動物。在一些進一步特別優(yōu)選的實施方式中，提供了用于評估 蛋白酶去除細胞表面標記能力的方法和組合物。10在一些可選的特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供適合于確定絲氨酸蛋白酶作用于不同細胞因子時的活性的方法和組合物。在一些最優(yōu)選的實施方式中，蛋白酶(proteases)是枯草桿菌蛋白酶 (proteases)。在一些進一步的優(yōu)選實施方式中，蛋白酶是BPN'Y217L、 緩慢芽孢桿菌(及/e"to)枯草桿菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、 LG12枯草桿菌蛋白酶和N155G枯草桿菌蛋白酶。然而，無意將本發(fā) 明限定于枯草桿菌蛋白酶或任意特定的枯草桿菌蛋白酶。11在一些其它的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供適合于確定 蛋白酶作用于不同細胞因子時的活性的方法和組合物，細胞因子包括 人細胞因子，以及來源于動物的細胞因子。在一些實施方式中，提供 了評估蛋白酶作用于至少一種細胞因子時的活性的組合物和方法，所 述細胞因子選自于包括白介素、干擾素和轉(zhuǎn)化生長因子的組。然而， 無意將本發(fā)明限定于任意具體類或組的細胞因子，或任一特定的細胞 因子。12
本發(fā)明提供降低感興趣的細胞因子之免疫原性的方法， 其包括下列步驟暴露所述感興趣的細胞因子于至少一種絲氨酸蛋白 酶，以產(chǎn)生免疫原性降低的細胞因子。在一些實施方式中，細胞因子 是人細胞因子。在一些優(yōu)選的實施方式中，細胞因子選自IL-4、 IL-13、 IL-12和IL-IO。在進一步的實施方式中，絲氨酸蛋白酶選自緩慢芽孢 桿菌(^^'〃"s /eWM)枯草桿菌蛋白酶、解淀粉芽胞桿菌(及 am^/o/^Me/ac/era)枯草桿菌蛋白酶、以及所述緩慢芽孢桿菌(及/e"^s) 枯草桿菌蛋白酶的變體和所述解淀粉芽胞桿菌(及am;;/0//^e/a"'era)枯草桿菌蛋白酶的變體。在一些優(yōu)選的實施方式中，枯草桿菌蛋白酶 是BPN，Y217L。在另外的一些實施方式中，該方法還包括將免疫原性 降低后的細胞因子活性與所述感興趣的細胞因子活性進行比較的步 驟。在另一些其它的實施方式中，產(chǎn)生多種免疫原性降低的細胞因子。13
本發(fā)明也提供從外周血細胞上去除細胞表面標記的方 法，其包括下列步驟暴露外周血細胞于至少一種絲氨酸蛋白酶，以 產(chǎn)生去除了細胞表面標記的外周血細胞。在一些實施方式中，細胞表 面標記選自于HLA-DR、 CD86、 CD4和CD8。在一些優(yōu)選的實施方式 中，外周血細胞是單核細胞。在另外的一些實施方式中，絲氨酸蛋白 酶選自緩慢芽孢桿菌(萬""7/w /e"ft^)枯草桿菌蛋白酶、解淀粉芽胞
桿菌(5. aw少/o we/ac/era)枯草桿菌蛋白酶、Carlsberg、 LG12，以及 所述的緩慢芽孢桿菌(及/e"to)和所述的解淀粉芽胞桿菌(及 a，/o/z々^/fl"'e"s)枯草桿菌蛋白酶的變體。在進一步優(yōu)選的實施方式 中，絲氨酸蛋白酶選自BPN，Y217L和BPN，Y217的變體N155G。附圖簡述14


圖1提供了示出對于細胞表面表達分子的酶活性的圖。 將人外周血單核細胞，用所示濃度的酶，在PBS中室溫下，處理60 分鐘。用2M的FCS終止反應。圖中閉合正方形代表BPN'Y217L，而 空白菱形代表枯草桿菌蛋白酶。A圖和B圖是用FSC/SSC參數(shù)篩選 PBMC中的單核細胞；而在C圖-E圖中，是用FSC/SSC參數(shù)篩選PBMC 中的淋巴細胞；F組顯示酶處理30分鐘后，使用FSC/SSC參數(shù)篩選 PHA母細胞的結(jié)果。A圖提供CD86的結(jié)果，B圖提供HLA-DR的結(jié) 果，C圖提供CD3的結(jié)果，D圖提供CD4的結(jié)果，E圖提供CD8的 結(jié)果，以及F圖提供CD25的結(jié)果。15圖2提供了如此一些圖，其示出了 BPN，Y217L和緩慢芽 孢桿菌(及/^^m)枯草桿菌蛋白酶對于人細胞因子具有不同的蛋白水 解活性。這些圖中，BPN，Y217L(正方形)、枯草桿菌蛋白酶(菱形)或 N155G (三角形)分別與指明的細胞因子(A組為IL-4的結(jié)果，B組為 IL-13的結(jié)果，C組為IL-12p70的結(jié)果，以及D組為IL-10的結(jié)果)， 在5%人血清存在條件下，于37X:、溫育18小時，用ELISA分析方法 檢測殘留的細胞因子水平。16
圖3提供了如此一些圖，其示出了地衣芽胞桿菌 (AZ/c/^my^m^) Carlsberg和緩慢芽孢桿菌(及/e"fw)的枯草桿菌 蛋白酶，對于IL-4、 IL-IO、 IL-12和TGF-p，具有相似的蛋白水解活性。 BPN，Y217L(正方形)、緩慢芽孢桿菌(5. /e"^s)枯草桿菌蛋白酶(菱 形)或地衣芽胞桿菌(S.//c/^m/orm") Carlsberg酶(三角形)，分別與 指明的細胞因子(A組為IL-4的結(jié)果，B組為TGF-卩的結(jié)果，C組為 IL-12p70的結(jié)果，以及D組為IL-10的結(jié)果)，在5%人血清存在下， 在37'C溫育18小時。用ELISA分析方法檢測殘留的細胞因子水平。17圖4提供了如此圖，其示出了酶活性導致IL-4的功能活
性降低。在這些實驗中，使用指定濃度的緩慢芽孢桿菌(及/e"加)枯 草桿菌蛋白酶(菱形)、BPN'Y217L(正方形)或地衣芽孢桿菌 (及"c/2em/w7 ^) Carlsberg (三角形)，在37。C下，溫育過夜處理 500ng/ml的人IL-4。然后加入PMSF滅活酶，每孔加入2xl04TF-l細 胞。在第3天測定TF-1細胞的增殖，沒有處理的對照孔含有500ng/ml 的IL-4，并且表現(xiàn)的平均值是31099CPM。發(fā)明詳述18本發(fā)明提供對蛋白酶的相對變應原性進行評估的方法。 具體而言，本發(fā)明提供用于定性評估任意蛋白酶在人體誘導過敏反應 的可能性的方法。另外，本發(fā)明提供在不同的應用中選擇低變應原性 蛋白酶的方法。定義19
除非本文另外定義，本文所使用的所有技術和科學術語 的含義，與本發(fā)明涉及的技術領域的普通技術人員對這些術語的普遍 理角軍相同。例如，Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed" John Wiley and Sons, NY (1994);和Hae and Marham, Tlie Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY(1991)為本領域技術人員提供了具有本文所使用的許多術語的通用 詞典。盡管類似或等同于本文所描述的材料和方法在本發(fā)明中也有使 用，但是本文描述的方法和材料是優(yōu)選地。相應地，對緊接下面定義的 術語，通過參考作為一個整體的說明書，進行更加詳細地描述。20如本文所應用，術語"免疫反應(immune response)"指 有機體(例如，人或其它動物)針對免疫原所產(chǎn)生的免疫反應。該術 語擬包括所有類型的免疫反應，包括但不限于體液免疫反應(例如， 抗體介導)、細胞免疫反應和非特異性免疫反應。在一些實施方式中， 該術語指群體的免疫水平(即，對某一特定抗原"免疫(immune)"的 人的數(shù)量和/或?qū)δ骋惶囟乖?不免疫(not immune)"的人的數(shù)量)。21
如本文所應用，術語"減低的免疫原性(reduced immunogenidty)"指與原始的野生型(例如，親本或起源)蛋白相比，變體蛋白(例如，衍生體)被觀察到免疫反應降低。在本發(fā)明的優(yōu)選 實施方式中，提供了與源蛋白相比，在體外和/或體內(nèi)刺激產(chǎn)生較弱的 免疫反應的變體蛋白。預期具有減低的免疫原性的蛋白將具有不同的 用途，其包括但不限于生物制品、蛋白治療劑、食物和飼料、個人護 理品、清潔劑和其它消費者相關產(chǎn)品，以及用在其它的處理方案中、 診斷試劑等。22
如本文所應用，術語"增強的免疫原性(enhanced immunogenicity)"指與原始的野生型(例如，親本或起源)蛋白相比， 變體蛋白(例如，衍生體)被觀察到免疫反應加強。在本發(fā)明的優(yōu)選 實施方式中，提供了與源蛋白相比，在體外和/或體內(nèi)剌激產(chǎn)生強免疫 反應的變體蛋白。預期具有增強的免疫原性的蛋白將具有不同的用途， 其包括但不限于疫苗、生物制品、治療劑、食物和飼料添加劑，以及 用在其它的處理方案中、診斷試劑等。23如本文所應用，術語"減低的變應原性或致敏性(reduced allergencity)"指與原始的野生型蛋白(例如，親本蛋白或源蛋白)相 比，變體蛋白(例如，衍生蛋白)被觀察到過敏性免疫反應降低。在 本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供了與源蛋白相比，在體外和/或體內(nèi)刺 激產(chǎn)生次強度的過敏反應的變體蛋白。預期具有降低的致敏性的蛋白 將具有不同的用途，其包括但不限于生物制品、蛋白酶治療劑、食物 和飼料、個人護理品、清潔劑和其它消費者相關產(chǎn)品，以及用在其它 的處理方案中、診斷學中，等。24如本文使用的術語"樣品(sample)"被以它的最廣義的 概念使用。然而，在優(yōu)選的實施方式中，該術語指包含有目的組合物 的樣品(例如，等分試樣)，所述目的組合物將被分析、鑒定、修飾和 /或與其它組合物進行比較。25
如本文所應用，術語"T淋巴細胞"和"T細胞"包括 T淋巴細胞譜系內(nèi)的任何細胞，其包括從T細胞前體(包括沒有進行T 細胞受體基因重排的Thyl陽性細胞)到成熟T細胞(也就是，或者 CD4或者CD8的單一陽性型，表面TCR陽性細胞)。26
如本文所應用，術語"細胞表面標記(cell surface markers)"指在某一特定型細胞表面表達的分子("標記")。例如，T
細胞在其表面表達各種"CD"("群名稱(cluster designation)")標記， 包括但不限于CD3、 CD4、 CD8、 CD25、 CD86等。表達特定的CDs 是特定細胞類型的特征。因此，應用在細胞表面表達的各種分子來區(qū) 分不同的細胞亞群。
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如本文所應用，"去除(removal)"細胞表面標記指使用 蛋白酶去實現(xiàn)細胞表面分子的去除，因此，蛋白酶處理后的細胞表達 較少的標記。蛋白酶處理不打算徹底去除所有的細胞表面標記，但是 預期在有些情況下和/或一定條件下會出現(xiàn)這種情況。
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如本文所應用，"蛋白質(zhì)"指包括氨基酸和本領域技術 人員所認為是蛋白質(zhì)的任何組分。本文中，術語"蛋白質(zhì)"、"肽"和 多肽可替換使用，其中肽指蛋白酶的一部分，本領域技術人員理解該 詞在上下文中的用法。
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如本文所應用，"感興趣(所關心)的蛋白質(zhì)(proteinof interest)"指被分析、鑒定和/或修飾的蛋白質(zhì)(例如，蛋白酶)。本發(fā) 明使用的蛋白質(zhì)包括天然發(fā)生的蛋白和重組蛋白。事實上，本發(fā)明使 用鑒定和/或調(diào)節(jié)人(和/或其它動物)的免疫反應所需的任何蛋白。在 一些實施方式中，本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)包括激素、細胞因子、抗體、 酶、結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)合蛋白。在一些特定的實施方式中，"所關心的蛋白 質(zhì)"是指"使人感興趣的細胞因子"。
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如本文所應用，"細胞因子"指控制免疫系統(tǒng)細胞間許 多重要的相互作用的可溶性傳遞質(zhì)。細胞因子包括不同類群的細胞間 信號傳遞肽和糖蛋白。多數(shù)在遺傳上和結(jié)構(gòu)上彼此相似。每種細胞因 子由特定的細胞類型分泌，響應于不同的刺激，而且每種細胞因子對 于靶細胞的生長、遷移(mobility)、分化和/或功能產(chǎn)生特征性的作用。 總體上，細胞因子不僅調(diào)節(jié)免疫和炎癥系統(tǒng)，而且也涉及傷口愈合、 血細胞生成、血管生成和許多其它的過程。該術語擬包括所有各種不 同的細胞因子，而不考慮它們的結(jié)構(gòu)和通常所使用的名稱命名。例如， 該術語擬包括"淋巴因子(lymphokines)"(即淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因 子)和"單核因子(monokines)"(即單核細胞產(chǎn)生的細胞因子)。
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如本文所應用，"細胞因子受體(cytokinereceptor)"指 識別并結(jié)合細胞因子的受體分子。該術語擬包括可溶性細胞因子受體和結(jié)合于細胞的細胞因子受體。該術語也擬包括修飾的細胞因子受體
分子(即"變體細胞因子受體(variant cytokine receptor)"),所述修飾 包括對細胞因子受體氨基酸和/或核酸序列的取代、缺失和/或增加。因 此，該術語擬包括野生型、以及重組體、合成產(chǎn)生的和變異的細胞因 子受體。
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如本文所應用，"野生型(wild-type)"和"天然(native)" 蛋白是在自然界發(fā)現(xiàn)的蛋白。術語"野生型序列(wild-type s叫uence)" 和"野生型基因(wild-type gene)"在本文可替換使用，均指在宿主細 胞中天然的或自然發(fā)生的序列。在一些實施方式中，野生型序列指感 興趣的序列，該序列是蛋白質(zhì)工程項目的起點。
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如本文所應用，"蛋白酶(protease)"指自然發(fā)生的蛋白 酶，以及重組蛋白酶。術語"蛋白酶"包括蛋白酶的成熟形式、相關 蛋白酶的前體(pro-)和前原形式(prepro-form)。蛋白酶的前原形式 包括成熟形式的蛋白酶，該蛋白酶的氨基末端可操作地連接有前導序 列，并且該前導序列的氨基末端可操作連接有"前"或"信號"序列。 蛋白酶是這樣的酶，它們通常切割蛋白酶或肽的肽鍵。自然發(fā)生的蛋 白酶包括但不限于這樣的實例a胺酰肽水解酶(a-aminoacylpeptide hydrolase).肽基氨基酸7jC解酶 (peptidylamino acid hydrolase)、酰胺 基水解酶 (acylamino hydrolase )、 絲氨酸羧肽酶 (serine carboxypeptidase)、金屬羧肽酶(metallocarboxypeptidase)、巰基蛋白 酶(thiol proteases)、羧基蛋白酶和金屬蛋白酶(carboxylproteases and metalloproteases)。包括絲氨酸(Serine)、金屬(metallo)、巰羥(thiol) 和酸性 (acid )蛋白酶，以及內(nèi)切和外切蛋白酶(endo and exo-proteases)。事實上，在一些優(yōu)選實施方式中，使用絲氨酸蛋白酶， 例如胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)和枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)。胰 凝乳蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶具有包含天門冬氨酸(aspartate)、組氨 酸(histidine)和絲氨酸(serine)的催化三聯(lián)體。在枯草桿菌蛋白酶中， 從羧基末端開始讀起，這些氨基酸的相對順序是天門冬氨酸-組氨酸-絲氨酸(aspartate-histidine-serine);而在胰凝乳蛋白酶中，從羧基末端 開始閱讀，這些氨基酸的相對順序是組氨酸-天門冬氨酸-絲氨酸 (histidine-aspartate-serine)。雖然，典型地，枯草桿菌蛋白酶從細菌、
真菌或酵母源中獲得，但是本文所用的"枯草桿菌蛋白酶"是指絲氨 酸蛋白酶，其具有上述定義的"枯草桿菌蛋白酶"的催化三聯(lián)體。另 外，人枯草桿菌蛋白酶是來源于人的具有枯草桿菌蛋白酶催化活性的
蛋白酶，例如，人源蛋白酶中的kexin家族。本領域的技術人員對枯草 桿菌蛋白酶很熟悉，例如，解淀粉芽胞桿菌枯草桿菌蛋白酶(BPN')，緩 慢芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(例如，SAVINASE⑧枯草桿菌蛋白酶)，枯 草芽孢桿菌(^a"7/^^Z^&)枯草桿菌蛋白酶，地衣芽胞桿菌枯草桿 菌蛋白酶(參見，例如.，美國專利4，760，025 (RE 34,606)、美國專利 5，204，015、美國專禾ij 5,185,258、 EP 0 328 299和W089馬279)。
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如本文所應用，功能相似的蛋白酶被認為是"相關的蛋 白酶(related protease)"。在一些實施方式中，這些蛋白酶源自不同的 屬和/或種(例如，枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和緩慢芽孢桿菌枯草 桿菌蛋白酶)，其包括兩類有機體之間的差異(例如，細菌枯草桿菌蛋 白酶和真菌枯草桿菌)。在其它的實施方式中，相關蛋白酶來自于同一 物種。事實上，無意限定本發(fā)明于任意來源的相關蛋白酶。
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如本文所應用，術語"衍生物(derivative)"指通過下 述方法從前體蛋白(例如，天然蛋白酶)得到的蛋白質(zhì)(例如，蛋白 酶)，所述方法為在N-端、C-端或兩端添加一個或多個氨基酸，在氨基 酸序列中的一個或多個不同位點取代一個或多個氨基酸，和/或在蛋白 質(zhì)的一端或兩端、或者在氨基酸序列中的一個或多個位點刪除一個或 多個氨基酸，和/或在氨基酸序列中的一個或多個位點插入一個或多個 氨基酸。蛋白質(zhì)衍生物的制備，優(yōu)選地，通過修飾編碼天然蛋白的DNA 序列，轉(zhuǎn)化該DNA序列到合適的宿主，表達修飾后的DNA以形成衍 生蛋白而實現(xiàn)。
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一種類型的相關蛋白酶(和衍生蛋白酶)是"變體蛋白 酶(variantproteases)"。在優(yōu)選的實施方式中，變體蛋白酶與親本蛋白 酶，以及不同的變體蛋白酶之間，僅有少數(shù)幾個氨基酸殘基的差異。 差異氨基酸殘基的數(shù)目可以是一個或多個，優(yōu)選1個、2個、3個、4 個、5個、10個、15個、20個、30個、40個、50個或更多個的氨基 酸殘基。在一個優(yōu)選實施方式中，變體蛋白酶之間的不同氨基酸的數(shù) 目在1到10個之間。在特別的優(yōu)選實施方式中，相關蛋白酶和特定的
變體蛋白酶，包括至少50%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98%或99%的氨基酸序列同一性。另外，相關蛋白 酶或變體蛋白酶，正如用于本文中，是指在顯著區(qū)(prominentregions) 的數(shù)目上不同于另一種相關蛋白酶或親本蛋白酶的蛋白酶。例如，在 一些實施方式中，變體蛋白酶有l(wèi)個、2個、3個、4個、5個或10個 相應顯著區(qū)不同于親本蛋白酶。在一個實施方式中，變體蛋白酶的顯 著性相應區(qū)僅產(chǎn)生背景水平的免疫反應。
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如本文所應用的，"相應于(corresponding to)"是指在 蛋白酶或肽中的計數(shù)位點處的殘基，或與另外一個蛋白酶或肽中的計 數(shù)殘基同功(analogous)、同源或等效(equivalent)的殘基。
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如本文所應用，"相應區(qū)域(corresponding region)" — 般指在相關蛋白酶或親本蛋白酶內(nèi)的類似位置。
39
如本文所應用，術語"同功序列(analogous sequence)" 指提供了與所關心的蛋白質(zhì)具有相似的功能、三級結(jié)構(gòu)、和/或保守殘 基的蛋白質(zhì)中的序列。在特別優(yōu)選的實施方式中，同功序列包括表位 處的或表位附近的序列。例如，在包含一個a螺旋或P折疊片狀結(jié)構(gòu) 的表位區(qū)中，同功序列中的替代氨基酸，優(yōu)選保持相同特異性結(jié)構(gòu)。
40
如本文所應用，術語"同源蛋白(homologousprotein)" 指與所關心的蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)具有相似的催化作用、結(jié)構(gòu)、抗 原性和/或免疫原性應答的蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)。這并不意味著同系
物與所關心的蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)必須是進化上相關的。因此，意思 是.-該術語包括來源于不同種的相同功能的蛋白質(zhì)。在一些優(yōu)選的實 施方式中，期望鑒定與所關心的蛋白質(zhì)具有相似的三級結(jié)構(gòu)和/或一級 結(jié)構(gòu)的同系物，因為當用源自同系物的同功片段代替所關心的蛋白質(zhì) 中的表位時，將降低由該變化所帶來的破壞性。因此，在多數(shù)情況下， 緊密同源的蛋白提供最期望的表位取代來源?？蛇x地，在一些實施方 式中，對于某個給定的蛋白質(zhì)，有利的是注意人的同系物。
41
如本文所應用，"同源基因(homologous gene)"指源自 不同的但通常緊密相關的物種的至少一對基因，它們彼此對應，并且， 它們是相同的或彼此非常相似。該術語包括由于物種形成而分離的基 因(例如，新物種的出現(xiàn))(例如，直向同源基因)，以及由于遺傳復制而分離的基因(例如，平行進化同源基因)。
42
如本文所應用，"直向同源物(ortholog)"和"直向同 源基因(orthologousgene)"指不同物種的基因，所述不同物種的基因是 從共同的祖先基因(例如，同源基因)通過物種形成進化而來的。典 型地，直向同源物在進化過程中保留相同的功能。直向同源物的鑒定， 可用于可靠地預測新測序基因組的基因功能。
43
如本文所應用，"平行進化同源物(pamlog)"和"平行 進化同源基因(paralogous)"是指在基因組內(nèi)，由于復制而相關的基 因。雖然直向同源物在進化過程中保留相同的功能，而平行進化同源 物在進化出新的功能，即使一些功能總是與原始功能有關。平行進化 同源基因的實例包括但并不局限于，編碼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 彈性蛋白酶和凝血酶的基因，這些酶都是絲氨酸蛋白酶，在同一物種 中，總是一起出現(xiàn)。
44
可以用本領域已知的合適方法確定序列之間的同源性程 度(參見，例如Smith and Waterman, Adv. Appl. Math" 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol" 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988];例如在威斯康星遺傳學軟件 包(Wisconsin Genetics Software Package)中的這些應用程序GAP、 BESTFIT、 FASTA和TFASTA (Genetics Computer Group, Madison,WI); 禾口 Devereux et al"Nucl.Acid Res.,12:387-395[1984])。
45
例如，PILEUP是用于確定序列同源性水平的有用程序。 FILEUP，運用漸進式比對(progressive alignment)、兩兩比對(pairwise alignment),從一組相關序列產(chǎn)生多序列比對。該程序也可繪制顯示用 來產(chǎn)生比對的簇集關系的樹圖。PILEUP使用簡化的Feng和Doolittle (Feng and Doolittle， J.Mol.Evol.， 35: 351-360[1987])的漸進式比對 方法。該方法類似于Higgins和Sharp所描述的方法(Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153[1989])。有用的PILEUP參數(shù)包括默認空位權(quán)數(shù) (default gap weight )為3.00，默認空位長度權(quán)數(shù)(gap length weigh) 為O.IO，并加權(quán)末端空位(weighted end gaps)。有用的算法的另一個 實例是BLAST算法，其由Altschul等人進行了詳述(Altschul et al., J.Mol.Biol.， 215:403-410， [1990];和Karlin et al.， Proc,Natl.Sci.USA
90:5873-5787[1993])。其中 一 個特別有用的BLAST程序是 WU-BLAST-2程序(參見Alstchuletal.， Meth. Enzymol. ， 266: 460-480 [1996])。參數(shù)"W"、 "T"和"X"決定比對的靈敏性和速度。BLAST 程序默認的字長(W)值是11、BLOSUM62的計分矩陣(scoringmatrix) 的比對(B) (alignments B)()是50 (參見Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989])、期望值(expectation) (E)是10， M'為5，N'為4，可對兩條鏈進行比較。
46如本文所應用，"核酸同一性序列百分比(percent nucleic acid sequence identity)"指候選序列中與比對序列的核苷酸殘基相同的 核苷酸殘基的百分數(shù)。
47如本文所應用，術語"雜交(hybridization)"指核酸的一 條鏈通過堿基配對原則與互補鏈結(jié)合的過程，正如本領域所已知的那 樣。
48
如本文所應用，"最大嚴緊性(maximum stringency)"指 雜交的水平，其典型地，在大約Tm — 5°C (比探針Tm值低5"C)時 發(fā)生；"高度嚴緊性(high stringency)"在低于Tm值大約5。C到10°C 下發(fā)生；"中度嚴緊性(intermediate stringency)"在低于Tm值大約10°C 到20。C下發(fā)生；"低度嚴緊性(low stringency)"在低于Tm值大約20°C 到25t:下發(fā)生。正象本領域技術人員所理解的，最大嚴緊性雜交可用 于鑒定或檢測相同的多核苷酸序列，而中度嚴緊性或低度嚴緊性雜交 可用于鑒定或檢測多核苷酸序列的同系物。
49
在一些實施方式中，"等效殘基(叫uivalentresidue)"是這
樣確定的在前體蛋白(例如，所關心的蛋白質(zhì)酶)三級結(jié)構(gòu)水平上、 通過確定同源性而確定，所述前體蛋白的三級結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過X射線結(jié) 晶學確定。等效殘基被定義為前體蛋白的特定氨基酸殘基的兩個或 多個主鏈原子與另一個蛋白的原子坐標，在比對后，是在0.13nm范圍 內(nèi)，優(yōu)選0.1nm。在將最優(yōu)模型定向并定位，從而使該蛋白的非氫蛋白 原子的原子坐標達到最大重疊后，實現(xiàn)比對。在多數(shù)實施方式中，最 優(yōu)模型是這樣的結(jié)晶學模型，它可以在可達到的最高分辨率下，對 實驗衍射數(shù)據(jù)，給出最低R因子。
50
在一些實施方式中，優(yōu)選對"前體DNA序列(precursorDNAs叫uence)"進行修飾，其中前體DNA序列編碼前體蛋白質(zhì)氨基 酸序列；但在替代性實施方式中，通過操作前體蛋白進行修飾。在殘 基不保守的情況下，替代一個或多個氨基酸局限于通過取代產(chǎn)生變體， 變體的氨基酸序列與自然界發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列不對應。在優(yōu)選的實施 方式中，在殘基保守的情況下，這種替代不會導致產(chǎn)生自然發(fā)生的序 列。本發(fā)明所提供的衍生物進一步包括改變蛋白質(zhì)特性的化學修飾。
51
在一些優(yōu)選的實施方式中，蛋白基因與合適的表達質(zhì)粒 連接。然后，使用克隆的蛋白基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，以便表達該 蛋白基因。宿主包含公知的質(zhì)粒復制所必須的元件或質(zhì)?？杀辉O計整 合到宿主的染色體上，在這兩種情況下，該質(zhì)?？稍谒拗髦羞M行復制。 提供必需的元件以有效表達基因(例如，啟動子可操作連接到感興趣 的基因)。在一些實施方式中，這些必須元件，如果能被識別(例如， 能被宿主轉(zhuǎn)錄)，可作為基因自身的同源啟動子予以提供，轉(zhuǎn)錄終止子 (用于真核宿主細胞的多聚腺苷化區(qū)域)可以是外源的或由所關心的 蛋白質(zhì)基因的內(nèi)源終止子提供。在一些實施方式中，也包含有選擇基 因，例如抗生素抗性基因，抗生素抗性基因使得質(zhì)粒感染的宿主細 胞，通過生長，可以在含有抗微生物劑的培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)保存。
52
在一些涉及蛋白酶的優(yōu)選實施方式中，通過檢測蛋白酶 與各種不同的商業(yè)化底物的相互作用，確定變體蛋白酶的活性(varient protease activity),并比較變體蛋白酶與所感興趣的蛋白質(zhì)酶的活性， 所述商業(yè)化底物包括但不局限于，酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白和膠 原蛋白。事實上，預期可使用本領域已知的任何合適的方法測定蛋白 酶活性。測定蛋白酶活性的示例性方法包括但不限于，琥珀酰-丙氨 酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對硝基苯胺(nitroanilide) (SAAPFpNA) (引用)方法；和2， 4， 6 —三硝基苯磺酸鈉鹽(TNBS)方法。在 SAAPFpNA方法中，蛋白酶切割肽和對硝基苯胺之間的肽鍵，弓l起對 405nm的可見黃色光的吸收。在TNBS顏色反應方法中，該方法測定 將底物酶促水解成含有游離氨基基團的多肽的水解作用。這些氨基基 團可與TNBS反應形成黃色的復合物。因此，反應顏色越深，測定的 酶活性越強。黃色的深淺可以用本領域已知的各種分析儀或分光光度 計進行測定。
53
變體蛋白酶的其它特性可用本領域技術人員己知的方法
進行測量。示例性特性包括，但不局限于熱穩(wěn)定性、堿穩(wěn)定性、及 特定蛋白酶在不同的底物或不同緩沖液或不同產(chǎn)品制劑中的穩(wěn)定性。
54例如，堿穩(wěn)定性可用本領域技術人員已知的合適方法進 行測量。在優(yōu)選的實施方式中，當與前體蛋白酶相比，在變體的酶活 性的半衰期上，至少有5%或更多的提高或降低(在多數(shù)實施方式中， 提高是優(yōu)選的)時，證明在堿穩(wěn)定性發(fā)生一個根本性改變。
55
另外，熱穩(wěn)定性也可用本領域技術人員已知的合適方法 進行測量。在優(yōu)選的實施方式中，當與前體蛋白酶相比，在暴露于相 對高溫和中性pH條件下時，在突變體的催化活性的半衰期上存在至少 5%或更大的提高或降低(在多數(shù)實施方式中，優(yōu)選的是提高)時，表 明熱穩(wěn)定性發(fā)生了根本改變。
發(fā)明詳述
56
本發(fā)明涉及對蛋白酶的相對變應原性進行評估的方法。 具體而言，本發(fā)明提供用于定性評估任何蛋白酶在人體誘導過敏反應 的可能性的方法。另外，本發(fā)明提供在不同的應用中選擇具有低變應 原性的蛋白酶的方法。
57普通空氣源性過敏原的蛋白水解活性，被描述為促進Th2 反應。蛋白水解過敏原，例如Derpl，可以去除T細胞和B細胞之表 面的免疫調(diào)節(jié)細胞表面分子。己知工業(yè)蛋白酶可以誘導并加強過敏反 應。另外，工業(yè)蛋白酶對職業(yè)接觸工人顯示出不同的致敏能力。如本 文所詳細描述的，對三種工業(yè)蛋白酶，緩慢芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、 BPN，Y217和地衣芽胞桿菌枯草桿菌蛋白酶，對細胞表面標記和人細胞 因子的影響進行了研究，目的是為了揭示誘導過敏反應的潛在機制， 評估它們不同的潛能。
58
如本文所示，發(fā)現(xiàn)蛋白酶對于細胞表面標記具有相似的 影響，包括去除CD25、 CD8和CD4。這些蛋白酶也被發(fā)現(xiàn)對人IL-10 (即白細胞介素-10)、 TGF-(3(即轉(zhuǎn)化生長因子卩)、和IL-13顯示了顯著 的特異性，其lC50值在ng/ml的范圍內(nèi)。雖然無意限定本發(fā)明為任何 特定機制，但是認為對觀察到的致敏性潛能差異的至少有一種解釋
是在于對IL-4的活性。事實上，認為這些蛋白酶對調(diào)節(jié)細胞相關的 細胞因子的活性，解釋了它們的總體變應原性。如上面所表明的，雖 然無意將本發(fā)明限定于任何特殊機制，但是認為針對細胞因子的蛋 白水解活性，提供了過敏誘導的至少一種一般機制。59
CD4+T細胞沿著分化途徑的激活，是抗原特異性的信號 傳遞所致，這種信號是通過抗原呈遞細胞實現(xiàn)的?？刂瓶乖盘杺鬟f 所致分化結(jié)果的因子很復雜，但包括細胞因子介導的信號傳遞。IL-4 和IL-12分別參與指導天然CD4+T細胞成為Thl和Th2細胞。IL-4 是進行Th2反應所絕對必需的(參見，例如Le Gros e a/.， J.Exp.Med.，172:921[1990])。 T細胞激活的另一個結(jié)果是誘導無反應性。 存在許多機制，從而已經(jīng)確信建立了抗原耐受的機制，包括缺失機制， 即在發(fā)育過程中的胸腺內(nèi)和在應答外源抗原的外周中，所述缺失機制 可以起作用；克隆"不應答(ignorance)"(即在其上具有抗原特異性 的T細胞對隱蔽抗原無應答)；及通過調(diào)節(jié)T細胞對應答的激活抑制作 用。調(diào)節(jié)T細胞的分化也受到細胞因子信號傳遞的影響，如已表明 TGF-卩禾B IL-10對它們的誘導是必需的(參見，例如，Chen " a/.， J.Exp.Med.， 198: 1875;禾Q Levings "a/., Blood 105: 1162[2005])。60
IgE介導的超敏反應，是一連串以Th2CD4+T細胞優(yōu)先 分化為特征的免疫反應的結(jié)果。過敏反應的誘導，傾向于在粘膜表面 (例如，在肺和腸中)發(fā)生。雖然無意將本發(fā)明限定于任何特定機制， 肺和腸中的調(diào)節(jié)T細胞被認為控制非過敏個體內(nèi)的過敏型反應。因此， 抗原特異性反應的失調(diào)被認為在一些個體內(nèi)導致過敏。對可以將免疫 反應從對普通遭遇蛋白的正常非過敏反應轉(zhuǎn)變成Th2型反應的過敏原 的特性，還不完全了解。然而，許多過敏原，包括許多呼吸過敏原， 已被描述為具有蛋白水解活性。例如，花粉過敏原是包括多種不同肽 酶在內(nèi)的許多蛋白的復雜混合物，而且，許多重組過敏原蛋白也顯示 了蛋白水解活性(參見，例如Hewitt " a/.,Allergy 53:60[1998];和 Bagarozzi e/ a/.，Phytochem.，47:593[1998p。61
在一些實驗中發(fā)現(xiàn)，蛋白水解活性是誘導過敏反應所必 需的，因為滅活的蛋白酶是不致敏的(參見，例如Shakib W"/., Clin. Exp. Allergy 30:751[2000]; Pollock W a/., J. Immunol., 170:1746[2002];和Kheradmand W a/.， J. Immunol., 169:5904[2002])。具有蛋白水解性的過 敏原與正常非過敏原蛋白的共同施用，被發(fā)現(xiàn)誘導出針對該第二個蛋 白質(zhì)的IgE反應，這表明蛋白水解活性是反式作用。蛋白水解活性影響免疫反應的機制，被描述為歸因于對細胞表面調(diào)節(jié)分子的作用。對于蛋白水解活性對于免疫反應而言，從反應細胞的表面去除CD23 和CD25是一個滿意解釋。然而，無意將本發(fā)明限定于有關蛋白酶和 免疫反應的任何特殊的機制。62
如前所述，工業(yè)蛋白酶的生產(chǎn)顯示蛋白酶可以在受暴 露工人中誘導致敏(參見，例如Cullinan 見上文；Novey d a/.,見上文；Pepys "a/.，見上文；Vanhanen a/.，見上文；Sclrweigert d 見上文)。如上所述，依據(jù)被加工材料的不同，每年致敏率在3%-11% 之間變化(參見，例如SarloandKirchner，見上文；和Sarlo ^/"Fund. Appl.Toxicol.，見上文)。然而，兩種高度相關的蛋白酶，緩慢芽孢桿菌 的枯草桿菌蛋白酶，和BPN，Y217L，在暴露的產(chǎn)業(yè)工人中，誘導截然 不同的致敏率。通過執(zhí)行改進的工作規(guī)程和控制措施，降低了職業(yè)接 觸工人之中的過敏病例數(shù)(參見，例如SarloandKirchner,見上文；和 Sarlo，見上文)。職業(yè)暴露期間所接觸的蛋白酶數(shù)量，不同于體內(nèi)和體 外對細胞表面標記產(chǎn)生作用、并起動Th2反應所必須的酶數(shù)量。因此， 在本發(fā)明的產(chǎn)生過程中，對控制Th細胞分化并且對蛋白水解作用極其 敏感的其它因子，進行了研究。為了評估兩種相關的工業(yè)蛋白酶潛能 之間的差異，發(fā)展并測試了多種實驗，用以確定各種工業(yè)蛋白酶對于 人細胞因子的蛋白水解活性。63
本發(fā)明產(chǎn)生過程中所獲得的結(jié)果表明人細胞因子，對 于絲氨酸蛋白酶過敏原，表現(xiàn)不同的敏感性。對于由所有三種被測試 蛋白酶的蛋白水解作用，與調(diào)節(jié)T細胞相關的細胞因子是最敏感的。 IL-IO、 IL-13和TGF-P的IC50值是低于100ng/ml的。相反，與建立 Thl反應相關的細胞因子，IL-12和IFN-y，是相對不敏感的，其IC50 值在ug/ml范圍上。有趣地是，Th2細胞因子IL-4，作為一種比較低效 能的過敏原，可以作為過敏原效價的指示劑；BPN，Y217L比其它兩個 相關的絲氨酸蛋白酶，對于IL-4表現(xiàn)出顯著更高的活性。然而，不意 欲將本發(fā)明限定于這些特定的細胞因子或蛋白酶，無論單獨地一種或
它們?nèi)我獾慕M合物。64
在小鼠和人體中，IL-10和TGF-P，是與調(diào)節(jié)T細胞的 分化和效應子功能都相關的細胞因子(參見,Chen&fl/.,見上文；Groux "a/" Nature 389:737[1997]; Yamagiwa " a/"J.Immunol" 166:7282[2001]; Read & a/"J.Exp.Med" 192:295[2000];禾卩Akbari ef a/.,Nat.Immunol" 2:725[2001p。因為調(diào)節(jié)T細胞被認為控制非過敏個體內(nèi)的過敏型反應， 所以被測試蛋白酶的致敏特性被認為是由于免疫調(diào)節(jié)細胞因子IL-10 和/或TGF-(3水平的降低引起的，該降低是通過抑制與蛋白抗原反應的 調(diào)節(jié)細胞的分化，和/或由預先存在的調(diào)節(jié)T細胞干擾抑制活性所介導 的。(參見Taylor " a/.， Int. Arch. Allergy Immunol.， 135:73 [2004];禾口 Akdis Wa/.， J. Exp. Med., 199:567 [2004])。然而，無意將本發(fā)明限定于 任何特定機制。65
蛋白酶對IL-13的影響是值得注意的，因為該細胞因子 被描述為有助于過敏反應的發(fā)生(參見，Herrick et al., J. Immunol., 170:2488 [2003])。因此，過敏原特異性反應發(fā)生的微環(huán)境中的細胞因 子的損失，被認為可以降低過敏反應。然而，也考慮IL-13對于過敏性 哮喘的產(chǎn)生具有獨特的作用，因為IL-13以及顯示:可誘導不依賴于IgE 誘導和嗜曙紅細胞增多的氣道高反應性((airway hyper-reactivity) AHR)和粘液分泌(參見，Grunig " a/.,Science 282:2261 [1998];Wills-Karp "/"Science 282:2258[1998〗;和Ford W a/"J.Immunol"167:1769[2001])。 在存在正常水平的IL-4下，IL-13水平的特異性降低可導致誘導IgE介 導的過敏反應，其不具有典型哮喘的AHR和粘液分泌。雖然已經(jīng)針對 這些酶進行了小鼠鼻內(nèi)試驗，但是氣道高反應性不是一個檢測到的結(jié) 果(參見，Rpbinson et al., Fund.Appl.Toxicol" 34:15[1996])。曲霉屬 (X^erg///^)蛋白水解酶的另外的小鼠鼻內(nèi)試驗確實表明AHR的 誘導(參見，Kherammand et al.，見上文)。認為這些特定的酶誘導 了與AHR的發(fā)展不相關的一種獨特類型的過敏反應。然而，如前所述， 不意欲將本發(fā)明限定于任何特定機制或者多種機制。66進一步地，認為蛋白酶活性也影響其它的調(diào)節(jié)機制。 例如，最近在過敏性炎癥的鼠模型上，CD8+抑制性細胞已被描述，并 且近來顯示具有下調(diào)作用(參見，例如Stock et al.， Eur. J. Immunol.,34:1817 [2004])。如本文所述，發(fā)現(xiàn)細胞表面CD8對酶特別敏感，這 是另一個機制，因而認為蛋白酶修飾抑制反應。IL-2受體的a鏈 (CD25),是激活的T細胞的標記，與CD4協(xié)同；并且，/oxp3表達是 調(diào)節(jié)T細胞的標記。在很低的酶濃度下，緩慢芽孢桿菌的枯草桿菌蛋 白酶和BPN，Y217L可以從PHA誘導型PBMC母細胞的表面除去 CD25。細胞表面CD25的損失，被認為影響T細胞的隨后激活。事實 上，這被認為是一些其它的蛋白水解過敏原調(diào)節(jié)它們的效應的機制(參 見，例如Schultz " a/" J,Exp.Med,，187:271 [1998];和Shakib ef a/" Immunol. Today 19: 313[1998])。本文所描述的兩種酶對于職業(yè)暴露工 人具有不同的致敏原效價，其中緩慢芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的作 用強于BPN，Y217L (參見，例如Robinson Wa/.，見上文)。然而，如本 文所述，對于細胞表面標記——包括CD25的總體效果，不是不同的。 所記錄到的唯一值得注意的差別是對于IL-4的蛋白水解特異性，其中 致敏原性較低的蛋白酶對于IL-4具有明顯較低的IC50值。該結(jié)果表明， 更有效的過敏原——緩慢芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，通過降低IL-10 和TGF-p的局部濃度抑制調(diào)節(jié)活性，從而來調(diào)節(jié)其效應，而同時保持 微環(huán)境中的IL-4水平相對不變。這被認為有助于支持Th2免疫偏離反 應(Th2-biased immune respone)的發(fā)展。然而，如上所述，無意將本 發(fā)明限定于任何特定機制或者多種特定機制。67
因為產(chǎn)生效應所需的濃度很低，所以考慮蛋白酶對于細 胞因子的作用是相關聯(lián)的。與蛋白水解過敏原分子對細胞表面標記表 達的公開作用相反(對于CD25的去除，是5-10ug/ml (參見，Shakib et al.，見上文)，本文所描述的蛋白水解酶作用于細胞因子的結(jié)果顯示 IC50值在pg/ml的水平。所有的分析，是在包含有5%人血清的培養(yǎng)基 中進行的；對細胞因子分子，顯示了明顯的特異性。工業(yè)操作情形中 對這些蛋白酶的暴露是很低的，其與其它蛋白酶被觀察到體外效應所 需的濃度不一致，但是它們在體內(nèi)能促進過敏型反應。例如，Derpl以 每鼠10ug的體內(nèi)劑量引起傾向于Th2和IgE，這與體外顯示生物學效 應所需的濃度不同(參見，Goughe/a/., J.Exp.Med.，190:1987[1999])。 在一個相似的體內(nèi)模型中，煙曲霉(A;^g///Ms/,/gato)蛋白酶，在 33ug/劑的濃度下，在小鼠中，在促進Th2反應中是有活性的(參見，Kheradmand ef a/.,見上文)。68
許多過敏原已經(jīng)被表征為具有蛋白水解活性(參見，例如 Hewitt a a/.， Allergy 53:60 [1998]; Stewart & <a/.， Cum Opin. Allergy Clin. Immunol" 1:95 [2001];禾卩Widmer a/.， Clin. Exp. Allergy 30:571 [2000])。另外，花粉顆粒是由蛋白質(zhì)的復雜混合物組成，所述蛋白質(zhì) 包括絲氨酸內(nèi)肽酶，該酶對于免疫調(diào)節(jié)肽，例如P物質(zhì)和血管緊張素1 和2，具有活性(參見，例如Bagarozzi^ a/" Phytochem., 47:593 [1998]; 禾口 Bagarozzi " a/" Am.J.Resp.Cell Mol.Biol., 18:363[1998])。如果對免 疫調(diào)節(jié)細胞因子的蛋白水解活性導致調(diào)節(jié)細胞活性的失活和隨后的過 敏型反應的形成，那么接下來的是也影響到對旁觀者抗原(bystander antigen)的免疫反應。這一效應可以用來解釋蛋白酶對于非過敏原蛋 白的增強作用(參見，例如Kheradmand"a/.,見上文；Kurup " a/., Int. Arch. Allergy Immunol" 129:129 [2002];和Sarlo w J. Allergy Clin. Immunol., 100:480 [1997])。預期這也對下述現(xiàn)象提供了一種解釋，即 過敏供體很少對單一的蛋白質(zhì)過敏。 實驗69下述實施例用以闡述本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方式和方 面，而且所述實施例不能理解為是對其范圍的限定。70
在下述公開的實驗內(nèi)容中，使用了下述的縮寫 叫(叫uivalents相等物)，M(Molar摩爾濃度)，pM(micromolar微摩爾濃 度)，N(Normal正常)，mol(moles摩爾數(shù))，mmol(millimoles毫摩爾)， y mol(micromoles微摩爾)，nmol(nanomoles纟內(nèi)摩爾)，g(grams克)， mg(milligrams毫克)，kg(kilograms千克)，P g(micrograms微克)，L(liters 升)，ml(milliliters毫升)，P l(microliters微升),cm(centimeters厘米)， mm(millimeters毫米)，P m(micrometers微米)，nm(nanometers纟內(nèi)米)， 。C (degrees Centigrade攝氏度)，h(hours小時)，min(minutes分鐘)， sec(seconds秒)，msec(milliseconds毫秒)，xg(times gravity乘以重力力口 速度)，Ci(Curies居里)，OD(optical density光密度)，Dulbecco,s phosphate buffered solution(DPBS Dulbecco 磷酸鹽緩沖液)，HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazine一N-[2陽ethanesulfonic acid] ， N-[2-夢5乙基] 哌嗪-N-[2-乙基磺酸])，HBS(HEPS buffered saline HEPS緩沖鹽溶液)，SDS (sodium dodecylsulfate ， 十二烷基硫酸鈉)，Tris-HCL (tris[Hydroxymethyl]aminomethane-hydrochloride ，三[夢圣甲基]氨基甲'掠 -氫氯化物)，IC50(inhibitory concentration of 50% 50%抑制濃度)， Klenow(DNA polymerase I large(Klenow)fragment ， DNA聚合酉每 I(Klenow)大片段)，rpm(revolutions per minute每分鐘轉(zhuǎn)速)， EGTA(ethylene glycol-bis(卩-aminoethyl ether)N,N，N，,N，-tetraacetic acid， 乙二醇-雙-(J3-氨基乙醚)N，N,N，,N，,-四乙酸)， EDTA(ethylenediaminetetracetic acid，乙二月安四乙酸)，SPT+(skin prick test positive 皮試陽性)，ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD)， BDIS(Becton-Dickinson Imunocytometry Systems, San Jose, CA)， BenderMed Systems(BenderMed Systems, Vienna, Austria), Cedar Lane(Cedar Lane Laboratories, Ontario, Canada) ， Gibco and Gibco/Life Technologies(Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY)， Sigma(Sigma Chemical Co"St丄ouis，MO)， Pharmacia(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)， Perspective(Perspective Biosystems, Framingham， MA)， Procter Gamble(Procter and Gamble, Cincinnnati， OH), Genencor(Genencor, International, Palo Alto， CA)，Endogen(Endogen， Woburn, MA)， Cedarlane(Cedarlane, Toronto, Canada), Dynal(Dynal,Novo(Novo Industries A/S， Copenhagen, Denmark)，Biosynthesis(Biosynthesis,Louisville,TX), RD Systems(RD Systems, Inc.， Minneapolis, MN), TriLux Beta(TriLux Beta, Wallac， Finland)，Wallac(Wallac, Turku, Finland), DuPont/NEN(DuPont/NEN Research Products, Boston, MA)， TomTec(Hamden， CT), 禾口 Stratagene(Stratagene，La Jolla,CA)。71
在下述實施例中，使用下述蛋白酶。緩慢芽孢桿菌 (丑./e"tos)枯草桿菌蛋白酶(Swissport序列號P29600)、 BPN，Y217L (Swissport序列號P00782)、地衣芽胞桿菌(5./z'c/zem/orm&)枯草桿 菌蛋白酶("Carlsberg";序列號AAU40017)、 LG-12(桿菌屬某種，序列 號U39230)和BPN，Y217LN155G("N155G";該蛋白酶是對BPN，Y217L 的一個氨基酸取代后產(chǎn)生的變體，變體對于合成底物succ-pAAPF的蛋 白水解活性降低到親本酶的0.1°/。)，使用BioCad 700E系統(tǒng)(Perseptive)
和多孔聚苯乙烯珠上的POROS HS/M樹脂(Perseptive)從肉湯培養(yǎng)基 中純化上述蛋白酶，所提供的酶的使用濃度為大約45mg/ml，其溶于 pH 5.8的20mM MES和lmM CaCL2中?？莶輻U菌蛋白酶的等分溶液 -2(TC凍存?zhèn)溆谩?ELISA實驗72
用ELISA分析確定暴露于試驗酶后的細胞因子的活性。 這些實驗中，純化的重組細胞因子購自R&D Systems。細胞因子與活 性酶，在含有5%人AB血清的RPMI-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中，在37°C 下，共同溫育12-18小時。加入lmMPMSF，終止酶活性。針對IL-2、 IL-IO、 IL-12p70禾B TGF-卩1，使用DuoSet ELISA試劑盒(R and D Systems)實施ELISA。使用快速ELISA試劑盒(BenderMed Systems) 測量IL-4和IFN-Y。所有試劑盒按照廠家說明書進行使用。從計算的 回歸趨勢線上，使用曲線的線性部分并且解斜率方程以得出50%的值， 這樣計算出IC50值。 細胞表面切割分析73
夕卜周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells (PBMC))，是從購自斯坦福血液中心(Stanford Blood Center, Palo Alto， CA)的捐獻者血沉棕黃層(donor buffy coat)制備而來。在DPBS中 稀釋棕黃層物質(zhì)，并且在不連續(xù)Lymph叩aque梯度(Gibco)上進行分 離。在DPBS (Gibco)中，重新懸浮PBMC至1()6個細胞/ml，然后， 與不同濃度的枯草桿菌蛋白酶，在室溫下，溫育1小時。加入處于DPBS 中的2。/。FCS (Sigma),并反復沖洗，以便終止反應。在酶處理后，細 胞被重懸于DPBS中，并且與熒光抗體，在室溫下，溫育30分鐘。在 DPBS，洗滌細胞；然后，在FACS Calibur流式細胞儀(BDIS)上， 進行分析；并使用CellQuest軟件(BDIS)分析數(shù)據(jù)。 功能分析74
TF-1細胞(CRL-2003)購自ATCC。在IL-4與蛋白酶 溫育過夜后，加入終濃度為lmM的PMSF。 TF-1細胞被洗滌3次； 并且，以每孔2xl04個TF-1細胞，在96孔板中，與酶作用后的細胞 因子一起被培養(yǎng)。將培養(yǎng)物，在37'C、 5%032條件下，溫育48小時。 然后，每孔加入0.5uCi的氚標記的胸腺嘧啶脫氧核苷(胸苷)。18小時后收獲培養(yǎng)物，并且使用Tri-Lux閃爍記數(shù)器(Wallac)，對其進行 閃爍記數(shù)。實施例l 細胞表面標記75
進行這些實驗以確定用蛋白酶去除細胞表面分子，對隨后的免疫反應之類型，是否有影響。特別是，由于本文所述的蛋 白酶具有不同的過敏原效價，所以研究了它們對于相關表面標記的作 用，以便確定它們是否是可區(qū)分的。使用緩慢芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和BPN'Y217L，處理人PBMC細胞。在處理之后，使用流式細胞儀， 檢測細胞表面標記的存在(見，圖3)。兩種酶均不能去除人單核細胞 之表面的HLA-DR或CD86。事實上，酶的處理導致CD86和HLA-DR 的微量、但可重復性的上調(diào)。兩種酶也對CD3的表達無影響。緩慢芽 孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和BPN，Y217L ，對CD8和CD25的表達，具 有相同的活性。然而，更高劑量的BPN，Y217L處理，導致較低的CD4 表達水平，以及較低的IC50。從PBMC的表面去除CD4和CD8的IC50 值，均在ug/ml范圍上。因此，這些結(jié)果表明細胞表面標記，被 BPN，Y217L和緩慢芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶，相似地去除。實施例2絲氨酸蛋白酶在人細胞因子上的活性76
在這些實驗中——它們被設計用來研究絲氨酸蛋白酶 對人細胞因子的活性，BPN'Y217L和緩慢芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶， 與重組人細胞因子一起，在5%人血清中，在37'C下，被溫育過夜。作 為一個對照，BPN，Y217L變體N155G也被檢測。對于四肽底物 succ-pAAPF， N155G被測量，顯示出0.1%對照酶活性。溫育后，通過 加入PMSF至終濃度為lmM，抑制了蛋白酶的活性。在ELISA試驗中， 檢測殘余的細胞因子水平。圖2提供了顯示關于細胞因子IL-4、 IL-13、 IL-12和IL-10的結(jié)果的圖。77
發(fā)現(xiàn)BPN'Y217L和緩慢芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶，對 除IL-4之外的所有被測試細胞因子，具有相等的活性。而在降低可檢 測水平的IL-4上所需的酶水平上，在BPN'Y217L和緩慢芽孢桿菌枯 草桿菌蛋白酶之間，存在一個明顯的不同。如下面的表1所表明的，BPN'Y217L的活性更高，大約高60倍。這些數(shù)據(jù)代表來自兩次實驗的 結(jié)果，其中已標明。在該表中，"ND"表示"沒做"。這些酶對于IL-13 的活性均在ng/ml的范圍上；而對于IL-10則相反，均在ug/ml的劑量 范圍上，才觀察到活性?？傊谶@些實驗中所獲得的結(jié)果表明在 體外，在很低的濃度下，絲氨酸蛋白酶對人細胞因子有活性。表l.蛋白水解酶作用于人細胞因子的IC50值(ug/ml)細胞因子蛋白酶BPN，Y217L緩慢芽孢桿 菌的枯草桿 菌蛋白酶CarlsbergLG12N155GIL陽4<0.02， 0.041.25， 1.51.250.257.5IL-100.04， 0.040.1， 0.110.230.022IL國12p702， 3,753.5， 1.92.50.5>10el-130.01， 0.0050.01， 0.0050.050.0058IFN-y2.5， 3.751.25， 4.060.88ndTGFpi0.09， 0.010.11， 0.040.220.18nd78
從這些實驗得到的結(jié)果也表明低效價過敏原，對于IL-4，具有相對較高的活性。如上所示，測試了四種不同的絲氨酸蛋白 酶過敏原對人細胞因子的活性。地衣芽胞桿菌蛋白酶Carlsberg和緩慢 芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶，在變應原性的動物模型上具有相等活性； 并且在職業(yè)暴露工人中，誘導大致相同的致敏率(參見，例如Robinson "a/. ， Toxicol. Sci., 43:39 [1998])。79
在動物模型中，BPN，Y217L的活性較低；比較于 Carlsberg,具有大約0.3x效價。與Carlsberg或者緩慢芽孢桿菌枯草 桿菌蛋白酶相比,BPN'Y217L在人群顯示出的致敏率也較低。在所測試 的細胞因子上，Carlsberg和緩慢芽孢桿菌草桿菌蛋白酶顯示出相等水 平的活性，該結(jié)果與它們具有大體相似的過敏原效價相一致(見圖3)。 對于IL-12， IC50值在ug/ml的范圍上；并且，對于IL-10和TGF-卩， IC50值低于200ng/ml。 一個例外是人IL-4，其中，相比較于BPN，Y217L，緩慢芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶和Carlsberg展現(xiàn)出實質(zhì)上更低的活 性。80
對于所有的人細胞因子，LG-12蛋白酶的總體活性較高。 然而，根據(jù)其被已經(jīng)證明的對于人IL-4的活性，可以預測其具有的 過敏原效價中間等級，位于緩慢芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和BPN' Y217L之間。關于LG-12，還沒有人暴露數(shù)據(jù)。81
如表1所示出，針對人細胞因子的蛋白酶的活性，落入 兩個總類別中IC50值在ug/ml的范圍，和lC50值在ng/ml的范圍。 對于絲氨酸蛋白酶的切割具有可比擬抗性的細胞因子，被發(fā)現(xiàn)是IL-12 和IFN-y。 IL-4對于緩慢芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和Carlsberg具有抗 性。敏感細胞因子，被發(fā)現(xiàn)包括IL-13、 IL-10和TGF-(3。敏感細胞因 子的IC50值，被確定是低于100ng/ml的。82
鑒于已知在這些實驗中所涉及的酶是高活性的絲氨酸蛋 白酶，并且潛在地可能對ELISA試驗分析組分有活性，所以用在這些 實驗中的三種被使用的蛋白酶被測試，發(fā)現(xiàn)沒有可檢測地影響在多數(shù) 分析中所使用的鼠IgGlELISA平板包被試劑。認為對被測試細胞因 子的蛋白水解活性破壞了它們在ELISA分析中被檢測出的能力，但不 影響它們的生物學功能。為了檢驗這一點，用與圖2和圖3所示的 ELISA分析中所使用的相同分析方式，使用蛋白酶處理人IL-4 。溫育 并用PMSF對酶抑制之后，在孔中加入IL-4響應細胞TF-1。第三天測 定TF-1細胞的增殖(見圖4)。 TF-1細胞增殖上的減低與ELISA分析 中檢測的IL-4的損失相一致。因此，蛋白水解活性降低了人IL-4的功 能活性。83
在本說明書中提及的所有專利和出版物提示了本發(fā)明所 屬領域的普通技術人員的水平。所有的專利和出版物均以相同的程度 在此并入作為參考，如同每一個別的出版物被特定地和個別地指出、 以并入作為參考那樣。84由于已經(jīng)對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行了描述，對于本 領域的技術人員來說，很明顯地，對公開的實施方式可進行各種不同 的修改，這些修改也意欲是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。85
本領域的技術人員很容易認識到，本發(fā)明非常適合于實現(xiàn)這些目標，并獲得所提到的結(jié)果和益處，以及本文固有的結(jié)果和益 處。本文所描述的組合物和方法僅是優(yōu)選實施方式的代表，僅是示例 性的，無意作為對本發(fā)明的范圍之限定。對于本領域的技術人員，很 明顯，對于本文公開的發(fā)明可進行不同的替代和改變，這些替代和改 變并不背離本發(fā)明的范圍和精神。86
本文說明性描述的發(fā)明，可以在缺乏本文未具體公開 的任一因素或多個因素、限制或多個限制的情況下被恰當?shù)貙嵺`。這 里所使用的術語和表達只是用于描述，不是用于限制，當使用這些術 語和表達時，無意排除任何顯示或描述的特征或其部分的任何等價物， 但是，也認識到，在本發(fā)明所要求的范圍內(nèi)可進行各種不同的改變。因此，應理解雖然通過優(yōu)選實施方式和任選特性，已經(jīng)具體公開了 本發(fā)明，但是本領域的技術人員可以采用本文所公開概念的修飾和改 變，這些修飾和改變被認為是在如本文所限定的發(fā)明之范圍內(nèi)。87本文對本發(fā)明進行了廣泛地、 一般地描述。位于一般公 開中的每一更窄的種類和亞類組群，也形成本發(fā)明的一部分。這也包 括用限制性條款或否定限定對本發(fā)明的一般描述，其中限制性條款或 否定限定從所述類中去除任何主題，而不管排除的材料是否在本文中 被特別地予以陳述。
權(quán)利要求
1.一種降低感興趣的細胞因子之免疫原性的方法，其包括下面步驟將所述感興趣的細胞因子暴露于至少一種絲氨酸蛋白酶，以產(chǎn)生具有降低的免疫原性的細胞因子。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中，所述細胞因子是人細胞因子。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中，所述細胞因子選自IL-4、 IL-13、 IL-12和IL-IO。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中，所述絲氨酸蛋白酶選自緩慢芽孢 桿菌(S""7/m /e" ^)枯草桿菌蛋白酶、解淀粉芽胞桿菌(5. amyfo/^"e/ac/era)枯草桿菌蛋白酶，以及所述緩慢芽孢桿菌(5. /e"&s) 枯草桿菌蛋白酶的變體和所述解淀粉芽胞桿菌(及a，/o/!Xfldera)枯草桿菌蛋白酶的變體。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中，所述枯草桿菌蛋白酶是BPN'Y217L。
6. 權(quán)利要求1的方法，其進一步包括下列步驟將所述具有降低 的免疫原性的細胞因子之活性與所述感興趣的細胞因子之活性，進行 比較。
7. —種從外周血細胞上去除細胞表面標記的方法，其包括下列步 驟將所述外周血細胞暴露給至少一種絲氨酸蛋白酶，以便產(chǎn)生去除 了細胞表面標記的外周血細胞。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述細胞表面標記選自HLA-DR、 CD86、 CD4和CD8。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所述外周血細胞是單核細胞。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶選自緩慢芽孢 桿菌(Sac/〃w /e"f"s)枯草桿菌蛋白酶、解淀粉芽胞桿菌(R am_y/o/^/e/ac/era)枯草桿菌蛋白酶、Carlsberg、 LG12，以及所述緩慢 芽孢桿菌(及/e^w)枯草桿菌蛋白酶的變體和所述解淀粉芽胞桿菌(及 am_y/o//《we/ac/era )枯草桿菌蛋白酶的變體。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶選自 BPN，Y217L，禾卩BPN，Y217L的變體N155G。
全文摘要
本發(fā)明提供對蛋白酶的相對變應原性進行評估的方法。具體而言，本發(fā)明提供用于定性評估任何蛋白酶在人體誘導過敏反應之潛能的方法。另外，本發(fā)明提供選擇具有低變應原性的蛋白酶用于各種不同應用的方法。
文檔編號C07K14/52GK101151275SQ200680010757
公開日2008年3月26日 申請日期2006年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月27日
發(fā)明者F·A·哈丁 申請人:金克克國際有限公司