專利名稱：從紅豆杉屬植物中獲得紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
從廣義上講，本發(fā)明涉及從含有紫杉醇的植物中獲得紫杉醇的方法。更具體地講，本發(fā)明涉及從紅豆杉(Taxaceae)科植物中提取紫杉醇的方法，該紅豆杉科植物包括紅豆杉屬植物，例如曼地亞紅豆杉(Taxus media)，所述方法包括一系列柱色譜步驟和之后的紫杉醇的結(jié)晶過程。
背景技術(shù)：
紫杉醇是主要來源于短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)(太平洋紅豆杉)的樹皮中的抗癌化合物。20世紀60年代，美國國家癌癥協(xié)會(National CancerInstitute)開始對具有抗癌或抗腫瘤活性的植物提取液進行研究。研究人員發(fā)現(xiàn)，從短葉紅豆杉的樹皮中獲得的粗提取液可以抑制多種腫瘤。1971年，M.C Wani等人分離獲得了紫杉醇并對其進行了描述(J.Am.Chem.Soc.93，2325，(1971))，他們用化學方法和X-射線晶體衍射分析定義了紫杉醇的結(jié)構(gòu)。1979年，Schiff和他的同事闡明了紫杉醇的新作用機制。此機制包括在解聚可以正常發(fā)生的條件下，與微管結(jié)合并且阻止微管的解聚。目前，紫杉醇用于治療卵巢癌、乳腺癌和非小細胞肺癌。
雖然紫杉醇是主要從太平洋紅豆杉(短葉紅豆杉)的樹皮中提取的天然產(chǎn)物，但在紅豆杉科的其它成員例如加拿大紅豆杉(T.canadensis)和云南紅豆杉(T.yunnanensis)中也發(fā)現(xiàn)了紫杉醇。紫杉醇也存在于其它紅豆杉種的地上部分和根中，例如歐洲紅豆杉(T.baccata)(其針葉中含有紫杉醇及其類似物)、亞洲紅豆杉(西藏紅豆杉(T.wallichiana)和中國紅豆杉(T.chinensis))以及以觀賞為目的栽培的紅豆杉樹。下列各種紅豆杉栽培物中也發(fā)現(xiàn)含有紫杉醇T.x media“Henryi”、T.x media“Runyan”、東北紅豆杉(T.cuspidata)、T.x media“Halloran”、T.x media“Hatgield”、直立曼地亞紅豆杉(T.x media“Hicksii”)、T.x media“Tauntonii”、T.x media“Dark GreenSpreader”、T.x media“Wardii”、密生曼地亞紅豆杉(T.x media“Brownii”)、T.x media“Densiformis”、T.x media“Nigra”、T.x cuspidata“Brevifolia”和T.cuspidata“Spreader”。
所有這些種類的紅豆杉中都含有極有限量的紫杉醇。例如短葉紅豆杉和云南紅豆杉樹的樹皮中含有約0.02％的紫杉醇，直立曼地亞紅豆杉灌木的針葉和根中含有約0.005％至約0.1％的紫杉醇。
因此，開發(fā)有效的從植物材料中提取高純度紫杉醇的方法引發(fā)了人們極大的興趣。本發(fā)明提供了應用色譜和之后的紫杉醇的結(jié)晶過程從植物材料中提取高純度紫杉醇的方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供從含有紫杉醇的植物中獲得高純度紫杉醇的方法。這些方法具有如下優(yōu)點保證紫杉醇的穩(wěn)定性、可以用多種紅豆杉栽培物或者它的部位、不受紫杉醇含量的限制以及保證在生物質(zhì)中存在的紫杉醇的最大回收率。本發(fā)明中描述的方法與以往方法相比具有幾個優(yōu)點。例如，眾所周知紫杉醇可以發(fā)生降解反應，如在7位的差向異構(gòu)表異構(gòu)化、在10位的脫乙酰作用和在13位的支鏈的除去。這些影響了分離的紫杉醇的質(zhì)量和產(chǎn)率的降解反應是由于加熱引起的，特別是在含有大量醇溶劑的介質(zhì)中更易發(fā)生。在本發(fā)明描述的方法中，在提取過程中，醇是以有限量和稀釋條件應用的并且通常不涉及加熱。因此，本文中描述的方法提高了紫杉醇的穩(wěn)定性。
另外，本文中描述的方法可以應用多種類型的植物部位作為原料。更特別的是，本發(fā)明中所用的原料可以是含有紫杉醇的植物的葉、莖、枝、樹皮、根，以上部位可以單獨或混合應用。原料的選擇可以不受植物部位的比例、紅豆杉栽培物的性質(zhì)和紫杉醇含量的限制。本發(fā)明的方法提供了相同的方法效率并且可以保證獲得恒量的和高質(zhì)量的紫杉醇。本文中描述的方法也可以保證紫杉醇的高產(chǎn)率。
這些方法包括通過從植物材料中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液。應用柱色譜系統(tǒng)(每個柱色譜系統(tǒng)包括固定相和洗脫劑)將紫杉醇從紫杉醇提取液中分離出來并且將最后色譜步驟中獲得的至少一種餾分中含有的紫杉醇結(jié)晶出來。在一些實施方案中，將紫杉醇從最后色譜步驟中獲得的全部餾分中結(jié)晶出來?？梢詫a(chǎn)生的紫杉醇晶體干燥。如上所述，一些生物質(zhì)可以作為植物材料。如果將曼地亞紅豆杉的全植物用作生物質(zhì)，植物材料典型地包括約40至約60重量(w/w)百分比的地上部分和約60至約40重量(w/w)百分比的根。另外，不同系統(tǒng)之間的固定相和洗脫劑可以不同。
在本發(fā)明的方法中，從植物材料中提取紫杉醇以形成紫杉醇提取液?？梢杂萌軇?、例如水和有機溶劑的組合從植物材料中提取紫杉醇。應用柱色譜系統(tǒng)從紫杉醇提取液中分離紫杉醇，每步色譜分離之后獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，并且任選地將至少一種餾分進行減壓以除去洗脫劑。當每次分離之后收集到多于一種餾分時，至少可以先將含有紫杉醇的一些餾分合并，再將洗脫劑從該合并液中除去。另外，結(jié)晶過程可以歷經(jīng)24小時且可以在室溫下進行。另外，本發(fā)明提供了在室溫下，通過用包含約40至約60體積(v/v)百分比丙酮的含水溶液提取植物材料來從曼地亞紅豆杉中提取紫杉醇的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過從植物材料中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液，然后用包括第一種固定相和第一種洗脫劑的第一種柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從紫杉醇提取液中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分。接著用包括第二種固定相和第二種洗脫劑的第二種柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從至少一個餾分中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分。其后用包括第三種固定相和第三種洗脫劑的第三種柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從至少一種餾分中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分。另外，再用包括第四種固定相和第四種洗脫劑的第四種柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從至少一種餾分中分離出來以至少除去三尖杉寧堿并且獲得至少一種含有紫杉醇的餾分。用結(jié)晶溶劑將紫杉醇從至少一種餾分中結(jié)晶出來以獲得紫杉醇晶體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過從植物材料中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液。然后用包括第一種固定相和第一種洗脫劑的第一種柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從紫杉醇提取液中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，并且將第一種洗脫劑從至少一種餾分中除去以形成第一種殘留物。接著用包括第二種固定相和第二種洗脫劑的第二種柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從第一種殘留物中分離出來以從第一種殘留物中獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，并且將第二種洗脫劑從至少一種餾分中除去以形成第二種殘留物。接下來用包括第三種固定相和第三種洗脫劑的第三種柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從第二種殘留物中分離出來以從第二種殘留物中獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，并且將第三種洗脫劑從至少一種餾分中除去以形成第三種殘留物。再用包括第四種固定相和第四種洗脫劑的第四種柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從第三種殘留物中分離出來以從第三種殘留物中獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，并且將第四種洗脫劑從第三種殘留物中除去以形成第四種殘留物。然后，用結(jié)晶溶劑將紫杉醇從第四種殘留物中結(jié)晶出來以獲得紫杉醇晶體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括在室溫下，通過用包含約40至約60v/v百分比丙酮的含水溶劑提取植物材料來從曼地亞紅豆杉制備植物材料提取液，然后通過從植物材料提取液中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液。將紫杉醇從紫杉醇提取液中分離出來，該步驟包括應用包括硅膠作為固定相以及單獨的二氯甲烷或二氯甲烷和甲醇的混合液作為洗脫劑的第一個色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分。然后將至少一種餾分進行減壓以除去二氯甲烷和/或甲醇。然后，通過應用包括中性氧化鋁作為固定相以及丙酮作為洗脫劑的第二個色譜系統(tǒng)將紫杉醇從至少一種餾分中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，將至少一種餾分進行減壓以除去丙酮。接下來，通過應用包括硅膠作為固定相以及正己烷和丙酮的混合液作為洗脫劑的第三個色譜系統(tǒng)將紫杉醇從至少一種餾分中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，將至少一種餾分進行減壓以除去正己烷和丙酮。另外，通過應用包括硅膠作為固定相以及乙酸叔丁酯作為洗脫劑的第四個色譜系統(tǒng)將紫杉醇從至少一種餾分中分離出來以至少除去三尖杉寧堿并且獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，將至少一種餾分進行減壓以除去乙酸叔丁酯。在室溫下，歷經(jīng)24小時，用環(huán)己烷和丙酮的混合液作為結(jié)晶溶劑將至少一種餾分結(jié)晶出來以獲得紫杉醇晶體。然后，將紫杉醇晶體在真空下干燥48小時。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括在室溫下，通過用包含約40至約60v/v百分比丙酮的含水溶劑提取植物材料來從曼地亞紅豆杉制備植物材料提取液，然后通過從植物材料提取液中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液。通過應用包括硅膠作為固定相以及二氯甲烷和甲醇作為洗脫劑的第一個色譜系統(tǒng)將紫杉醇從紫杉醇提取液中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，將至少一種餾分進行減壓獲得第一個殘留物，將殘留物溶于丙酮中以獲得丙酮-殘留物組合物。接下來，通過應用包括中性氧化鋁作為固定相以及丙酮作為洗脫劑的第二個柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從丙酮-殘留物組合物中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分。將至少一種餾分進行減壓以除去丙酮。然后應用包括硅膠作為固定相以及正己烷和丙酮作為洗脫劑的第三個柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從至少一種餾分中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，將至少一種餾分進行減壓以除去正己烷和丙酮。應用包括硅膠作為固定相以及乙酸叔丁酯作為洗脫劑的第四個柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從至少一種餾分中分離出來以至少除去三尖杉寧堿并且獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，將至少一種餾分進行減壓以除去乙酸叔丁酯。在室溫下，歷經(jīng)24小時，用環(huán)己烷和丙酮的混合液作為結(jié)晶溶劑將至少一種餾分結(jié)晶出來以獲得紫杉醇晶體。將紫杉醇晶體在真空下干燥48小時。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括在室溫下，通過用包含約40至約60v/v百分比丙酮的含水溶液提取植物材料來從曼地亞紅豆杉制備植物材料提取液，然后通過從植物材料提取液中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液。通過應用包括中性氧化鋁作為固定相以及二氯甲烷和甲醇作為洗脫劑的第一個色譜系統(tǒng)將紫杉醇從紫杉醇提取液中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，將至少一種餾分進行減壓以除去二氯甲烷和甲醇。通過應用包括硅膠作為固定相以及二氯甲烷和甲醇作為洗脫劑的第二個柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從至少一種餾分中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，將至少一種餾分進行減壓以獲得殘留物，將殘留物溶于丙酮以獲得丙酮-殘留物組合物。然后通過應用包括硅膠作為固定相以及正己烷和丙酮作為洗脫劑的第三個柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從丙酮-殘留物組合物中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，將至少一種餾分進行減壓以除去正己烷和丙酮的混合物。接下來，通過應用包括硅膠作為固定相以及乙酸叔丁酯作為洗脫劑的第四個色譜系統(tǒng)將紫杉醇從至少一種餾分中分離出來以至少除去三尖杉寧堿并且獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，將至少一種餾分進行減壓以除去乙酸叔丁酯。然后，在室溫下，歷經(jīng)24小時，應用環(huán)己烷和丙酮的混合液作為結(jié)晶溶劑將至少一種餾分結(jié)晶出來以獲得紫杉醇晶體。將紫杉醇晶體在真空下干燥48小時。


圖1是概述了本發(fā)明方法的實施方案的流程圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法包括從含有紫杉醇的植物中獲得紫杉醇的方法。圖1是概述了本發(fā)明方法的實施方案步驟的流程圖。步驟A包括通過從含有紫杉醇的植物材料中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液。然后在步驟B-E中應用柱色譜分離系統(tǒng)在紫杉醇提取液中將紫杉醇從其它組分中分離出來。標記有(i)的各個步驟包括應用包括固定相和洗脫劑的柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從紫杉醇提取液或色譜餾分中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分。標記有(ii)的各個步驟包括從在前一色譜步驟中獲得的至少一種餾分中將洗脫劑去除。在優(yōu)選的實施方案中，將至少一種餾分進行減壓以除去洗脫劑。圖1中的標記(a)和(b)代表不同的分離路線。例如，如果按照路線(a)進行各個分離步驟的話，不從至少一種紫杉醇的餾分中除去洗脫劑。相反，如果應用路線(b)進行各個分離步驟的話，要從至少一種含有紫杉醇的餾分中除去洗脫劑。在某些實施方案中，某些分離步驟可以按照路線(a)進行而另一些分離步驟可以按照路線(b)進行。如在步驟B中，可以進行路線(b)以便將洗脫劑從在步驟B中獲得的餾分中除去，而在步驟C中，可以進行路線(a)以便將餾分直接在步驟D中進行分離而并沒有除去洗脫劑的步驟C。步驟F包括將最后色譜步驟中獲得的至少一種餾分進行結(jié)晶。在特殊的實施方案中，將步驟E(ii)中獲得的至少一種餾分在步驟F中進行結(jié)晶。雖然圖1只給出了四個色譜步驟，但是在結(jié)晶之前還可以有另外的色譜步驟。結(jié)晶步驟之后是干燥步驟。
植物材料本發(fā)明的步驟A中應用的原料是含有紫杉醇的植物材料?？梢詮募t豆杉科(即紅豆杉屬植物)的植物部位獲得適合的植物材料。優(yōu)選地，從曼地亞紅豆杉制備植物材料。適合的各種曼地亞紅豆杉包括T.x media“Hill”、T.x media“Henrvi”、T.x media“Runyan”、東北紅豆杉、T.x media“Halloran”、T.x media“Hatfield”、直立曼地亞紅豆杉、T.x media“Tauntonii”、T.x media“Dark Green Spreader”、T.x media“Wardii”、密生曼地亞紅豆杉、T.x media“Densiformis”、T.x media“Nigra”、T.x cuspidata“Brevifolia”和T.x cuspidata“Spreader”。另外，可以從紅豆杉屬植物的多種部位制備植物材料，例如新鮮的或干燥的根、葉、枝、種子、樹皮、莖或這些部位的混合物。優(yōu)選地，由約40至約60w/w百分比的地上部位和約60至約40w/w百分比的根制備植物材料。植物材料是通過例如提取、粉碎或切割從含有紫杉醇的植物部位獲得的。在特殊的實施方案中，用安裝有例如10mm直徑的網(wǎng)的刀片研磨生產(chǎn)線將用于提取的植物材料研碎。在一個實施方案中，用至少一種提取溶劑提取植物材料。適合的溶劑包括含水溶劑，例如含水有機溶劑，如丙酮在水中的溶劑。優(yōu)選地，應用約40至約60體積百分比的丙酮和約60至約40體積百分比的水的混合液。含水丙酮可以防止紫杉醇的降解。優(yōu)選地，提取在室溫下進行。在室溫下的提取也可以防止紫杉醇降解。
紫杉醇和其同系物(cogener)的提取在第一步色譜步驟之前，如在步驟B前，在步驟A中制備了紫杉醇提取液。在一個實施方案中，通過用溶劑從植物材料中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液。在一個特殊的實施方案中，通過處理植物材料的丙酮水提取液來制備紫杉醇提取液。適合的提取溶劑包括但不限于脂族酯，例如乙酸乙酯，或氯化溶劑例如氯仿或二氯甲烷。優(yōu)選的提取溶劑是二氯甲烷。在特殊的實施方案中，在將紫杉醇用以上溶劑之一提取前，先將丙酮水提取液在真空下濃縮以除去丙酮。然后用溶劑將濃縮液稀釋。稀釋溶劑可以包括甲醇或其它水溶性的醇溶劑如乙醇或丙醇。然后用提取溶劑、例如二氯甲烷和上述其它提取溶劑將紫杉醇從稀釋的濃縮液中提取出來。形成紫杉醇提取液。
在一個實施方案中，在真空下，將紫杉醇提取液濃縮以除去溶劑。濃縮的紫杉醇提取液包含紫杉醇及其同系物、葉綠素、脂肪、木酚素、類黃酮、酚和多種極性雜質(zhì)。同系物包括，例如三尖杉寧堿、N-脫苯甲?；?N-己酰基-紫杉醇、N-脫苯甲酰基-N-己?；?N-甲基-紫杉醇、N-脫苯甲?；?N-苯乙?；?紫杉醇、N-脫苯甲酰基-N-肉桂?；?紫杉醇和N-脫苯甲?；?N-惕各?；?tigloyl)-紫杉醇，這些都可以伴有各自的7位的差向異構(gòu)化、10位的脫乙?；?-O-木糖衍生物。因此，還存在相應的紫杉醇衍生物。這些非紫杉醇組分或雜質(zhì)可以應用下面討論的色譜技術(shù)除去。
通過色譜法純化紫杉醇通過應用至少四步柱色譜步驟(圖1中的步驟B-E)將紫杉醇從紫杉醇提取液中分離出來。步驟B(i)-E(i)中的每一步都包括應用包括固定相和洗脫劑的色譜系統(tǒng)。每一個系統(tǒng)可以是具有不同固定相和洗脫劑的相同裝置。適合的固定相包括但不限于中性氧化鋁和硅膠?？赡艿南疵搫┌ǖ幌抻诒?、二氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸叔丁酯、氯仿和乙酸乙酯。
每一步色譜步驟包括應用包括固定相和洗脫劑的柱色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分。至少一種餾分可以包括色譜步驟中獲得的多種餾分的組合。例如，從色譜步驟中可以獲得一種以上餾分。然后將這些餾分合并并且將合并的餾分用于下一色譜步驟。
在一個實施方案中，將洗脫劑從至少一種餾分中除去?？梢詫⒅辽僖环N餾分在步驟B(ii)-E(ii)中進行減壓以除去洗脫劑。除去溶劑可以包括除去至少一種餾分中的一部分溶劑，并不需要除去所有的溶劑。
在一個實施方案中，第一步色譜步驟-步驟B(i)，通常將脂肪、葉綠素、低分子量的酚類和極性大的雜質(zhì)從紫杉醇中分離除去。第二步色譜步驟-步驟C(i)，通常將另外的雜質(zhì)、特別是類黃酮和木酚素從紫杉醇中分離除去。第三步色譜步驟-步驟D(i)，通常將其它紫杉烷從紫杉醇中分離出來。這些紫杉烷包括上述的紫杉烷衍生物，特別是三尖杉寧堿和少量其它紫杉烷，例如那些以上討論的紫杉烷。第四步色譜步驟-步驟E(i)，將同系物三尖杉寧堿從紫杉醇中分離除去。適合除去三尖杉寧堿的固定相包括硅膠。有用的洗脫劑的實例包括乙酸叔丁酯、乙酸異丁酯、甲酸正丁酯、甲酸異丁酯、甲酸叔丁酯和甲酸仲丁酯。見U.S.Patent No.6,333,419，其內(nèi)容全部并入本文作為參考。
在一個實施方案中，第一個柱色譜系統(tǒng)包括包含硅膠的固定相以及包含二氯甲烷和二氯甲烷-甲醇混合液(99∶1或98∶2，v∶v)的洗脫劑。在另一個實施方案中，第二個柱色譜系統(tǒng)包括包含中性氧化鋁的固定相和包含丙酮的洗脫劑。再在另一個實施方案中，第三個柱色譜系統(tǒng)包括包含硅膠的固定相以及包含正己烷和丙酮(4∶1，v/v)的洗脫劑。在另一個實施方案中，第四個柱色譜系統(tǒng)包括包含硅膠的固定相和包含乙酸叔丁酯的洗脫劑。
任選地，可以以不同順序除去雜質(zhì)。例如，經(jīng)氧化鋁除去酚，然后用硅膠作為固定相除去葉綠素和脂肪。
紫杉醇的結(jié)晶在最后的色譜步驟之后，將從該步驟中獲得的至少一種含有紫杉醇的餾分在步驟F中用結(jié)晶溶劑結(jié)晶以獲得紫杉醇晶體。適合的結(jié)晶溶劑包括環(huán)己烷、丙酮、正己烷、異己烷、正庚烷、乙酸叔丁酯和它們的混合物。優(yōu)選應用環(huán)己烷和丙酮1∶1的混合液。在一個實施方案中，結(jié)晶在室溫下進行。通常，結(jié)晶歷經(jīng)24小時。但是，結(jié)晶也可以歷經(jīng)其它時間。結(jié)晶之后，將紫杉醇晶體在一定溫度下、如在約50℃和約60℃之間真空干燥。優(yōu)選將晶體干燥約48小時。
實施例1在室溫下，用15,000L 50％的含水丙酮提取1噸從直立曼地亞紅豆杉獲得的干燥且研碎的植物材料，該植物材料中包括約500kg的根和約500kg的葉和細枝。將提取液在真空下濃縮至約300L。然后向其中加入150L甲醇并且用200L二氯甲烷提取5次。將合并的有機層在真空下濃縮直到獲得軟殘留物，將軟殘留物重新溶于二氯甲烷中并且將其經(jīng)180kg硅膠進行柱色譜分離。約2,700L的二氯甲烷通過柱洗脫并除去。
然后將紫杉醇用二氯甲烷-甲醇99∶1(v/v)混合液洗脫。然后在真空下蒸發(fā)溶液以獲得軟殘留物。將殘留物溶于8L的丙酮中獲得丙酮-殘留物，將該丙酮-殘留物通過含有30kg中性氧化鋁的柱，用相同的溶劑洗脫。將含有紫杉醇的餾分合并并且在真空下濃縮至8L。
然后，將丙酮溶液上樣到用正己烷-丙酮(4∶1)裝填的含有180kg硅膠的柱上。用該洗脫劑進行洗脫使紫杉醇中不含有大多數(shù)其它的紫杉烷(三尖杉寧堿除外)。將含有紫杉醇的餾分合并并且在真空下濃縮至5L。
然后將此溶液經(jīng)用乙酸叔丁酯裝填的180kg硅膠進行色譜分離，并用此溶劑洗脫。將含有紫杉醇的餾分合并并且在真空下蒸發(fā)直到獲得軟殘留物。再用乙酸叔丁酯進行柱洗脫至少除去了三尖杉寧堿。將含有紫杉醇的軟殘留物(約300g)溶于2L的丙酮中，用1.2L的環(huán)己烷稀釋并且放置結(jié)晶。在過濾和50℃干燥48小時后，獲得255g純度高于99％的紫杉醇。
實施例2在室溫下，用1,500L 50％的含水丙酮提取100kg來源于Taxus mediadark green spreader全植物的干燥且研碎的植物材料，該植物材料包括約40kg的根和約60kg的葉和細枝。將提取液在真空下濃縮至30L。然后，向其中加入15L的甲醇并且用20L的二氯甲烷提取5次。將二氯甲烷提取液合并并且在真空下濃縮至15L。
加入甲醇(150mL)并且使溶液通過含有13kg中性氧化鋁的柱，用二氯甲烷-甲醇99∶1v/v洗脫。收集合有紫杉醇的餾分并且在真空下濃縮至5L。
將濃縮的溶液上樣到含有9kg硅膠的柱上并且用二氯甲烷-甲醇99∶1v/v洗脫。當極性雜質(zhì)被洗脫之后，收集220L含有紫杉醇的餾分，將其合并并且在真空下蒸發(fā)以獲得軟殘留物(190g)。
將殘留物溶解于400mL丙酮中以形成丙酮-殘留物，將該丙酮-殘留物經(jīng)9kg硅膠進行柱色譜分離，用正己烷-丙酮4∶1洗脫。收集合有紫杉醇的餾分并且再次通過經(jīng)硅膠的柱色譜進行純化，用乙酸叔丁酯洗脫，如實施例2中描述的。用環(huán)己烷-丙酮1∶1的混合液結(jié)晶，在55℃下干燥后，獲得18.5g純度高于99％的紫杉醇。
權(quán)利要求
1.從含有紫杉醇的植物中獲得紫杉醇的方法，該方法包括(a)通過從植物材料中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液；(b)應用包括第一種固定相和第一種洗脫劑的第一個柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從紫杉醇提取液中分離出來，得到至少一種含有紫杉醇的餾分；(c)應用包括第二種固定相和第二種洗脫劑的第二個柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從在步驟(b)中獲得的至少一種餾分中分離出來，得到至少一種含有紫杉醇的餾分；(d)應用包括第三種固定相和第三種洗脫劑的第三個柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從在步驟(c)中獲得的至少一種餾分中分離出來，得到至少一種含有紫杉醇的餾分；(e)應用包括第四種固定相和第四種洗脫劑的第四個柱色譜系統(tǒng)將紫杉醇從在步驟(d)中獲得的至少一種餾分中分離出來以至少除去三尖杉寧堿并且獲得至少一種含有紫杉醇的餾分；以及(f)應用結(jié)晶溶劑將在步驟(e)中獲得的至少一種餾分中含有的紫杉醇結(jié)晶出來，得到紫杉醇晶體。
2.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括將在步驟(f)中獲得的紫杉醇晶體干燥。
3.權(quán)利要求1的方法，其中從植物部位獲得植物材料。
4.權(quán)利要求3的方法，其中通過提取包含約40至約60w/w百分比的地上部分和約60至約40w/w的根的植物材料來制備植物材料提取液。
5.權(quán)利要求1的方法，其中植物材料包括從曼地亞紅豆杉、T.x media“Henryi”、T.x media“Runyan”、東北紅豆杉、T.x media“Halloran”、T.xmedia “Hatfield”、直立曼地亞紅豆杉、T.x media“Tauntonii”、T.x media“Dark Green Spreader”、T.x media“Wardii”、密生曼地亞紅豆杉、T.x media“Densiformis”、T.x media“Nigra”、T.x euspidata“Brevifolia”或T.cuspidata“Spreader”獲得的植物材料。
6.權(quán)利要求1的方法，其中第二種固定相包括中性氧化鋁。
7.權(quán)利要求1的方法，其中第一種、第三種或第四種固定相包括硅膠。
8.權(quán)利要求1的方法，其中第一種、第二種或第三種洗脫劑包括丙酮、二氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸叔丁酯、氯仿或乙酸乙酯。
9.權(quán)利要求1的方法，其中第一種洗脫劑包括二氯甲烷和甲醇。
10.權(quán)利要求1的方法，其中第二種洗脫劑包括丙酮。
11.權(quán)利要求1的方法，其中第三種洗脫劑包括正己烷和丙酮。
12.權(quán)利要求1的方法，其中第四種洗脫劑包括乙酸叔丁酯、乙酸異丁酯、甲酸正丁酯、甲酸異丁酯、甲酸叔丁酯或甲酸仲丁酯。
13.權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)晶溶劑包括環(huán)己烷和丙酮。
14.從含有紫杉醇的植物中獲得紫杉醇的方法，該方法包括(a)通過從植物材料中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液；(b)從紫杉醇提取液中分離紫杉醇，包括(i)應用包括第一種固定相和第一種洗脫劑的第一個柱色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將第一種洗脫劑從在步驟(b)(i)中獲得的至少一種餾分中除去以形成第一種殘留物。(c)從在步驟(b)(ii)中獲得的第一種殘留物中分離紫杉醇，包括(i)應用包括第二種固定相和第二種洗脫劑的第二個柱色譜系統(tǒng)以從第一種殘留物中獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將第二種洗脫劑從在步驟(c)(i)中獲得的至少一種餾分中除去以形成第二種殘留物。(d)從在步驟(c)(ii)中獲得的第二種殘留物中分離紫杉醇，包括(i)應用包括第三種固定相和第三種洗脫劑的第三個柱色譜系統(tǒng)以從第二種殘留物中獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將第三種洗脫劑從在步驟(d)(i)中獲得的至少一種餾分中除去以形成第三種殘留物。(e)從在步驟(d)(ii)中獲得的第三種殘留物中分離紫杉醇，包括(i)應用包括第四種固定相和第四種洗脫劑的第四個柱色譜系統(tǒng)以從第三種殘留物中獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將第四種洗脫劑從在步驟(e)(i)中獲得的第三種殘留物中除去以形成第四種殘留物；以及(f)用結(jié)晶溶劑將紫杉醇從在步驟(e)(ii)中獲得的第四種殘留物中結(jié)晶出來，獲得紫杉醇晶體。
15.權(quán)利要求14的方法，其中在步驟(e)中至少將三尖杉寧堿從第三個殘留物中除去。
16.權(quán)利要求14的方法，其中通過將在步驟(b)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓而除去第一種洗脫劑。
17.權(quán)利要求14的方法，其中通過將在步驟(c)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓而除去第二種洗脫劑。
18.權(quán)利要求14的方法，其中通過將在步驟(d)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓而除去第三種洗脫劑。
19.權(quán)利要求14的方法，其中通過將在步驟(e)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓而除去第四種洗脫劑。
20.權(quán)利要求14的方法，該方法還包括將在步驟(f)中獲得的紫杉醇晶體干燥。
21.權(quán)利要求20的方法，其中紫杉醇晶體是在真空下干燥的。
22.權(quán)利要求14的方法，其中應用第一種含水溶劑將紫杉醇從植物材料中提取出來。
23.權(quán)利要求22的方法，其中第一種含水溶劑包括水和丙酮。
24.權(quán)利要求14的方法，其中步驟(a)在室溫下進行。
25.權(quán)利要求14的方法，其中從步驟(b)(i)中獲得了一種以上餾分并且至少將一些餾分合并，然后在步驟(b)(ii)中將第一種洗脫劑除去。
26.權(quán)利要求14的方法，其中從步驟(c)(i)中獲得了一種以上餾分并且至少將一些餾分合并，然后在步驟(c)(ii)中將第二種洗脫劑除去。
27.權(quán)利要求14的方法，其中從步驟(d)(i)中獲得了一種以上餾分并且至少將一些餾分合并，然后在步驟(d)(ii)中將第三種洗脫劑除去。
28.權(quán)利要求14的方法，其中從步驟(e)(i)中獲得了一種以上餾分并且至少將一些餾分合并，然后在步驟(e)(ii)中將第四種洗脫劑除去。
29.權(quán)利要求14的方法，其中步驟(f)的結(jié)晶歷經(jīng)24小時。
30.權(quán)利要求14的方法，其中步驟(f)的結(jié)晶是在室溫下進行的。
31.權(quán)利要求14的方法，其中從植物部位獲得植物材料。
32.權(quán)利要求31的方法，其中通過從包含約40至約60w/w百分比的地上部分和約60至約40w/w的根的植物部位中提取植物材料來制備植物材料提取液。
33.權(quán)利要求14的方法，其中植物材料包括從曼地亞紅豆杉、T.xmedia “Henryi”、T.x media“Runyan”、東北紅豆杉、T.x media“Halloran”、T.x media “Hatfield”、直立曼地亞紅豆杉、T.x media“Tauntonii”、T.x media“Dark Green Spreader”、T.x media“Wardii”、密生曼地亞紅豆杉、T.x media“Densiformis”、T.x media“Nigra”、T.x cuspidata“Brevifoli”或T.cuspidata“Spreader”獲得的植物材料。
34.權(quán)利要求14的方法，其中第二種固定相包括中性氧化鋁。
35.權(quán)利要求14的方法，其中第一種、第三種或第四種固定相包括硅膠。
36.權(quán)利要求14的方法，其中第一種、第二種或第三種洗脫劑包括丙酮、二氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸叔丁酯、氯仿或乙酸乙酯。
37.權(quán)利要求14的方法，其中第一種洗脫劑包括二氯甲烷和甲醇。
38.權(quán)利要求14的方法，其中第二種洗脫劑包括丙酮。
39.權(quán)利要求14的方法，其中第三種洗脫劑包括正己烷和丙酮。
40.權(quán)利要求14的方法，其中第四種洗脫劑包括乙酸叔丁酯、乙酸異丁酯、甲酸正丁酯、甲酸異丁酯、甲酸叔丁酯或甲酸仲丁酯。
41.權(quán)利要求14的方法，其中結(jié)晶溶劑包括環(huán)己烷和丙酮。
42.從曼地亞紅豆杉中獲得紫杉醇的方法，該方法包括(a)在室溫下，通過用包含約40至約60v/v百分比丙酮的含水溶劑提取植物材料來從曼地亞紅豆杉制備植物材料提取液；(b)通過從在(a)中獲得的植物材料提取液中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液；(c)從紫杉醇提取液中分離紫杉醇，包括(i)應用包括硅膠作為固定相以及單獨的二氯甲烷或二氯甲烷和甲醇的混合液作為洗脫劑的第一個色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將在步驟(c)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以除去二氯甲烷和或甲醇；(d)從在步驟(c)(ii)中獲得的至少一種餾分中分離紫杉醇，包括(i)應用包括中性氧化鋁作為固定相以及丙酮作為洗脫劑的第二個柱色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將在步驟(d)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以除去丙酮；(e)從在步驟(d)(ii)中獲得的至少一種餾分中分離紫杉醇，包括(i)應用包括硅膠作為固定相以及正己烷和丙酮的混合液作為洗脫劑的第三個柱色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將在步驟(e)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以除去正己烷和丙酮；(f)從在步驟(e)(ii)中獲得的至少一種餾分中分離紫杉醇，包括(i)應用包括硅膠作為固定相以及乙酸叔丁酯作為洗脫劑的第四個柱色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將在步驟(f)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以除去乙酸叔丁酯；(g)在室溫下，歷經(jīng)24小時，用環(huán)己烷和丙酮的混合液作為結(jié)晶溶劑將在步驟(f)(ii)中獲得的至少一種餾分進行結(jié)晶以獲得紫杉醇晶體；以及(h)將在(g)中獲得的紫杉醇晶體在真空下干燥48小時。
43.權(quán)利要求42的方法，其中在步驟(b)中制備紫杉醇提取液還包括(a)在減壓下濃縮植物材料提取液來除去丙酮以形成濃縮液；(b)用甲醇稀釋濃縮液；(c)用二氯甲烷提取濃縮液以形成二氯甲烷提取液；以及(d)在減壓下濃縮二氯甲烷提取液以形成紫杉醇提取液。
44.從曼地亞紅豆杉中獲得紫杉醇的方法，該方法包括(a)在室溫下，通過用包含約40至約60v/v百分比丙酮的含水溶劑取植物材料來從曼地亞紅豆杉制備植物材料提取液；(b)通過從在(a)中獲得的植物材料提取液中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液；(c)從紫杉醇提取液中分離紫杉醇，包括(i)應用包括硅膠作為固定相以及二氯甲烷和甲醇作為洗脫劑的第一個色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，(ii)將在步驟(c)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以獲得殘留物，以及(iii)將在步驟(c)(ii)中獲得的殘留物溶于丙酮中以獲得丙酮-殘留物組合物；(d)從在步驟(c)(iii)中獲得的丙酮-殘留物組合物中分離紫杉醇，包括(i)應用包括中性氧化鋁作為固定相以及丙酮作為洗脫劑的第二個柱色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將在步驟(d)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以除去丙酮；(e)從在步驟(d)(ii)中獲得的至少一種餾分中分離紫杉醇，包括(i)應用包括硅膠作為固定相以及正己烷和丙酮作為洗脫劑的第三個柱色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將在步驟(e)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以除去正己烷和丙酮；(f)從在步驟(e)(ii)中獲得的至少一種餾分中分離紫杉醇，包括(i)應用包括硅膠作為固定相以及乙酸叔丁酯作為洗脫劑的第四個柱色譜系統(tǒng)以至少除去三尖杉寧堿并獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將在步驟(f)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以除去乙酸叔丁酯；(g)在室溫下，歷經(jīng)24小時，用環(huán)己烷和丙酮的混合液作為結(jié)晶溶劑將在步驟(f)(ii)中獲得的至少一種餾分結(jié)晶以獲得紫杉醇晶體；以及(h)將在(g)中獲得的紫杉醇晶體在真空下干燥48小時。
45.權(quán)利要求44的方法，其中曼地亞紅豆杉包括直立曼地亞紅豆杉。
46.從曼地亞紅豆杉中獲得紫杉醇的方法，該方法包括(a)在室溫下，通過用包含約40至約60v/v百分比丙酮的含水溶液提取植物材料來從曼地亞紅豆杉制備植物材料提取液；(b)通過從在(a)中獲得的植物材料提取液中提取紫杉醇來制備紫杉醇提取液；(c)從紫杉醇提取液中分離紫杉醇，包括(i)應用包括硅膠作為固定相以及二氯甲烷和甲醇作為洗脫劑的第一個色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將在步驟(c)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以除去二氯甲烷和甲醇；(d)從在步驟(c)(ii)獲得的至少一種餾分中分離紫杉醇，包括(i)應用包括硅膠作為固定相以及二氯甲烷和甲醇作為洗脫劑的第二個柱色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分；(ii)將在步驟(d)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以獲得殘留物，以及(iii)將在步驟(d)(ii)中獲得的殘留物溶于丙酮中以獲得丙酮-殘留物組合物；(e)從在步驟(d)(iii)中獲得的丙酮-殘留物組合物中分離紫杉醇，包括(i)應用包括硅膠作為固定相以及正己烷和丙酮作為洗脫劑的第三個柱色譜系統(tǒng)以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將在步驟(e)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以除去正己烷和丙酮；(f)從在步驟(e)(ii)中獲得的至少一種餾分中分離紫杉醇，包括(i)應用包括硅膠作為固定相以及乙酸叔丁酯作為洗脫劑的第四個柱色譜系統(tǒng)以至少除去三尖杉寧堿并獲得至少一種含有紫杉醇的餾分，以及(ii)將在步驟(f)(i)中獲得的至少一種餾分進行減壓以除去乙酸叔丁酯；(g)在室溫下，歷經(jīng)24小時，用環(huán)己烷和丙酮的混合液作為結(jié)晶溶劑將在步驟(g)(ii)中獲得的至少一種餾分結(jié)晶以獲得紫杉醇晶體；以及(h)將在步驟(g)中獲得的紫杉醇晶體在真空下干燥48小時。
47.權(quán)利要求46的方法，其中曼地亞紅豆杉包括T.media“dark greenspreader”。
全文摘要
本發(fā)明公開了從含有紫杉醇的植物中獲得紫杉醇的方法。首先是從含有紫杉醇的植物中獲得植物材料，然后從植物材料中提取紫杉醇，接著用一系列柱色譜分離步驟將紫杉醇從紫杉醇提取液中分離出來以獲得至少一種含有紫杉醇的餾分。將從最后色譜步驟中獲得的餾分中的紫杉醇結(jié)晶出來。應用這些方法可以有效地從含有紫杉醇的植物中獲得高純度的紫杉醇。
文檔編號C07D305/14GK1984896SQ200580023414
公開日2007年6月20日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月13日
發(fā)明者B·加貝塔, G·齊尼 申請人:因德納有限公司